专利名称：八种人源miRNA的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学专业领域，涉及属于人源miRNA的八种新型miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。
背景技术：
miRNA(microRNA，微RNA)是一类具有19～25nt的RNA分子，是由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70～120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明miRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。(Bartel DP.MircroRNAsGenomics，Biogenesis，Mechanism，and Function.Cell，2004，116281-297)最近的研究发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，已经发现miRNA与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关，分析结果显示约一半已发现的miRNA定位于染色体肿瘤基因相关区域及染色体的脆性位点。(Barad O，Meiri E，Avniel A，et al.MicroRNA expression detected by oligonucleotidemicroarraysSystem establishment and expression profiling in human tissues.2004，Genome Res，14(12)2486-2494，Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation.Science，2004，303，83-86，Matthew NP，Lena Eliasson，et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulinsecretion.Nature，2004，432226-230，Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes arefrequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers.Proc Natl Acad Sci USA，2004，1012999-3004，Bino John，et al.Human MicroRNA Targets.PLoS Biology，2004，21862-1879)这些研究结果都表明miRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用。
自从2001年，德国、英国及美国的3个实验室分别运用生物信息学及分子生物学手段发现一类重要的非编码RNA(noncodingRNA)——miRNA以来，现已在线虫、小鼠、人、植物等多种生物中发现了数百种miRNA。研究表明miRNA广泛存在，并在细胞中起着调控基因表达等重要的作用。目前，虽然已经发现了大量的miRNA，但仍有许多新的miRNA有待挖掘，特别是那些在特定组织或特定发育阶段表达的miRNA。此外，目前对miRNA的表达分布还不十分清楚，对大部分miRNA的生物功能还知之甚少。因此克隆新的miRNA是十分必要的。
发明内容
胎肝是造血、免疫、肝干祖细胞的主要来源，表达的基因在各类组织中最为丰富，存在大量具有医学价值的活性成分。因此，本发明以人胎肝为材料进行miRNA分子的克隆分析。采用分子生物学常规技术，从人胎肝中分离获得小分子RNA，经过3`末端加Poly(A)尾，5′端加RNA接头，反转录，PCR扩增，克隆测序，获得基因片段的核酸序列。经过测序及生物信息学分析，我们共得到了数十条约22nt的RNA分子。经Blast比对，RNA二级结构分析发现有八条新的miRNA，分别命名为miRF-1至miRF-6。其7条经Northern blot杂交证实，miRF-7通过RT-PCR及测序的方法获得证实。miRNA是由miRNA前体RNA分子在细胞内通过酶加工后形成的成熟体，经过基因序列的同源分析，获得了八条miRNA相应的前体RNA序列。此外，针对miRNA序列设计合成了其反义寡核苷酸序列，并对其对肝癌细胞的生长的影响进行了分析。
本发明的目的是提供八种新型miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，该发明所涉及的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。
本发明所提供的八种人源miRNA包含如下任一种序列
1)miRF-15′AAUAUAACACAGAUGGCCUGU2)miRF-25′UCACUCCUCUCCUCCCGUCUUCU3)miRF-35′UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU4)miRF-45′GUCAUACACGGCUCUCCUCU5)miRF-55′UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG6)miRF-65′AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU7)miRF-75′ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCU8)miRF-85′UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUU据此，本发明所提供的八种人源miRNA的前体RNA包含如下序列1)miRF-1前体5′GGUACCUGAGAAGAGGUUGUCUGUGAUGAGUUCGCUUUUAUUAAUGACGAAUAUAACACAGAUGGCCUGUUUUCAGUACC2)miRF-2前体5′GAGGGGGAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAGUGGUUCCAUCACGCCUCCUCACUCCUCUCCUCCCGUCUUCUCCUCUC3)miRF-3前体5′GUCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAUAAACCCCUAAAUAGGGACUUUCCCGGGGGGUGACCCUGGC4)miRF-4前体5′ACUUGGAGAGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUCGAUUCAUCAAAGCGAGUCAUACACGGCUCUCCUCUCUUUUAGU5)miRF-5前体15′GUAUCCUGUACUGAGCUGCCCCGAGCUGGGCAGCAUGAAGGGCCUCGGGGCAGCUCAGUACAGGAUGC6)miRF-5前体25′GGUAUCCUGUACUGAGCUGCCCCGAGCUGGGCAGCAUGAAGGGCCUCGGGGCAGCUCUAGUACAGGAUGCC7)miRF-6前体5′GGUACUUGAAGAGUGGGUCCCUGCUGUGUUCGCUUAAUUUAUGACGAAUCAUACAGGGACAUCCAGUUUUUCAGUAUC8)miRF-7前体5′GUUCUAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAGUGAAGUAGAUUAGCAUCUACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGGC9)miRF-8前体5′UUCUACACAGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCUGUGUUUCUGUAUGGUAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUUGAGG其中，miRF-5在染色体上有两个同源序列位点，miRF-5可能有两个前体，即miRF-5前体1和miRF-5前体2。
据此，本发明所提供的八种人源miRNA的反义寡核苷酸包含如下任一种序列1)miRF-1反义寡核苷酸5′ACAGGCCATCTGTGTTATATT2)miRF-2反义寡核苷酸5′AGAAGACGGGAGGAGAGGAGTGA3)miRF-3反义寡核苷酸5′ATCGGGAGGGGACTGAGCCTGA4)miRF-4反义寡核苷酸5′AGAGGAGAGCCGTGTATGAC5)miRF-5反义寡核苷酸5′CTCGGGGCAGCTCAGTACAGGA6)miRF-6反义寡核苷酸5′AACTGGATGTCCCTGTATGATT7)miRF-7反义寡核苷酸5′AGAAGGAGCACTTAGGGCAGT8)miRF-8反义寡核苷酸5′AACAGGCCGGGACAAGTGCAATA据此，本发明所提供的新型人源miRNA前体基因在人染色体上的定位分别为，miRF-1前体基因、miRF-4前体基因、miRF-6前体基因定位于人染色体14q32.31；miRF-2前体基因定位于人染色体11p15.5；miRF-3前体基因定位于人染色体16p13.11；miRF-5前体基因定位于人染色体8p11.21；miRF-7前体基因和miRF-8前体基因定位于人染色体13q31.3。
本发明所提供的八种新型miRNA均克隆自人胎肝细胞，成熟miRNA序列长度为20～23nt，其前体序列均可以形成miRNA前体的典型二级结构，符合miRNA的结构特征。Northern blot和RT-PCR检测结果表明八种新型miRNA分别在人胎肝、HepG2肝癌细胞、BEL-7402肝癌细胞中均有不同程度的表达，将八种miRNA的反义寡核苷酸转染HepG2肝癌细胞，HepG2细胞的生长均受到了不同程度的抑制，说明八种新型miRNA分子在肝细胞和肝癌细胞中具有重要的生物学功能。对已有其它miRNA的研究结果证明miRNA分子广泛参与细胞的增殖、分化，并与细胞的癌变相关，在不同细胞中过表达miRNA和采用miRNA反义寡核苷酸抑制miRNA表达的研究也证明了miRNA分子在细胞内的表达对细胞生物学功能产生重要影响。因此，在肝细胞、肝癌细胞中过表达miRF-1～miRF-8、miRF-1～miRF-8前体分子或采用miRNA反义寡核苷酸抑制miRF-1～miRF-8的表达将影响肝细胞和肝癌细胞增殖。
以下为结合附图进一步说明本发明图1八种人源miRNA序列图2八种人源miRNA的前体RNA序列图3Northern blot检测miRNA在人胎肝、HepG2和BEL-7402细胞中表达图4RT-PCR检测miRF-7在人胎肝细胞中的表达图5八种人源miRNA的反义寡核苷酸序列具体实施方式
实施例miRNA的克隆和分析1.人胎肝small RNA的提取纯化使用mirVanaTM miRNA Isolation(Ambion，Austin，TX)试剂盒从30mg胎肝组织中提取smallRNA(≤200nt)，溶于无RNase水，260nm测定RNA浓度。
2.构建small RNA分子cDNA文库首先用Takara公司Poly(A)加尾酶试剂盒在小分子RNA 3`末端加上Poly(A)尾。在50μl反应体系中加入 1.5μg small RNA、5U poly(A)polymerase(Takara)、5μl 10×缓冲液和1mmol/L的ATP，于37℃反应30min。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA。用T4RNA ligase(Invitrogen)再在RNA的5′端加上44nt的RNA接头(CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA)，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA。然后用含多个T的60nt RT锚定引物(ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30(A，G，or C)(A，G，C，or T))进行反转录，反转录使用SuperScript III(invitrogen)反转录酶，获得cDNA。根据RT引物及RNA接头设计PCR引物(引物15′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′，引物25′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3′)，并以反转录的产物为模板进行PCR。PCR产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收大小约为109bp的PCR产物，并连接到T载体上，挑取阳性克隆测序。
3.获得的克隆序列分析克隆测序获得序列对人基因组序列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST分析，采用Mfold程序(http//www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/forml.cgi)对可能的miRNA前体RNA序列进行结构分析，参照miRNA分子标准筛选获得候选miRNA分子及其前体分子。同时采用生物信息学方法对miRNA前体分子进行了染色体定位。
共获得8条新的miRNA(图1)，及其前体RNA序列(图2)。miRNA分别命名为miRF-1～miRF8。
图1为八种新型人源miRNA的核苷酸序列。其中miRF-1和miRF-7的长度为21nt，miRF-3、miRF-5、miRF-6的长度为22nt，miRF-4的长度为20nt；miRF-2和miRF-8的长度为23nt。图2为八种新型人源miRNA的前体RNA序列，其中，miRF-5在染色体上有两个同源序列位点，miRF-5可能有两个前体，即miRF-5前体1和miRF-5前体2。八种新型miRNA的前体均可以形成miRNA前体的典型的发夹环状结构。
染色体定位分析表明，miRF-1前体基因、miRF-4前体基因、miRF-6前体基因定位于人染色体14q32.31；miRF-2前体基因定位于人染色体11p15.5；miRF-3前体基因定位于人染色体16p13.11；miRF-5前体基因定位于人染色体8p11.21；miRF-7前体基因和miRF-8前体基因定位于人染色体13q31.3。
4.miRNA的Northern blot和RT-PCR鉴定使用mirVanaTM miRNA Isolation(Ambion，Austin，TX)试剂盒从胎肝组织、以及培养的HepG2、BEL-7402和HeLa细胞中提取small RNA(≤200nt)，以[γ-32P]ATP标记的miRF1～miRF6和miRF-8为杂交检测探针，按照常规northern blot方法检测miRF-1～miRF-6在人胎肝组织、HepG2肝癌细胞和BEL-7402肝癌细胞中的表达；miRF-8在人胎肝组织、HepG2肝癌细胞和HeLa细胞中的表达；以溴化乙锭染色的tRNA作为内参照。放射自显影结果如图3。
使用mirVanaTM miRNA Isolation(Ambion，Austin，TX)试剂盒从胎肝组织提取small RNA(≤200nt)，按照“构建small RNA分子cDNA文库”的方法制备cDNA，用miRF-7引物(5′-ACTGCCCTAAGTGCTCCTTC-3′)和引物2(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3′)进行PCR扩增，结果见图4。克隆获得DNA片段，测序。
图3为Northern blot检测miRNA在组织和细胞中的表达。图4为RT-PCR检测miRF-7在组织和细胞中的表达。检测结果显示miRF-7在人胎肝中表达。其中1为RT-PCR反应的阴性对照，2为未加poly(A)尾的人胎肝小RNA分子的cDNA阴性对照，3为加poly(A)尾的人胎肝小RNA分子的cDNA样品，M为25bp的DNA分子量标准。RT-PCR扩增获得的miRF-7序列经过克隆测序证明正确。
northern blot杂交结果表明miRF1～miRF6在人胎肝组织、HepG2肝癌细胞和BEL-7402肝癌细胞中均有不同程度的表达；miRF-8在在人胎肝组织、HepG2肝癌细胞和HeLa癌细胞中均有不同程度表达。经PCR和测序证明miRF-7在人胎肝细胞中表达。这一方面证明了所克隆的miRNA的正确性，同时也显示miRF1～miRF-6、miRF-8在胎肝组织和肝癌细胞中表达，说明这些miRNA分子在肝细胞和肝癌细胞中具有重要的生物学功能。
5.miRNA的反义寡核苷酸对HepG2细胞的作用根据八种miRNA序列，设计合成了与miRF1～miRF-8八种miRNA完全互补的反义寡核苷酸序列，如图5。用DMEM培养基培养HepG2细胞，铺96孔细胞培养板，每孔5×103细胞，培养过夜。每个样品作6孔，脂质体对照6孔，正常细胞对照6孔。脂质体DMRIE-C Reagent(invitrogen)用量为每孔0.4ul，反义寡核苷酸用量为1μmol/L，培养液为100μl无血清DMEM，按说明书操作。5小时后加含20％血清的培养液100μl。培养72小时后，每孔加入20μl MTT，培养三小时，492nm测细胞增殖情况。测定结果表明八种miRNA的反义寡核苷酸对HepG2细胞的生长均有不同程度的抑制作用，抑制率的的范围为3％～28％。这一结果表明八种人源miRNA与肝细胞和肝癌细胞增殖相关，八种人源miRNA和其反义寡核苷酸在临床上可能具有治疗肝脏相关疾病的用途。
此外，为了提高反义寡核苷酸的作用和细胞内的稳定性，上述所用的八种人源miRNA的反义寡核苷酸可以是DNA或RNA，还可以对反义寡核苷酸可以进行硫代、甲氧基等修饰。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所<120>八种人源miRNA<160>25<210>1<211>21<212>RNA<213>人<400>
aauauaacac agauggccug u 21<210>2<211>23<212>RNA<213>人<400>
ucacuccucu ccucccgucu ucu 23<210>3<211>22<212>RNA<213>人<400>
ucaggcucag uccccucccg au 22<210>4<211>20<212>RNA<213>人<400>
gucauacacg gcucuccucu 20<210>5<211>22<212>RNA<213>人<400>
uccuguacug agcugccccg ag 22<210>6<211>22
<212>RNA<213>人<400>
aaucauacag ggacauccag uu 22<210>7<211>21<212>RNA<213>人<400>
acugcccuaa gugcuccuuc u 21<210>8<211>23<212>RNA<213>人<400>
uauugcacuu gucccggccu guu 23<210>9<211>80<212>RNA<213>人<400>
gguaccugag aagagguugu cugugaugag uucgcuuuua uuaaugacga auauaacaca 60gauggccugu uuucaguacc 80<210>10<211>75<212>RNA<213>人<400>
gagggggaag acgggaggaa agaagggagu gguuccauca cgccuccuca cuccucuccu 60cccgucuucuc cucuc 75<210>11<211>63<212>RNA<213>人<400>
gucaggcuca guccccuccc gauaaacccc uaaauaggga cuuucccggg gggugacccu 60ggc 63<210>12<211>73
<212>RNA<213>人<400>
acuuggagag aggcuggccg ugaugaauuc gauucaucaa agcgagucau acacggcucu 60ccucucuuuu agu 73<210>13<211>68<212>RNA<213>人<400>
guauccugua cugagcugcc ccgagcuggg cagcaugaag ggccucgggg cagcucagua 60caggaugc 68<210>14<211>71<212>RNA<213>人<400>
gguauccugu acugagcugc cccgagcugg gcagcaugaa gggccucggg gcagcucuag 60uacaggaugc c 71<210>15<211>78<212>RNA<213>人<400>
gguacuugaa gagugggucc cugcuguguu cgcuuaauuu augacgaauc auacagggac 60auccaguuuu ucaguauc 78<210>16<211>69<212>RNA<213>人<400>
guucuaaggu gcaucuagug cagauaguga aguagauuag caucuacugc ccuaagugcu 60ccuucuggc 69<210>17<211>72<212>RNA<213>人<400>
uucuacacag guugggaucg guugcaaugc uguguuucug uaugguauug cacuuguccc 60
ggccuguuga gg 72<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-1反义寡核苷酸<400>
acaggccatc tgtgttatat t 21<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-2反义寡核苷酸<400>
agaagacggg aggagaggag tga 23<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-3反义寡核苷酸<400>
atcgggaggg gactgagcct ga 22<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-4反义寡核苷酸<400>
agaggagagc cgtgtatgac 20<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人源miRNA--miRF-5反义寡核苷酸<400>
ctcggggcag ctcagtacag ga 22<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-6反义寡核苷酸<400>
aactggatgt ccctgtatga tt 23<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-7反义寡核苷酸<400>
agaaggagca cttagggcag t<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源miRNA--miRF-8反义寡核苷酸<400>
aacaggccgg gacaagtgca ata 2权利要求
1.八种人源miRNA，其特征在于包含如下任一种miRNA序列1)miRF-1 5′AAUAUAACACAGAUGGCCUGU2)miRF-2 5′UCACUCCUCUCCUCCCGUCUUCU3)miRF-3 5′UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU4)miRF-4 5′GUCAUACACGGCUCUCCUCU5)miRF-5 5′UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG6)miRF-6 5′AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU7)miRF-7 5′ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCU8)miRF-8 5′UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUU
2.根据权利要求1所述的八种人源miRNA的前体RNA包含如下序列，其中miRF-5有两种前体形式miRF-5前体1和miRF-5前体2miRF-1前体5′GGUACCUGAGAAGAGGUUGUCUGUGAUGAGUUCGCUUUUAUUAAUGACGAAUAUAACACAGAUGGCCUGUUUUCAGUACCmiRF-2前体5′GAGGGGGAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAGUGGUUCCAUCACGCCUCCUCACUCCUCUCCUCCCGUCUUCUCCUCUCmiRF-3前体5′GUCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAUAAACCCCUAAAUAGGGACUUUCCCGGGGGGUGACCCUGGCmiRF-4前体5′ACUUGGAGAGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUCGAUUCAUCAAAGCGAGUCAUACACGGCUCUCCUCUCUUUUAGUmiRF-5前体15′GUAUCCUGUACUGAGCUGCCCCGAGCUGGGCAGCAUGAAGGGCCUCGGGGCAGCUCAGUACAGGAUGCmiRF-5前体25′GGUAUCCUGUACUGAGCUGCCCCGAGCUGGGCAGCAUGAAGGGCCUCGGGGCAGCUCUAGUACAGGAUGCCmiRF-6前体5′GGUACUUGAAGAGUGGGUCCCUGCUGUGUUCGCUUAAUUUAUGACGAAUCAUACAGGGACAUCCAGUUUUUCAGUAUCmiRF-7前体5′GUUCUAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAGUGAAGUAGAUUAGCAUCUACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGGCmiRF-8前体5′UUCUACACAGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCUGUGUUUCUGUAUGGUAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUUGAGG
3.根据权利要求1所述的八种人源miRNA的反义寡核苷酸包含如下任一种序列1)miRF-1反义寡核苷酸5′ACAGGCCATCTGTGTTATATT2)miRF-2反义寡核苷酸5′AGAAGACGGGAGGAGAGGAGTGA3)miRF-3反义寡核苷酸5′ATCGGGAGGGGACTGAGCCTGA4)miRF-4反义寡核苷酸5′AGAGGAGAGCCGTGTATGAC5)miRF-5反义寡核苷酸5′CTCGGGGCAGCTCAGTACAGGA6)miRF-6反义寡核苷酸5′AACTGGATGTCCCTGTATGATT7)miRF-7反义寡核苷酸5′AGAAGGAGCACTTAGGGCAGT8)miRF-8反义寡核苷酸5′AACAGGCCGGGACAAGTGCAATA
4.权利要求3所述的八种人源miRNA的反义寡核苷酸可以是DNA或RNA。
5.权利要求3所述的八种人源miRNA的反义寡核苷酸可以进行硫代、甲氧基等修饰。
6.权利要求1～5所述的任一寡核苷酸在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了八种肝和肝癌细胞相关的miRNA序列、及其前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在制备治疗肝癌疾病药物中的用途。
文档编号A61P1/16GK1800388SQ20051000025
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月7日 优先权日2005年1月7日
发明者郑晓飞, 付汉江, 朱捷, 铁轶, 孙志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所