专利名称：胎儿乙醇综合征的动物模型和治疗方法
技术领域：
本发明涉及胎儿乙醇综合征动物模型，乙醇诱导的胎儿脑过小和与胎儿乙醇综合征有关的其他出生缺陷的关键靶标，还涉及治疗胎儿乙醇综合征的方法，和筛选可以减轻与胎儿乙醇综合征有关的出生缺陷的化合物的方法。
背景技术：
胎儿乙醇综合征(FAS)与怀孕期间母亲乙醇滥用有关，代表主要的公共健康问题。FAS的特征是眼/肠发育、中枢神经系统(CNS)，以及小脑中的异常、生长迟缓，和在怀孕期间滥用乙醇的母亲的胎儿中特征性面部畸形。FAS的发病率在美国是1000例出生中0.5-3例。CNS的发育中的缺陷通常导致智力迟钝和异常的小头，即脑过小(Peng，Neurobiology of Disease，2004)，是出生前乙醇暴露的最严重的后果。FAS中所观察到的其他缺陷为眼缺陷(Peng，IOVS，2004)和肠缺陷(Peng，J.Mol.Biol.，2004)。
乙醇对正发育的脑产生深远而不同的影响。乙醇诱导正发育的大鼠前脑中广泛的凋亡性神经变性，破坏星形胶质细胞的发育并干扰GABA、谷氨酸脱氢酶能、血清素能、多巴胺能、胆碱能和阿片样物质神经元系统的功能。氧化损伤是对以FAS为特征的神经系统功能障碍提出的许多机理之一。已经用大鼠、小鼠和鸡胚胎模型系统表征乙醇诱导的脑损伤的性质。尽管乙醇暴露对于正在发育的脑的影响已经详细记载，但是乙醇导致这些影响的机理还不清楚，这部分是由于当前所用的模型系统的复杂性(也参见Stratton.(编者)，1996；C.Ikonomidou，2000；C.Guerri，1997；M.Guizzetti，2000；L.G.Costa，1999；M.J.Eckardt，1998；H.C.Becker，1996；C.E.Chmielewski，1997；B.Bupp，1998)。
考虑到我们社会中乙醇的广泛使用，需要详细和系统的研究。为了彻底研究和检验所有潜在的机理和有价值的神经保护剂，需要关于乙醇对正发育的胚胎的作用的更简单的模型。这种模型提供了用于检验试剂以确定它们是否可以用于防止或者治疗FAS的机理。
发明概述本发明提供了非洲爪蟾(Xenopus laevis)(非洲有爪蛙)模型系统以研究乙醇对生长发育和生长迟缓的影响。使用本发明的系统可以确定得到明显效果需要用乙醇处理的剂量和最小持续时间。使用该模型，还可以确定针对乙醇诱导的损伤的保护剂。例如，发现维生素C有效防止乙醇诱导的ROS产生和NF-κB活化，同时防止生长迟缓和脑过小。
非洲爪蟾(非洲爪蟾属)是一种温和的淡水动物，其可以通过激素，如人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射，而反复产卵。这些特征，加上胚胎的大尺寸，使得可以进行显微操作和微注射。此外，它们的快速发育使得非洲爪蟾属是分析早期脊椎动物发育的优秀的动物模型。
此外，非洲爪蟾是具有良好表征的发育阶段的最简单的脊椎动物之一。一次可以得到大量胚胎并且可以详细研究乙醇对胚胎发育的影响。此外，非洲爪蟾胚胎可以在它们母亲的体外发育并且因此可以精确控制它们的孵育环境。具有详细记载的发育过程，可以容易地评估乙醇对胚胎的影响；其还允许快速评估早期发育过程。可以容易地除去腹膜内注射乙醇对胚胎发育的母亲系统的代谢影响。
本发明提供了非洲爪蟾作为胎儿乙醇综合征的动物模型。例如，证明本发明的非洲爪蟾胚胎模型在最初神经板阶段到晚神经胚阶段暴露于乙醇是需要的并且足够产生眼缺陷、延迟的肠发育，和类似于在人和小鼠FAS中观察到的那些表型的小头/身体表型。该结果与以前的报导一致，所述报导表明非洲爪蟾从早原肠胚形成期到晚神经胚期暴露于乙醇产生具有明显更小的头部的蝌蚪。当在中神经胚阶段除去乙醇或者在晚神经胚阶段后施用乙醇时，乙醇影响可容易地逆转，并且不会对蝌蚪产生明显影响。这些结果表明起始到晚神经胚阶段期间所得到的改变是关键的，并且可能是导致FAS的最近的原因；并且为干扰提供了机会。因此使用本发明的模型使所需的乙醇暴露窗口变窄。该非洲爪蟾模型中的观察也与在FAS的小鼠和鸡模型中的公布数据相一致。
本发明的非洲爪蟾模型还可以用于阐明抗氧化剂——抗坏血酸(维生素C)抑制乙醇诱导的活性氧成分(ROS)产生和NF-κB活化，并且保护胚胎免于乙醇诱导的脑过小以及生长迟缓。这些结果表明NF-κB和氧化胁迫与乙醇介导的发育缺陷有关，并且表明可能使用维生素C作为针对FAS的新的和有效保护剂。
此外，使用本发明的非洲爪蟾模型，发现几种关键神经基因的表达减少。这些基因包括xPax6、xOtx2、xSox3、xSox2、和xNCAM，其中Pax6最脆弱。将Pax6微注射到非洲爪蟾模型以依赖剂量的方式挽救了乙醇诱导的脑过小并且恢复了xOtx2、xSox3、xSox2、和xNCAM的表达。为了试验活性氧成分(ROS)是否是乙醇诱导的脑过小和xPax6抑制的上游信号，在非洲爪蟾胚胎中过表达过氧化氢酶。过氧化氢酶不仅减少了乙醇诱导的H2O2的形成，而且完全恢复了Pax6表达并逆转了脑过小。相比，xPax6和过氧化氢酶仅可以提供对生长迟缓的部分保护。这些结果第一次表明H2O2介导的Pax6抑制在乙醇诱导的脑过小中的关键角色并且表明存在乙醇诱导的胎儿生长迟缓的额外机理或者治疗。
附图简述从下面的详细描述可以更容易理解本发明的上面的和其他特征和优点，下面的详细描述与附图一起提供，附图中
图1A到图1C显示了建立乙醇处理条件以产生具有类似于在人FAS中观察到的那些表型的非洲爪蟾胚胎。当缺乏乙醇时生长的对照胚胎达到蝌蚪阶段时检查所处理的胚胎。
图1A表明乙醇以依赖剂量的方式影响非洲爪蟾胚胎神经结构的发育。胚胎在30％ MMR(改良的Marc’s Ringer；含有0.5％，0.6％和1％乙醇，不除去乙醇直到晚神经胚阶段(阶段22))中培养。
图1B显示了在阶段13、16和20暴露于乙醇的蝌蚪，这些暴露与更早或更晚的暴露相比似乎产生严重缺陷。胚胎最初在阶段9、11、13、16、18、20、23、25和40暴露于0.6％乙醇，直到阶段45的观察才除去乙醇。
图1C显示了乙醇处理蝌蚪12小时的结果。为了确定产生胎儿畸形所需要的最小持续时间，胚胎在阶段13暴露于0.6％乙醇1、2、4、6、12、24、36和48小时。然后将胚胎转移到新鲜MMR培养基并且允许生长直到对照组达到蝌蚪阶段。12小时暴露(从最初神经板阶段到晚神经胚，阶段13-22)总是导致与对照组相比死亡率增加和头和身体大小显著减小。左图对照组；中间图12小时乙醇处理组；和右图12小时乙醇处理开始前用100μM抗坏血酸预处理的组。
图2A到2M显示了蝌蚪的冠状脑切片的组织学分析，显示乙醇的影响，和维生素C对乙醇诱导的损伤的影响。显示了前脑(图2A到2C)、间脑(图2D到2I)和头盖区(图2J到2L)的代表性切片。图2M显示了乙醇处理的胚胎中维生素C上调的NCAM表达。RT-PCR分析所表明的条件处理的胚胎中NCAM和Pax6表达。EF-1α表达用作相等RNA加样的内部对照。
图3显示了在阶段40的畸形蝌蚪的代表性照片，所述蝌蚪已经暴露于不同浓度(0.3％、0.6％和1％)的乙醇12小时(从阶段13到阶段22)。照片阐明了爪蟾胚胎中乙醇诱导的脑过小。上图为侧视图，中图为背视图，下图分别显示了0％、0.3％、0.6％和1％乙醇处理的蝌蚪的头。底部的值指出表现出脑过小和生长迟缓的胚胎的频率。
图4显示了通过乙醇处理对多种神经基因表达的下调。(A)分子标记的RT-PCR分析，用多种浓度乙醇(如所指出的从0.1％到1％)处理的动物髓盖实施。Pax6神经和眼标记；NCAM全-神经标记；Otx2前部神经区标记；Sox2全-神经标记；Sox3预期的神经外胚层标记；和Vent1一般腹部标记。延伸因子EF-1的表达用作相等RNA加样的内部对照。(B)显示浓度增加的乙醇下神经标记的相对mRNA水平的图。
图5显示通过xPax6表达以依赖剂量的方式从脑过小挽救的胚胎照片。将2细胞阶段的胚胎注射pCS2+或者如所指出的不同剂量的pCS2+xPax6质粒，然后从阶段13到阶段22用0.6％乙醇处理12小时。上图为侧视图，下图为背视图。在图底部指出的值代表体长(长度)和头大小(头)的平均值，这些值计算为对照无乙醇处理组的百分数。
图6显示了xPax6表达对下游神经基因表达的影响的RT-PCR分析。用微注射100pg pCS2+或者pCS2+xPax6表达质粒然后用0.6％乙醇处理的动物髓盖实施RT-PCR分析。
图7表明人过氧化氢酶的过表达显著减少了乙醇诱导的ROS产生并恢复了Pax6和其他神经基因的表达。在每个实验中，将胚胎在2细胞阶段微注射100pg pCMS或者pCMS-CAT表达质粒，并从阶段13直到阶段22用0.6％乙醇处理。在阶段22，收获并分析胚胎。(A)通过EGFP(增强的绿色荧光蛋白)荧光显示的所注射的pCMS-CAT质粒的分布。左边照片在光学显微镜下拍摄，右边照片在荧光显微镜下拍摄；(B)过氧化氢酶蛋白质的表达的蛋白质免疫印迹分析。泳道1和3，用pCMS注射；泳道2和4，分别用50和100pg pCMS-CAT注射。肌动蛋白免疫印迹显示为加样对照。(C)过氧化氢酶对乙醇诱导的H2O2产生的影响。星号表示pCMS载体注射组的显著差异(p＜0.05)；(D)动物髓盖测定中基因表达的RT-PCR分析。
图8显示维生素C对乙醇诱导的ROS产生和NF-κB活化的影响。(A)用或者不用维生素C预处理胚胎2小时后乙醇处理(0.6％，12小时，从阶段13到22)。在阶段22收获胚胎并根据生产商提供的方案(BIOXYTECH H2O2-560试剂盒，OXIS International，Inc.，USA)，通过过氧化氢比色定量方法(总过氧化氢)测量过氧化氢水平；(B)用含有IL-6启动子区与NF-κB结合位点的四个重复的NF-κB萤光素酶报道子质粒(pLuc-NF-κB)测量NF-κB介导的转录活性。
图9显示了非洲爪蟾胚胎中乙醇诱导的生长迟缓和延迟的肠发育。Midneurala阶段胚胎保持在对照10％MSS培养基或者补加0.5％乙醇的相同的培养基中。允许胚胎生长直到对照胚胎(无乙醇)达到蝌蚪阶段(阶段45-46)。然后固定所有胚胎并记录它们的体长和肠形态。(A)对照(左)和乙醇处理的胚胎(右)的侧视图。(B)显示对照(左图)和0.5％乙醇处理的胚胎(右图)的肠形态的代表图。注意当对照胚胎达到阶段45-46时，乙醇处理的胚胎仍然在如所示的阶段41-44。(C)当与对照胚胎(左)相比时，乙醇处理的胚胎(右)的矢状切片显示出肠的迟缓发育，如通过少数肠环和异常的大肠腔所阐明的。下图代表加框区域的高倍放大。
图10显示了阶段23对照(作图)和0.5％乙醇处理的胚胎(右图)的组织学分析。顶部对照和乙醇处理的胚胎的矢状切片用H&E染色。方框指出肠和头间充质的特定区域。底部方框区域的高倍放大，显示了前肠、中肠、后肠和头间充质的放大图。缩写FG，前肠；HG，后肠；HM，后间充质；MG，中肠。
图11显示了(A)延迟的肠发育和胎儿生长之间的相关性。将胚胎用pCMS、pCMS-mtPRDx5、pCMS-cpPRDx5或pCMS-过氧化氢酶表达质粒注射，然后保持在有或没有0.5％乙醇的培养基中。当对照组蝌蚪达到阶段45-46时，固定所有蝌蚪并测量它们的肠发育阶段和体长并将它们用于相关性研究。(B)胚胎中PRDX5和过氧化氢酶的表达有差别地恢复了肠标记表达。将胚胎用pCMS、pCMS-mtPRDX5、或pCMS-过氧化氢酶表达质粒注射，然后用或不用所指出的乙醇处理。通过RT-PCR确定肠标记的表达。(C)肠发育中乙醇诱导的延迟的分子基础的示意图。
发明详述在下面的详细描述中，参考所附附图，这些附图形成本发明的一部分并且为了阐明显示本发明可以在其中实施的特定代表性实施方案。足够详细地描述了这些实施方案以使得本领域技术人员能够实施本发明，并且可以理解可以利用其他实施方案，并且可以进行改变而不背离本发明的精神和范围。所描述的处理步骤的进展是本发明的实施方案代表；然而，这些步骤的顺序不限于本文中提出的顺序，并且可以如本领域中公知的进行改变，但是必须以某一顺序发生的那些步骤除外。
非洲爪蟾模型的胚胎收集和实验条件。通过如在前描述的(Peng，2000)体外受精得到非洲爪蟾胚胎。使用Nieuwkoop和Faber(Nieuwkoop和Faber，1994)的标准确定胚胎的发育阶段。在每个实验中，从dejellied胚胎收集2-4细胞阶段的胚胎。达到所指定的阶段后，将胚胎分组，每组含有15-20个胚胎。然后将每组在含有10ml30％ MMR，有或者没有乙醇的塑料培养皿中孵育12小时。允许胚胎在室温(22℃)下发育约48小时，直到对照组达到蝌蚪阶段(阶段45)。用于产生眼缺陷(Peng等人，2004)、延迟的肠发育(Peng)、脑过小(Peng等人)，和生长迟缓(Peng)的条件在所附参考文献中详细显示。
脑过小和生长迟缓的形态学测量。将蝌蚪在30％ MMR中2％多聚甲醛中固定，通过光学显微术检查它们的形态，并以固定放大率拍照以测量体长和头宽。记录下面的标准(1)正常/畸形/死亡胚胎数；(2)在爪尖和尾尖之间测量的体长，和(3)在蝌蚪的两眼之间最宽水平处测量的宽度。
维生素C处理。收集阶段13(最初神经板阶段)的胚胎并将其分组，每组含有15-20个胚胎并在含有如上述的MMR培养基的塑料培养皿中孵育。12小时乙醇暴露同时、2小时前或者2小时后加入浓度为100μM的维生素C。固定蝌蚪并如上所述的进行测量。
脑损伤的组织学分析。将胚胎在2％多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋。将胚胎通过头冠状切片并用苏木精和伊红染色。
ROS测量。乙醇暴露前2小时用维生素C处理胚胎，然后将其转移到存在或不存在0.6％乙醇的培养基中培养12小时(从阶段13到阶段22)。实验结束时，收获胚胎并通过过氧化氢的比色定量方法(总过氧化氢物)，按照生产商(BIOXYTECH H2O2-560试剂盒，OXISInternational，Inc.美国)提供的方案确定总ROS含量。
NF-κB报道子测定法。含有IL-6启动子区与NF-κB结合位点的四个重复的NF-κB萤光素酶报道子质粒(pLuc-NF-κB)用于测量NF-κB介导的转录活性(Li，1997)。将处于2细胞阶段的胚胎按照所述文章中所示的用pLuc-NF-κB注射，在阶段22收获并裂解。确定蛋白质浓度。测量萤光素酶活性并将其计算为每毫克蛋白质相对萤光素酶活性。
RT-PCR从阶段8.5的胚胎解剖动物髓盖并培养于存在或不存在不同浓度乙醇的67％ Leibovitz’s L-15培养基(pH7.5)直到阶段22。用Trizol试剂(Invitrogen)从培养的动物髓盖提取总RNA。NCAM和Pax6的引物组和PCR条件已经在我们以前的报导(Peng，Neurobiol.Dis.，2004；Peng，J.Mol.Biol.，2004)中描述。将PCR产物进行TBE凝胶上的电泳并通过溴化乙锭染色显现。尽管显示了来自各个实验的数据，但是在所有情况中在多个实验中证实所述结果。
质粒构建。通过将全长人过氧化氢酶cDNA插入哺乳动物表达质粒pCMS-EGFP(Clontech，Palo Alto，CA)(其处于CMV启动子控制下)中制备人过氧化氢酶(pCMS-CAT)的表达质粒，EGFP的表达受到单独的SV40-启动子的控制。由W.A.Harris和M.E.Zuber(UCSD，USA)提供表达载体。
过氧化氢酶和Pax6测定法如在前描述的(Peng等人，2000)通过体外受精得到非洲爪蟾胚胎。用Nieuwkoop和Faber(Nieuwkoop和Faber，1994)的标准确定胚胎的发育阶段。在每个实验中，收集2-细胞阶段胚胎并用过氧化氢酶的表达质粒(pCMS-CAT)、xPax6表达质粒(pCS2+xPax6)或者xSox2表达质粒(pCS2+xSox2)微注射到两个卵裂球的每一个中。达到阶段13后，将胚胎分组，每组20个胚胎，将其在10ml 30％改良Marc’s Ringer(MMR)中孵育12小时直到阶段22，其中MMR中存在或不存在所指出的不同浓度的乙醇。由于乙醇是挥发性的，所以在乙醇处理期间每4小时用新鲜培养基替换实验培养基以便使得乙醇浓度波动最小。在阶段22，将胚胎转移到无乙醇的10ml30％MMR中并允许生长直到对照组达到蝌蚪阶段(阶段40或45)。固定并检查蝌蚪。每个实验重复至少一次，得到可再现的结果。
动物髓盖外植体测定。从阶段8.5的胚胎解剖动物髓盖并在存在或不存在不同浓度的乙醇的67％ Leibovitz’s L-15培养基(pH7.5)中培养直到阶段22(约20h)。用TRIZOL试剂(Invitrogen)从动物髓盖或者完整胚胎提取总RNA。用Superscript系统(Invitrogen)逆转录总RNA，并通过PCR扩增靶基因的第一条链cDNA。用于PCR的引物为xOtx-2(SEQ ID NO1，5’-GGATGGATTTGTTGCACCAGTC-3’；和SEQID NO2，5’-CACTCTCCGAGCTCACTTCTC-3’)；xSox2(SEQ ID NO3，5’-GAGGATGGACACTT-ATGCCCAC-3’；和SEQ ID NO4，5’-GGACATGCTGTAGG-TAGGCGA-3’)；xSox3(SEQ ID NO5，5’-ACCAACACTACCAGAGTGCC-3’和SEQ ID NO6，5’-CCCAA-CACATCATCCCTACC-3’)；xPax6(SEQ ID NO7，5’-CAGAACATCTTTTACCCAGGA-3’和SEQ ID NO8，5’-ACTACTAGGCGA-3’)；xNCAM(SEQ ID NO9，5’-CACAGTTCCACCAAATGC-3’和SEQ ID NO10，5’-GGAATCAAGCGGTACAGA-3’)；xVent-1(SEQ ID NO11，5’-TTCCCTTCAGCATGGTTCAAC-3’和SEQ ID NO12，5’-GCATCTCCTTGGCATATTTGG-3’)；xSox17α(SEQ ID NO13，5’-GATGGTGGTTACGCCAGCGA-3’和SEQ ID NO14，5’-TGCGGGGTCTGTACTTGTAG-3’)；xVegT(SEQ ID NO15，5’-CAAGTAAATGTGAGAAACCG-3’和SEQ ID NO16，5’-CAAATACACACACATTTCCC-3’)；EF-1α(SEQ ID NO17，5’-CAGATTGGTGCTGGATATGC-3’和SEQ ID NO18，5’-ACTGCCTTGATGACTCCTAG-3’)。
蛋白质免疫印迹。将阶段25的胚胎通过移液用含有2mM苯甲基磺酰氟的冷PBS裂解。裂解物在12.5％SDS-PAGE凝胶上分离并转移到Immobilon聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。将膜用针对人过氧化氢酶(Calbiochem，La Jolla，CA)的多克隆抗体探测并通过ECL+Plus试剂(Amersham)显色。
统计学分析。使用不成对斯氏t检验确定显著差异。对于多重比较，使用具有多重比较的单向ANOVA。认为p值小于0.05是统计学上显著的。
结果确定了产生具有FAS表型(包括显著更小的身体和头部尺寸)的非洲爪蟾胚胎所需的乙醇处理的剂量、开始时间，和持续时间。本实施方案的非洲爪蟾模型中乙醇暴露条件对头部大小和体长产生容易检测的影响并且允许进行潜在保护剂的功效试验。
通过将原肠胚形成中期(阶段11)胚胎暴露于含有0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、1％、1.5％或2％乙醇的30％ MMR，允许它们生长直到对照“无乙醇”处理组达到蝌蚪阶段(阶段45)，并检查它们的形态确定产生显著畸形的胚胎所需的乙醇处理的剂量。乙醇暴露导致死亡和畸形蝌蚪的数目的依赖剂量的增加，并且畸形蝌蚪同样显示出显著形态改变(脑过小和生长迟缓，分别通过眼睛之间的宽度和体长确定；图3)。尽管胚胎通常抗0.3％乙醇，但是胚胎暴露于0.4％、0.5％、0.6％、1％、1.5％和2％导致与对照无乙醇治疗组相比身体和头部尺寸显著减小的蝌蚪(表1和图3)。在特定实施方案中，胚胎暴露于至少约0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％乙醇。值得注意地，乙醇处理的非洲爪蟾胚胎表现出多种生长缺陷，包括水肿、体轴弯曲(未显示)。然而，神经结构总是发育不全(图1A)。
表1乙醇剂量对蝌蚪的生存力和形态的影响a
a来自代表性实验的数据，每组15个胚胎。平均值和SD显示为对照组的平均值的百分数。
bN正常的；def畸形的。
c体长在爪尖和尾尖之间测量的活蝌蚪的身体的长度；宽度/眼在最宽水平处测量的眼之间的宽度。
*P＜0.05与暴露于无乙醇的对照组显著不同。
**P＜0.001与暴露于无乙醇的对照组非常显著不同。
经典畸形学的主要原理之一是致畸剂对所影响的器官产生的影响的严重性非常依赖于该器官在发育的敏感阶段是否暴露于该致畸剂(Hannigan等人，1999)。据认为在脑生长激增期间暴露于乙醇造成乙醇诱导的脑损伤。在非洲爪蟾中，起始神经发育在阶段11，并持续到阶段22。
确定了非洲爪蟾胚胎对乙醇处理敏感的时间窗口。将胚胎在阶段9、11、13、16、18、20、23、25和40暴露于0.6％乙醇并生长直到对照“无乙醇”组达到蝌蚪阶段。然后检查蝌蚪的形态(表2)。在最初神经板阶段(阶段13)的暴露似乎产生最严重的缺陷，较早(从原肠胚形成，阶段11)或较晚暴露(晚神经胚阶段，阶段20)都导致更小程度的损害。阶段9之前或者阶段25之后的胚胎抗乙醇的致畸效应；蝌蚪与对照的蝌蚪显著不同(未显示)。当阶段40蝌蚪暴露于0.6％乙醇时，观察到高死亡率(80％)，然而，存活的蝌蚪表现正常。在阶段13、16和20暴露于乙醇的蝌蚪的照片在图1B中显示。高百分比胚胎显示出曲轴，当胚胎在阶段13暴露于乙醇时该现象也是明显的。
表2损害的严重性与起始乙醇暴露的发育阶段有关
为了确定产生胎儿畸形所需的最小持续时间，阶段13的胚胎暴露于0.6％乙醇1、2、4、6、12、24、36或48小时。然后将胚胎转移到新鲜培养基并允许生长直到对照组达到蝌蚪阶段。似乎暴露小于6小时在蝌蚪的生存力或形态中都不产生显著影响。12小时暴露(从最初神经胚到晚神经胚，即阶段13-22)与对照“无乙醇”组相比，总是产生增大的死亡率和头和身体尺寸的显著减小(图1C)。长于24小时(36或48小时)的暴露时间不显著增加伤害的严重性(未显示)。从而，在一个实施方案中，胚胎暴露于乙醇(例如，0.6％)至少约6、7、8、9、10、11或12小时。
抗坏血酸(维生素C)显著防止乙醇诱导的生长迟缓和脑损伤。已经提出氧化损伤是乙醇改变正发育的脑的主要机理之一(Hannigan，2000和Ozer，2000)。使用本发明的非洲爪蟾模型试验了充足和安全的抗氧化剂，例如，抗坏血酸(维生素C)对乙醇诱导的缺陷的影响。在12小时乙醇处理开始之前或之后2小时或者同时将非洲爪蟾胚胎在100μM抗坏血酸中孵育。发现用维生素C预处理胚胎显著降低了乙醇诱导的脑过小和生长迟缓的严重性，因为那些胚胎的头部大小和体长恢复到接近对照值(表3，第5排；图1C)。
表3维生素C对乙醇诱导的损伤的保护效果
值代表平均值±SD。用具有多重比较的单向ANOVA分析了显著差异。
aP＜0.001与0.6％乙醇处理组显著不同。
bP＜0.001与对照无乙醇组显著不同。
对阶段45的蝌蚪的组织学检查揭示在加入乙醇前2小时加入维生素C显示出对前脑区的显著恢复(图2A到2L)。当与对照相比时用乙醇处理的蝌蚪中前脑区的大小减小(比较图2A和2B)。然而，在乙醇之前或者同时加入维生素C可以缓和乙醇的损伤性影响(图2C)。灰质和白质的大小没有显示出与对照的显著差异。另一方面，在间脑区(图2D到2I)中，乙醇的效果不是那么严重。如图2D-F中所示，灰质和白质的区域和神经元细胞的形态没有显著改变。仅发现与对照相比乙醇处理的蝌蚪中导管的宽度改变(比较图2G和2H)。同时加入维生素C不能使导管变窄(图2I)。在头盖区(图2J到L)，乙醇处理的蝌蚪的大小没有显著减小，灰质和白质的大小也没有减小。然而，神经元细胞的大小似乎比对照更大。同时加入维生素C可以减小乙醇的影响。与这些形态学观察吻合的是，通过维生素预处理也显著恢复了泛-神经标记NCAM和神经和眼标记(Pax6)的表达(图2M)。仅维生素C对脑发育没有不利影响。检测作为相等RNA负荷的内部对照的EF-1转录物。
乙醇暴露减少了神经标记的表达。在该实施方案中，使用本发明的模型系统阐明了神经发育中乙醇诱导的改变的机理并使用动物髓盖测定进一步检查乙醇对几种分子神经标记表达的影响。非洲爪蟾动物髓盖由多能细胞组成并且可以经诱导形成神经、中胚层、或者表皮组织，并且是评估多种因子对神经发育的活性的有用组织。将动物髓盖用所指出的不同浓度的乙醇处理。如图4中所示，在从0.1％到0.6％的浓度范围内，乙醇以依赖剂量的方式抑制Pax6(神经和眼标记)、NCAM(泛神经标记)、Otx2(外部神经区标记)、Sox2(泛神经标记)，和Sox3(预期的神经外胚层标记)的表达，其中Pax6最易受抑制。Pax6的表达受到低至0.1％、0.2％和0.3％(65mM)乙醇浓度的抑制分别为25％、50％和90％。NCAM表达在0.1％、0.2％、0.3％和0.4％乙醇时分别减少15％、25％、50％和70％。相比，Otx2、Sox2和Sox3表达对乙醇较不敏感并且一般腹部标记Vent1的表达不受严重影响。
xPax6的异位表达足够挽救乙醇诱导的脑过小。为了试验乙醇介导的Pax6的抑制是否是脑过小的关键因素，进行了挽救实验。用对照载体或者不同浓度(0、5、10、25、50、和100pg)的xPax6表达质粒pCS2+xPax6(Henderson等人，1999)注射到胚胎的2细胞阶段的两个卵裂球并暴露于对照培养基或者0.6％乙醇12小时(从阶段13到阶段22)。允许注射的胚胎生长到阶段40，然后将它们的头大小和体长与用空质粒pCS2+注射和没有乙醇处理的对照胚胎的头大小和体长比较。xPax6或者仅空质粒的表达对胚胎发育没有影响。此外，xPax6的异位表达依赖剂量地恢复乙醇诱导的脑过小和生长迟缓(图5)。在50和100pg xPax6处理组中观察到最大保护，其中蝌蚪的平均头大小与对照组没有显著不同。然而，体长仅部分恢复到对照组的平均94％(n＝50，p＜0.05，与对照组显著不同)。在单独实验中，将100pg pCS2+xSox2或者pCS2+质粒注射到2细胞阶段胚胎的动物极(n＝50)并在如关于Pax6所描述的相同条件下用0.6％乙醇处理这些胚胎。Sox2的过表达没有显著防止脑过小或者生长迟缓(数据未显示)。用pCS2+xSox2注射的蝌蚪的明显脑过小和生长迟缓的频率为48％，相比在pCS2+注射组中为52％。此外，畸形蝌蚪中头大小和体长没有显著差异(数据未显示)。这些结果表明与Pax6相比，Sox2的异位表达不能明显防止乙醇诱导的脑过小和生长迟缓。
然后使用动物髓盖测定法检查xPax6对其他神经标记的表达的影响。将胚胎注射100pg pCS2+xPax6或者对照质粒pCS2+。在阶段8.5，解剖动物髓盖，然后在对照培养基或者含有0.6％乙醇的培养基中孵育直到阶段22。微注射pCS2+xPax6质粒恢复了xPax6基因的表达。此外，它还将其他神经标记Otx2、Sox2、Sox3和NCAM的表达恢复到接近正常水平(图6)，表明Pax6的抑制是上游事件。与形态学测量一起，这些结果表明Pax6是乙醇的关键靶标和神经发育的关键调节剂，从而xPax6的表达足够防止乙醇诱导的脑过小并诱导神经基因表达并且可以表达为治疗剂。该数据还表明生长迟缓没有完全由xPax6挽救，表明额外的途径可能参与乙醇诱导的生长迟缓。
过氧化氢酶的异位过表达防止正发育的胚胎中乙醇诱导的ROS产生和脑过小。已经提出活性氧组分(ROS)导致的氧化胁迫是FAS的病因。由于H2O2是胎儿乙醇暴露产生的主要ROS(Ozer等人，2000)，所以通过过氧化氢酶的保护作用检查消除乙醇诱导的H2O2产生是否可以防止脑过小。通过用100pg过氧化氢表达质粒pCMS-CAT微注射2细胞阶段胚胎在非洲爪蟾胚胎中过表达人过氧化氢酶，然后从阶段13到22用或不用0.6％乙醇处理胚胎。通过在阶段22的EGFP荧光的观察(图7A)和通过在阶段40对过氧化氢酶蛋白质的免疫印迹分析(图7B)证实了过氧化氢酶的存在。为了阐明ROS的体内产生，在阶段22收获胚胎以分析H2O2。这些结果表明乙醇显著增加了体内H2O2产生，其可以通过过氧化氢醇的表达有效消除(图7C)并且暗示了根据该实施方案的治疗选择。
更重要地，过氧化氢酶减轻乙醇诱导的脑过小。微注射100pg过氧化氢酶表达质粒使头大小恢复到对照组的平均81％到98％(与对照没有显著不同)，表明该酶保护胚胎免于乙醇诱导的脑过小。类似于xPax6的作用，过氧化氢酶对生长迟缓提供了较小的保护作用，因为其仅使体长恢复到对照的平均84％到93％(表1)。
表4过氧化氢酶对乙醇诱导的损伤的作用
从两个实验组合数据，对于每个实验每组20个胚胎。以对照组的平均值百分数显示平均值和SD。如“方法”中描述的测量体长和眼距。值以平均值±SD给出。ap＜0.05，与对照pCMS-EGFP组显著不同，bp＜0.05，与pCMS-EGFP+乙醇组显著不同。
过氧化氢酶恢复Pax6和其他神经基因的表达。用非洲爪蟾动物髓盖测定法确定过氧化氢酶是否通过调节Pax6信号传导途径发挥其保护作用。微注射仅过氧化氢酶表达质粒对Pax6、Otx2、Sox2、Sox3、和NCAM的表达没有影响。另一方面，过氧化氢酶使Pax6、Otx2、Sox2、Sox3、和NCAM的乙醇诱导的抑制恢复到与没有乙醇处理的对照组相当的水平(图7D)。为了检验通过ROS递送是否可以模拟乙醇的影响，将动物髓盖用100M H2O2代替乙醇处理。我们证明H2O2也降低了Pax6、Otx2、Sox2、Sox3、和NCAM的基因表达(图7D)。这些结果一起表明Pax6基因表达的ROS-介导的抑制在乙醇诱导的脑过小中起关键作用。这尤其重要，如上面所讨论的，因为Pax6是最脆弱的并最重要的乙醇靶标之一。过氧化氢酶对脑过小和生长迟缓的不同的保护作用还暗示氧化胁迫可能仅是乙醇诱导的异常的潜在机理之一。
维生素C抑制乙醇诱导的ROS以及NF-κB活化。在另一实施方案中，显示了维生素C保护发育中的脑免于乙醇诱导的损害的机理，并通过胚胎中过氧化氢的水平测量了作为乙醇诱导的脑损伤的介质的活性氧组分的机理。图8A表明存在乙醇时胚胎中过氧化氢水平显著增加。当乙醇处理前用维生素C预处理胚胎时过氧化氢的这种上升受到抑制。与表型观测一起考虑，维生素C似乎防止乙醇诱导的ROS产生。ROS的该下调可能部分是维生素C的神经保护活性的原因。
NF-κB是神经转录因子，其通常以细胞质中被IκB结合的无活性形式存在。活化时，NF-κB与IκB解离并转移到细胞核中，在其中NF-κB活化转录。乙醇与幼稚大鼠脑中NF-κB的活化相关(Ward等人，1996)。然而，以前还没有表明NF-κB活化是否在乙醇诱导的脑损伤和生长迟缓中起作用。在该实施方案中，通过报道构建体pLuc-NF-κB测量了完整胚胎中NF-κB活性，其中pLuc-NF-κB在2细胞阶段注射到胚胎中。如上文中描述的用0.6％乙醇处理经注射的胚胎，和萤光素酶r活性。
当胚胎达到阶段22是记录到报道分子。当乙醇损害时，胚胎中NF-κB活性增加。当用维生素预处理胚胎时，NF-κB活性的增加受到抑制，表明乙醇以依赖活性氧组分的方式诱导完整胚胎中NF-κB活化(图8B)。
表5.有和没有乙醇暴露的蝌蚪中肠发育阶段和体长的比较
能够产生延迟的肠成熟和生长迟缓的乙醇浓度(0.5％)暗示了该模型与人FAS的相关性和可应用性。胚胎在阶段13和阶段22之间(约12小时)暴露于0.5％乙醇产生的蝌蚪具有脑过小11(头小)、眼异常(脉络膜裂不完全封闭)12，和生长迟缓(表5，图9A)，以及肠发育的显著延迟(图9B)。Chalmers和Slack13详细记载阶段42胚胎的正常非洲爪蟾肠仅是短的厚管。其然后在不同的阶段转化成显示出明确的环形模式的长薄管。在阶段46，肠由不同的胃、近端小肠、小肠的外部旋管、小肠的内部旋管、大肠的外部旋管、和远端大肠组成。如图9B和表5中所示，阶段13-22之间的短暂乙醇暴露产生肠成熟的显著延迟，其可以通过检查蝌蚪肠的环形模式确定。尽管所有对照蝌蚪的肠都达到发育阶段45-46，但是0.5％乙醇处理的蝌蚪的肠仍然处于发育阶段42-44(表5，图9B)。在形态上，乙醇处理的组表现出肠中形成的环的数目的明显减少(图9B)。为了试验乙醇在肠的不同部分的形态学作用，我们对蝌蚪阶段(发育阶段42-46，图9C)和尾芽期(阶段23，图10)的对照和乙醇处理的矢状切片进行H&E染色。在蝌蚪阶段，与对照相比，乙醇处理组具有少数肠环和异常大的肠腔。然而，我们没有观察到乙醇在阶段23的尾芽的肠的特定区域(前肠、中肠或者后肠)或者头间充质中的任何形态学效果。
两栖动物肠在变态期间经历广泛重塑。非洲爪蟾变态期间肠的形态学已经由Sundqvist和Holmgren14详细描述。简言之，在前变态(NF阶段56-59)时，蝌蚪肠的长度约为150mm。在NF阶段61-62，蝌蚪肠缩短约2/3，在NF阶段65-66，为15-20mm。通过观察肠形态可以容易地区分这些改变。为此，我们跟踪了从阶段42直到阶段65的乙醇处理的和对照蝌蚪的肠形态。我们观察到当正常蝌蚪在阶段45-46时环状模式的显著不同(图9B和表5)。之后，该差异变得较不明显。当在阶段60检查肠时，在乙醇处理的和对照组之间没有发现差异。这些结果表明短暂乙醇暴露导致关键发育阶段肠发育的延迟，并且当撤销乙醇时该延迟是可以逆转的。相比，从阶段13开始持续的乙醇暴露导致蝌蚪在约阶段45-50时死亡。
为了描绘ROS和RNS在延迟的肠发育和生长迟缓中的原因，我们检查了过氧化氢酶和mtPRDX5和cpPRDX5的体内保护效果20，21。将对照载体或者mtPRDX5、cpPRDX5和过氧化氢酶的表达质粒注射到2细胞期胚胎的两个卵裂球中，并在阶段13到22之间用含有0％或0.5％乙醇的培养基处理。所有三种酶的过表达都提供了针对乙醇诱导的延迟肠发育和生长迟缓的不同程度的保护，其中mtPRDX5提供了最大的保护(表5)。我们还检查了每个个体蝌蚪中肠发育阶段和体长之间的相关性。发现了显著正相关性(r＝0.73)，表明延迟肠发育和生长迟缓之间存在因果关系(图10A)。
除了进行这些形态学研究外，我们还通过动物髓盖外植体测定法检查了过氧化氢酶和mtPRDX5对关键肠发育基因的影响。如图10B中所示，乙醇抑制Sox17、Pax6和VegT的表达。微注射仅过氧化氢酶没有任何效果。然而，其挽救了Pax6和VegT表达的乙醇介导的抑制，但是不能挽救Sox17基因表达。相比，mtPRDX5不仅恢复了Pax6和VegT的表达，还恢复了Sox17基因的表达。这些结果表明ROS和RNS代表乙醇诱导的延迟肠发育的两种不同的机理，它们分别抑制Pax6/VegT或Sox17(图10C)。
基于上述观察，本发明还提供了筛选可以用于保护或者治疗，即预防或者治疗FAS的试剂的方法，该方法使用本发明的非洲爪蟾胚胎模型。可通过多种方法检测这种试剂对出生缺陷的减少，所述方法包括，但不限于，观察形态学变化，和测量胚胎的动物髓盖中神经标记表达的水平，即Pax6、Sox2、Sox3，和/或NCA的表达水平。
此外，本发明提供了通过使用导致或者增强Pax6表达的试剂治疗FAS的方法。这种试剂包括，但不限于，维生素C、过氧化氢酶，或者使用上述筛选方法可以选择的其他试剂。在另一实施方案中，本发明提供了通过施用导致NF-κB活化的抑制的试剂治疗FAS的方法。这种试剂包括维生素C和/或通过本发明的筛选方法可以选择的多种试剂。
讨论非洲爪蟾是胎儿乙醇综合征的动物模型。在该研究中，阐明非洲爪蟾在起始神经板阶段到晚神经阶段暴露于乙醇是所需要的并且足够产生类似于在人和小鼠FAS中观察到的小头/身体表型。该结果与以前的报导吻合，所述报导表明非洲爪蟾从早原肠胚形成阶段到晚神经胚阶段暴露于乙醇产生具有显著更小的头部的蝌蚪(Nakatsuji，1983)。使用本发明的非洲爪蟾模型，将所需要的乙醇暴露时间窗口变窄。该非洲爪蟾模型中的观察也与FAS的小鼠(Olney，等人，2002)和鸡(Natsuki，1990)模型中公布的数据吻合。
当在中神经胚阶段之前除去乙醇或者晚神经胚阶段后施用乙醇时，乙醇影响可以容易地逆转并且不对蝌蚪产生显著影响。这些结果表明在起始到晚神经胚阶段期间获得到改变是关键的，并且可能是FAS的最接近的原因，并且存在干预的机会。
抗氧化剂可以保护抗乙醇诱导的脑损伤。根据本发明，抗氧化剂维生素C可以减小乙醇诱导的脑损伤和生长迟缓的严重性。非常可能维生素C通过减小乙醇处理的胚胎中ROS水平发挥其神经保护作用。在大鼠模型中，当乙醇施用同时用叶酸处理怀孕大鼠时，乙醇介导的氧化胁迫的量得到减轻(Cano，等人，2001)。叶酸的抗氧化能力似乎与其保护作用有关。维生素E或者β-胡萝卜素保护胚胎海马培养物抵抗400-2400mg/dl乙醇处理(Mitchell，等人，1999)。与我们的研究一起考虑，似乎掺入抗氧化剂的营养治疗可能帮助保护母亲乙醇滥用导致的有害的胎儿影响。
乙醇和NF-κB。表明乙醇能够通过与活性氧组分有关的途径调节不同生理背景中的NF-κB活性。因此，加入抗氧化剂可以消除乙醇对细胞NF-κB活性的影响(Altura，2002和Toldano，1991)。用本发明的非洲爪蟾模型得到关于该观点的其他证据，因为用抗氧化剂维生素C预处理非洲爪蟾胚胎显著减小了过氧化氢产生以及乙醇诱导的NF-κB活化。
乙醇对NF-κB活性的调节是组织特异的。通常，乙醇下调或者不会对免疫系统中NF-κB产生直接影响，但是活化其他组织中的NF-κB。例如，乙醇自身不能活化T-淋巴细胞中NF-κB，但是可以通过TNF-α，以依赖ROS的方式加强NF-κB活化(Dong等人，2000)。在单核细胞中，乙醇通过下调NF-κB干扰炎性细胞因子产生，导致免疫力受损(Mandrekar，1997和Mandrekar，1999)。相比乙醇是脂质过氧化和脑血管肌细胞中NF-κB活化的强力诱导剂(Altura，2002)。乙醇还可以通过NF-κB信号转导的活化导致在成骨细胞中产生生成破骨细胞的细胞因子而导致骨损失。此外，当短期注射乙醇时可以在幼稚大鼠的脑中检测到NF-κB诱导(Ward等人，1996)。
使用根据本发明的非洲爪蟾模型第一次阐明了NF-κB活化可能与乙醇诱导的脑发育损伤有关。乙醇诱导的NF-κB活化可以受到处理时产生的ROS的介导。
使用本发明的非洲爪蟾模型可以对控制神经发生和生长的重要基因的鉴定提供了解。将Pax6鉴别为乙醇对胎儿发育的有害作用的关键靶标，因为Pax6的过表达有效挽救了乙醇诱导的脑过小。此外，使用非洲爪蟾胚胎方便地进行实验使得非洲爪蟾是研究和阐明乙醇诱导的失调的分子基础，和研究有效神经保护治疗的优秀模型系统。
Pax6的氧化胁迫介导的抑制是乙醇诱导的脑过小的关键靶标并且是乙醇诱导的生长迟缓的部分原因。长期以来，活性氧组分(ROS)诱导的氧化胁迫都与FAS有关(Guerri等人，1994；West，1994；Henderson等人，1995；Henderson等人，1999)。在脑来源的细胞中体外进行的研究表明乙醇刺激ROS的产生，ROS包括氧自由基，如超氧化物(O2-)和羟基自由基(·OH)，和非自由基，像H2O2。认为这些高度活性和不稳定的组分主要通过破坏几乎所有类别的生物分子(包括DNA、蛋白质、脂质、糖，和多糖)而发挥它们的有害作用(Henderson等人，1999)，导致信号转导受损和最终细胞死亡。来自该研究和根据本发明的多种实施方案的结果表明ROS可能通过调节神经发育的关键基因的表达导致脑损伤。ROS可以扰乱这些基因的转录或者抑制神经发生的信号转导途径。
脑对于氧化损伤非常敏感，因为脑具有高水平氧消耗，然而其抗氧化机理没有良好地发育。例如，脑中过氧化氢酶仅为肝脏中的约10％(Marklund等人，1982)。此外，脑富含多不饱和脂肪酸，其是脂质过氧化的良好底物(Floyd和Carney，1992)。因此，可以想象乙醇可以通过增加脑内ROS的浓度在非洲爪蟾胚胎中产生脑过小，ROS又可以抑制关键调节基因的表达并从而影响胎儿发育。
过氧化氢酶催化H2O2向O2和H2O的分解，并提供针对氧自由基的毒性作用的保护。该酶在成年人组织中到处表达。作为天然的保护机理，过氧化氢酶的表达受到乙醇和大鼠胚胎中高氧条件的诱导(Aspberg和Tottmar，1994；Mover和Ar，1997)。以前表明过氧化氢酶能够通过阻断自由基形成而在体外提供胚胎CNS神经元的存活(Walicke等人，1986；Martin等人，1987；Chau等人，1988)。类似于Pax6，过氧化氢酶的过表达降低了乙醇处理的胚胎具有脑过小的频率，但是其不能完全防止生长延缓。其原因当前还未知。然而，根据本发明，过氧化氢酶可以通过减小体内H2O2水平并正常化Pax6表达逆转乙醇的致畸效应并且可用作治疗。
本报告第一次直接描绘了ROS和乙醇诱导的损伤之间的因果关系。我们阐明了过氧化氢酶针对乙醇诱导的H2O2产生以及乙醇诱导的脑过小和生长迟缓的保护效果。更重要地，通过动物髓盖测定法显示了H2O2和Pax6信号转导之间的关系，所述测定法中100M H2O2通过抑制Pax6和其他神经基因的表达模拟乙醇的影响。
神经发育由几种主要过程组成，这些过程包括神经启动、保持、分化等等。神经启动早在阶段10发生，之后其他过程逐渐加入该任务并且共存直到形成完整神经系统。Pax6是含有同源域的转录因子，其对于脑、脊髓、眼、鼻、垂体和胰的发育是重要的(Callaerts等人，1997)。在CNS中，Pax6与脑图式形成、神经元特化、神经元迁移、和轴突延伸有关(Osumi，2001)。Pax6还作为神经胶质-神经元反式分化的控制开关(Heins等人，2002)。Pax6在脑发育中的关键角色通过纯合Pax6突变小鼠得到证明，所述小鼠表现出CNS的严重异常，包括前脑图式形成缺陷(Stoykova等人，1996)和畸形大脑皮质(Gotz等人，1998；Pratt等人，2000)。根据本发明的实施方案，还证明乙醇下调Pax6表达并且诱导非洲爪蟾胚胎中脑过小，这与脑发育中Pax6的关键功能相吻合。
Sox2(Sry相关的HMG因子)不足以导致神经分化，但是作为辅因子帮助外胚层细胞加强它们的神经死亡和进一步应答细胞外信号(Peng等人，2002)。这些结果一致表明Sox2的异位表达不足以防止乙醇诱导的脑过小和生长迟缓，但是仅相同剂量xPax6的异位表达恢复了乙醇诱导的脑过小并部分挽救了生长迟缓(图5)。与Sox2一样，其他神经标记Sox3、Otx2和NCAM表达没有Pax6对乙醇敏感。基于这些结果，Pax6是最重要的乙醇靶标之一，尽管其他基因也可能与脑过小表型有关。
Sox17，一种Sry相关的HMG盒转录因子，作为脊椎动物内胚层决定子或者内胚层发育的专性介质。Pax6在神经组织和眼的发育中具有多种角色，并且还在十二指肠GIP细胞和远端胃的胃泌素和促生长素抑制素细胞的发育中起关键作用24。VegT是启动内胚层形成所需的母亲T-盒转录因子。其在活化并加强Nodal相关的TGFβ信号转导的内胚层特定转录序位的顶部附近起作用。VegT还诱导内胚层基因Bix1、Bix3、Bix4、Milk、Mix.1、Mix.2、Mixer、XSox17 alpha、Gata4、Gata5、Gata6和内胚素(endodermin)、前内胚层基因Xhex和Cerberus，和组织者特异基因xlim1的必需下游转录调节子的表达25。基于Sox17、Pax6和VegT在胚胎发育中的关键角色，我们推测这些基因的下调很大程度上造成在我们的非洲爪蟾模型中观察到的乙醇诱导的延迟的肠发育和生长迟缓。
已经提出乙醇通过增加ROS和RNS的产生促进对组织的氧化和亚硝化(nitrosative)胁迫17，19，26。ROS包括氧自由基如超氧化物(·O2-)和羟基(·OH)，和非自由基，像过氧化氢(H2O2)和臭氧(O3)，然而RNS包括许多高反应性含氮自由基和非自由基，如一氧化氮(·NO)、二氧化氮(·NO2)、亚硝酸(HNO2)，和过氧化亚硝酸(ONOO-)。ROS和RNS都是强氧化剂。当过量存在时，这些活性组分可以压倒细胞抗氧化防御机制，导致细胞凋亡、染色体异常、脂质过氧化，和蛋白质损害。该研究的结果表明ROS和RNS也可以影响基因表达。妊娠期高水平ROS和RNS可以干扰基因表达的一般内部机理并且损害肠组织发育的动力学。我们证明乙醇特异抑制VegT、Pax6和Sox17的表达，但是对其他肠发育基因具有明显更小的影响。这提高乙醇诱导肠发育基因的特定子集下调的可能性。此外，尽管过氧化氢酶的异位表达仅恢复了VegT/Pax6的表达，但是PRDX5可以恢复VegT/Pax6以及Sox17的表达。这表明氧化胁迫和亚硝化胁迫可能靶定不同的基因。
非洲爪蟾模型具有明确的发育阶段、体外培养、快速发育和容易操作，该模型似乎是研究FAS的分子基础的优秀模型，其局限是非洲爪蟾不可能表现出哺乳动物皮质的皮质迁移异常，因为该爪蟾“皮质”比哺乳动物皮质的组织简单得多。
上面描述的方法和装置阐明可以使用和生产的优选方法和典型装置。上面的说明书和附图阐明实施方案，其实现了本发明的目标、特征和优点。然而，本发明不打算受到上面描述和阐明的实施方案的严格限制。在下面的权利要求书的精神和范围内对本发明的任何修改(尽管当前预料不到)都认为是本发明的部分。
参考文献这里将下面的引用完整并入本文作为参考以补充该发明Y.Peng，K.H.Kwok，P.H.Yang，S.S.Ng，J.Liu，O.G.Wong，M.L.He，H.F.Kung，M.C.Lin，抗坏血酸抑制ROS产生、NF-κB活化并防止乙醇诱导的生长迟缓和脑过小.Neuropharmacology.2005，48(3)426-34.Y.Peng，P.H.Yang，S.S.Ng，O.G.Wong，J.Liu，M.L.He，H.F.Kung，M.C.Lin.，Pax6在乙醇诱导的胎儿脑过小中的关键角色，Neurobiol Dis.，2004，16(2)370-6.Y.Peng，P.H.Yang，Y.Guo，S.S.Ng，J.Liu，P.C.Fung，D.Tay，J.Ge，M.L.He，H.F.Kung，M.C.Lin.过氧化氢酶和peroxiredoxin 5保护非洲爪蟾胚胎抵抗乙醇诱导的眼异常.InvestOphthalmol Vis Sci.2004；45(1)23-9.Y.Peng，P.H.Yang，S.S.Ng，C.T.Lum，H.F.Kung，M.C.Lin.，通过peroxiredoxin 5和过氧化氢酶保护非洲爪蟾胚胎抵抗乙醇诱导的延迟的肠成熟和生长迟缓，J.Mol.Biol.，2004，340(4)819-27.Y.Peng，K.H.Kok，R.H.Xu，K.H.Kwok，D.Tay，P.C.Fung，H.F.Kung，M.C.Lin，母亲冷可诱导的RNA结合蛋白是非洲爪蟾胚胎肾形成所需的，FEBS Lett.，2000，48237-43.P.D.Nieuwkoop和J.Faber，非洲爪蟾(Daudin)的正常表格从受精卵到变态结束的发育的系统的和按时间顺序的调查，Garland Pub，New York，1994.J.J.Li，C.Westergaard，P.Ghosh，N.H.Colburn，核因子-κB的抑制剂核蛋白质-1活化的活化剂阻断瘤性转化应答，Cancer Res.，1997，573569-76.J.H.Hannigan，L.P.Spear，N.E.Spear，引言乙醇和酒精中毒的研究为关于正发育的脑的研究提供了怎样的信息，J.H.Hannigan(编者)，Alcohol and alcoholismeffects on brain anddevelopment，Lawrence Erlbaum Associates，London，1999.J.H.Hannigan，R.F.Berman，改善大鼠中胎儿乙醇相关的神经发育精神病研究药物和环境治疗，Neurotoxicol.Teratol.，2000，22103-11.E.Ozer，S.Sarioglu，A.Gure，出生前乙醇暴露对神经迁移、神经发生和小鼠脑中脑髓鞘形成的影响，Clin.Neuropathol.，2000，1921-5.G.I.Henderson，J.J.Chen，和S.Schenker.乙醇、氧化胁迫、活性乙醛，和胎儿，Front.Biosci.，1999，4D541-D550.R.J.Ward，Y.Zhang，R.R.Crichton，B.Piret，J.Piette，P.de Witte，体内乙醇施用后鉴定大鼠中核转录因子NFκB，FEBS Lett.，1996，389119-22.N.Nakatsuji，早期胚胎暴露于乙醇化导致的非洲爪蟾蝌蚪中颅面畸形，Teratology，1983，28299-305.J.W.Olney，T.Tenkova，K.Dikranian，Y.Q.Qin，J.Labruyere，C.Ikonomidou，正在发育的C57BL/6小鼠脑中乙醇诱导的凋亡性神经退化，Brain Res.Dev.Brain Res.，2002，133115-26.R.Natsuki，乙醇对鸡胚中脑生物胺核磷脂的影响，ArukoruKenkyuto Yakubutsu Ison，1990，25497-508.M.J.Cano，A.Ayala，M.L.Murillo，0.Carreras，叶酸针对在怀孕和哺乳期通过母亲乙醇长期消费导致产后21天大鼠中产生的氧化胁迫的保护作用，Free Radic.Res.，2001，341-8.J.J.Mitchell，M.Paiva，M.B.Heaton，抗氧化剂维生素E和β-胡萝卜素保护抵抗胚胎大鼠海马培养物中乙醇诱导的神经毒性，Alcohol，1999，17163-8.B.M.Altura，A.Gebrewold，A.Zhang，B.T.Altura，乙醇诱导快速脂质过氧化和脑血管平滑肌中核因子κB的活化与大鼠中乙醇诱导的脑损伤的有关，Neurosci.Lett.，2002，32595-8.M.B.Toledano，W.J.Leonard，通过体外氧化减弱调节转录因子NF-κB结合活性，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1991，884328-32.Q.Dong，S.Kelkar，Y.Xiao，S.Joshi-Barve，C.J.McClain，S.S.Barve，乙醇增强CD4+Jurkat T淋巴细胞中TNF-α可诱导的NFκB活化和HIV-1-LTR转录，J.Lab Clin.Med.，2000，136333-43.P.Mandrekar，D.Catalano，G.Szabo，人单核细胞中核调节因子-κB的乙醇诱导的调节，Alcohol Clin.Exp.Res.，1997，21988-94.P.Mandrekar，D.Catalano，G.Szabo，在人单核细胞中通过乙醇抑制脂多糖介导的NFκB活化，Int.Immunol.，1999，111781-90.Z.Yao，J.Zhang，J.Dai，E.T.Keller，乙醇激活人成骨细胞样细胞中NFκB DNA结合和p561ck蛋白质酪氨酸激酶，Bone，2001，28167-73.C.Guerri，C.Montoliu，J.Renau-Piqueras，自由基机理参与乙醇的毒性作用与胎儿乙醇综合征有关，Adv.Exp.Med.Biol.，1993，366291-305.J.R.West，关于乙醇破坏正发育的神经系统的机理的最近发现，Alcohol，1994，Suppl.2395-399.G.I.Henderson，B.G.Devi，A.Perez，S.Schenker，子宫内乙醇暴露引起大鼠胎儿中氧化胁迫，Alcohol Clin.Exp.Res.，1995，19714-720.S.L.Marklund，N.G.Westman，E.Lundgren，和G.Roos，正常和瘤性人细胞系和正常人组织中的含铜和锌超氧化物歧化酶、含锰超氧化物歧化酶，和谷胱甘肽过氧化物酶，Cancer Res.，1982，421955-1961.R.A.Floyd和J.M.Carney，自由基对蛋白质和DNA的损害经历氧化胁迫的大脑的相关机理和相关发现，Ann.Neurol.，1992，32S22-S27.A.Aspberg和O.Tottmar，大鼠脑细胞中再聚集培养物中过氧化氢酶活性的乙醇诱导的增加是由于增加的少突神经胶质细胞分化，Alcohol.Clin.Exp.Res.，1994，18620-624.H.Mover和A.Ar，长期暴露于低氧和高氧的大鼠的胚胎和胎盘中抗氧化酶活性，Comp.Biochem.Physiol.，Part CPharmacol.，Toxicol.Endocrinol.，1997，117151-157.P.Walicke，S.Varon，和M.Manthrope.纯化维持培养的CNS神经元生存的人血红细胞蛋白质，并且将其鉴定为过氧化氢酶，J.Neurosci..1986，61114-1121.E.M.Martin，S.D.Skaper和S.Varon，体外神经元的过氧化氢酶保护不涉及培养基中过氧化物的积累，Int.J.Dev.Neurosci.，1987，51-10.R.M.Chau，S.D.Skaper和S.Varon，葡萄糖利用的过氧化阻断和CNS神经元培养物的生存，Neurochem.Res.，1988，13611-616[34]P.Callaerts，G.Halder和W.J.Gehring，发育和进化中的PAX-6，Annu.Rev.Neurosci，1997，20483-532.N.Osumi，Pax6在脑图式形成中的角色，Tohoku J.Exp.Med.，2001，193163-174.N.Heins，P.Malatesta，F.Cecconi，M.Nakafuku，K.L.Tucker，M.A.Hack，P.Chapouton，Y.A.Barde和M.Gotz，神经胶质细胞产生神经元转录因子Pax6的角色，Nat.Neurosci.，2002，5308-315.A.Stoykova，R.Fritsch，C.Walther和P.Gruss，小眼缺陷小鼠中前脑图式形成缺陷，Development，1996，1223453-3465.T.Pratt，T.Vitalis，N.Warren，J.M.Edgar，J.O.Mason和D.J.Price，Pax6在后丘脑及其皮质连接的正常发育中的角色，Development，2000，1275167-5178.Y.Peng，R.H.Xu，J.M.Mei，X.P.Li，D.Yan，H.F.Kung和J.M.Phang，作为骨形态生成蛋白4信号转导中协同因子的C-jun的神经抑制，Neuroscienee，2002，109657-664.K.Stratton，C.Howe，和F.Battaglia，(编者)，胎儿乙醇综合征诊断、流行病学、预防和治疗，National Academy Press，Washington，D.C.，1996.C.Ikonomidou，P.Bittigau，M.J.Ishimaru，D.F.Wozniak，C.Koch，K.Genz，M.T.Price，V.Stefovska，F.Horster，T.Tenkova，K.Dikranian，和J.W.Olney，乙醇诱导的凋亡性神经退化和胎儿乙醇综合征，Science，2000，2871056-60.C.Guerri和J.Renau-Piqueras，乙醇、星形神经胶质和脑发育，Mol.Neurobiol.，1997，1565-81.M.Guizzetti和L.G.Costa，蛋白激酶C zeta在星形细胞瘤细胞的蕈毒碱受体-诱导的增殖中的可能角色，Biochem.Pharmacol.，2000，601457-66.L.G.Costa和M.Guizzetti，毒蕈碱胆碱能受体信号转导作为乙醇的发育神经毒性的潜在靶标，Biochem.Pharmacol.，1999，57721-6.M.J.Eckardt，S.E.File，G.L.Gessa，K.A.Grant，C.Guerri，P.L.Hoffman，H.Kalant，G.F.Koob，T.K.Li，和B.Tabakoff，适度乙醇消费对中枢神经系统的影响，AlcoholClin.Exp.Res.，1998，22998-1040.H.C.Becker，J.L.Diaz-Granados，和C.L.Randall，乙醇在小鼠中的致畸作用简述，Pharmacol.Biochem.Behav.，1996，55501-13.C.E.Chmielewski，L.M.Hernandez，A.Quesada，J.A.Pozas，L.Picabea，和F.A.Prada，乙醇对发育期间鸡视网膜的内层的影响，Alcohol，1997，14313-7.B.Bupp，Sr.和I.A.Shibley，Jr.，不同鸡品种中乙醇的致畸性，Alcohol，1998，33457-64.
权利要求
1.胎儿乙醇综合征(FAS)的非洲爪蟾胚胎模型，其包含显示出胎儿乙醇综合征(FAS)相关的出生缺陷的非洲爪蟾胚胎，所述缺陷由该胚胎短暂乙醇暴露的特定条件导致。
2.根据权利要求1的模型，其中所述特定条件包括暴露于至少约0.4％到约1％乙醇。
3.根据权利要求2的模型，其中暴露在胚胎生长的起始神经板阶段和晚神经胚阶段之间发生。
4.根据权利要求2的模型，其中暴露为约6到约12小时。
5.根据权利要求1的模型，其中出生缺陷包括水肿、体轴弯曲、脑过小、肠缺陷、眼异常，和生长迟缓，并且特定条件包括在胚胎生长的起始神经板阶段和晚神经胚阶段之间暴露于约0.4％到约1％乙醇。
6.筛选保护或治疗FAS的试剂的方法，该方法包括(i)在权利要求1的非洲爪蟾胚胎模型的短暂乙醇暴露之前、之后或同时对该胚胎施用所述试剂；和(ii)检测与对照相比胚胎中出生缺陷的减少。
7.权利要求6的方法，其中通过观察与对照相比胚胎的形态来检测出生缺陷的减少。
8.权利要求6的方法，其中通过测量胚胎中神经标记表达水平来检测出生缺陷的减少。
9.权利要求8的方法，其中神经标记为Pax6、Otx2、Sox2、Sox3、和/或NCAM。
10.得到胎儿乙醇综合征的非洲爪蟾胚胎模型的方法，其包括将非洲爪蟾胚胎在该胚胎发育期间置于短暂乙醇暴露的特定条件下以产生显示出与FAS一致的出生缺陷的蝌蚪。
11.根据权利要求10的方法，其中特定条件包括暴露于约0.4％到约1％乙醇。
12.根据权利要求11的方法，其中暴露在胚胎生长的起始神经板阶段和晚神经胚阶段之间发生。
13.根据权利要求11的方法，其中暴露发生约6到约12小时。
14.根据权利要求10的方法，其中出生缺陷包括水肿、体轴弯曲、脑过小、肠缺陷、眼异常，和生长迟缓。
15.预防或治疗FAS的方法，其包括将维生素C以有效减轻FAS影响的量施用于动物。
16.根据权利要求15的方法，其中在动物暴露于乙醇前施用维生素C。
17.根据权利要求15的方法，其中在动物暴露于乙醇同时施用维生素C。
18.治疗FAS的方法，其包括施用有效导致或者增强Pax6表达的试剂量。
19.权利要求18的方法，其中所述试剂是维生素C。
20.权利要求18的方法，其中所述试剂是过氧化氢酶。
21.治疗胎儿乙醇综合征(FAS)的方法，其包括施用有效导致NF-κB活化抑制的试剂量。
22.权利要求21的方法，其中所述试剂是维生素C。
23.制备胎儿乙醇综合征(FAS)的非洲爪蟾胚胎模型的方法，其包括提供非洲爪蟾胚胎；将该胚胎暴露于一定量乙醇一定时间以足够诱导FAS特征性或者与FAS有关的出生缺陷。
24.根据权利要求22的方法，其中该胚胎暴露于浓度至少约0.4％到约1％的乙醇，时间为约6到约12小时，并且暴露在胚胎生长的起始神经板阶段和晚神经胚阶段之间发生，以及出生缺陷包括水肿、体轴弯曲、脑过小、肠缺陷、眼异常，和生长迟缓。
25.根据权利要求23的方法产生的具有FAS特征性出生缺陷的非洲爪蟾FAS模型。
26.根据权利要求24的方法产生的具有FAS特征性出生缺陷的非洲爪蟾FAS模型。
全文摘要
提供了用于研究乙醇对胎儿发育的影响的非洲爪蟾(非洲有爪蛙)胚胎模型。非洲爪蟾胚胎在特定发育阶段暴露于乙醇以依赖剂量和时间的方式导致类似于人类胎儿乙醇综合征(FAS)中观察到的具有脑过小和生长迟缓的蝌蚪。本发明还提供了筛选试剂以确定其预防和治疗FAS的有用性的方法。此外，本发明提供了通过施用试剂，如包括维生素C和过氧化氢酶的试剂预防或者治疗动物中FAS的方法，所述试剂导致或者增强Pax6(其为神经和眼标记)的表达。此外，本发明提供了通过施用导致NF－κB活化的抑制的试剂，如维生素C，预防或者治疗FAS的方法。
文档编号A61K31/375GK1799631SQ200510091478
公开日2006年7月12日 申请日期2005年8月12日 优先权日2004年8月13日
发明者彭英, 林李家宓, 孔祥复, 杨百皓 申请人:香港大学