专利名称：系列单抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及生物医药领域，主要是HAb18G/CD147功能表位区的临床及制药领域的应用。
背景技术：
目前全世界每年新增1000万癌症患者，而且癌症的发病率呈急剧上升趋势。据世界卫生组织估计，每年全世界死于癌症患者约600万.我国1995年主要疾病死亡率及死亡原因构成中，恶性肿瘤排列第2位，占死亡总人数的21.85％。其中发病率较高的肿瘤有胃癌(占癌总死亡率21.76％)、肝癌(17.83％)、肺癌(15.19％)、食管癌(15.02％)等。长期以来，由于肿瘤高复发、高转移的恶性特点，一直是治疗疗效亟待解决的问题。目前国内外抗癌治疗关注的热点之一是抗肿瘤的浸润、转移。肿瘤的转移规律极其复杂，涉及诸多因素，如(1)蛋白水解酶；(2)血管生成因子；(3)粘附因子，如整合素，选择素，钙粘合素等；(4)相关运动因子；(5)瘤细胞信号转导。在肿瘤的侵袭、转移过程中，癌细胞诱导效应细胞分泌蛋白水解酶，降解细胞外基质，其中基质金属蛋白酶(MMPs)最为重要，目前已发现了20余种，它们几乎能降解细胞外基质的所有成分。MMPs的作用可概括为(1)降解间质，破坏胶原限制肿瘤生长的机械屏障作用；(2)破坏基底膜完整性，利于癌细胞穿过血管壁进入血流；(3)通过对细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管或转移灶的形成。由于MMPs在肿瘤侵袭转移中的重要作用，因而肿瘤组织中MMPs的来源一直是人们研究的重点问题。近年来多个实验室研究发现，CD147分子与肿瘤细胞膜有关，可刺激肿瘤间质成纤维细胞分泌MMPs，且最近的一篇文献报道，CD147分子不仅能刺激MMPs的产生，而且还与MMPs在肿瘤细胞表面形成复合物，这种复合物的形成相当于将MMPs浓缩在肿瘤细胞周围，有利于肿瘤细胞周围基质的降解，使肿瘤细胞易于扩散和转移。目前，抗间质降解多采用酶抑制剂，如天然酶抑制剂—组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)，能够与MMPs结合并抑制酶活性，但TIMPs在组织中含量极微且难于提取，人工重组TIMPs是大分子蛋白质，存在降解和口服吸收不良等问题。人工合成的拟肽类金属蛋白酶抑制剂，如Batimastat(BB-94)，只能抑制早期肿瘤诱导产生的MMPs的活性，几乎不能抑制晚期肿瘤诱导产生的大量MMPs的活性，导致III期临床实验的停止。
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)在我国患病人数达300余万。发病年龄轻，致残率高。其临床特点为累及到周身关节的增殖性和侵蚀性滑膜炎，呈进行性病变终生反复不断，被认为是类似“局限性恶性肿瘤”的增生性和破坏性病变，自发性缓解极为罕见。晚期由于关节软骨及骨的损伤而导致关节强直、畸形和功能障碍，病变亦可侵犯浆膜、心肺、动脉、神经及眼等结缔组织。RA组织病理学特征是滑膜衬里过度增生和衬里下层大量炎性单个核细胞浸润。成纤维细胞样滑膜细胞和滑膜组织巨噬细胞在关节损伤中起最重要的作用。这两种细胞均能大量产生MMPs。此外，骨关节炎与老龄化密切相关，随着人类寿命的延长发病率增高，软骨细胞、滑膜细胞和成纤维细胞产生MMPs，亦在骨关节炎发病中起重要作用。这些酶以协同作用方式能够消化滑膜、关节软骨和软骨下骨的所有主要的细胞外基质组分。RA滑膜中EMMPRIN(CD147)的表达上调，可诱导局部产生MMPs 1、2、3等蛋白水解酶，且可导致MMPs和TIMPs的不平衡最终引起RA关节的破坏。此病至今尚无特效治疗。90年代以来，国内外学者采用仿效结核病和恶性肿瘤的联合疗法，是此类疾病治疗学上的一大突破，使部分患者病情得到较长期缓解，生活质量得到提高，但并未治愈疾病。抑制软骨和骨侵蚀仍是此病治疗亟待解决的问题。但迄今有关应用酶抑制剂抗间质降解的临床实验结果与上述抗肿瘤转移治疗一样令人失望。
发明内容
本发明提供CD147家族成员HAb18G/CD147功能表位区氨基酸序列，及其做为抗肿瘤复发、转移和抗类风湿性关节炎、骨关节炎的临床应用及治疗性药物的靶位。
HAb18G/CD147分子的功能表位区氨基酸序列，其具有序列表<400>1或<400>2的序列。
上述功能表位区氨基酸序列在制备用于治疗抗肿瘤复发、转移和抗类风湿关节炎、骨关节炎药物中的应用。
本发明首次发现了HAb18G/CD147的功能区，可作为靶向分子，设计、筛选并合成它的拮抗剂；阻断效应细胞(成纤维细胞、滑膜细胞)诱导分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的功能；减少肿瘤组织间质的降解、关节软骨侵蚀、新生血管(血管翳)的形成；达到治疗肝癌等肿瘤的复发、转移，以及类风湿性关节炎和骨关节炎的目的。因此，该功能表位的发现具新药开发的前景。筛选有效的针对此功能区的治疗剂，在高位阻断效应细胞分泌MMPs，也是类风湿性关节炎和骨关节炎治疗的新途径和发展趋势。
图1为5株抗体作用下的明胶酶谱。
图2为5株抗体作用下的肝癌细胞HHCC的侵袭力实验结果直方图。
图3为HAb18G/CD147分子模建示意图。
具体实施例方式
一、HAb18G/CD147功能区21AAGTVFTTVEDLG33和39LTCSLNDSATEV50的确定(一)抗体的制备及功能利用HAb18G/CD147的胞外区免疫Ba1b/c小鼠，通过杂交瘤技术获得单抗1B3，3B3，5A12，6H8，这五株单抗都能和HCC结合。明胶酶谱实验(见附图1)显示这五株单抗都具有抑制肿瘤细胞刺激其周围基质细胞分泌MMPs的作用。侵袭力实验(见附图2)表明这些抗体能抑制肿瘤细胞的侵袭能力。
明胶酶谱实验肝癌细胞HCC和人胚肺成纤维细胞各(fb)培养至对数期用2.5g/L胰酶消化，以105/孔的密度接种于96孔板中，培养24h。弃去培养上清，换无血清培养液。加入终浓度为100μg/ml的单抗，并设立阴性对照孔。37℃培养20小时后，收集无血清培养细胞上清。以1％明胶为底物配制一定体积的8％分离胶和5％浓缩胶，取培养上清与样品缓冲液混合，上样电泳，电泳停止后，将胶放入Triton X-100溶液中复性，在明胶酶孵育缓冲液中孵育。染色、脱色、观察、拍片。图1中1为单独fb培养，2为HCC和fb共培养，3为单独HCC，4为HCC和fb共培养，加单抗1B3，5为HCC和fb共培养，加单抗3B3，6为HCC和fb共培养，加单抗HAb18，7为HCC和fb共培养，加单抗5A12，8HCC和fb共培养，加单抗6H8。由图1可见在抗体的作用下，与对照相比(1，2)MMP-2的分泌明显降低(4-8)。
Borden Chamber侵袭力实验在小室(chamber)内膜上加入Matrigel胶，放至胶干。用2.5g/L胰酶消化HCC和fb细胞，离心洗涤。用含0.1％BSA的RPIM-1640悬起，加入上室，同时在上室加入终浓度为100μg/ml的单抗。在小室的下室24孔板内加入500μl趋化剂。将24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中培养20h。取出小室，弃去培养液，95％乙醇固定25min，滤膜HE染色，梯度酒精脱水，用棉签擦去上室中的Matrigel胶及细胞，切下滤膜；透明后封片。在40×光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，随机计数膜上4个视野，每细胞计数3份，求出其平均值，测验重复3次。由图2可见，与对照相比，5株抗体均能不同程度地抑制肿瘤细胞的侵袭能力。
(二)抗体的表位作图将HAb18G/CD147胞外区分段表达，应用Western-blot和ELISA的方法确定这五株抗体的功能表位。实验证实这五株抗体的表位分别为HAb1839LTCSLNDSATEV503B3，5A1239LTC411B321AAGTVFTTVEDLG336H848TEV50因此认为39LTCSLNDSATEV50和21AAGTVFTTVEDLG33为HAb18G/CD147的功能区。
(三)合成肽证实实验结果分别对两段表位功能区合成多肽，利用ELISA和Western-blot的方法证实五株抗体的表位确实在这两段上。
(四)抗原HAb18G/CD147结构的分子模建使用Modeller 8vl1对HAb18G/CD147胞外段进行分子模建，使用WAM2对抗体HAb18可变区进行分子模建，得到两者最优化结果后，利用ZDOCK 2.33进行蛋白—蛋白对接模拟，结果说明在HAb18G/CD147胞外第二个loop环段与抗体重链可变区存在较强的相互作用残基对，这与实验结果相互吻合。在Chrimera下绘制的HAb18G/CD147分子模型图见图3。由图3可见，HAb18G/CD147分子由两个球形部分组成，在第一个球形部分内，有一个暴露在外的环形结构(红色所示)，为5株抗体的识别功能表位。
二、所述的HAb18G/CD147功能区作为制备抗肿瘤复发、转移和抗类风湿关节炎、骨关节炎治疗剂的靶位。
本发明人在长期从事肝癌免疫导向药物研究的基础上，获得肝癌高亲和力单抗HAb18的相应膜抗原HAb18G的cDNA全长序列，发现其与CD147的序列高度同源，通过基底膜侵袭实验和明胶酶谱实验分析，体外实验表明HAb18G/CD147与其效应细胞(癌周成纤维细胞)结合，诱导产生MMPs，使肿瘤组织中MMPs含量及活性显著提高，间质成分和血管基底膜的胶原蛋白过度降解，癌细胞穿过基底膜及结缔组织屏障不断侵袭扩散，证实HAb18G分子在肝癌中发挥的作用同CD147分子在其它肿瘤上发挥的作用相同，可大大促进肝癌细胞的侵袭和转移。基于以上研究基础，以及HAb18G/CD147在正常肝细胞中不表达，在肝癌上为高表达的特点，故可通过阻断HAb18G/CD147分子的作用来抑制肝癌转移。本发明首次发现肝癌转移相关因子HAb18G/CD147的功能区，为靶向分子，设计、筛选并合成它的拮抗剂；阻断效应细胞成纤维细胞诱导分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的功能；减少肿瘤组织间质的降解、关节软骨侵蚀、新生血管(血管翳)的形成；达到治疗肝癌等肿瘤的复发、转移，以及类风湿性关节炎和骨关节炎的目的。
鉴于MMPs通过直接降解软骨、骨组织和间接促进血管形成而参与RA关节破坏。因此抑制MMPs是治疗RA的基本途径之一。我们经免疫组化法证明HAb18G/CD147分子在滑膜细胞上有明确定位。所以，该功能区的发现可能在类风湿关节炎及骨关节炎等疾病的治疗中具有潜在的应用价值。
序列表<110>陈志南<120>系列单抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列及其应用<160>2<210>1<211>13<212>PRT<213>人<400>1Ala Ala Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp Leu Gly5 10 13<210>2<211>12<212>PRT<213>人<400>2Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr Glu Val5 10 1权利要求
1.系列单抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列，其具有序列表<400>1或<400>2的序列。
2.如权利要求1所述功能表位区氨基酸序列在制备用于治疗抗肿瘤复发、转移和抗类风湿关节炎、骨关节炎药物中的应用。
全文摘要
本发明提供系列单抗作用的HAb18G/CD147功能表位氨基酸序列，其具有序列表<400>1或<400>2的序列，以及上述功能表位区在制备用于治疗抗肿瘤复发、转移和抗类风湿关节炎、骨关节炎药物中的应用。本发明首次发现了HAb18G/CD147的功能区，可作为靶向分子，设计、筛选并合成它的拮抗剂；阻断效应细胞(成纤维细胞、滑膜细胞)诱导分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的功能；减少肿瘤组织间质的降解、关节软骨侵蚀、新生血管(血管翳)的形成；达到治疗肝癌等肿瘤的复发、转移，以及类风湿性关节炎和骨关节炎的目的。因此，该功能表位的发现具新药开发的前景。
文档编号A61P35/00GK1749268SQ20051009620
公开日2006年3月22日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者陈志南, 库晓明, 汪莉, 李郁, 杨向民, 杨滨 申请人:陈志南