促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志的制作方法

文档序号:1093959阅读:463来源:国知局
专利名称:促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志的制作方法
技术领域
本发明一般涉及组织样品的体外分析检测,尤其涉及关于生长调节的基因表达谱方面。
背景技术
促生长素抑制素(SST-14;SRIF)是包含位置3和位置14间二硫键的环状十四肽下丘脑激素。见于美国专利号6,225,284,在此引用作为参考。促生长素抑制素也以28个氨基酸的肽(SST-28)存在。在其作用机制中,促生长素抑制素抑制生长激素(GH)和促甲状腺素(TSH)的释放,从而抑制胰岛素和胰高血糖素的释放并降低胃分泌作用。氨肽酶和羧肽酶对促生长素抑制素的代谢作用导致促生长素抑制素的作用持续时间短。促生长素抑制素以对每种亚型相对较高的亲和力与五种不同高亲和力的膜相关受体(SSTR)亚型结合。生长激素和促甲状腺激素分泌由促生长素抑制素受体亚型SSTR2和SSTR5调节,通过SSTR1对生长激素分泌有额外的影响。促生长素抑制素受体类型SSTR2和SSTR5的活化与生长激素抑制相关并且更特别地与生长激素分泌腺瘤(肢端肥大症)和促甲状腺激素分泌腺瘤相关。催乳素只由SSTR5调节。
临床上有用的促生长素抑制素类似物善得定(Sandostatin)和生长妥林用于肢端肥大症患者的治疗,对他们来说外科手术不能充分控制生长和胰岛素样生长因子I(IGF-I)水平或者外科手术受禁忌的。两种类似物都表现对促生长素抑制素受体亚型2(SSTR2)的选择性高亲和力。Sandostatin主要与SSTR2结合并在某种程度上与SSTR3和SSTR5结合。
开发帕瑞肽(Pasireotide)用于认可的Sandostatin适应症,但是可作为在体内具有较长血浆半衰期的更有效的促生长素抑制素类似物。Lewis I等人,J Med,46(12)(2003年6月5日);Weckbecker G等人,Endocrinology,143(10)4123-30(2002年10月)。与其他类似物不同,帕瑞肽与除SSTR4外的所有促生长素抑制素受体结合。对不同促生长素抑制素受体的亲和力是限定帕瑞肽可能的新临床适应症范围的基础。Bruns C等人,Eur J Endocrinol,143(Suppl 1)S3-7(2000);Bruns C等人,Eur JEndocrinol,146(5)707-16(2002年5月)。此外,由于帕瑞肽对生长激素和IGF-1调节具有提高的活性并对胰岛素和胰高血糖素分泌具有不同的抑制作用,这提示其可用于其他可能的新适应症。
具有普遍高亲和力促生长素抑制素结合的促生长素抑制素类似物(如帕瑞肽)不仅对生长激素抑制具有更大的功效,还调节其他脑垂体前叶激素的分泌。Murray RD等人,Endocrine Abstracts 5P186(2003)。帕瑞肽的明确特征(甚至亚治疗剂量的帕瑞肽的明确特征)可用来鉴定与已知的帕瑞肽类化合物药理学作用一致的促生长素抑制素激动剂活性。这种明确特征可用于比较用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗的不同组织中的活性。
因此,本领域需要在生物体范围内了解促生长素抑制素类似物活性。
本发明提供了促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物功效的生物学标记。对生长激素/IGF-1和胰高血糖素/胰岛素轴的影响反映在几种器官中转录水平改变上。表达的基因用作帕瑞肽生物学活性的替代标志,特别是在垂体和肾脏中发现IGF-2。生物标志特征可用于比较用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗的生物体不同组织中的治疗功效。
本发明提供了基于分析待治疗受试者中表达的生物标志而确定受试者入选临床试验的方法。向受试者施用待检测的化合物。在一个实施方案中,待检测化合物以亚治疗剂量施用。例如,帕瑞肽的明确特征(甚至亚治疗剂量的帕瑞肽的明确特征)可用于鉴定与已知的帕瑞肽类化合物药理学作用一致的促生长素抑制素激动剂的活性。这个特征可用于比较用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗的不同组织中的活性。然后获得施用化合物后受试者的基因表达谱。当施用化合物的受试者的基因表达谱与指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志基因表达谱相似时,受试者可被入选临床试验。当受试者的基因表达谱与指示治疗功效的生物标志基因表达谱不同时,则将受试者排除于临床试验之外。本领域的技术人员可观察到此类相似性和不同性。
本发明也提供了帕瑞肽在制造治疗所选患者群体中生长调节紊乱的药物中的用途。对患者群体的选择基于施用帕瑞肽的患者中指示帕瑞肽功效的基因表达谱。
本发明也提供了确定化合物是否具有与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物(如帕瑞肽)治疗功效相似的治疗功效的方法。向受试者施用化合物,然后获得作为施用化合物结果的受试者基因表达谱。将得到的受试者的基因表达谱与指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的标准生物标志基因表达谱比较。当受试者的基因表达谱与标准生物标志基因表达谱相似时,则确定化合物具有与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效相似的治疗功效,但是当受试者的基因表达谱与生物标志基因表达谱不同时,则确定化合物具有与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效不同的治疗功效。
本发明也提供了确定需要施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的疾病的治疗功效的临床测定法、试剂盒和试剂。在一个实施方案中,试剂盒含有通过杂交确定生物标志基因表达的试剂。在另一个实施方案中,试剂盒含有通过聚合酶链式反应确定生物标志基因表达的试剂。
发明详述本发明提供了通过多器官微芯片分析对促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物(例如在食蟹猴中)作用方式和潜在治疗适应症的鉴定。本发明提供了判断在何种程度上多组织转录谱可用于比较帕瑞肽与促生长素抑制素Sandostatin或其他促生长素抑制素类似物的药理学谱。
如本文所使用,当增加的或减少的基因表达为施用化合物之后对基线基因表达的增加或减少(例如至少1.5倍的差异)时,基因表达谱可用于确定治疗功效。备选地或者此外,当治疗受试者的基因表达谱可与标准生物标志基因表达谱比较时,基因表达谱可用于确定与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物(例如帕瑞肽)治疗相比较的治疗功效。在一个实施方案中,标准生物标志基因表达谱为已施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的脊椎动物的基因表达谱或平均基因表达谱,该基因表达谱或平均基因表达谱是来自施用后受试者的基因表达谱结果所比较的标准。本领域的许多技术人员称含有治疗学和诊断学方面的此种方法为“诊疗(theranostic)”。
在一个实施方案中,受试者为脊椎动物。在特别的实施方案中,脊椎动物为哺乳动物。在更特别的实施方案中,哺乳动物为灵长类动物,如食蟹猴或人。如本文所使用,向受试者或患者施用制剂或药物包括自我施用和通过他人施用。
如本文所使用,当基因表达(例如治疗受试者的样品中)与基线样品相比在表达水平上显示具有1.5倍的差异(例如高于基线表达)时,基因表达模式为“高于正常”。当基因表达(例如治疗受试者的样品中)与基线样品相比在表达水平上显示具有1.5倍的差异(例如低于基线表达)时,基因表达模式为“低于正常”。
检测本发明所述基因的基因表达的技术包括但不限于Northern印迹、RT-PCT、实时PCR、引物延伸、RNA酶保护、RNA表达谱分析和相关技术。通过检测本发明所述基因编码的蛋白质产物来检测基因表达的技术包括但不限于识别蛋白质产物的抗体、Western印迹、免疫荧光、免疫沉淀、ELISA和相关技术。这些技术为本领域的技术人员所熟知。SambrookJ等人,Molecular CloningA Laboratory Manual,第三版(Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,2000)。在一个实施方案中,检测基因表达的技术包括基因芯片的使用。基因芯片的构建和使用为本领域所熟知。见美国专利号5,202,231、5,445,934、5,525,464、5,695,940、5,744,305、5,795,716和5,800,992。也见于Johnston,M.Curr biol,8R171-174(1998);Iyer VR等人Science,28383-87(1999)和Elias P,“New human genome‘gene chip’is a revolution in the offing”Los Angeles Daily News(2003年10月3日)。
促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物促生长素抑制素-14和促生长素抑制素-28的肽和治疗用途为本领域所熟知。见美国专利号6,225,284;Lewis I等人,J.Med.Chem.,46(12)2334-44(2003年6月5日);Weckbecker G等人,Endocrinology,143(10)4123-30(2002年10月),每一个在此引用作为参考。如体外和体内检测所示,游离形式或可药用盐和复合体形式的促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物表现有价值的药理学性质,因此其表明可用于治疗。
如本文所用的“促生长素抑制素类似物”是指来自天然存在的促生长素抑制素-14的直链或环状肽,其中一个或多个氨基酸单位被缺失或者由一个或多个其他氨基酸替代,或者其中一个或多个官能团由一个或多个其他官能团替代和/或一个或多个基团由一个或数个其他同配基团替代。见美国专利号6,225,284,在此引用作为参考。环状的、桥环的和直链的促生长素抑制素类似物为已知的化合物。此类化合物及其制备在例如欧洲专利说明书EP-A-1295;29,579;215,171;203,031;214,872;298,732;277,419中描述。一般地,术语“促生长素抑制素类似物”涵盖了所有经修饰的天然促生长素抑制素-14的衍生物,其在nM范围内与至少一种促生长素抑制素受体亚型具有亲和力。
一种目的促生长素抑制素类似物为帕瑞肽,其具有如下的化学结构,环[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe] 在此处,Phg指-HN-CH(C6H5)-CO-,Bzl指苄基。见PCT专利申请WO 02/10192。帕瑞肽为与除促生长素抑制素受体4(SSTR4)外的五种促生长素抑制素受体具有亲和力的促生长素抑制素类似物。已经开发出帕瑞肽用于数种适应症,这包括上面公开的对于其他促生长素抑制素类似物的那些适应症。见Lewis I等人,J.Med.Chem.,46(12)2334-44(2003年6月5日);Weckbecker G等人,Endocrinology,143(10)4123-4130(2002);Kneissel M等人,Bone,28237-250(2001)以及Thomsen JS等人,Bone25561-569(1999),其内容在此引用作为参考。
促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物与促生长素抑制素受体(SSTR)结合。目前如下理解促生长素抑制素受体活化的细胞效应与促生长素抑制素结合造成PI3激酶信号传导途径的激活,抑制腺苷酸环化酶、激活蛋白质酪氨酸磷酸酶,调节促分裂原活化蛋白激酶(MAPK),与内向整流K+通道、依赖电压的Ca++通道、Na+/H+交换体、AMPA/红藻氨酸谷氨酸通道、PLC和PLA2偶联。Patel YC,Frontiers inNeuroendocrinology,20157-98(1999)。促生长素抑制素受体活化通过抑制胞内cAMP和Ca++以及通过对胞吐作用的受体连接远端影响来阻断细胞分泌。促生长素抑制素受体1、2、4和5(SSTR1,2,4,5)通过磷酸酪氨酸磷酸酶依赖的MAPK(与成视网膜细胞瘤(Rb)肿瘤抑制蛋白和p21相关)的调节诱导细胞周期停滞。SSTR3引起磷酸酪氨酸磷酸酶依赖的细胞凋亡,同时伴随着p53和Bax的活化。
下面实施例中提供了用促生长素抑制素,尤其是用促生长素抑制素类似物帕瑞肽治疗灵长类动物的其他作用。
促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物与至少一种促生长素抑制素受体亚型结合。已经克隆并描述了五种促生长素抑制素受体亚型SST-1、SST-2、SST-3、SST-4和SST-5。Yamada Y等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,89251-255(1992)公开了人促生长素抑制素受体hSST-1、hSST-2和hSST-3及其序列。Rohrer L等人Proc.Acad.Sci.U.S.A.,904196-4200(1993)公开了人促生长素抑制素受体hSST-4及其序列。Panetta R等人,Mol.Pharmacol.,45417-427(1993)公开了人促生长素抑制素受体hSST-5及其序列。
使用从hSST-1、hSST-2、hSST-3、hSST-4或hSST-5选择性细胞系(例如稳定表达hSST-1、hSST-2、hSST-3、hSST-4或hSST-5的CHO细胞系)制备的膜可进行结合测定分析。见美国专利号6,225,284。在针对hSST-1、hSST-2、hSST-3、hSST-4和/或hSST-5的上述测定分析中,促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物具有nM范围的IC50。
此外,如通过在体外抑制GH从培养的垂体细胞释放所示,促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物表现出抑制生长激素释放的活性。见美国专利号6,225,284。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物以浓度依赖性(10-11至10-6M)抑制生长激素释放。
如用雄性大鼠的标准检测所示,促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物也抑制胰岛素/胰高血糖素的释放。见美国专利号6,225,284。血清胰岛素和胰高血糖素水平的确定通过放射免疫测定法实现。在该检测中,当以0.02-1000μg/kg例如10μg/kg的剂量皮下使用时,促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物是有活性的。
然而如上所述,促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的施用可有效地提供生物标志信息,甚至以亚治疗剂量施用亦如此。
促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物可用于治疗具有包含过度生长分泌或与过度生长分泌相关病因学的紊乱,例如用于治疗肢端肥大症以及糖尿病、尤其是其并发症(例如血管病变、增生性视网膜病、黎明现象和肾病和其他与胰岛素或胰高血糖素释放相关的代谢紊乱)。见美国专利号6,225,284。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物也抑制胃酸分泌、外分泌和内分泌性胰脏分泌和胃肠道多种肽的分泌。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物还用于治疗胃肠紊乱,例如治疗消化性溃疡、肠瘘和胰瘘、肠易激惹综合征和疾病、倾倒综合征、水样腹泻综合征、AIDS相关的腹泻、化学疗法诱导的腹泻、急性或慢性胰腺炎和胃肠激素分泌型肿瘤(例如血管活性肠多肽肿瘤、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、类癌等)以及胃肠出血。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物也对治疗促生长素抑制素受体阳性的肿瘤有效,尤其对带有人促生长素抑制素受体hSST-1、hSST-2、hSST-3、hSST-4和/或hSST-5的肿瘤有效。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物可用于治疗包含过度生长激素分泌或与过度生长激素分泌相关的病因学、治疗胃肠紊乱、抑制表皮细胞的增殖和角质化或者治疗需要此种治疗的受试者的退化性老年痴呆。见美国专利号6,123,916,在此引用作为参考。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物也可用于治疗结核病、肉样瘤病、恶性淋巴瘤、皮肤Merkel细胞瘤、成骨肉瘤、病灶淋巴细胞反应、局限性自身免疫病和移植后的器官排斥。见美国专利号6,123,916。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物尤其指明用于治疗促生长素抑制素受体阳性肿瘤,例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、肺癌和淋巴结癌。
为重复说明,已经开发了促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物并用于治疗数种适应症,其包括肢端肥大症、糖尿病和并发症(例如血管病变、糖尿病增生性视网膜病、糖尿病黄斑水肿、肾病、神经病变、下丘脑性肥胖或高胰岛素学症肥胖)、疾病肥胖、格雷夫斯病、多囊肾疾病、胃肠紊乱(例如肠易激惹综合征和疾病或肠瘘和胰瘘)、倾倒综合征、水样腹泻综合征、AIDS相关的腹泻、化学疗法诱导的腹泻、胰腺炎、胃肠激素分泌肿瘤(例如GEP肿瘤如血管活性肠多肽肿瘤、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、类癌等等)、促生长素抑制素受体阳性肿瘤(例如垂体癌、胃肠胰癌、类癌、中枢神经系统癌症、乳腺癌、前列腺癌(包括晚期激素抵抗性前列腺癌)、卵巢癌或结肠肿瘤、小细胞肺癌、恶性肠梗阻、神经节细胞瘤、肾癌、皮肤癌、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、髓样甲状腺癌、骨髓瘤、淋巴瘤、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、骨肿瘤和转移瘤、慢性异源移植排斥和其他血管闭塞紊乱(例如静脉移植狭窄、血管损伤后的再狭窄和/或血管闭塞,例如烧灼过程或血管刮除过程(例如经皮血管成形术、激光治疗或其他破坏血管内膜或内皮完整性的侵入过程)引起的)、血管发生、肝细胞癌以及胃肠出血(例如静脉曲张食管出血)、黄斑水肿(例如囊状黄斑水肿、先天性囊状黄斑水肿、渗出性年龄相关黄斑变性、脉络膜新血管形成相关紊乱)和增生性视网膜病。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物用于治疗库欣病即垂体肿瘤的一种亚型。促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物也用于治疗睡眠呼吸暂停。
游离形式或复合形式的促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物可通过任何常规途径施用,尤其是腹膜内或静脉内施用,例如以可注射的溶液或混悬液形式施用。它们也可方便地通过输注施用,例如30-60分钟的输注。取决于肿瘤的位置,它们可尽可能靠近肿瘤位置施用,例如通过导管方法施用。可以常规方式制造包含游离形式或与一种或多种可药用赋形剂或稀释剂复合形式的促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的药物组合物,并且可以试剂盒形式提供(例如为了成像)。见美国专利号6,225,284。
促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物可与其他药物联合施用,如Starlix或其他抗糖尿病药物或化疗剂,例如泰素、吉西他滨、阿霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、抗雄激素、米托蒽醌(mitoxanthrone),例如来曲唑、抗代谢药、植物碱、淋巴素、干扰素、蛋白质酪氨酸激酶和/或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、埃坡霉素(epothilone)或者抗血管生成剂。
本发明的试剂盒可在试剂盒容器上或容器中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒所含试剂确定需要促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗的患者是否需要用化合物治疗。在几个实施方案中,可根据本发明的方法使用试剂。在一个实施方案中,试剂为确定相关基因表达的基因芯片。
提供下列实施例以更全面地描述本发明优选的实施方案。这个实施例绝不解释为限制如后附权利要求限定的本发明的范围。
实施例帕瑞肽诱导的猴子中的基因表达谱前言和概要使用以亚治疗剂量的帕瑞肽治疗14天的猴组织进行微芯片基因表达分析。分析这些测定结果以鉴定与治疗应用相关的帕瑞肽作用模式。
所有检测的猴子组织(甲状腺、褐色脂肪、垂体、胰腺、肝脏、肾脏、脾脏)证明了天然促生长素抑制素14(SST-14)和促生长素抑制素28(SST-28)与促生长素抑制素受体(SSTR)结合所调节的基因的变化。转录谱反映了已知的促生长素抑制素对生长激素/胰岛素样生长因子1(GH/IGF-1)、胰高血糖素/胰岛素轴的作用以及对细胞增殖的作用。然而,化合物显著影响垂体和肾脏中其他相关基因如胰岛素样生长因子2(IGF-2)的转录水平。这可为药物功效的候选生物学标志(生物标志),只要是蛋白质生物合成的变化会反映在容易获得的组织如血液中即可。促生长素抑制素和激动剂对生长因子、免疫系统的细胞以及心血管和肾脏功能的其他已知作用也通过帕瑞肽施用后这些种类基因谱的变化反映出来。
组织来源和加工将雄性和雌性食蟹猴皮下施用帕瑞肽(100μg/只动物/天)或媒介物14天。在第15天处死所有动物,将用于提取RNA的组织立即速冻并存于-80℃直到处理。
表1用于分析的组织的来源
RNA表达谱分析通过HG-U95A基因表达探针芯片(Affymetrix;SantaClara,Calif.,美国)方法进行,该芯片含有多于12,600个主要查询的全长人基因的探针集合以及一些对照探针集合。根据生产商的推荐进行实验。简言之,通过酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取(Trizol,Invitrogen LifeTechnologies,San Diego,Calif.,美国)从每一冷冻组织部分中获得总RNA。然后在亲和树脂(Rneasy,Qiagen)上纯化总RNA并定量。在存在T7-(dT)24DNA寡核苷酸引物的条件下使用SuperscriptChoice系统(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,Calif.美国)用起始数量大约5μg的总RNA合成双链cDNA。合成之后,通过酚/氯仿/异戊醇提取和乙醇沉淀纯化cDNA。然后在存在生物素化核糖核苷酸的条件下用BioArray高产量RNA转录标记试剂盒(ENZO,Farmingdale,New York,美国)将纯化的cDNA体外转录形式生物素标记的cRNA。在亲和树脂(Rneasy,Qiagen)上纯化标记的cRNA、定量并片段化。大约10μg量的标记cRNA在45℃与表达探针芯片杂交16小时。然后用GeneChipFluidicsWorkstation 400(Affymetrix,Santa Clara,Calif.美国)洗涤芯片并用链霉抗生物素-藻红蛋白(Molecular Probes)染色两次。然后用共聚焦激光扫描器(GeneArrayScanner,Agilent,Palo Alto,Calif.美国)扫描芯片两次得到一个扫描图像。用MAS4程序(Affymetrix)将得到的结果“.dat-file”处理成“.cel-file”。捕获“.cel-file”并载入Affymetrix GeneChip实验室信息管理系统(LIMS)中。LIMS数据库通过允许将所有探针小室平均强度(CELfile)载入Oracle数据库(NPGN)的网络提交系统与UNIX Sun Solaris服务器连接。用150的“靶强度”将原始数据转换成表达水平。评价数据的质量并载入GeneSpring软件4.2.4(Silicon Genetics,Calif.美国)用于分析。
在人Affymetrix HGU95Av2芯片上,单个基因的探针集合含有20个寡核苷酸对,每一个由“完全匹配”的25mer和在单一碱基处与“完全”匹配的寡核苷酸不同的“不匹配”的25mer组成。在探针标记、杂交和激光扫描之后,通过将由特定探针的寡核苷酸对所测量的信号强度差异进行平均(AvgDiff值)来评价表达水平。从对照和处理之间AvgDiff值的差异计算所选基因的倍数变化和变化方向。
为鉴定受帕瑞肽影响的基因,首先过滤数据集合以在第一波分析中排除那些系统原因处于较低表达范围的数值,在这种情况下,实验噪音很高(在许多次实验中至少80个对应着最小数量的任何实验点重复)。在第二轮选择中,p-值为0.05的阈值(基于t-检验)鉴定出处理和对照之间的差异,这基于两组分误差模型(整体误差模型)以及(可能的)对多假设检验的逐渐减小校正(Benjamini及Hochberg的假发现率)。保留或拒绝特定基因的结论是基于比较和统计算法鉴定的数值差异以及与指向共同生物学主题的其他受调节基因的相互关系两者的联合。分析者通过回顾相关科学文献评价关系的意义。
对于本文所述的测定分析(1)除非特殊说明,表达的增加或降低指RNA表达水平,(2)如果有代表同一基因的多个探针集合,优选设计成针对正义靶标的探针集合,(3)基因表达的变化表明,单个基因代表的途径、细胞活性或成分可能受到影响。理解功能性含意依赖于关于转录水平变化生物学背景(基因功能、生理变异、其他基因变化、组织、化合物等)的信息可得性。使用RT-PCR鉴定mRNA水平绝对变化的程度,但是该方法通常不能为转录水平变化相关性提供更多的信息。
在每个芯片的12,600个基因中,发现大约100个基因反映了特定组织中的化合物的特征标志。为清楚起见,将它们在下表中分成不同种类并再细分成(许多是重叠的)功能类别。
表2帕瑞肽基因表达谱
表3帕瑞肽基因表达谱(续表)
这些结果表明多个信号传导途径受到影响。它们包括磷脂酰肌醇/PKC/磷脂酶/钙-钙依赖磷酸酶-钙调蛋白途径、Ras/MAPK激酶/ERK激酶依赖性途径、JAK/STAT途径和具有其依赖途径的腺苷酸/鸟苷酸环化酶。细胞表面受体的变化包括许多G蛋白偶联受体、生长因子受体和谷氨酸受体。ATP依赖性转运蛋白的变化涉及离子通道和相关蛋白质。该化合物还影响神经介质/神经调质、胰腺和胃肠分泌、激素、细胞骨架蛋白质和酶/催化剂。
反映垂体中多个SSTR信号传导途径的基因的实例示于表4中。通过依次过滤和统计算法(t检验p值0.05)产生了从主要基因列表中所选则的基因。数值对应着对于每一实验的相关探针集合的AvgDiff(见上),所观察到的数值范围置于括弧内。此分析的特殊目的是已知与天然肽(SST-14和SST-28)同SSTR的结合紧密相关的分子的转录水平变化。
表4反映垂体中多个SSTR信号传导途径的基因的实例
对GH/IGF-1和胰高血糖素/胰岛素轴的影响(Macaulay VM,Br.J.Cancer,65311-20(1992);Pollak MN和Schally AV,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,217143-52(1998))反映在多个器官中的转录水平变化上。结果示于表5。除了预期的IGF-1转录水平的变化以外,还影响IGF-2(在垂体和肾脏中),如果反映于血液中,则其可能用作帕瑞肽活性的生物学标志。如上文表4中选择基因。
表5在不同组织中反映帕瑞肽对GH/IGF和胰高血糖素/胰岛素轴影响的基因的实例
其他受帕瑞肽影响的目的基因变化是参与肿瘤生长和扩散的生长因子(PDGF、FGF、EGF、TGFβ)、这些生长因子的受体和血管发生因子(PDGF、VEGF、血小板反应蛋白)(Woltering EA等人,New Drugs 1577-86(1997))的转录水平。对于促生长素抑制素和类似物,还报道了参与免疫的基因的变化,即细胞因子(IL-1、TNF、IFN)、T细胞和B细胞发生和功能的调节物(CD2抗原、IL-2受体、B淋巴酪氨酸激酶、IL-2可诱导的T细胞激酶、p56lck、RAG1、TCRζ链前体、RAG2、FLT 3配体)(van Hagen PM等人,Eur.J.Clin.Invest.,2491-9(1994))以及参与血压控制和利尿的基因,即心房肽及其受体鸟苷酸环化酶A、精氨酸加压素及其受体(Aguilera G等人,Nature,292262-3(1981);Aguilera G等人,Endocrinology,1111376-84(1982);Ray C等人,Clin.Sci.(Lond),84455-60(1993);Cheng H等人,Biochem.J.,36433-9(2002))。参与脂肪储存的特异基因为褐色脂肪中的肾上腺素能β3受体(Bachman E等人,Science,297843-45(2002))。
上述基因的蛋白质产物用作帕瑞肽生物学活性的代用标志,尤其是在垂体和肾脏中发现IFG。
从而得出结论,对亚治疗剂量帕瑞肽治疗的猴组织进行基因谱分析是鉴定已知的对于促生长素抑制素的信号和效应途径的敏感方法。
文中引用的所有参考文献在文中整体引用作为参考,并且为了全部目的以这样一种程度引用作为参考,即如同将每个单独的公开或专利或专利申请被特别地和单独地指明为了全部目的整体引用作为参考。此外,文中引用的所有GenBank登录号、Unigene Cluster编号和蛋白质登录号在文中整体引用作为参考,并且为了全部目的以这样一种程度引用作为参考,即如同将每一个此种编号被特别地和单独地指明为了全部目的整体引用作为参考。
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权利要求
1.帕瑞肽在制造用于治疗选定患者群体中生长调节紊乱的药物中的用途,其中对患者群体的选择是基于在施用帕瑞肽的患者中的指示帕瑞肽功效的基因表达谱。
2.权利要求1的用途,其中生长调节紊乱为肿瘤。
3.权利要求1或2的用途,其中在确定患者基因表达谱之前以治疗剂量向患者施用帕瑞肽。
4.权利要求1或2的用途,其中在确定患者基因表达谱之前以亚治疗剂量向患者施用帕瑞肽。
5.治疗受试者中疾病的方法,其中疾病是需要施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的一种疾病,所述方法包括如下步骤(a)向受试者施用化合物;(b)获得受试者的基因表达谱,其中基因表达谱包含一个或多个基因的基因表达模式,其中一个或多个基因的表达模式是施用化合物的结果;(c)将已施用化合物的受试者的基因表达谱与指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志基因表达谱进行比较;其中已施用化合物的受试者的基因表达谱与生物标志基因表达谱的相似性指示着用化合物治疗的功效。
6.权利要求5的方法,其中化合物为促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物。
7.权利要求5的方法,其中化合物为帕瑞肽。
8.权利要求5-7中任何一项所述的方法,其中受试者为哺乳动物。
9.权利要求8的方法,其中哺乳动物为灵长类动物。
10.权利要求9的方法,其中灵长类动物为食蟹猴或人。
11.权利要求5-10中任何一项所述的方法,其中生物标志基因表达谱为施用化合物之前受试者的基线基因表达谱。
12.权利要求5、6或7-11中任何一项所述的方法,其中生物标志基因表达谱为已施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的脊椎动物的基因表达谱或平均基因表达谱。
13.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自下列的基因在脑垂体中表达的降低PKC抑制物;MAPKKK5;rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶,α亚基;SHB接头蛋白(Src同源性2蛋白);双特异性磷酸酶8;磷酸酶和张力蛋白同系物;可溶性腺苷酸环化酶;ATP酶,H+/K+交换,α多肽;K+通道,亚家族K,成员3(TASK);K+电压门控通道,Shab相关的亚家族,成员1;forkhead盒O3A;forkhead盒H1;细胞周期蛋白F;cdk抑制物2D(p19,抑制CDK4)及其组合。
14.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自下列的基因在脑垂体中表达的增加IP-4磷酸酶,1型,同工型b;PI-3激酶,催化性,δ多肽;PI-3激酶,催化性,α多肽;PI转移蛋白,β;PLC,γ1(以前为亚型148);Rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶β亚基;RAB 5C,RAS癌基因家族成员;PTP,受体型,T;PP 1,调节(抑制物)亚基5;SSTR3;GLUR 2,前体;ATP酶,Na+/K+转运,β3多肽;ATP酶,Na+/K+转运,α2(+)多肽;假定的Ca++转运ATP酶;核心结合因子,runt结构域,α亚基2,转位的,1;细胞周期蛋白D相关;细胞周期蛋白D3;S期应答(细胞周期蛋白相关);细胞分裂周期25B;cdk抑制物2C(p18,抑制CDK4);BCL2相关的抗死亡基因;细胞死亡拮抗物BCL2;Baxγ;BCL2/腺病毒EIB 19kD相互作用蛋白质3;程序性细胞死亡6;成神经细胞瘤扩增的蛋白质及其组合。
15.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含IGF-2基因在脑垂体中表达的降低。
16.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自胰高血糖素受体(GR)、IGFBP(酸不稳定性亚基)和SSTR3的基因在脑垂体中表达的增加。
17.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IGF-1和IGFBP 4的基因在褐色脂肪中表达的降低。
18.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IRS 2和SSTR 3的基因在褐色脂肪中表达的增加。
19.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含IGF-1基因在胰腺中表达的降低。
20.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含SSTR2基因在胰腺中表达的增加。
21.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IGF-1和IGF-2的基因在肾脏中表达的降低。
22.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IGFBP2、SSTR 3和SSTR 2的基因在胰腺中表达的增加。
23.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自胰岛素启动子因子1、同源异型域转录因子和IGF-2的基因在肝脏中表达的降低。
24.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IGFBP2和胰高血糖素受体(GR)的基因在肝脏中表达的增加。
25.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IGFBP6、IGF-1和SSTR 2的基因在脾脏中表达的降低。
26.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含选自IGFBP2和胰高血糖素受体(GR)的基因在脾脏中表达的增加。
27.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含IGF-1基因在脾脏中表达的增加。
28.权利要求5-12中任何一项所述的方法,其中基因表达谱包含IGF-2基因表达的降低。
29.选择受试者入选临床试验的方法,该临床试验用于确定化合物在治疗需要用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗的疾病中的功效,所述方法包括如下步骤(a)向受试者施用化合物;(b)获得受试者的基因表达谱,其中基因表达谱包含一个或多个基因的基因表达模式,其中一个或多个基因的基因表达模式是施用化合物的结果;(c)将已施用化合物的受试者的基因表达谱与指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志基因表达谱比较;以及(d)然后(i)当已施用化合物的受试者的基因表达谱类似于指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志基因表达谱时,该受试者被入选进入临床试验;或(ii)当已施用化合物的受试者的基因表达谱不同于指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志基因表达谱时,该受试者被排除于临床试验之外。
30.权利要求29的方法,其中以亚治疗剂量向受试者施用化合物。
31.用于确定化合物是否具有与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效类似的治疗功效的方法,其包含以下步骤(a)向受试者施用化合物;(b)获得受试者的基因表达谱,其中基因表达谱包含一个或多个基因的基因表达模式,其中一个或多个基因的基因表达模式是施用化合物的结果;(c)将已施用化合物的受试者的基因表达谱与指示促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效的生物标志基因表达谱比较;以及(d)然后(i)当已施用化合物的受试者的基因表达谱类似于已施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的受试者的生物标志基因表达谱时,则确定化合物具有与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效类似的治疗功效;或(ii)当已施用化合物的受试者的基因表达谱不同于已施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的受试者的生物标志基因表达谱时,则确定化合物具有与促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效不同的治疗功效。
32.权利要求31的方法,其中促生长素抑制素类似物为帕瑞肽。
33.权利要求31或32的方法,其中受试者为哺乳动物。
34.权利要求33的方法,其中哺乳动物为灵长类动物。
35.权利要求34的方法,其中灵长类动物为食蟹猴或人。
36.权利要求31-35中任何一项所述的方法,其中以亚治疗剂量向受试者施用化合物。
37.用于确定疾病治疗策略的试剂盒,其中疾病为需要施用促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物的疾病,所述试剂盒包含(a)检测促生长素抑制素或促生长素抑制素类似物治疗功效生物标志的试剂;(b)盛放试剂的容器;以及(c)在容器表面或内部的书面产品,其描述生物标志在确定疾病治疗策略中的用途。
38.权利要求37的试剂盒,其中试剂为基因芯片。
39.权利要求37的试剂盒,其中试剂为杂交探针。
40.权利要求37的试剂盒,其中试剂为基因扩增试剂。
41.权利要求37-40中任何一项所述的试剂盒,其中生物标志包含选自下列的一个或多个基因(a)PKC抑制物;MAPKKK5;rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶;α亚基;SHB接头蛋白(Src同源性2蛋白质);双特异性磷酸酶8;磷酸酶和张力蛋白同系物;可溶性腺苷酸环化酶;ATP酶,H+/K+交换,α多肽;K+通道,亚家族K,成员3(TASK);K+电压门控通道,Shab相关的亚家族,成员1;forkhead盒O3A;forkhead盒H1;细胞周期蛋白F和cdk抑制物2D(p19,抑制CDK4);(b)IP-4磷酸酶,1型,同工型b;PI-3激酶,催化性,δ多肽;PI-3激酶,催化性,α多肽;PI转移蛋白,β;PLC,γ1(以前为亚型148);Rab牻牛儿基牻牛儿基转移酶β亚基;RAB 5C,RAS癌基因家族成员;PTP,受体型,T;PP 1,调节(抑制物)亚基5;SSTR3;GLUR 2,前体;ATP酶,Na+/K+转运,β3多肽;ATP酶,Na+/K+转运,α2(+)多肽;假定的Ca++转运ATP酶;核心结合因子,runt结构域,α亚基2;转位的,1;细胞周期蛋白D相关;细胞周期蛋白D3;S期应答(细胞周期蛋白相关);细胞分裂周期25B;cdk抑制物2C(p18,抑制CDK4);BCL2相关的抗死亡基因;细胞死亡拮抗物BCL2;Baxγ;BCL2/腺病毒EIB 19kD相互作用蛋白质3;程序性细胞死亡6和成神经细胞瘤扩增的蛋白质;(c)IGF-2;(d)胰高血糖素受体(GR),IGFBP(酸不稳定性亚基)和SSTR3;(e)IGF-1和IGFBP 4;(f)IRS 2;(g)SSTR 2;(h)IGFBP2和SSTR 2;(i)胰岛素启动子因子1和同源异型域转录因子;(j)胰高血糖素受体(GR);(k)IGFBP6;及(l)其组合。
全文摘要
对使用亚治疗剂量促生长素抑制素类似物帕瑞肽治疗14天的猴组织进行基因表达分析。对测定结果进行以便鉴定出与治疗应用相关的帕瑞肽作用模式。对生长激素/IGF-1和胰高血糖素/胰岛素轴的影响反映在数种器官中转录水平的变化上。所表达的基因可用作帕瑞肽生物学活性的代用标志,尤其是在脑垂体和肾脏中发现IGF-2。
文档编号A61P35/00GK1905895SQ200480040917
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月24日 优先权日2003年11月25日
发明者M·索尼耶 申请人:诺瓦提斯公司
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