专利名称：应用豆类产品治疗和预防放疗引起的皮肤损伤的制作方法
技术领域：
本发明涉及非变性豆类产品，含有所述非变性豆类产品的局部用组合物，以及这些产品的制备和应用。
背景技术：
进行放射治疗或放疗的病人，经常会经受急性和长期的从红斑、蜕皮、和疼痛到纤维化和增加患皮肤癌危险之类的皮肤损伤。这些并发症可能严重到改变这些病人全身的体质和生活质量。它们能够导致溃疡、受影响区域的运动范围受限制和转化为鳞状上皮细胞癌(Lorette G，Machet L.，辐射引起的皮肤毒性预防、治疗、癌症放射指示剂Acta Oncol(Cancer Radiother Acta Oncol)，35增刊7；141-8，1996)。
放疗包括比紫外线更强而且穿透更深的“电离”辐射。这种辐射强度高，要依照特殊的方案实施。由辐射引起的皮肤变化被称为放射性皮炎，而且伴有干性或湿性蜕皮和TEWL增加(透皮水分损失)。
已经证明，放疗引起的永久性皮肤病变既是细胞水平的，又是超微结构水平的(Rudolph R，Arganese T，Woodward M.，The ultrastructure and etiology ofchronic radiotherapy damage in human skin(Ann Plast Surg，94，282-92，Oct 1982；Nachtrab U，Oppitz U，Flentje M，Stopper H，Radiation-induced micronucleusformation in human skin fibroblasts of patients showing severe and normal tissuefamage after radiotherapy，Int J Radiat Biol 733，279-87，五月，1998；SivanV，Vozenin-Brotons MC，Tricaud Y，Lefaix JL，Cosset JM，Dubray B，Martin MT，altered proliferation and differentiation of human epidermis in cases of skin fibrosisafter radiotherapy，Int J Radiat Oncol Biol Phys 533，385-93，2002，6，1)。
目前没有可用于预防或治疗放疗引起的皮肤损害的疗法。不同的分次辐射和后处理方案的减小放疗引起皮肤损伤的能力正在进行评价。例如Vab derSchueren等人(Radiotherapy by multiple fractions per day(MFD)in head and neckcanceracute reactions of skin and mucosa，Int J Radiat Oncol Biol Phys 192，301-11，Aug，1990)已经评价了几种头部和颈部肿瘤放疗不寻常的分段时间表对皮肤和黏膜急性反应方面的可行性。他们总结指出，十二天的间隔使得黏膜损伤能够完整修复而没有累积影响。然而，由于皮肤损伤发展更慢，甚至两周间隔也不够皮肤从辐射损伤中完全恢复。随后的治疗造成了累积的损伤。
另一种方法用于对进行放疗治疗头部和颈部或乳癌的，已经有延迟和日益严重皮肤反应的病人，进行至少六个月的联合己酮可可碱和维生素E组合物联合治疗。这种方法能显著恢复慢性放疗损伤。(Delanian S，Balla-mekias S，LefaixJL，Striking regression of chronic radiotherapy damage in a clinical trial ofcombined pentoxifylline and tocopherol，J Clin Oncol 1710，3283-90，十月，1999)。然而，这种方法无法用于预防放射性皮炎。
对昼夜生理节奏循环的正确时期辐射曾进行评价，但发现没有用(Hirn-stadler B，Rojas A，昼夜节律对放射敏感度的影响对老鼠皮肤单次和分次给药的研究，Int J Radiat Biol 591，185-93，一月，1991)。
对使用各种药剂的局部治疗也已经进行了评价，发现仅有有限的反应。发现Lalugen乳中的透明质酸能够减小高度放射性皮炎的发病率(Liguori等人.，double-blind，randomized clinical study comparing hyaluronic acid cream toplacebo in patients treated with radiotherapy，Radiother Oncol 422 155-61，二月，1997)。
另一种局部产品包含硬脂酸、疏水组分和丙二醇、甘油和聚不饱和醇、亲水组分的混合物，对包括红斑、干性和湿性蜕皮和溃疡的急性放射皮肤损伤完全治愈率达到57.9％。36.8％受治疗病人得到改善，5.3％受治疗病人失败。(Dini等人，急性放射性皮炎的处理。药理治疗法还是非药理治疗法？，Cancer Nurs165，366-70，十月，1993)。然而，该疗法不适于预防放射引起的皮肤损伤。
Biafine乳是一种用于减小放射治疗的皮肤反应发生风险和治疗放射治疗的皮肤反应的局部制剂。这种乳有深度皮肤水合、软化剂和硬脂酸，声称恢复了完好皮肤的天然屏障功能和弹性，而且表明了放射/药物肿瘤学引起的发红、红斑、干性/湿性蜕皮。
炎症是由通过环氧合酶-1和2(COX-1和COX-2)催化的反应产生的前列腺素E(PGE2)部分介导的。辐射同时在局部上和系统上增加了PGE2的产生，引起了放疗的副作用。Liang和同事们在老鼠模型放疗系统中研究了Cox-2抑制剂的使用(Am J Clin Oncol.2003八月；26(4)S114-21)。与盐水处理控制对照，同时使用Cox-2抑制剂Celecoxib和50戈瑞的辐射导致更少的皮肤炎症。
关卡酶-1(Chk-1)是DNA损坏关卡的重要组分。Chk1的磷酸化是细胞延迟细胞响应双链DNA断裂的细胞周期发展必需的能给细胞足够的时间进行DNA修复，从而降低癌症风险。随着细胞觉察到DNA损坏，开始修复作用，电离辐射同时诱导了S和G2关卡。缺少Chk-1的人类细胞无法在电离辐射后导致S和G2检测点。(Zhao等人，Proc Natl Acad Sci USA.2002年11月12日；99(23)14795-800。Epub 2002年10月24日)。需要诱导Chk-1磷酸化的试剂来保持在这些关卡中的受辐射细胞和组织直到DNA损坏被修复，从而降低放射引起的癌症的风险。
前述的例子涉及攻克对放射引起的皮肤损伤的急性和可见病症的的治疗方法。然而这些例子都没有检验降低放射引起的皮肤癌风险的途径。
因此，需要更好、更安全、更高效的用于预防和/或治疗放疗引起的皮肤损伤的药剂。
豆类种子含有高水平的蛋白质、脂类和糖。因此，大豆之类的豆类种子和含有豆类种子的组合物，被认为是对人有很高营养价值的产品。豆类种子还含有抑制蛋白酶活性的化合物。例如，早在20世纪40年代即已从大豆中分离出两种蛋白酶抑制剂，Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(大豆胰蛋白酶抑制剂，STI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂(BBI)。参考文献见Birk，Int.J.Pept.Protein Res.25113-131(1985)和Kennedy，Am.J.Clin.Neutr.681406S-1412S(1998)。
STI是通过形成稳定的化学计量的络合物抑制胰蛋白酶的蛋白水解活性的。参见Liu，K.，化学和大豆成分的营养价值。在《大豆，化学，工艺及应用》32-35页(Aspen publishers，Inc.，Gaithersburg，MD，1999)。STI含有181个氨基酸残基，通过两个二硫键桥联，并且大致为球形。参见Song等，J.Mol.Biol.275347-63(1998)。
BBI是一个8k-Da的蛋白质，在不同的反应位点抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶。参见Billings等，Pro.Natl.Acad.Sci.893120-3124(1992)。STI和BBI只在大豆种子中被发现，而在大豆植物的其它部位未发现。参见Birk，Int.J.Pept.Protein Res.25113-131(1985)。
发明内容
本发明涉及具有胰蛋白酶抑制活性和降低的微生物含量的豆类产品，预防和治疗放疗引起的皮肤损伤的方法和含有这种豆类产品的用于预防和治疗放疗引起的皮肤损伤的组合物。在一个优选的实施方式中，该豆类产品为大豆产品。
本新发明的其它特征和优点将通过发明详述和权利要求变得明白。
具体实施例方式
我们相信本领域熟练技术人员能够基于本文描述，最大限度利用本发明。以下优选的实施方式仅用于说明和解释，并不以任何方式限定本发明。
除非另有说明，本发明所述的技术和科学术语都是按照本领域普通技术人员通常所理解的意思。而且，这里提到的所有的出版物、专利申请、专利以及其它资料都用作参考。在本文中，除非特别指出，所有百分比都是重量百分比。
这里提到的“胰蛋白酶抑制活性”指的是例如0.1％(w/w)浓度的豆类产品抑制胰蛋白酶活性的能力，通过以下实施例2所述测量方法测量。这种活性也可以通过纯大豆衍生试剂或具有胰蛋白酶抑制活性的合成分子来执行。在一个实施方式中本发明的豆类产品具有至少约15％的胰蛋白酶活性抑制能力。进一步优选实施方式中，本发明的豆类产品至少有约25％，例如至少约35％的胰蛋白酶活性抑制能力。
这里提到的“微生物含量”指的是存在于豆类产品的细菌、真菌和酵母菌的数量。测量微生物含量的方法的实例包括但不限于，在“Official Methods ofAnalysis of AOAC International”，Patricia Cunniff主编，第十六版，第5次修订，1999(AOAC International)中指出的AOAC 986.23法；或在“Official Compendiaof Standards，USP 24USP/NF 19”，美国药典协定，Inc.，2000(Board of Trustees，美国药典协定，Inc.)指出的方法。
“不允许的微生物含量”意思是指对人有害的存在于豆类产品中的细菌、真菌和酵母菌的数量，包括，但不限于，大肠菌类、大肠杆菌、沙门氏菌、嗜热孢子、杆菌、肠道球菌、葡萄球菌、粪链球菌，和那些在“Disinfection，sterilization，and preservation”第4版，Seymour S.Block，pp.887-888(1991，Lea & Febiger，Malvern，PA)一文中所提到的微生物。
这里提到的“局部应用”指的是直接涂布或铺展于皮肤，可用手或诸如粉擦、膨胀棉、滚涂器、或喷雾器等涂抹器进行涂敷。
这里提到的“化妆可接受的”是指那些适合于与组织(如皮肤)接触的，没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏反应等的产品或物质。
这里提到的“局部载体”指的是一种或多种适于哺乳动物局部施用的固体或液体填充稀释剂。局部载体的例子包括但不限于水、蜡、油、软化剂、乳化剂、增稠剂、凝胶剂，及它们的混合物。
这里提到的“治疗放疗引起的皮肤损伤”指的是对电离辐射在黏膜、皮肤、毛发或指甲损伤的再生或预防。放疗引起的皮肤损伤的例子包括但不限于，对黏膜、皮肤、毛发和指甲的损伤，包括但不限于，皮炎、红斑、上皮炎、蜕皮、疼痛、纤维化、溃疡、病变、和由于增加的DNA损坏造成的皮肤癌风险增大。还可包括我们相信是由屏蔽损伤引起的TEWL增加。
这里提到的“安全有效量”指的是所用的化合物或组合物(如豆类产品)足够对被调节或处理的状况产生正面修饰作用，但不会造成严重的副作用的用量。化合物或组合物的安全有效量会随着被治疗状况，最终的使用者年龄和身体状况，预防/治疗状况的严重性，治疗的持续时间，其它治疗的情况，所用物质或产品/组合物的特性，所用的化妆品可接受的载体的特性及其它一些因素的不同而改变。
引入本文作为参考的美国专利申请2000年10月27日提交的系列号09/698454和2003年10月20日提交的系列号10/689149，描述了含有非变性大豆产品或胰蛋白酶抑制剂的组合物。
豆类产品“豆类产品”指的是从豆类种子衍生的物质。豆类植物通常来源于豆科植物，都有开裂的种子，如蚕豆、豌豆或小扁豆。豆类植物的例子包括但不限于大豆、小扁豆，豌豆和花生。
豆类产品可以包含全部的豆类种子(如将豆类种子碾成粉末)，或只用豆类的一部分(如豆类种子的提取物)。豆类产品可以是流体(如豆类种子和水的混合物)或是固体(如豆类种子的粉末)的形式。当是流体形式时，术语“豆类产品”指的是从豆类植物中衍生出的流体中的固体成分。
本发明的组合物包含安全有效量的豆类产品(如大豆产品)。在一个实施方式中，组合物包含约0.001％到50％，优选约1％到30％的豆类产品(如大豆产品)。
大豆产品本发明新颖的组合物包含豆类产品，优选可以是液体(例如豆奶)或固体(例如，大豆粉、大豆面或豆奶粉)的大豆产品。“大豆产品”指的是衍生自大豆的物质，该物质含有能在大豆中找到的处于大豆中发现的相对浓度的无水天然组分。大豆产品可以只包含大豆的一部分(如大豆提取物如脂质减少的大豆粉，或滤过的豆奶)，也可以包含全部的大豆(如碾碎的豆粉末)。在一个实施方式中，所述大豆产品是一种非变性大豆制品。“变性”在Bantam医学字典(1990年版)中定义为“通过加热、X射线或化学制剂引起的蛋白质物理和生理性质的变化。这些变化包括失去活性(对酶来说)和失去(或改变)抗原性(对抗原来说)”。“非变性大豆产品”的含义是指在衍生加工(例如温度、萃取介质)中并未除去大豆产品蛋白酶抑制活性的大豆产品。在一个实施方式中，所述的本发明非变性态的大豆产品在完好的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)蛋白质存在下进行测量。在另一个实施方式中，在胰蛋白酶抑制活性存在下根据实施例2中的描述进行了测量。
大豆产品可以是流体(如豆奶)，或是固体(如大豆粉末或豆奶粉末)。当是流体形式时，术语“大豆产品”指的是从大豆中衍生出的流体中的固体成分。在一个实施方式中，大豆产品是大豆粉末。大豆粉末可以通过碾压干燥的大豆制得。在一个实施方式中，大豆粉末具有低于500微米的平均粒径，如小于200微米。在一个实施方式中，大豆粉末的水分含量小于10％，如小于5％。在一个实施方式中，大豆粉末是冷冻干燥的。
在一个实施方式中，大豆产品是豆奶或豆奶粉末。豆奶是从大豆中衍生出的固体和水的混合物，其中滤除全部或部分不溶残留物。豆奶粉末是豆奶蒸干后得到的，在一个实施方式中，是冷冻干燥或是喷雾干燥的形式。制备豆奶的过程包括但不限于以下三种方法。首先，将大豆放入水中吸收水分；膨胀的豆子随后碾压，并加入剩余的水；过滤混合物除去纤维残渣。第二，豆奶可以从大豆粉末制备。大豆粉末与水彻底混合(如至少混合一小时)，接着过滤除去纤维残渣。第三，还可以通过加入水与豆奶粉末重新组合成豆奶。在一个实施方式中，豆奶含1％到50％(如2.5％到20％)重量大豆固体。
豆类产品的抗微生物处理如上所述，豆类种子表面通常含有较高浓度的微生物。因而，在人们应用之前，豆类产品均要经过处理减少或消除这些微生物。
在一个实施方式中，本发明的豆类产品中微生物总数小于每克10000个菌落形成单位(cfu)。在另一个实施方式中，本发明的大豆产品的微生物总数大约小于1000cfu每克(例如小于100cfu每克)。
在一个实施方式中，本发明的豆类产品中不允许的微生物总数小于300cfu每克，例如，小于150cfu每克。在进一步的实施方式中，本发明的豆类产品在至少1克(例如至少10克)产品中不允许的微生物总数达到测不出的水平。
在一个实施方式中，豆类产品暴露在伽马射线的辐射中。在进一步的实施方式中，豆类产品是暴露在强度为2到30千戈瑞的伽马射线的辐射下，例如伽马射线的辐射强度为5到10千戈瑞。如美国专利号6555143B2中所述，申请人意外发现这样的处理在降低了豆类产品的微生物含量的同时，保持了其生物活性(如丝氨酸蛋白酶抑制活性)。
申请人还发现用伽马射线处理豆类产品可保持该产品的化妆品的优点，如保持天然色泽，且不带来明显的臭味。
其它同样保持豆类产品的蛋白酶抑制活性的微生物处理方法可以单独应用，或可以与伽马射线辐射联合使用，这些加工方法包括但不限于X-射线，高能电子束或质子束，紫外线辐射，流体静压力，和加入具有抗微生物活性的化学试剂，及它们的组合。一个降低微生物数量的方法的完整记录在“消毒，杀菌，保存”一书第4版，Seymour S.Block，pp.887-888(1991，Lea & Febiger，Malvern，PA)中已经阐明。
申请人发现使用热处理的方法会导致蛋白酶抑制活性的丧失，并且处理时要十分小心。例如，申请人发现在100℃下加热豆奶只要10分钟即可将豆奶的蛋白酶抑制活性从86％(在4℃时)降低到46％。申请人还发现加热豆奶会导致产品色泽和味道的变化。
局部用组合物本发明所用的局部组合物包括那些适于皮肤局部应用的组合。在一个实施方式中，组合物包括大豆产品和化妆品可接受的局部载体。在一个实施方式中，化妆品可接受的局部载体占组合物重量的50％到99.99％(例如从80％到95％)。
组合物可以制成各种不同的产品类型，包括但不限于洗剂、霜乳剂、凝胶剂、棒状物、喷雾剂、剃须膏、软膏、清洁洗涤液和固体洗涤棒、香波、膏剂、粉剂、摩丝、剃须膏、擦剂、贴剂、指甲油、外伤敷料和粘性绷带，水凝胶、薄膜和诸如粉底、睫毛膏和唇膏等的化妆品。这些产品剂型可以含有几种化妆品可接受的局部载体，包括但不限于溶液、乳液(如微乳液和毫微乳液)、凝胶、固体和脂质体。以下是这些载体的非限定的实例。其它载体可以由本领域普通技术人员按常规方法得到。
本发明的局部组合物可以制成溶液。溶液通常包括含水溶剂(如50％-99.99％，或90％-99％的化妆品可接受的含水溶剂)。
本发明应用的局部组合物可以制成含有软化剂的溶液。这样的组合物优选包含约2％-50％的软化剂。在这里，“软化剂”是指那些可以用于防止或减轻干燥，而达到保护皮肤效果的物质。许多适合的软化剂都是已知的，并可在此使用。Sagarin，Cosmetics，Science and Technology，第2版，Vol.1，pp.32-43(1972)，和国际化妆品活性成分辞典和手册，Wenninger and McEwen编，pp.1656-61，1626，和1654-55(The Cosmetic，Toiletry，and Fragrance Assoc.，Washington，D.C.，第7版，1997)(以下简称“ICI手册”)中记载了许多合适的上述物质的例子。
洗剂可以从上述溶液制备。洗剂通常含有大约1％-20％(如，约5％-10％)的一种软化剂以及大约50％-90％(如，约60％-80％)的水。
本发明的产品另一种可从溶液制备的剂型是霜。乳剂通常含有约5％-50％(如，约10％-20％)的软化剂，和大约45％-85％(如约50％-75％)的水。
还有一种可从溶液制备的剂型是软膏。软膏通常含有一种简单的基质如动物油、植物油或半固体的烃类。软膏可以含有大约2％-10％的软化剂，加上大约0.1％-2％的增厚剂。常用的增厚剂或增稠剂都可以在Sagarin，Cosmetics，Science andTechnology，第2版，Vol.1，pp.72-73(1972)，和ICI手册pp.1693-1697中找到。
本发明的局部组合物可以制成乳液。若载体是一种乳液，应该含有约1％-10％(如，约2％-5％)的乳化剂。乳化剂可以是非离子、阴离子或阳离子的。适合的乳化剂在美国专利No.3755560，4421769，McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers，NorthAmerican Edition，pp.317-324(1986)，和ICI手册，pp.1673-1686中已经公开。
洗剂和霜剂可以制成乳液。通常这样的洗剂含有大约0.5％-5％的乳化剂。这样的乳剂通常含有大约1％-20％(如约5％-10％)的软化剂；大约20％-80％(如约30％-70％)的水；和大约1％-10％(如约2％-5％)的乳化剂。
本发明组合物应含有能够有效保护、预防和/或治疗放射引起的皮肤损伤含量的非变性大豆，配方中不应有过多的大豆，以免产生多粒状的或不美观的组合物。本发明组合物应当优选含有占组合物重量0.1到15％的非变性大豆。应该更优选含有占组合物重量0.5到10％的非变性大豆。最优选应含有占组合物重量的2到6％的非变性大豆。
水包油型和油包水型的单相乳液护肤制剂，如洗剂和乳剂，都是化妆品领域公知的，并在本发明中使用。多相乳液组合物，如水包油包水型，在美国专利No.4254105和4960764中公开并也在本发明中使用。通常，上述单相和多相乳化剂均含有水、软化剂和乳化剂作为必要组分。
本发明的局部组合物还可以制成凝胶(如用适当凝胶剂制成水凝胶)。用作含水凝胶的合适的凝胶剂包括但不限于天然树胶、丙烯酸和丙烯酸酯聚合物和共聚物、纤维素衍生物(如羟甲基纤维素，羟乙基纤维素)。适合的用于油类(如矿物油)的凝胶剂包括但不限于氢化丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物，和氢化乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物。上述凝胶通常含有重量百分比为约0.1％-5％的上述凝胶剂。
本发明的局部用组合物还可以是固体剂型(如蜡制的条状物，肥皂条组合物，粉剂，或带粉擦的粉)。
脂质体制剂也是本发明有用的组合物。脂质体可以是单层，多层和寡层的脂质体，可以包含或不包含磷脂。制备这样的组合物首先是将桔皮素与磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，胆固醇和水按照Mezei & Gulasekharam，“Liposomes—A SelectiveDrug Delivery System for the Topical Route of Administration；Gel Dosage Form”，Journal of Pharmaceutics and Pharmacology，Vol.34(1982)，pp.473-474所述的方法，或改良方法进行混合。形成脂质体的适宜的组合物的表皮脂类可以替代磷脂。然后是将脂质体混入一种上述载体(如凝胶或水包油乳液)，以获得脂质体剂型。局部施用脂质体的其它组合物和药用在Mezei，M.，“Liposomes as a Skin Drug DeliverySystem”，Topics in Pharmaceutical Sciences(D.D.Breimer and P.Speiser，eds.，)ElsevierScience Publishers B.V.，New York，N.Y.，1985，pp.345-358，PCT专利申请WO96/31194和美国专利No.5260065中有详细说明。
本发明的局部组合物除前述组分以外可以含有多种附加的油溶性物质和/或水溶性物质，它们可以以现有技术确立的水平按常规方法用于皮肤、毛发和指甲用组合物。
附加的化妆用活性剂在一个实施方式中，局部组合物在大豆产品以外可以进一步含有另一种化妆品或药学活性剂。这里“化妆品或药学活性剂”指的是对皮肤、毛发或指甲具有美容或治疗作用的化合物(例如，合成化合物或化合物或化合物的混合物，可以是合成的或从天然原料中分离得到的)，包括但不限于，例如光亮剂、美黑剂之类的增黑剂、抗痤疮剂、抗癌剂、防癌剂、消光剂、抗微生物剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、外用镇痛剂、防晒剂、光防护剂、抗氧化剂、角蛋白溶解剂、洗涤剂/表面活性剂、增湿剂、营养物、维生素、能量增强剂、抗汗剂、收敛剂、除臭剂、脱毛剂、生发剂、固化剂、抗茧剂和毛发、指甲和/或皮肤调理剂。
自然提取物包含适用于本发明组合物的抗氧化剂，包括但不限于含有类黄酮和异黄酮(isoflavonoids)和它们的衍生物(例如染料木黄酮和黄豆苷原)的提取物，含有白藜芦醇的提取物等。这种自然提取物的例子包括葡萄籽、绿茶、松树皮、菊科植物和蜂胶。其他抗氧化剂的例子可在ICI手册1612-13页找到。其他来自天然来源的提取物含有色素(pigment)(例如来自Hedychium属或熊果类植物的棕色色素，或来自含有类胡萝卜素或斑蜇黄的植物的黄色、橙色和红色色素)的提取物也可用于本发明的局部组合物。
矿质水本发明的组合物可以使用矿质水制备，例如Evian矿质水(法国，evian)之类的自然矿化的矿质水。在一个实施方式中，矿质水的矿化程度至少是约200mg/L(如约300mg/L到约1000mg/L)。
在一个实施方式中，矿质水包含至少约10mg/L的钙和/或至少约5mg/L的镁。
抗炎剂本发明组合物还含有合成的或天然衍生的抗炎剂，抗炎剂中含有氢化可的松等等之类的皮质类固醇、非甾族抗炎药，包括布洛芬、水杨酸酯、甲氧萘丙酸盐、acetominophen、COX-2抑制剂等，菊科植物和其它天然抗炎化合物或衍生物。
在一个具体的实施方案中，这些药剂可以选自包括但不限于羟酸、过氧化苯甲酰、硫代间苯二酚、抗坏血酸、D-泛醇、氢醌、甲氧基肉桂酸辛酯、二氧化钛、水杨酸辛酯、水杨酸三甲环己酯、阿伏苯宗(avobenzone)、聚酚醛、类胡萝卜素、自由基清除剂、自旋捕捉剂、类维生素A如视黄醇和棕榈酸视黄酯、神经酰胺、多不饱和脂肪酸、必需的脂肪酸、酶、酶抑制剂、矿物质、雌激素之类的激素、类固醇(如氢化可的松)、2-二甲基氨基乙醇、铜盐(如氯化铜)、含铜肽如CuGly-His-Lys，辅酶Q10、如那些在PCT专利申请WO00/15188中公开的肽、硫辛酸、诸如脯氨酸和酪氨酸的氨基酸、维生素和与它们相关的分子(例如维甲酸、维生素A、α、γ或δ维生素E和其它维生素E或它们的混合物)，乳糖酸、乙酰辅酶A、烟酸、核黄素、维生素B1、核糖、电子转移剂如NADH和FADH2，以及其它植物提取物(如芦荟、菊科植物)、Bugrane-P和它们的衍生物及其混合物。本发明组合物中的化妆品活性剂的含量通常占组合物重量的约0.001％-20％，例如约0.01％-10％，更进一步是如约0.1％-5％。
维生素的例子包括但不限于维生素A、视黄醇或视黄醇酯之类的维生素A前体、维生素B系列如维生素B3、维生素B5、维生素B12，维生素C，维生素K，及α、γ或δ生育酚和其它相关的生育酚或生育酚的混合物。
羟酸的例子包括但不限于乙醇酸，乳酸，苹果酸，水杨酸，柠檬酸，及酒石酸等，参见欧洲专利申请No.273202。
抗氧化剂的例子包括但不限于水溶性抗氧剂如硫醇化合物及衍生物(如偏亚硫酸氢钠和N-乙酰半胱氨酸)，硫辛酸及二氢硫辛酸，白藜芦醇，乳铁蛋白，以及抗坏血酸和抗坏血酸衍生物(如维生素C棕榈酸酯和维生素C多肽)。适用于本发明的组合物的油溶性抗氧剂包括但不限于丁基化羟基甲苯，类维生素A(如视黄醇和棕榈酸视黄酯)，不同的生育酚(如α、γ或δ生育酚及其混合物，如生育酚醋酸盐的形成)，生育三烯酚和辅酶Q。适于本发明组合物的含抗氧化剂的天然提取物包括但不限于含黄酮，异黄酮及衍生物(如三羟基异黄酮和黄豆苷(diadzein))的提取物，含白藜芦醇的提取物等。天然提取物的例子包括葡萄籽，绿茶，松树皮，及蜂胶。其它抗氧化剂的例子参见ICI手册第1612-13页。
其它物质其它不同的物质也可以用于本发明的组合物。这些包括湿润剂，蛋白质和多肽，防腐剂，及碱性试剂。这些试剂在ICI手册，pp.1650-1667中公开。
本发明的组合物还含有螯合剂(如EDTA)和防腐剂(如对羟基苯甲酸酯类)。合适的防腐剂和螯合剂的例子已经在ICI手册，pp.1626和1654-55中公开。另外，这里的局部组合物通常含有化妆辅剂，如染料，遮光剂(如二氧化钛)，颜料及香味剂。
疗法本发明的组合物优选涂施于在放疗过程中暴露于辐射的病人皮肤区域(“治疗区域”)。本发明的组合物更优选在暴露于辐射之前和每次放疗期之后涂施于治疗区域。最优选地，本发明的组合物在暴露于辐射之前和每次辐射期之后每天一次地涂施于治疗区域至少一天，优选1-2周，而在放疗结束之后每天一次地涂施至少四周。
本发明中的组合物和含有这种组合物的制剂可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。
实施例1 豆类产品的伽马射线辐照申请人发现，豆奶粉进行灭菌操作(例如伽马辐射)前含有高水平的微生物，最多可高达50,000cfu/克。还发现这些产品含有可探测水平的有害微生物成份，例如达到20,000cfu/g的粪链球菌。
申请人使不同量的(例如，从约1g到约200kg)豆奶粉接触1kGy-16kGy的伽马辐射。使总微生物含量低于100cfu/g的所需伽马辐射剂量大约是10KGy。测定出使粪链球菌减少1个对数级的剂量是约3KGy，而发现5KGy的剂量相应地使10克豆奶粉样品中的微生物含量减少到无法探测的水平。不过，用于豆类产品的伽马辐射量最终要由待处理的豆类产品的微生物含量和多少来决定。
实施例2豆类产品的胰蛋白酶抑制性按照厂商指导的方法(EnzChekTM蛋白酶化验试剂盒产品信息，3/15/99修订版；Molecular Probes，Eugene OR)使用EnzChekTM蛋白酶测定试剂盒测定对胰蛋白酶诱导裂解荧光酪蛋白肽的抑制作用。总的来说，不同的豆类制品首先在1X消化缓冲液(在试剂盒中预备)中稀释，并在不同的浓度下与溶解在1X消化缓冲液中的100单位胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)一起保温。用纯的丝氨酸蛋白酶抑制剂(豆类胰蛋白酶抑制剂，来自Sigma，St.Louis，MO)在0.1％，0.01％和O.001％w/v浓度作为阳性对照。接着，1.0mg/ml BODIPYFL酪蛋白储备液通过在与底物(试剂盒中预备)一起提供的小瓶中加入0.2ml去离子水获得，然后，在消化缓冲液中配制成最终浓度为10微克/毫升。在加入或不加入测试物质的情况下，室温下保温胰蛋白酶与BODIPY FL荧光酪蛋白底物一小时后，使用SoftmaxPro3.0软件(Molecular DevicesCorporation)，在SpectraMaxGemini微量滴定板阅读机(Molecular DevicesCorporation，Sunnyvale，CA)上测定荧光(激发波长485nm，发射波长530nm)。每个试验一式三份，每份试样重复两遍。
试验可对用七种不同方法处理的豆类产品进行测量。实例A是碾磨成粉末的豆类(Sunlight Foods Corporation，Taipei County，Taiwan，R.O.C)。实例B是用约8-15KGy的伽马辐射的实例A的大豆粉末。实例C是大豆粉末经过萃取油脂被提取出的大豆粉末(来自Central Soya Company Inc.，FortWeyne，IN的Soyafluff，)。实例D是由去皮豆类和水制得的大豆粉末，然后经过滤、加热、喷雾干燥(Devansoy Farms，Carroll，Iowa)并用7-9KGy的伽马射线辐照。实例E是豆奶粉末，该粉末是通过将大豆与水混合，将混合物加热过夜，在混合物中加入1，3-丁二醇后得到的(来自日本Ichimaru PharcosCO.，Ltd，Gifu的FlavosteroneSB)。实例F是豆奶粉末，该粉末是通过将大豆与水混合，将混合物加热过夜，再加入乙醇后得到的(来自日本IchimaruPharcos CO.，Ltd，Gifu的FlavosteroneSE)。实例G是大豆蛋白提取物(来自法国Laboratories Serobiologiques S.A.，Pulnoy的Vegeseryl HGP LS8572)。所有这些大豆产品均与大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)(Sigma)进行对比。
不同大豆制品对底物的胰蛋白酶裂解抑制作用的百分数通过MicrosoftExcelTM计算并记录在表1中。
表1
如表1所示，STI可以剂量反应方式抑制胰蛋白酶诱导的裂解。实例A，作为大豆粉末，同样具有显著的胰蛋白酶抑制活性。对大豆粉末进行伽马辐射(实例B)在减少大豆粉末的微生物含量的同时，出乎意料未显著影响其胰蛋白酶抑制活性。实例C-G的加热和/或提取加工却明显降低了大豆粉末的胰蛋白酶抑制活性。
实施例3防止Cox-2的上调已知辐射作用可通过上调Cox-2的表达而局部或系统地增加PGE2的产生。Cox-2的这种上调在放疗中具有副作用，而且能抑制Cox-2的药物显示出可以减少这些副作用。我们出人意料地发现非变性豆类提取物通过降低Cox-2的表达而具备抑制Cox-2的活性。
将非GMO大豆(来自Devansoy，Carroll，Iowa)由Natural Product公司(NPI，Grinnel，Iowa)研磨成Enzact大豆粉末，并由Isomedix公司(Mentor，Ohio)进行伽马辐射。大豆粉末(2％)在磷酸盐缓冲盐水中(PBS，来自Invitrogen，Carlsbad，CA)，再用Sonics Vibra-Cell Sonicator(来自Sonics公司，Newton，CT)在冰上超声波降解10秒，重复3次。
HaCaT细胞(一种人类角化细胞系)缓冲液在24孔培养板(～2×104细胞/孔)并在37摄氏度的DMEM+10％胎牛血清(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)中，5％CO2中培养24小时。然后这些细胞在DMEM中血清饥饿24小时。然后3份的HaCaT细胞在DMEM中用大豆试样处理24小时。在除去盖板的曝晒室中在孔中放置PBS，用UVB FS光源(Spectronic公司Westbury，NY，Ble1T156灯泡)进行UVB辐射(30mJ/cm2)。UVB的密度用1UVX辐射计(UVP公司，SanGabrial，CA)测定。辐射后，立刻用DMEM培养基替换PBS。没有接触UVB的细胞用相同方法处理，不同在于不经UVB辐射。UVB6小时辐射后，用100微升的Ambion(Aaustin，TX)RNA裂解缓冲液裂解细胞以提取RNA。根据制造商说明书用Ambion(Austin，TX)的RNAqueous试剂盒提取RNA。来自每个试样的50纳克的总RNA根据厂商说明书用OneStep RT-PCR试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)进行一步式RT-PCR反应。在50摄氏度下进行了30分钟逆转录，然后还包括15分钟的95摄氏度的热启动，来激活反应混合物中的HotStarTaqTMDNA聚合物酶。反应包括各30pmol的COX-2的引物(COX-2正义引物TGA AAC CCA CTC CAA ACA CA；COX-2反义引物CAG CAA ACC GTAGAT GCT CA)，和每个引物中的10pmol的甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH正义引物ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC；GAPDH反义引物；TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA)。PCR对COX-2进行33轮，对GAPDH进行23轮，每轮在94摄氏度下变性50秒，在58摄氏度退火1分钟，在72摄氏度聚合1分钟进行。最后的延伸步骤为72摄氏度10分钟。PCR产品在1.5％琼脂糖凝胶用电泳法解析，用溴乙锭染色。RT-PCR产品的凝胶图像用KodakGel Logic 100显像系统(Eastman Kodak公司，New haven，CT)进行分析。作为Cox-2的表达对于GAPDH管家基因对照的比例，结果如下表2所示。
表2
这些数据显示大豆同时减少了Cox-2表达的基准水平和UVB诱导水平，说明未变性大豆提取物具有Cox-2抑制活性。Cox-2活性的下调应减少由放疗诱导的不良炎症过程。
实施例4Chk-1的激活细胞对由包括UV和离子辐射在内的各种辐射诱导的双链DNA损伤作出反应，诱导Chk-1的磷酸化。Chk-1的活化延迟了细胞周期的进程，同时使细胞有足够的时间修复DNA，从而减少了癌症的危险。我们意想不到地发现未变性大豆提取物诱导Chk-1磷酸化，而且DNA受到损害时该诱导大幅增高。
接触或不接触UVB曝晒，如实施例3所示，HaCat细胞铺板，并同样处理豆类。UVB处理1小时以后收集细胞，用50mM的NaF和1mM的硫基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)的冰PBS液洗涤。加入RIPA缓冲液(200微升)(65mM TRIS，150mM NaCl，1％的NP-40，0.25％的脱氧胆酸钠，1mM的EDTA，PH7.4(来自Sigma，St.Louis，MO)，该缓冲液含有上述磷酸酶抑制剂和Complete MiniProtease Inhibitor Cocktail(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)，细胞用细胞刮机械分离。冷冻裂解液并在-20摄氏度下储存。
试样在4摄氏度时14,000rpm下离心10分钟得到不溶性片状沉淀。采用BioRad Dc Protein Assay(BioRad Labroratories，公司，Hercules，CA)测定总蛋白质。然后试样以1∶1与含有β-硫基乙醇的Laemmli样品缓冲液混合，煮沸5分钟，然后离心。试样对总蛋白归-化，再装到4-20％的Tris-Glycine微型溶胶(Inveitron公司，Carlsbas，CA)。将蛋白质转移到PVDF薄膜(BioRad Labratories公司，Hercules，CA)，用10％的牛奶(来自BioRadLabratories公司，Hercules，CA)封闭并用抗体过夜探测Chk和磷酸Chk(均来自Cell Signaling Technology公司，Beverly，MA)。Chk-2的抗体用做对比。用PBST(1×PBS个0.2％的Tween-20)(Sigma，St.Louis，MO)清洗斑点，用抗兔抗体HRP结合的第二抗体(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)在PBS和5％牛奶中探测1小时，用PBST清洗3次。通过在ECL plus试剂(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)中将印迹孵育1分钟，将过多的液体去除并在Hyperfilm ECL(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)中曝光不同时间，使蛋白质显像。用Konica SRX-101A处理仪(Pacific NorthwestX-ray，Gresham，OR)使胶片显影。结果用Kodak Gel Logic 100成像系统和Kodak 1D成像软件(Eastman Kodak公司，New Haven，CT)进行电子捕获和精度计量确定数量。以下表3描述了Chk-1磷酸化对总Chk-1的比例的结果。由于磷酸化Chk-1在没有DNA损害的细胞中几乎探测不到，这个比例被定义为TLTD(含量太低无法检测)。TLTD比例表明Chk-1的活化水平很低。对Chk-2进行类似研究，作为比照。
表3
这些数据显示，在含有大豆提取物时，当DNA发生损害时Chk-活化增加，从而使DNA更好被修复并减少癌症危险。
实施例5放疗诱导的皮肤损伤的诱导非变性大豆制品包括甘油、螯合剂，软化剂，表面活性剂，皮肤调理剂，抗氧化剂，豆奶粉(5wt％)，防腐剂和皮肤和头发调理剂，以乳液形式施用在12周龄的C3Hf/Kam剃去毛的后腿上，每天两次施用间隔6个小时，在接受辐射前进行10日，接受辐射后5日。一群对照的小鼠接受安慰剂处理。后腿在第11天接受辐射(XRT)(42，45，或48Gy)，进行上述处理3小时后，在小动物137Cs辐射仪上以5.40Gy/min XRT。小鼠(未麻醉)在特制夹具上限制行动，右后腿中心在辐射区域3cm直径内。1小时和24小时XRT后处死多只小鼠，皮肤处理后进行组织学研究。其余小鼠在接受辐射10天后和约35天后每日观察其急性皮肤反应。皮肤状况采用分级的质量对应分值，从红斑，干性脱皮到不同程度的湿性脱皮对皮肤状况进行了评估。对毛发脱落程度也进行了评估。
受试组在进行零处理，安慰剂处理和大豆处理后进行剂量为42Gy，45Gy和48Gy下的单辐射。90只小鼠用于辐射剂量反应实验，72只用于组织学实验。
由于该研究不是在工业化规模下进行，仅仅采用小试制得的乳膏，因此试验材料的稳定性是粗略和不一致的。这可由同时在动物上施用大豆和载体对照的机械创伤而证实。因此，该研究的最好对比样是载体+辐射，而不是单单的辐射。
本实施例中进行的研究的第一部分的结果，即对皮肤反应的评估结果显示相对于载体对照，42Gy和45Gy的剂量下大豆提取物更具有保护性。反应曲线向右漂移，达到峰值反应的时间更长，脱皮分值略小于载体处理组。这些结果在以下表4和5中示出。
急性细微皮肤反应的分值表示0.5红斑(变红)1.0干性脱皮(鳞状外表)
1.5灶性湿性脱皮2.0多区域的湿性脱皮2.5腿上一半处理表面湿性脱皮3.0腿上超过一半湿性脱皮3.5整个接受辐射的区域完全渗出性脱皮。
以下数据表示豆类提取物可减少电离辐射引发的皮肤反应。
表4辐射引发的皮肤反应处理组*峰值皮肤反应**到达峰值的时间(天)从第一次处理 从XRT
*小鼠的腿剃毛，两天后开始施用药剂。介质和豆类每日施用两次，共15天。在第一次施用后9日对腿部进行辐射。
**每日对腿的皮肤反应打分，测定最高(峰)值。皮肤反应分值如前定义。
表5辐射引发的皮肤反应处理组*治疗时间(天)*从XRT 从峰
*小鼠的腿剃毛，两天后开始施用药剂。载体和大豆每日施用两次，共15天。在第一次施用后9日对腿部进行辐射。
**愈合的皮肤反应定义未没有湿性脱皮(例如，小于1.5分)。
可以理解本发明用详细描述进行了说明，该说明书是用于说明本发明，而不是限定本发明的范围，本发明的范围是由附加的权利要求书的范围所确定。其它的特征，优点，以及修改均在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种用于预防或治疗放疗引起的皮肤损伤的组合物，其特征在于，包含非变性豆类产品。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述豆类产品包含非变性大豆产品。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述非变性大豆产品选自大豆粉、大豆奶、大豆奶粉、利马豆粉、利马豆奶、利马豆奶粉、黑豆粉、黑豆奶、黑豆奶粉和它们的组合。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，在组合物中所述非变性大豆产品的含量能够有效预防放疗引起的皮肤损伤。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，组合物中非变性大豆产品的含量占组合物重量的0.1到20％。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，组合物中非变性大豆产品的含量占组合物重量的0.5到15％。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，组合物中非变性大豆产品的含量占组合物重量的1％到10％。
8.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，在组合物中所述非变性大豆产品的含量能够有效治疗放疗引起的皮肤损伤。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，组合物中非变性大豆产品的含量占组合物重量的0.1到20％。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，组合物中非变性大豆产品的含量占组合物重量的0.5到15％。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，组合物中非变性大豆产品的含量占组合物重量的1％到10％。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为乳剂形式。
13.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为乳剂形式。
14.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含软化剂。
15.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含湿润剂。
16.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种下列试剂增亮剂、美黑剂之类的增黑剂、抗痤疮剂、消光剂、抗微生物剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、外用镇痛剂、防晒剂、光防护剂、抗氧剂、角蛋白溶解剂、洗涤剂/表面活性剂、增湿剂、营养物、维生素、能量增强剂、抗汗剂、收敛剂、除臭剂、脱毛剂、生发剂、固化剂、抗茧剂、维生素、漂白剂、脱色剂、发泡剂、调理剂、湿润剂、香料、抗老化剂、防锈剂、抗癌剂、防癌剂和毛发、指甲和皮肤调理剂。
17.一种使用非变性豆类产品治疗或预防放疗引起的皮肤损伤的方法，其特征在于，该方法包括将所述非变性豆类产品涂施到病人皮肤上将会依照所述放疗使用电离辐射辐照的区域上。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述豆类产品是一种非变性大豆产品。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，包括在暴露于辐射之前涂施所述的非变性豆类产品。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，包括在暴露于辐射之前和之后涂施所述的非变性豆类产品。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，包含在暴露于辐射之前大约1到14天，每天涂施所述的非变性豆类产品。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品每天涂施两次，至少间隔6小时。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品在暴露于辐射之前涂施大约1到14天，在暴露于辐射之后至少涂施约30天。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品在暴露于辐射之后涂施。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品在暴露于辐射之后涂施至少30天。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品在每次暴露于辐射之后涂施。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品首先在第一次暴露于辐射之前大约1到14天涂施。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的非变性豆类产品在暴露于辐射完成之后再涂施至少30天。
全文摘要
本发明涉及具有胰蛋白酶抑制活性和减少的微生物含量的非变性豆类产品，使用这种豆类产品、含这种豆类产品的组合物治疗或预防放疗产生的皮肤损伤的方法，和这种豆类产品或组合物对皮肤、指甲和毛发的局部应用。
文档编号A61K9/107GK1733058SQ20051008761
公开日2006年2月15日 申请日期2005年7月18日 优先权日2004年7月16日
发明者M·瑟博格 申请人:强生消费者公司