专利名称：修复角膜知觉的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括Rho蛋白抑制剂的角膜神经突发生(neuritogenesis)的促进剂，和一种基于对角膜神经突发生的促进，恢复或提高角膜敏感性或治疗干眼症的药剂。
由于角膜神经被角膜外科手术诸如屈光性激光角膜切削术(PRK)，激光辅助原位角膜切削术(LASIK)，角膜成形术等所切断，据说角膜敏感性通常降低约3周到一年的时间。例如，已经报道了在LASIK后，角膜神经明显被切断(Tuuli U.Linna等.，Experimental Eye Research 66755-763，1998)，并且在角膜区域中角膜敏感性降低，其中在LASIK后，没有观察到神经纤维分布图或神经束太短而不能产生连接(Tuuli U.Linna等，Investigative Ophthalmology & Visual Sciences，41393-397，2000)。
已经证实了PRK和LASIK后的角膜低敏感性导致了较低的泪腺反应并减少了泪液(Ang，Robert T.等，Current Opinion in Ophthalmology 12318-322，2001)。作为角膜敏感性功能降低的结果，做过角膜外科手术的患者眨眼次数减少，有问题地显示干眼症的症状。在患有干眼症的患者中，泪腺机能减退引起了角膜的低敏感性，其与另外的泪腺机能减退结合后，有问题地加剧了角膜表面的疾病状况。
然而，目前角膜外科手术后角膜敏感性的恢复依赖于自发恢复，并且在干眼症的治疗中，没有提供积极治疗以恢复角膜敏感性。
此外，由疾病导致的角膜低敏感性伴随角膜神经变性，诸如神经麻痹性角膜病变、角膜溃疡、糖尿病性角膜病变等。
Rho蛋白是包括在Rho家族(包含Rho、Rac，Cdc42等)中的低分子量G蛋白，并已知涉及肌动蛋白细胞骨支架组织和神经突收缩反应。
例如，已知C3酶，一种Rho蛋白质抑制剂，延伸了3T3成纤维细胞的细胞突出(Hirose，M.等，The Journal of Cell Biology，1411625-1636，1998)，并且公开了通过向患者施用有效量的Rho蛋白抑制剂来促进中枢神经轴突生长的方法(JP-T-2001-515018和EP-1,011,330-A)。此外，已知作为Rho蛋白质效应分子之一的Rho激酶抑制剂具有视黄醛神经节细胞的轴突延伸作用，并显示对视觉神经细胞的再生促进作用(WO 02/83175和EP-1,142,585-A)。WO 03/020281教导在外科手术，诸如LASIK等后，可以将能够促进神经再生或神经突延伸的化合物用于治疗由角膜神经紊乱引起的疾病状态。显示了作为这类化合物的实例，neotrofin等，所述neotrofin是神经营养因子刺激物质，但是既没有发现关于Rho蛋白质抑制剂的描述，也没有发现关于其的提示。
已经报道，关于在大鼠三叉神经组织培养物(在整个包埋培养物中的三叉神经束)系统中的三叉神经，神经生长因子(NGF)等的神经营养蛋白诱导的神经轴突的延伸为Rho激活剂(溶血磷脂酸)所抑制，并通过将显性负调控Rho引入细胞得以促进(Ozdinler，P.Hande等，The Journal ofComparative Neurology，438377-387，2001)。同时，有描述指出在缺乏神经营养蛋白的情况下，Rho对三叉神经束的神经轴突延伸是否有影响尚不知道，并且Rho蛋白抑制剂对三叉神经的影响尚未阐明。
另一方面，公开了由于具有Rho激活作用的化合物具有角膜上皮迁移作用并且作为Rho蛋白抑制剂的C3酶抑制其角膜上皮细胞的迁移，因此对于角膜疾病诸如角膜溃疡、角膜上皮磨损、角膜炎等，具有Rho激活作用的化合物是有用的(JP2000-264847A和EP-1,142,585A)。
发明内容
本发明提供一种药物试剂，所述药剂在具有角膜敏感性功能降低的患者，角膜外科手术诸如激光光折射角膜切开术(PRK)、激光辅助原位角膜磨削术(LASIK)、角膜移植术等之后的患者中显示角膜敏感性功能恢复。
本发明人已经出于提供一种新类型药剂的目的进行了研究，所述药剂恢复角膜外科手术后的角膜敏感性或改善干眼症状中的角膜敏感性状况，并且本发明人首次发现Rho蛋白抑制剂对三叉神经(其后有时称为角膜神经)细胞具有促神经突发生的作用。基于这些发现，他们另外研究并且完成了本发明，将Rho蛋白抑制剂用作恢复角膜敏感性等的药物。
因此，本发明涉及(1)一种促进角膜神经突发生的药剂，其包括Rho蛋白抑制剂，(2)一种促进角膜神经轴突延伸的药剂，其包括Rho蛋白抑制剂，(3)一种恢复角膜敏感性的药剂，其包括Rho蛋白抑制剂，(4)一种用于干眼的治疗剂，其包括Rho蛋白抑制剂，(5)一种促进角膜神经突发生的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂，(6)一种促进角膜神经轴突延伸的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂，(7)一种用于恢复角膜敏感性的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂，(8)一种用于治疗干眼的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂，(9)Rho蛋白抑制剂用于制备促进角膜神经突发生的药物组合物的应用，(10)Rho蛋白抑制剂用于制备促进角膜神经轴突延伸的药物组合物的应用，(11)Rho蛋白抑制剂用于制备恢复角膜敏感性的药物组合物的应用，(12)Rho蛋白抑制剂用于制备治疗干眼的药物组合物的应用，(13)一种促进角膜神经突发生的方法，其包括向需要促进角膜神经突发生的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂，(14)一种促进角膜神经轴突延伸的方法，其包括向需要促进角膜神经轴突延伸的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂，(15)一种恢复角膜敏感性的方法，其包括向需要恢复角膜敏感性的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂，和(16)一种治疗干眼的方法，其包括向被干眼侵袭的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂。
附图简述
图1是在实验例1中的培养的兔三叉神经细胞的荧光显微图像，其中A是在未添加C3酶的培养基中培养24小时的兔三叉神经细胞，B显示在含终浓度为2μg/mL的C3酶的培养基中培养24小时的细胞。
图2显示在实验例1中神经突发生细胞与总细胞数的比率(％)，其中垂直轴显示神经突发生细胞与总细胞的百分比，每个值都显示3个实验的平均值±标准误差而*显示相对于对照的显著差异(p＜0.05)。
图3是在实验例2中的培养的兔三叉神经细胞的荧光显微图像，其中A显示在未添加试验物质的培养基中培养的细胞，B显示在添加了化合物1(终浓度10μM)的培养基中培养的细胞，C显示在添加了化合物2(终浓度10μM)的培养基中培养的细胞，D显示显示在添加了化合物3(终浓度1μM)的培养基中培养的细胞，和E显示在添加了化合物4(终浓度10μM)的培养基中培养48小时的细胞。
图4是显示在实验例2中神经突发生细胞与计数的总细胞数的比率(％)的图，其中每个值都显示3个实验的平均值±标准误差，*显示相对于未添加组的显著差异(p＜0.05)，**显示相对于未添加组的显著差异(p＜0.01)。
图5显示在实验例3中兔角膜(C)和三叉神经节(T)的ROCKI和ROCKII蛋白质印迹的结果。
发明详述在本说明书中，“Rho蛋白抑制剂”包括任何抑制失活的GDP结合Rho蛋白被活化成活性GTP结合Rho蛋白的抑制剂，一种抗Rho蛋白或Rho蛋白片段的抗体等，以及任何抑制效应器分子作用的抑制剂，所述效应器分子转导诸如Rho激酶(ROCK)等的Rho蛋白的作用。“角膜神经”指在三叉神经控制下于周围角膜中形成的环状神经丛，其是在角膜基质中网状分布的感觉神经元、基质神经丛，紧接在鲍曼氏膜下面形成的上皮下神经丛，以及紧接在贯通的鲍曼氏膜之后形成的基底细胞神经丛和神经纤维。在本发明中，“神经突”指来自神经元(神经细胞)细胞体的突起(树突和轴突)，而“发生”指上述来自细胞体的神经突的生长和/或延伸。对于本领域技术人员来说将何种水平的神经突发生视为促进是清楚的。神经突发生的促进可以通过，例如，荧光染色神经细胞和利用荧光显微镜观察细胞状况来确认。此外，可以利用图像分析软件等对使用显微镜的观察结果进行分析。而且，神经突发生的状态可以通过统计学处理所述结果进行数字表示。作为另一种方法，可以用一种抗体和与识别相同物的所述抗体反应的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合抗体标记构成神经细胞体和神经突的物质，令HRP进行显色并且神经丝的量通过测量吸光度进行测定并将其用作神经突发生的指征。
作为Rho蛋白质抑制剂，可以提及的，例如，外酶C3(在本说明书有时简称为C3酶)、毒素A、毒素B和Rho激酶抑制剂。
当然，作为Rho蛋白质抑制剂(其后有时称为ROCK抑制剂)，可以提及的，例如，在JP61-227581A(USP 4,678,783)中所述的化合物诸如由FASUDIL盐酸盐等代表的异喹啉磺酰基行生物；在WO 00/57914和JP2000-44513A中所述的化合物诸如Rho激酶抑制剂(例如，利尿酸和4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸等)；在WO 02/076977(EP-1,370,552-A和1,370,553-A)中所述的化合物诸如Rho激酶抑制剂(例如，2-氯-6，7-二甲氧基-N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺等)；以及在WO02/100833中所述的化合物诸如Rho激酶抑制剂(例如，N-(1-苄基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二盐酸一水化物等)。
在下列说明中，用于本发明中的包含Rho蛋白质抑制剂的药剂和组合物有时也统称为“本发明的药剂”。
本发明的药剂可用于哺乳动物(例如，人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪、狗、猫等)角膜敏感性功能疾病的恢复，其中角膜神经受到损伤或切除或有缺陷。例如，它可用作恢复PRK、LASIK之后降低的角膜敏感性，伴随角膜神经变性的角膜敏感性降低，诸如神经麻痹性角膜病变、角膜溃疡、糖尿病性角膜病变等的治疗药物，或者用作具有降低的角膜敏感性的干眼症的治疗药物。
对本发明的药剂进行系统性或局部性给药。系统性地，对它进行口服给药，而肠胃外地，将它给药为静脉内注射、皮下注射、肌内注射等。局部性地，将它给药到眼中。
作为本发明的药剂的剂型，可以提及的有固体药剂如粉末、颗粒、片剂、胶囊、栓剂等；液体诸如糖浆、注射剂、滴眼剂等等。
对于将本发明的药剂生产为颗粒和片剂，可以通过使用，例如，赋形剂(乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，微晶体纤维素等)，润滑剂(硬脂酸镁，滑石，硬脂酸，硬脂酸钙等)，崩解剂(淀粉，羧甲纤维素钠，碳酸钙等)，粘合剂(淀粉膏溶液，羟丙基纤维素溶液，羧甲基纤维素溶液，阿拉伯树胶溶液，明胶溶液，海藻酸钠溶液等)等。对于颗粒和片剂来说，可以利用合适的包被剂(明胶，蔗糖，阿拉伯树胶，巴西棕榈蜡等)，肠溶衣(例如，醋酞纤维素，甲基丙烯酸共聚物，羟丙纤维素邻苯二甲酸酯，羧甲基乙基纤维素等)等形成包衣膜等。
对于将所述药剂生产为胶囊，将提高流动性和滑动性的合适赋形剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、轻硅酐等，提高在压力下流动性的微晶体纤维、乳糖等，以及适当添加的上述崩解剂等均匀混合或颗粒化，包以适合的包被剂以形成膜和包装于胶囊或封装内，其用具有提高可塑性的胶囊基质塑成，它包含适合的胶囊基质(明胶等)、甘油或山梨糖醇等。这些胶囊可以包含着色剂、防腐剂[二氧化硫，对羟基苯甲酸酯类(对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯)]等作为必需品。所述胶囊可以是传统的胶囊，一种肠包衣胶囊，一种胃包衣胶囊或一种缓释胶囊。当生产肠衣胶囊时，将一种包以肠包衣剂或上述适合的赋形剂的化合物加至一种化合物中并包装于传统胶囊中或者胶囊本身可以用肠包衣剂进行包被，或者可以将肠聚合物用作塑模的基质。
对于将本发明的药剂生产为栓剂，可以适当地选用一种栓剂的基质(例如，可可脂，聚乙烯二醇等)。
对于所述将药剂生产为糖浆，可以适当地选用，例如，稳定剂(乙二胺四乙酸钠等)，混悬剂(阿拉伯树胶，羧甲纤维素等)，矫味剂(单糖浆，葡萄糖等)，芳香剂等。
对于将本发明的药剂生产为注射液或滴眼剂，可以通过将抑制剂溶解或分散在溶液中进行生产，所述溶液适当地包含可药用添加剂如等渗剂(氯化钠，氯化钾，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，缓冲液(磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris缓冲液，谷氨酸盐缓冲液，ε-氨基己酸盐缓冲液等)，防腐剂(对氧基苯甲酸酯，氯代丁醇，苯甲醇，苯扎氯铵，脱氢醋酸钠，依地酸钠，硼酸，硼砂等)，增稠剂(羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，稳定剂(亚硫酸氢钠，硫代硫酸钠，乙二胺四乙酸钠，柠檬酸钠，维生素C，二丁基羟基甲苯等)，pH调节剂(盐酸，氢氧化钠，磷酸，乙酸等)等。
尽管用于上述糖浆、注射剂和滴眼剂的添加剂的量根据所用添加剂的种类、用途等而变化，它们可以以能够实现添加剂的目的的浓度加入，等渗剂通常以约0.5至约5.0w/v％加入以使得渗透压为约229-约343mOsm。此外，缓冲液以约0.01-约2.0w/v％加入，增稠剂以约0.01-约1.0w/v％加入，稳定剂以约0.001-约1.0w/v％加入。适当地加入pH调节剂以通常获得约3至约9、优选约4至约8的pH。
对于本发明的药剂特别用作滴眼剂，将包含在本发明药剂中的Rho蛋白抑制剂的浓度下限调整为通常约0.00001w/v％，优选约0.00005w/v％或更加优选为约0.0001w/v％，上限调节为约0.1w/v％，优选约0.05w/v％，更加优选约0.01w/v％，进一步优选为约0.005w/v％或更加进一步优选为约0.001w/v％。
尽管本发明的药剂的剂量根据目标疾病、症状、施用受试者、Rho蛋白抑制剂的种类、给药方法等而变化，当例如将它局部施用于PRK外科手术后的成人的眼睛作为恢复角膜敏感性的药剂时，例如，将含有约0.001w/v％的C3酶或大约0.003w/v％的Rho蛋白抑制剂如N-(1-苄基-1-4-piperizinyl-1H-吲唑-5-胺·2盐酸·1/2水合物的液体滴眼剂优选滴入眼睛，1天数次，每剂量约20至约50μL。
此外，当在LASIK外科手术后将本发明的药剂向成人口服给药作为角膜敏感性恢复剂时，例如，优选给药包含大约10mg的Rho蛋白抑制剂，如4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸的片剂，一天一次或两次。
实施例通过参考下列实验例和实施例更详细地解释本发明，这些实验例和实施例不应理解为是限制性的。
实验例1在培养的兔三叉神经细胞中对于神经突发生的促进作用1)所用动物使用购自Fukusaki Rabbit Warren的日本白兔(2-3天龄)。
2)试验物质
C3酶[由Upstate生产；外酶C3(在大肠杆菌中表达的重组酶)；目录#13-118，Lot#23330]3)试验方法细胞培养物根据Chan等(Chan，Kuan Y.和Haschke，Richard H.，Exp.Eye Res.，41687-699，1985)的报道分离三叉神经细胞。具体地，在乙醚麻醉下，在用生理盐水进行心脏灌注之后，移去三叉神经节，利用神经分散溶液(SUMITOMO BAKELITE Co.，Ltd.)进行分散，并将细胞接种于用聚赖氨酸包被的8孔培养板中(BECTON DICKINSON Co.，Ltd.)。细胞数目为大约3×103细胞/孔并在为5％CO2，95％空气和100％湿度，37℃温度条件下进行培养。对于细胞培养，使用添加了B27添加物(GIBCO；0.02mL/mL培养溶液)和L-谷氨酸(GIBCO；终浓度1mM)的神经基(Neurobasal)培养基(GIBGO)，并在细胞接种之后将C3酶(2μg/mL的终浓度)立即加入到培养基中并将细胞培养24小时。
免疫染色培养24小时后，将所述细胞用4％的多聚甲醛于室温固定2小时，使用抗-神经丝200抗体(Sigma生产)和与其具有反应性的荧光二抗(Molecular Probes生产)对神经细胞体和轴突进行荧光染色，所述抗神经丝200抗体特异性地识别作为特异于神经细胞的中间体丝的神经丝。将染色的细胞作为图像(一幅图像1.83mm×1.36mm)从荧光显微镜输入计算机中，并计算每幅图像的整个细胞数量(t)。据此，使用图像分析软件(MacSCOPE，MITANI CO.生产)测量细胞轴突的长度，并将轴突的长度不少于细胞体直径两倍的细胞作为神经突发生细胞(a)。输入多个图像直到在各个图像中的总细胞数(t1+t2+...+tn＝∑t)到达约不少于100。然后计算总神经突发生细胞数(a1+a2+...+an＝∑a)与总细胞数(∑t)的比率(％)。为了比较C3酶添加组和非添加组(对照组)的这种比率，进行了t-检验并将少于5％的临界比率作为显著。
4)试验结果图1显示培养的兔三叉神经细胞的荧光显微图像，其中A表示在C3酶非添加培养基中培养24小时的对照组细胞，而B显示在包含终浓度为2μg/mL的C3酶的培养基中培养24小时的细胞，图2显示每组中神经突发生细胞的数量对细胞总数的比率。
在对照组中，神经突发生细胞的比率约为细胞总数的21％，而在C3酶添加组中约为细胞总数的46％。添加C3酶明显增加了细胞的数量，显示了神经突生长(图2)。
从前述来看，已经发现具有Rho抑制剂活性的C3酶促进了三叉神经神经细胞的神经突生长。
实验例2在培养的兔三叉神经细胞中的轴突生长促进作用1)使用的动物使用购自KITAYAMALABES Co.，Ltd的日本白兔(2-3天龄)。
2)试验物质作为ROCK抑制剂，使用2-氯-6，7-二甲氧基-N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺，N-(1-苄基-4-哌啶基)-1H-吲引唑-5-胺二盐酸盐，4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸和盐酸法舒地尔。
按照参考实施例1合成所用的2-氯-6，7-二甲氧基N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺(其后称为化合物1)。按照参考实施例2合成所用的N-(1-苄基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二盐酸·1/2水合物(其后称为化合物2)。按照参考实施例3合成所用的4-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸(其后称为化合物3)。使用的盐酸法舒地尔(其后称为化合物4)是商购的盐酸法舒地尔水合物注射剂“Eril Injection 30mg”(Asahi Kasei Corporation生产)。
3)细胞培养以与实验例1相同的方式分离兔三叉神经细胞。对于细胞培养，使用通过向神经基培养基(GIBCO生产)添加B27添加物(GIBCO生产；终浓度2％v/v)和L-谷氨酰胺(GIBCO生产；浓度1mM)而获得的培养基。将圆的盖玻片(直径12mm；SUMITOMO BAKELITE生产)在聚赖氨酸/层粘连蛋白包被之后置于24孔板的每个孔中，并将细胞以约3×103细胞/孔接种到载玻片上。在细胞粘附于盖玻片后(约2小时)，将上述的培养基转变为包含每种测试物质的培养基(化合物1，终浓度10μM；化合物2，终浓度10μM；化合物3，终浓度1μM；化合物4，终浓度10μM)，并将所述细胞培养48小时。培养条件是5％CO2，95％空气，湿度100％，37℃。
4)免疫染色培养48小时后，将所述细胞用4％的多聚甲醛于室温固定2小时。
使用抗-神经丝200抗体(Sigma生产)和与其具有反应性的荧光二抗(Molecular Probes生产)对固定的标本进行荧光染色，所述抗神经丝200抗体特异性地识别作为特异于神经细胞的中间体丝的神经丝。将染色的图像输入到计算机中，一幅图像1.83mm×1.36mm。计算每幅图像的整个细胞数量(t)。据此，使用图像分析软件(MacSCOPE，MITANI CO.生产)测量细胞轴突的长度和细胞体的直径，并将轴突的长度不少于细胞体直径两倍的细胞作为神经突发生细胞(a)。然后计算总神经突发生细胞数(a1+a2+...+an＝∑a)与总细胞数(∑t)的比率(％)。
5)数据处理通过Dunnet’s多重检验，比较非添加组(对照)和测试物质添加组的神经突发生细胞的比率，并将少于5％的临界比率作为显著。
6)测试结果图3显示培养的兔三叉神经细胞的荧光显微图像。
图3A显示在未添加测试物质的培养基中培养48小时的细胞，图3B显示在添加化合物1的培养基中培养48小时的细胞，图3C显示在添加化合物2的培养基中培养48小时的细胞，图3D显示在添加化合物3的培养基中培养48小时的细胞，并且图3E显示在添加化合物4的培养基中培养48小时的细胞。
图4显示相对于总细胞数，非-添加组和相关测试物质添加组中的神经突发生细胞的数量的比率。对于非添加组，神经突发生细胞对总细胞的比率约为31％，对于化合物1添加组，神经突发生细胞对总细胞的比率约为41％，对于化合物2添加组，神经突发生细胞对总细胞的比率约为57％，对于化合物3添加组，神经突发生细胞对总细胞的比率约为51％，对于化合物4添加组，神经突发生细胞对总细胞的比率约为70％，测试物质添加组显示了神经突发生细胞比率的明显的增加或增加的趋势。
从上述结果来看，已经阐明ROCK抑制剂显示对三叉神经细胞的神经突发生促进作用。
参考实施例12-氯-6，7-二甲氧基N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺的合成(WO 02/076977，实施例1)将2，4-二氯-6，7-二甲氧基喹唑啉(8.6g，64.58mmol)、5-氨基吲唑(4.8g，36.04mmol)和醋酸钾(7.351g，74.91mmol)加入四氢呋喃/纯化水(138mL/62mL)中，并将所述混合物于室温搅拌过夜。将纯水(130mL)加入所述混和物中以使晶体沉淀。用纯水洗涤沉淀的晶体并从DMF-H2O中再结晶以得到浅黄色粉末形式的目标产物2-氯-6，7-二甲氧基-N-[5-1H-吲唑基]喹唑啉-4-胺。
mp 278.7-283.8℃.
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ3.93(s，3H)，3.96(s，3H)，7.16(s，1H)，7.60(m，2H)，7.90(s，1H)，8.03(s，1H)，8.12(s，1H)，9.94(s，1H)，13.13(brs，1H).
理论值C17H15N5O2Cl·1/2H2OC，55.97，H，4.14，N，19.20.实测值C，56.05，H，4.46，N，19.22。
参考实施例2N-(1-苄基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二盐酸盐1/2水合物(WO 02/100833，
mp 150.1-152.2℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.39(m，2H)，1.94(m，2H)，2.08(t，2H，J＝10.8)，2.79(d，2H，J＝11.4)，3.19(m，1H)，3.47(s，3H)，5.11(d，1H，J＝7.8)，6.68(br s，1H)，6.83(dd，1H，J＝8.9，1.7)，7.20-7.37(m，6H)，12.58(br s，1H)。
理论值C19H22N4C，74.48，H，7.24，N，18.29.实测值C，74.42，H，7.27，N，18.37
于室温向获得的N-(1-苄基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺(6.0g，19.58mmol)的四氢呋喃(60mL)溶液中加入1N-盐酸/乙醚溶液(38mL)和4N-盐酸/乙酸乙酯溶液(13mL)，并将所述混合物于室温搅拌30分钟。通过对沉淀的固体进行过滤和从甲醇中再结晶来得到N-(1-苄基-4-哌啶基)-1H-吲唑-5-胺二盐酸盐1/2水合物(4.32g，56％)。
mp 193.0-194.6℃.
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ2.18(m，1.75H)，2.51(m，0.25H)，2.98(m，1.5H)，3.17(m，0.5H)，3.41(m，2H)，3.68(m，0.75H)，3.90(m，0.25H)，4.25(m，1.5H)，4.46(m，0.5H)，7.40-7.64(m，6H)，7.59(m，1H)，7.70(m，1H)，7.92(m，1H)，8.20(s，1H)，11.02(br s，0.75H)，11.53(br s，0.25H)。
理论值C19H22N42HCl 1/2H2OC，58.76，H，6.49，N，14.43.实测值C，58.49，H，6.48，N，14.45。
参考实施例34-[2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)丙烯酰]肉桂酸的合成(JP2000-44513A，
步骤2向4-甲酰苯甲酸(20g，0.133mol)的吡啶(138ml)溶液中加入丙二酸乙酯一钾盐(46g，0.270mol)、对-甲苯磺酸一水合物(50g，0.263mol)和哌啶(2.0mL)，并将所述混合物逐渐加热。将所述混合物于120℃搅拌1.5小时。在冰冷却下，将反应混合物用2N盐酸进行酸化，并收集沉淀物以得到晶体形式的4-羧基肉桂酸乙酯(26.58g，91％)。
步骤3
在氮气氛下，向4-羧基肉桂酸乙酯(5.0g，22.7mmol)的三氯甲烷(15mL)溶液中逐滴加入亚硫酰二氯(8.4mL)，加入二甲基甲酰胺(1滴)并将所述混合物在回流下加热30分钟。将反应混合物在减压下浓缩以得到酰基氯。
在氮气氛下，向在步骤1中获得的(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酸叔-丁酯(6.35g，23.5mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中逐滴加入1M二(三甲基甲硅烷基)酰胺锂的甲苯(26mL)溶液，同时用干冰冷却。5分钟后，逐滴加入步骤2中获得的酰基氯的四氢呋喃(100mL)溶液。在逐滴加入完成后的20分钟，将所述混合物于室温搅拌1.5小时。将5％的柠檬酸水溶液(120mL)加入反应混合物中，并将所述混合物用乙醚抽提。用水和饱和的盐水洗涤有机层，在无水硫酸镁上干燥并在减压下进行浓缩。用硅胶柱层析对获得的残余物进行纯化以得到晶体形式的4-[(2RS)-2-(叔-丁氧基羰基)-2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酰基]肉桂酸乙酯(4.83g，44％)。
步骤4将在二噁烷(24ml)中的于步骤3中获得的4-[(2RS)-2-(叔-丁氧基羰基)-2-(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酰基]肉桂酸乙酯(5.6g，11.6mmol)溶液置于抗压试管中，并加入浓缩的盐酸(24ml)。将所述反应混合物搅拌4小时，并同时加热到130℃。用冰冷却所述反应混合物并将所述沉淀物通过过滤收集以得到晶体形式的4-[(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酰基]肉桂酸(3.7g，90％)。将4-[(2，3，4，5，6-五氟苯基)乙酰基]肉桂酸(2.03g，5.7mmol)的二噁烷(115mL)溶液置于抗压试管中，加入低聚甲醛(0.7g)、二甲基胺盐酸(1.86g，22.8mmol)、乙酸(10滴)和无水硫酸镁(8g)，并将所述混合物搅拌过夜，同时加热到130℃。在冰冷却下，将反应混合物用0.1N的盐酸酸化并用乙酸乙酯抽提。用饱和的盐水洗涤有机层，在无水硫酸镁上干燥并在减压下进行浓缩。通过过滤收集沉淀物以得到晶体形式的标题化合物(1.46g，93％)。
mp 214.0-217.0℃.
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ6.25(s，1H)，6.30(s，1H)，6.46(d，1H，J＝16.2)，7.57(d，2H，J＝8.4)，7.64(d，1H，J＝15.9)，7.78(d，2H，J＝8.4)
参考实施例3ROCK I、ROCK II在兔三叉神经神经节和角膜组织中的蛋白质表达1)所用的动物使用购自KITAYAMA LABES Co.，Ltd.的雄性日本白兔。
2)组织可溶性蛋白的制备对所述动物进行无痛致死并移去三叉神经神经节和角膜。将移去的组织置于冰冷的磷酸缓冲盐(Invitrogen生产)溶液中，在包含0.1％TritonX-100(Pharmacia Biotech生产)和1片剂/10ml的蛋白酶抑制剂混合物(complete，Mini；Roche生产)的冰冷的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中洗涤和放置并用超声波破碎。将通过超声波破碎获得的每种组织的细胞粗裂解溶液进行离心(10,000g，15min，4°)，并回收上清液以得到组织可溶性蛋白溶液。用BCA Protein Assay Reagent(PIERCE生产)对蛋白的量进行定量。
3)使用蛋白质印迹法检测ROCKI和ROCKII通过蛋白质印迹法检测制备的组织可溶性蛋白中包含的ROCK I和ROCK II。制备的溶液中包含25μg的使用8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(TEFCO生产)电泳分离的蛋白，并将在凝胶中分离的蛋白电转移到PVDF膜上(Immobilon-P；Millipore)。用5％的去脂牛奶封闭具有转移蛋白质的膜，使其与山羊抗ROCK I抗体或山羊抗OCK II抗体(二者都是SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY生产)反应，并用与抗-山羊IgG抗体偶联的碱性磷酸酶(AP)(Bio-Rad，Richmond，CA生产)再次标记。使用AP染色试剂盒(Bio-Rad，Richmond，CA生产)对所述抗原进行免疫检测。
4)测试结果蛋白质印迹的结果显示于图5中。其证实了ROCK I和ROCK II都在兔三叉神经神经节和角膜组织的可溶性蛋白中以蛋白质水平进行了表达。
实施例1片剂C3酶10mg乳糖80mg淀粉17mg硬脂酸镁3mg
微晶纤维素10mg使用以上组分作为一种片剂的材料，按照常规方法形成片剂。根据需要可以用常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)，或糖包衣或薄膜(例如乙基纤维素)包被片剂。可以将主要药剂，C3酶转变为化合物1、2、3或4。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含20mg、5mg、1mg、0.5mg或0.1mg/片剂的主要药剂的片剂。
实施例2胶囊C3酶50mg甘露糖醇75mg淀粉17mg硬脂酸钙3mg使用以上组分作为一种胶囊的材料，将它们均匀混合，按照常规方法成粒，并包装在硬胶囊中。在包装前，根据需要用常规的肠溶包衣(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)，或糖包衣或薄膜(例如乙基纤维素)包被颗粒。可以将主要药剂，C3酶转变为化合物1、2、3或4。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含20mg、10mg、5mg、1mg、0.5mg或0.1mg/胶囊的主要药剂的胶囊。
实施例3注射剂C3酶750mg羧甲基纤维素钠 500mg注射用水总量100mL按照常规方法将以上组分无菌混合以提供注射剂。可以将主要药剂，C3酶转变为化合物1、2、3或4。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含1000mg、500mg、200mg、或100mg/100mL的主要药剂的注射剂。
实施例4滴眼剂C3酶5mg硼酸700mg硼砂适量(pH7.0)氯化钠 500mg羟甲基纤维素0.5g
乙二胺四乙酸钠0.05mg苯扎氯铵 0.005mg无菌纯化水总量100mL将无菌纯化水(80mL)加热至约80℃，加入羟甲基纤维素，搅拌混合物直至液体温度达到室温。将C3酶、氯化钠、硼酸、乙二胺四乙酸钠和苯扎氯铵加入该溶液使其溶解。加入适量硼砂调节pH至7。加入无菌纯化水以达到100mL。可以将主要药剂，C3酶转变为化合物1、2、3或4。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含1w/v％、0.5w/v％、0.3w/v％，0.1w/v％、0.05w/v％、0.03w/v％、0.01w/v％、0.003w/v％和0.001w/v％的主要药剂的滴眼剂。
实施例5滴眼剂C3酶10mgD-甘露糖醇 4.5g磷酸二氢钠 0.1g氢氧化钠适量(pH7.0)无菌纯化水 总量100mL将C3酶、D-甘露糖醇和磷酸二氢钠加入无菌纯化水(80mL)使其溶解。加入适量氢氧化钠来调节pH至5.0。加入无菌纯化水以达到100mL。用膜滤器将制备的滴眼剂无菌过滤并装入一次性(单位剂量)容器和密封。可以将主要药剂，C3酶转变为化合物1、2、3或4。通过改变添加剂的混合比率，可以制备包含1w/v％、0.5w/v％、0.3w/v％、0.1w/v％、0.05w/v％、0.03w/v％、0.005w/v％、0.003w/v％和0.001w/v％的主要药剂的滴眼剂。
工业适用性由于含有Rho蛋白抑制剂的本发明的药剂对三叉神经细胞具有促神经突发生作用，因此对于改善与角膜神经损伤等有关的角膜敏感性的功能降低和与角膜敏感性功能降低有关的干眼症状，其是有效的。具体地，期望Rho蛋白抑制剂的应用提供对如下的改善效果白内障外科手术或LASIK外科手术后角膜敏感性降低，与角膜神经变性诸如神经性麻痹角膜病变、角膜溃疡、糖尿病性角膜病变等有关的角膜敏感性降低和干眼。
尽管以上已经详细描述了本发明的一些实施方案，然而，对于本领域的普通技术人员显而易见的是可以在实质上不背离本发明新的教导和优势的情形下对所示特定实施方案进行各种改进和变化。因此，这些改进和变化包含在后附权利要求中阐明的本发明的精神和范围内。
本申请是基于在日本提交的专利申请号114819/2003和273177/2003，其内容特此结合作为参考。
权利要求
1.一种角膜神经突发生促进剂，其包括Rho蛋白抑制剂。
2.一种角膜神经轴突延伸促进剂，其包括Rho蛋白抑制剂。
3.一种角膜敏感性恢复剂，其包括Rho蛋白抑制剂。
4.一种干眼治疗剂，其包括Rho蛋白抑制剂。
5.一种促进角膜神经突发生的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂。
6.一种促进角膜神经轴突延伸的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂。
7.一种恢复角膜敏感性的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂。
8.一种治疗干眼的药物组合物，其包括Rho蛋白抑制剂。
9.Rho蛋白抑制剂用于制备促进角膜神经突发生的药物组合物的应用。
10.Rho蛋白抑制剂用于制备促进角膜神经轴突延伸的药物组合物的应用。
11.Rho蛋白抑制剂用于制备恢复角膜敏感性的药物组合物的应用。
12.Rho蛋白抑制剂用于制备治疗干眼的药物组合物的应用。
13.一种促经角膜神经突发生的方法，其包括向需要促进角膜神经突发生的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂。
14.一种促进角膜神经轴突延伸的方法，其包括向需要促进角膜神经轴突的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂。
15.一种恢复角膜敏感性的方法，其包括向需要恢复角膜敏感性的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂。
16.一种治疗干眼的方法，其包括向患有干眼的受试者施用有效量的Rho蛋白抑制剂。
全文摘要
本发明提供一种在角膜外科手术后恢复角膜敏感性和改善干眼症状的新的药剂。由于所述药剂包含Rho蛋白抑制剂，对于改善与角膜神经变性诸如白内障手术后、LASIK手术后、PRK手术后、和角膜成形术后、神经麻痹性角膜病变、角膜溃疡、糖尿病性角膜病变等关联的角膜敏感性降低以及干眼，其是有效的。
文档编号A61K31/517GK1777445SQ20048001047
公开日2006年5月24日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月18日
发明者高山美子, 中村义邦, 井上淳, 东光佳 申请人:千寿制药株式会社