专利名称：治疗多囊病的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及多囊疾病领域，及涉及该疾病的诊断和治疗。
背景技术：
常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)是最常见的遗传性肾病，发病率为1∶1000个体，其特征表现为在所有肾小管中的病灶囊肿形成(Friedman，J.Cystic Diseases of the Kidney，In PRINCIPLESANDPRACTICEof MEDICALGENETICS(A.Emery and D.Rimoin，Eds.)pp.1002-1010，ChurchillLivingston，Edinburgh，U.K.(1983)；Striker & Striker(1986)Am.J.Nephrol.6161-164.肾外症状包括肝和胰腺囊肿，及心血管并发症。Gabow &Grantham(1997)Polycystic Kidney Disease，in DISEASES OF THEKIDNEY(R.Schrier & C.Gottschalk，Eds.)，PP.521-560，Little Brown，Boston；Welling& Grantham(1996)Cystic Diseases of the Kidney，in RENALPATHOLOGY(C.Tisch & B.Brenner，Eds.)pp1828-1863，Lippincott，Philadelphia。
目前为止，仅PKD1和PKD2被认为是与这些细胞异常有关的分子。据报道，PKD1和PKD2分别占导致这些疾病的原因的85％和15％。Burn，et al.(1995)Hum.Mol.Genet.4575-582。尽管在对ADPKD在遗传性和病理生理方面的了解已经取得了显著的进步，但是对于疾病形成基因引发囊肿形成的突变如何进行和其它分子在囊肿表型中起到什么样的重要作用仍然是不清楚的。
因此，需要特征化参与囊肿表型的生物化学途径，并能找出另外的治疗靶点。本发明可以满足这样的需要，并能提供相关改进。
发明内容
本发明涉及通过修饰下述表2到5中所列的至少一个基因的生物活性来诊断和治疗肾囊肿病的组合物和方法。这里使用的术语“肾囊肿病”包括(但不限于)大量疾病，包括多囊肾病、vonHippel-Lindau、tuberosclerosis、肾消耗病、常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)、常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD)、获得性肾囊肿(ACKD)和常染色体显性遗传多囊肝病(ADPKD)。
仅作为举例说明，结缔组织生长因子(CTGF)基因或其表达产物为下述表2到5中所列基因中的一个。因此，尽管下面要进行的讨论和实施例大多数是涉及CTGF基因和其生物等同物，但本发明并不限于此。该申请涉及的发明包括表2到5中所列的任一个基因，将它们作为治疗和药物干预的靶点；CTGF仅是这些靶点中的一个。因此，应该理解的是，尽管没有详细说明，表2到5中所列的任何一个基因都可代替本发明使用的术语“CTGF”。
一方面，本发明提供了一种修饰表2到5中所列的至少一个基因的生物活性的方法，通过将有效量的改性剂和分子与需要治疗的细胞或组织接触。该方法中使用的合适的改性剂包括但不限于小分子、核酶(ribozyme)、反义寡核苷酸、双链RNA、双链干扰RNA(iRNA)、三链RNA、RNA适配物，和结合到基因产物上并抑制其活性的抗体分子的至少一部分。或者，在一些实施方案中，这些改性剂结合到受体上，并引发信号传递。所述这样抗体部分的例子包括但不限于完整的抗体分子、单链可变区(ScFv)、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述抗体可以在任何合适的体内或体外系统中产生，如猿、小鼠、大鼠或人。合适的抗体可从Torrey Pines Biolabs，Inc.(Cat.No.TP 143)或Santa Gruz Biotechnology，Inc.(SC 14939)商业获得。所述抗体可任选地结合到细胞毒素部分、治疗部分、可检测部分或抗囊肿药上。一方面，所述改性剂或分子先被分离，然后再被传递。
本发明还提供了治疗或改善异常胆囊机能障碍和与组织中胆囊形成相关的疾病的组合物和方法。所述方法和组合物通过抑制如CTGF基因表达或该基因表达产物的生物活性来治疗和改善病理性胆囊在组织中的形成。在某些方面，受体活化受到抑制。在另一些方面，受体活性受到引发或增强。
本发明还提供了治疗、抑制或改善与常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)相关的症状的方法。该方法需要向需要治疗的病人给药有效量的药物或分子，如CTGF，这些药物或分子能调节CTGF基因或其表达产物的活性。在另一方面，向病人给药有效量的能抑制CTGF受体生物活性的药物。美国专利No.6,555,322公开了编码受体的cDNA序列和其氨基酸序列。一方面，所述药物或分子先被分离，然后再被传递。另一方面，在由于基因欠表达而导致疾病或症状发生的部位，可以向该部位给药能增强表达的基因或多肽。这种药物是本领域已知的，包括但不限于，编码肽或多肽本身的多聚核苷酸。
本发明还提供了通过检测基因表达水平或其表达产物来帮助诊断存在于组织中的胆囊异常的方法。该方法可用于帮助诊断其它器官中存在的ADPKD相关肾囊肿和囊性异常(这些症状通常在ADPKD中出现)，所述器官包括肝、胰腺、脾和卵巢。此外，通过在异常囊肿形成之前检测蛋白质或多聚核苷酸的过表达或欠表达，人们可预测患ADPKD的倾向，并及早诊断和/或治疗。
本发明进一步提供的是实施所述诊断和预测方法的药盒。该药盒含有用于这些方法的组合物和使用说明。
本发明还提供了用于所述治疗和诊断方法的组合物。一方面，该组合物含有包含抗体可变区的分子，所述抗体可变区特异性地结合到CTGF蛋白质(如，SEQ ID NO2)上或其受体上，从而使结合受到抑制和/或阻断，且受体未受到活化或受体活化受到抑制。所述分子可为例如，完整的抗体分子、单链可变区(ScFv)、单克隆抗体、嵌合的或人源化抗体。抗体可在细胞培养物、在抗菌素中或在各种动物中产生，所述动物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴子、黑猩猩、猿，等等。所述分子可任选地结合到细胞毒素部分、治疗部分、可检测部分或抗囊肿药上。
在另一方面，本发明提供了抑制CTGF基因表达或与CTGF蛋白结合的受体的核酸分子，或抑制编码该受体的基因。这里所述的核酸包括但不限于核酶、反义寡核苷酸、双链RNA、iRNA、三链RNA、RNA适配物。一方面，所述核酸以独立形式被传递。所述核酸可从动物中分离出来，或者，可在任何合适的重组系统中经重组性产生，所述重组系统为例如细菌、酵母菌、杆状病毒(baculoviral)或哺乳动物。
另一方面，本发明提供了能提高、支持、增强或增加基因表达或其转录和/或翻译产物或能活化受体的任何配体的核酸分子。这里所述的核酸分子包括但不限于核酶、反义寡核苷酸、双链RNA、iRNA、三链RNA或RNA适配物。一方面，所述核酸以独立形式被传递。所述核酸可从动物中分离出来，或者，可在任何合适的重组系统中经重组产生，所述重组系统为例如细菌、酵母菌、杆状病毒或哺乳动物。
本发明的又一方面是提供了一种鉴定参与CTGF相关囊肿形成的CTGF结合配体的方法。将测试化合物或药物，如抗体或抗体衍生物或变体与在合适样品中的CTGF蛋白或其片段在有利于与CTGF或其受体结合形成的条件下接触。如果发生受体结合或CTGF结合，则将被检测出。
一方面，所述治疗和诊断药用于与其它药物联合使用。这些药物或分子与其它药物或治疗剂的共同给药可收到出人意料的协同治疗益处。在这个共同给药方法中，所述药物或分子通过减少剂量也用于减小已知疗法和治疗药的有害副作用，及那些待发现的疗法和治疗药的有害副作用。一方面，这种有效组合的使用是要提供这样的治疗组合该组合所需的每种成分的总剂量比单独使用每个治疗方法、化合物或药物时所使用的剂量要低，从而减少有害副作用。因此，本发明也包括涉及本发明所述化合物与一种或多种其它活性药物或方法共同给药的方法。实际上，本发明的另一方面是提供通过共同给药本发明化合物来提高其它疗法和/或药物组合物的方法。在共同给药方法中，药物可以被同时给药或先后给药。在一个实施方案中，本发明所述化合物在给药其它活性药物、进行其它治疗之前或给药其它治疗剂之前进行给药。药物剂型和给药模式可以是本发明所描述的或本领域技术人员已知的那些中的任何一个。
本发明的另一实施方案是确定用来治疗囊肿性损伤的候选药物的方法，该方法是通过将表达CTGF基因或其受体的细胞与测试化合物或药物接触。如果某测试化合物增加或减少CTGF基因或编码其受体的基因的表达，则该化合物就被认为是候选药物，用来治疗囊肿异常。可以通过本领域已知的任何方法来检测和量化表达，如在合适的部位，通过将细胞或组织的mRNA杂化到核酸探针上进行，所述核酸探针与CTGF mRNA或受体mRNA是互补的。能减少表达的测试化合物或药物被认为是用来治疗异常CTGF囊肿形成的候选药物。
发明人还提供了一种药盒用来测定病态细胞或病人是否适合于用本发明描述的一种或多种治疗剂进行治疗。此外，还提供了能显示测试结果的药盒。这些药盒含有本发明所述的至少一种组合物及使用说明书。
图1说明抗-CTGF抗体在抗囊肿生成体外模型中的效果。
图2说明CTGF蛋白被表达在jck小鼠肝脏中。
图3是来自ADPKD病人的囊液的2D SDS凝胶图。
表格说明表1A是筛选到的SAGE库的汇总。其总结了全部按顺序排列的标记和单独标记。表1B汇总了CTGF在正常和囊肿性肾脏中的表达。
表2列出了在囊肿性肝脏(CL)中前20个上-和下-调基因。
其中给出了这20个下-(顶板)或上调(底板)标记(10个碱基长)及它们在正常肝脏(NL)或囊肿性肝脏(CL)上皮库中的数量、Genebank注册号、基因命名和HUGO分配。标签的第11个碱基的给出是为了当10碱基-标记具有数个Unigene相配物时来帮助区别这些基因之间的不同。
表3列出了在囊肿性肾脏(CK)中的前20个上-和下-调基因。这20个下-或上-调标记及它们在正常肾脏(NK)或囊肿性肾脏脏(CK)中的数量如表2中所列。
表4列出了在肝脏和肾脏上皮中的常见的上-调基因＞5x。在CK和CL中上调的常见基因也在此给出，以及10个碱基标记序列、第11个碱基、CL/NL和CK/NK比率、Genebank注册号、基因描述和相应的HUGO命名。
表5A列出了在CL中的上调基因的官能团。表5B列出了在CK中的上调基因的官能团。
实施本发明的模式在整个公开中，各种出版物、专利和公开的专利说明书经由引用作为参考。这些出版物、专利和公开的专利说明书所公开的内容在此通过参考并入本发明中以便更充分地描述本发明相关的技术状态。
这里所使用的某些术语具有下述定义的含义。
定义除非另有说明，本发明的实施将采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA中常用的技术，这些技术在本领域的技术范畴之内。见，例如，Sambrook，Fritsch and Maniatis，MOLECULARCLONINGA LARBORATORYMANUAL，2ndedition(1989)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel，et al.eds.，(1987))；the series METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)PCR2A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))，Harlow andLane，eds，(1988)Antibodies，ALABORATORYMANUAL，and ANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshney，ed.(1987))。
除非上下文中清楚地说明，否则在说明书和权利要求书中所使用的单数形式的和特指形式的名词包括其复数形式。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括这些细胞的混合物。
这里所使用的术语“包含”是指所述组合物和方法包括所引用的元素，但是不排除还包括其它元素。当使用“基本由...组成”来定义组合物和方法时，其是指排除对组合来说非常明显的其它成分。因此，基本由本发明定义的成分组成的组合物不排除来自分离和纯化方法中的痕量污染物和药学可接受的载体，如磷酸盐缓冲的食盐水、防腐剂，等等。“由...组成”是指排除其它成分和方法步骤中的痕量物质以给药本发明组合物。经这些过渡术语中的每一个定义的具体实例在本发明的范围内。
所有数字形式的定义，如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围都是近似值，以变量0.1(+)或(-)变化。尽管没有总是明确说明，但是应当理解的是所有的数字形式的定义都应在其前面加上术语“约”。尽管没有总是明确说明，但是应当理解的是，本发明中公开的试剂仅仅是举例说明，其等同物是本领域已知的。
术语“多肽”以其最广泛的含义加以使用，是指两个或多个亚单元氨基酸化合物、氨基酸类似物或仿肽(peptidomimetics)。所述亚单元可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚单元可以通过其它键连接，如酯、醚，等等。本发明所用术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，和氨基酸类似物和仿肽。三个或多个氨基酸的肽，如果肽链短则通常被称为寡肽。如果肽链长，则该肽通常被称为多肽或蛋白质。
术语“分离”是指从组分、细胞中分离出来，否则其中的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或它们的片段自然状态时通常是结合在一起的。本发明的一方面，将分离的多聚核苷酸从3′和5′个相邻核苷中分离出来，该多聚核苷酸与这些核苷在其固有或天然环境中通常是结合在一起的，所述环境为如在染色体中。本领域技术人员显而易见的是，非自然生成的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或它们的片段不需要进行“分离”以区别于自然生成的对应物。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或它们的片段区别于其自然生成的相应物，因为每体积中的分子浓度或数目比其自然生成的对应物“浓缩的”大或比“分离的”小。在基本序列方面或例如其糖基化模式不同于其自然生成相应物的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或它们的片段不需要以其分离形式存在，因为它们由于其基本序列，或者其它特征如糖基化模式不同于其天然生成的相应物而能与后者区别开来。因此，非天然生成的多聚核苷酸作为单独的实施方案给出，不同于经分离出的天然生成的多聚核苷酸。在细菌细胞中产生的蛋白质作为单独的实施方案给出，不同于从真核细胞中分离出的天然生成的蛋白质，在真核细胞中所述蛋白质自然产生。
术语“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”可相互交换使用，是指任何长度的核苷的聚合形式，脱氧核糖核苷或核糖核苷，或它们的类似物。核苷可以有任何三维结构，可以完成已知的或未知的任何功能。下述为多聚核苷酸的非限定性例子基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转录RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多聚核苷酸、支链多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、引物。多聚核苷酸可以包含经修饰的核苷，如甲基化核苷和核苷类似物。如果要对核苷结构进行修饰，该修饰可以在聚合物聚集之前或之后进行。核苷的序列可经非核苷成分断开。多聚核苷酸可以在聚合之后进一步经修饰，如通过与标记组分结合而得到修饰。这个术语也指双链和单链分子。除非特别提到或需要，本发明涉及多聚核苷酸的任何实施方案包括双链形式和两个互补单链形式中的每一个，该互补单链形式已知或被预测为能弥补双链形式。
多聚核苷酸由四个核苷碱基的特定序列组成腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多聚核苷酸为RNA时，对应鸟嘌呤的为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”为多核苷酸分子的字母表示形式。这个字母表示形式可输入到具有中心处理单元的电脑数据库中，并用于生物信息应用如功能基因学和同族检索。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框的多聚核苷酸，其能够在经转录和翻译后编码特定多肽或蛋白质。这里所述的多聚核苷酸的任何一个可以用来识别与之相关的基因的更大片段或全长编码序列。分离更大片段序列的方法是本领域技术人员已知的，其中一些在本发明中也进行了描述。
“基因产物”或“表达产物”是指当基因经转录和翻译后产生的氨基酸(如，肽或多肽)。
“在转录的控制下”是本领域熟知的术语，表明多聚核苷酸序列(通常为DNA序列)的转录取决于其与能有助于引发(或促进)转录的要素进行有效连接。“有效连接”是指并列，其中所述要素位于能使它们起作用的位置。
“基因传递载体”定义为能携带插入多聚核苷酸进入宿主细胞的任何分子。基因传递载体的例子是脂质体、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽、多糖；脂多糖；人工病毒囊膜；金属粒子；和细菌，或病毒，如杆状病毒、腺病毒和反转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌介体和其它常用于本领域的重组载体，它们被公开用于在各种真核和原核宿主中表达，并可用于基因治疗和简单的蛋白质表达。
这里使用的“基因传递”、“基因转移”等术语是指向宿主细胞中引入外源性多聚核苷酸(有时也称作“转基因”)，不管引入的方法是什么。这些方法包括各种已知技术，如载体-介导的基因转移(通过，例如病毒感染/转染，或各种其它蛋白脂基或脂基基因转运复合体)和能促进“裸”多聚核苷酸传递的技术(如电穿孔、“基因枪”传递和各种其它用于引入多聚核苷酸的技术)。引入的多聚核苷酸可以稳定地或短暂地停留在宿主细胞中。稳定停留往往需要引入的多聚核苷酸含有与宿主细胞相容的复制源或者结合进入宿主细胞的复制子中，如染色体外复制子(如，质粒)或核的或线粒体的染色体。许多载体已知可以介导基因转运到哺乳动物细胞中，正如本领域所熟知的那样，并在本发明中有所描述。
“病毒载体”定义为在体内、间接体内(ex vivo)或体外重组生产的病毒或病毒颗粒，其含有要传递到宿主细胞中的多聚核苷酸。病毒载体的例子包括逆转录病毒表达载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α-病毒载体等。α-病毒载体，如塞姆利基森林病毒基载体和辛德毕斯病毒基载体已经被开发出来用于基因治疗和免疫治疗。见，Schlesinger andDubensky，Curr.Opin.Biotechnol.(1999)5434-439 and Ying，et al.，Nat.Med.(1999)5(7)823-827。在基因转移由逆转录病毒表达载体介导的情况下，载体构件(vector construct)是指含有逆转录病毒基因组或该基因组一部分的多聚核苷酸，以及治疗基因。这里使用的“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”含义相同，是指凭借进入细胞的病毒将基因或核酸序列稳定转移进入宿主细胞并将其基因组整合入宿主细胞基因组中的方法。所述病毒可通过正常的感染机制进入宿主细胞，或经过修饰使其能与不同的宿主细胞表面受体或配体结合。这里使用的逆转录病毒表达载体是指能通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸引入到细胞中的病毒粒子。
逆转录病毒以RNA形式携带它们的基因信息；然而，一旦病毒感染了细胞，所述RNA就反转录成DNA形式，该DNA整合进入被感染细胞的基因族DNA中。经整合的DNA形式被称为前病毒。
在基因转移由DNA病毒载体介导的情况下，如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)，载体构件是指含有病毒基因组或该基因组一部分的多聚核苷酸，和转基因。腺病毒(Ads)为病毒经相对较好特征化的、同源组，包括50个血清型。见，例如，国际PCT申请No.WO95/07071。Ads很容易生长，不需要整合到宿主细胞基因组中。已经构建得到重组的Ad衍生的载体，特别是能减少野生型病毒重组和生成的可能性的那些载体。见，国际PCT申请Nos.WO 95/00655和WO95/11984。野生型AAV在整合到宿主细胞基因族方面具有高度的感染性和专一性。见，Hermonat和Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)816466-6470和Lebkowski，et al.，Mol.Cell.Biol.(1988)83988-3996。
含有启动子和克隆位点的载体是本领域已知的，其中在所述克隆位点多聚核苷酸可以有效连接。这样的载体能够体外或体内转录RNA，并且可以提供者处商业上购得，如Stratagen(La Jolla，CA)和PromegaBiotech(Madison，WI)。为了优化表达和/或体外转录，可能需要除去、加入或改变克隆物5′和/或3′未翻译的部分以除去额外的、可能不合适的替代翻译启动码或其它可能干扰或减少表达的序列，在转录水平或翻译水平。或者，大多数核糖体结合位点可被立即插入到启动码的5′以提高表达。
基因传递载体也包括若干非病毒载体，包括DNA/脂质体复合体和靶向病毒蛋白质-DNA复合体。也含有靶向抗体或其片段的脂质体也可用在本发明的方法中。为了提高向细胞的传递，本发明的核酸或蛋白质可结合到抗体或其结合片段上，该抗体或其结合片段结合细胞表面抗原，如TCR、CD3或CD4上。
当用于多聚核苷酸操纵这一情况中，“探针”是指寡核苷，该寡核苷用作试剂，通过与靶点杂化来检测存在在感兴趣的样品中的潜在的靶点。通常，探针包括标记(label)或媒介，通过该媒介，标记可以在杂化反应前或杂化后进行连接。合适的标记包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光的化合物、染料和蛋白质，包括酶。
“引物”是短的、通常具有游离的3′-OH基团的多聚核苷酸，其通过与靶点杂化而结合到存在在感兴趣的样品中潜在的靶点或“模板”上，然后促进与靶点互补的多聚核苷酸的聚合。“聚合酶链式反应”(“PCR”)为一种反应，其中复制品(replicate copies)由靶点多聚核苷酸制备，通过使用“引物对”或“一套引物”，该“一套引物”由“上游”和“下游”引物组成，和聚合反应催化剂，如DNA聚合酶，和典型的热稳定聚合酶。进行PCR的方法是本领域已知的，公开在例如，“PCRA PRACTICALAPPROACH”(M.MacPherson et al.，IRL Press at Oxford University Press(1991))。所有生产多聚核苷酸复制品的方法，如PCR或基因克隆在本发明中统称为“复制”。引物也可在杂化反应中用作探针，所述杂化反应如Southern or Northern blot分析.Sambrook et al.，supra.
“数据库”这一词表示一组储存的数据，该数据代表序列的集合，该序列反过来代表生物相关材料的集合。
术语“cDNAs”是指互补DNA，即存在在细胞或有机体中的利用酶如逆转录酶合成cDNA的mRNA分子。“cDNA库”是所有存在在细胞或有机体中的mRNA的集合，所有mRNA通过逆转录酶转变成cDNA分子，然后被插入到“载体”中(其它在加入外来DNA后能继续复制的DNA分子)。用于库的载体的例子包括抗菌素(也称作“噬菌体”)、感染细菌的病毒，例如，λ噬菌体。该库然后可针对感兴趣的具体的cDNA(即mRNA)而被探针化。
当“差异表达”用于基因时，其是指从基因转录的mRNA的不同产物，或由基因编码的蛋白质产物。与正常的或对照细胞的表达水平相比，差异表达的基因可以是被过表达的或欠表达的。一方面，其是指比在对照样品中探测到的表达水平高或低2.5倍的差异，或5倍差异，或10倍差异。术语“差异表达”也指细胞或组织中的核苷序列，其在对照细胞中是沉默的地方或在对照细胞中被表达的地方是没有被表达的。
如这里使用的，“固相载体”或“固体载体”是可相互替换的，该定义并不限于具体的载体类型。而是许多可购得的或本领域技术人员已知的载体。固相载体包括硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝胶。这里使用的“固体载体”也包括合成的存在抗原的基质、细胞和脂质体。合适的固体载体可以根据最终用途和对各种实验方案的适合性进行选择。例如，对于肽合成，固体载体可以指树脂如聚苯乙烯(如，PAM-树脂，从Bachem Inc.，Peninsula Laboratories，etc获得)，POLYHIPE树脂(从Aminotech，Canada获得)、聚酰胺树脂(从Peninsula Laboratories获得)、接枝了聚乙二醇的聚苯乙烯树脂(TentaGel，Rapp Polymere，Tubingen，Germany)或聚二甲基丙烯酰胺树脂(从Milligen/Biosearch，Galifornia获得)。
多聚核苷酸也可被连到固体载体上以用于高通量筛选分析。例如，国际PCT申请No WO97/10365公开了高密度寡聚核苷酸芯片的构建。也参见美国专利Nos.5,405,783；5,412,087；和5,445,934。利用这个方法，在衍生的玻璃表面(也被称作芯片阵(chip arrays))上合成探针。将光保护的亚磷酸根核苷偶合到玻璃表面，利用光解作用通过光刻掩膜选择性地去保护，并与另一个经保护的亚磷酸根核苷反应。该偶合/脱保护过程重复进行直到完成得到所需的探针。
本发明使用的“表达”是指一个过程，通过该过程多聚核苷酸被转录成mRNA和/或一个过程，通过该过程经转录的mRNA接下来被翻译成肽、多肽或蛋白质。如果所述多聚核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括mRNA在真核细胞中的拼接。用于基因的“过表达”是指从基因转录的mRNA的过生产，或由基因编码的蛋白质产物的过生产，比在对照样品中探测到的表达水平要高2.5倍、或者高5倍，或者高10倍。
“杂化“是指一个反应，其中一种或多种多聚核苷酸反应形成通过氢键稳定的复合体，该氢键在碱基和核苷残基之间形成。所述氢键可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合产生，或采用任何其它序列专属性方式产生。所述复合体可以包括两个链(形成双链结构)，三个或更多个链(形成多链结构)，单一自杂化链，或它们的任意组合。杂化反应可能是一个更大的方法的一个步骤，如PCR反应的引发，或通过核酶进行的多聚核苷酸的酶断裂反应。
杂环反应可以在具有不同“严谨性”的条件下进行。通常，低严谨性杂化反应在约40℃在10×SSC中进行，或在等离子强度/温度的溶液中进行。适中的严谨性杂化典型的是在约50℃，在6×SSC中进行，高严谨性杂化反应通常是在约60℃，在1×SSC中反应。
当杂化以反式平行构型在两个单链聚核苷酸之间发生时，该反应被称为“退火”，这些多聚核苷酸被称为“补体”。如果杂化能在第一多聚核苷酸链中的一个与第二之间发生时，则双链多聚核苷酸可以是另一个多聚核苷酸的“补体”或“同源体”。“互补度”或“同源性”(一个多聚核苷酸与另一个核苷酸互补的程度)可以根据碱基在相对链(被认为会相互之间形成氢键)中的比例进行量化，根据普遍接受的碱基配对原则。
多聚核苷酸或多聚核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一个序列具有一定的“序列相似性”百分比(如，80％、85％、90％或95％)是指经比对后，在比较这两个序列时，碱基(或氨基酸)的百分比相同。这种序列比对和相似百分比或序列相似性可以通过本领域已知的软件程序确定，例如，在CURRENTPROTOCOLS INMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubelet al.，eds.，1987)增刊30，7.7.18节，表7.7.1中描述的那些。优选地，缺省参数可以用于序列比对。优选的序列比对程序为使用缺省参数的BLAST。特别地，优选程序为BLASTN和BLASTP，使用下列缺省参数遗传密码(genetic code)＝标准(standard)；过滤器(filter)＝无(none)；链(strand)＝两个都有(both)；截止值(cutoff)＝60；期望值(expect)＝10；序列号(Matrix)＝BLOSUM60；定义(Descriptions)＝50个序列；sort by(按...序列)＝HIGH SCORE；数据库(Databases)＝不冗余(non-redundant)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细内容可以在下述网址内找到http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
“抑制”细胞生长是指下列状态的任何一种或所有情况缓慢、推迟和阻止肿瘤生长，和肿瘤萎缩。细胞和组织的生长可以通过本领域已知的任何方法进行评估，包括但不限于测量囊肿大小、利用3H-胸腺嘧啶脱氧苷整合实验法判定细胞是否增生，或细胞计数。
“组合物”是指活性剂与另一个化合物或组合物(惰性的(例如，可检测的试剂或示踪剂)或活性的，如助剂)的结合，。
“药物组合物”包括活性剂和载体(惰性或活性的)的结合物，使该组合物适用于体外、体内或间接体内诊断或治疗用途。
这里所使用的术语“药学可接受的载体”包括任何一个标准的药学可接受的载体，如磷酸盐缓冲的食盐溶液、水，和乳液，如油/水或水/油乳液，和各种类型的润湿剂。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和助剂的例子参见Martin，REMINGTON’sPHARM.SCI.，15thEd.(Mack Publ.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以引起有益的或所希望的结果的量。有效量可以分一次或多次给药，或一次或多次施用，或一个或多个剂量给药。“受试者”“个体”或“病人”在本发明中可以互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人类。哺乳动物包括，但不限于，小鼠、大鼠、猿、人、农畜、工作动物，和宠物。
“对照”是指实验中对比用的受试者或样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，如果一个实验的目的是确定基因改变的表达水平与癌症或病症特定类型的关系，则通常优选使用阳性对照(受试者或受试者的样品携带这样的改变和表现出那种疾病的症状特征)，和阴性对照(受试者或来自受试者的样品缺少经改变的表达和那种疾病的临床症状)。
治疗方法本发明提供了治疗和/或改善与存在在组织中的囊肿异常有关的症状的方法。一方面，所述囊肿为常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)的症状。该疾病的主要表现为肾小管渐进式囊肿增大，并最终导致感染的病人中的一半肾衰竭。美国专利No.5,891,628和Gabow，P.A.，Am.J.Kidney Dis.(1990)16403-413。ADPKD相关的肾囊肿可能会增大，以至含有几升液体，并且肾脏由于渐进式增大而导致疼痛。其它异常如血尿、肾和泌尿器官感染、肾癌、盐水失横和通常由肾缺陷导致的高血压。在其它器官中的囊肿异常也经常在ADPKD中发现，所述其它器官包括肝、胰腺、脾脏和卵巢。严重的肝肿大有时会导致门静脉高血压和肝衰竭。在ADPKD中也观察到贲门瓣异常和蛛网膜下和其它颅内出血频率增加。美国专利No.5,891,628。尽管对ADPKD病人的肾脏研究已经解释了许多不同生化的、结构的和生理的异常，但该疾病潜在的致病生化缺陷依然不为人所知。已经观察到的生化异常涉及蛋白质分选、细胞膜标识在肾上皮细胞中的分配、细胞外基质、离子传递、上皮细胞翻转，和上皮细胞增生。这些发现中记载最详细的是管状上皮细胞组成异常，和细胞膜蛋白正常极化分布的反转，如Na+/K+ATPase。Carone，F.A.et al.，Lab.Inv.(1994)70437-448。因此，本发明提供了抑制、减少或改善上述与ADPKD相关的生化的、结构的和生理异常的方法。
该方法需要向需要治疗的组织传递有效量的试剂或分子，该试剂或分子能在感染的组织中修饰(抑制或增加)表2到5所列基因的表达或其表达产物。一方面，申请人出人意料地发现，CTGF基因在组织中的过表达与囊肿异常有关，并且该基因或其表达产物的向下调节能治疗或改善与囊肿异常有关的症状。抑制CTGF与受体的结合也可治疗或改善与囊肿异常有关的症状。
从病理学角度来看，CTGF已经被认为参与了其中结缔组织细胞过度生长的疾病，如硬皮病、癌症、纤维化疾病，和动脉粥样硬化。据报道，CTGF多肽最主要的生物活性与其分裂性有关，或刺激靶细胞增生的能力有关，和其在细胞外基质的合成中的所扮演的角色有关。这种体内分裂活性的最终结果是靶组织的生长。也报道CTGF具有趋化活性，这是细胞与特定分子相互作用后导致的化学诱导运动。在纤维化损伤中发现CTGF含量升高，因此认为CTGF功能性参与了纤维化疾病的改善和伤口愈合。Chih-Chiun，C.et al.，J.Biol.Chem.(2001)276(13)10443-10452；Hahn，A.et al.，J.Biol.Chem.(2000)275(48)3749-3735。用于调节与增生疾病有关的生长因子的组合物和方法先前也有报道。参见美国专利公开文件US2002/0115156A1heUS2002/0142353；美国专利Nos.6,555,322 B1；6,358,741B1；6,348,329；5,783,187B1；5,408,040，和国际PCT申请Nos.WO00/35939；WO 01/15729A1；WO 00/13706；WO 96/38168和WO 96/38172。
CTGF是富含半胱氨酸的Mr38,000单体肽。其为生长调节子CCN家族的一员，该生长因子包括小鼠(也称作fisp-12或βIG-M2)和人CTGF，Cyr61(小鼠)、Cef10(鸡)和Nov(鸡)。在序列比较的基础上人们认为这个家族的成员都具有模块结构，由以下组成(1)负责结合的胰岛素样生长因子结构域，(2)负责复合体形成的血管性血友病因子结构域，(3)可能用于结合基质分子的I型凝血敏感蛋白重复序列，和(4)在基质蛋白中发现的被认为是用于结合受体的C终端组件。
CCN是新出现的调节蛋白家族的缩写，该家族据报道参与细胞增生、化学趋化性、血管生成和细胞外基质的形成。Lin，C.G.et al.，J.Biol.Chem.(2003)278(26)24200-24208；Lafont，J.et al.，J.Biol.Chem.(2002)277(43)41220-41229；Li，C.L.et al.，J.Clin.Pathol.(2002)55250-261；Manara，M.C.et al.，Am.J.Pathol.(2002)160(3)849-859。该家族包括共享共同的多模块管理的正和负调节物。见，generally，Perbal，B.，Mol.Pathol.(2001)54103-104，该参考在此引用。
据报道，用于人CTGF(hCTGF)的cDNA含有1047个核苷的开放阅读框，起始点在130位置，TGA终点位置在1177。cDNA编码349个氨基酸的肽。见美国专利公开号US2002/0115156A1。该cDNA序列也可从GenBank No.NM_001901获得，其也被复制为SEQ ID NO1。该基因据报道含有2312个核苷，其中开放阅读框由核苷146到1195代表。由该序列表达的572个氨基酸多肽可以以GenBankNo.NP_001892.1获得，其也被复制为SEQ ID NO2。
据报道，用于大鼠CTGF的cDNA序列含有2350个核苷的开放阅读框，起始点在212位置，TAA终点位置在1353，并编码346个氨基酸的肽。见，美国公开的专利Doc US 2002/0115156A1第28段。
本发明使用的术语“治疗”或类似词语是指获得所希望的药理和/或生理效果。该效果就完全或部分预防疾病或体症或其症状方面是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由于该疾病导致的副反应时是治疗性的。
“治疗”也包括所有对哺乳动物疾病的治疗，包括(a)防止疾病在可能感染该疾病(但是还没有被诊断感染了该疾病)的受试者体内发生；(b)抑制疾病，即阻止疾病的发展；或(c)减轻或改善疾病，如使疾病(如ADPKD)消退。
这里使用的进行“治疗“包括与病理相关的症状的全身性改善和/或症状发作的推迟。“治疗”的临床和亚临床证据会因病理、个体和治疗的变化而改变。
表2到5中所列基因的过度表达或在某些情况下的欠表达导致细胞和/或组织的病理状态，然后该细胞和/或组织就可以用本发明的方法进行治疗。这些细胞或组织可以通过本领域已知的任何方法进行识别，这些方法可以对基因的不同表达或其表达产物进行识别。实例性方法在本文给出。
治疗剂可以给药到合适的细胞、组织或个体，或此外给药到可能会感染或具有胆囊异常患病危险的个体。当将治疗剂给药到受试者如小鼠、大鼠或病人时，可以将该治疗剂加到药学可接受的载体中，并全身性地或局部地给药到受试者。为了判定病人能收到有益治疗，需要检验囊肿得到了消退。治疗量可以凭经验判断，并根据进行治疗的病症、进行治疗的受试者和治疗的效果和毒性而变化。
体内给药可以在整个治疗过程中连续或间歇以一个剂量起作用。确定最有效的给药途径和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并根据用于治疗的组合物、治疗目的、进行治疗的靶细胞和进行治疗的受试者而变化。根据主治医师选择的剂量和形式也可进行单一或多次给药。进行治疗剂给药的合适的剂量制剂和方法是本领域已知的。
本发明的药剂和组合物通过按照常规步骤给药(如作为在药物组合物中的活性成分)而用于制备用于治疗人和其它动物的药物。
本发明的药剂可以通过任何合适的途径进行给药治疗，所述途径包括经鼻、局部、(包括透皮、气雾剂、口腔和舌下)，parental(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)和经肺。可以理解的是，优选的途径将随接受者的身体状况和年龄，及进行治疗的疾病而变化。
用于本发明方法的多聚核苷酸可以利用PCR复制。PCR技术是美国专利Nos.4,683,195；4,800,159；4,754,065；和4,683,202的发明主题，并在PCR中描述THEPOLYMERASECHAINREACTION(Mullis etal.eds，Birkhauser Press，Boston(1994))，及其中引用的参考文献中。
或者，本领域技术人员可以利用本发明提供的序列和购得的DNA合成仪来复制DNA。相应地，本发明还提供了通过给出多聚核苷酸线性序列、合适的引物分子、化学制品(如酶)和对它们复制的说明，并将该核苷以正确的方向连接来获得本发明多聚核苷酸的方法。在单独的实施方案中，这些多聚核苷酸被进一步分离。而且，本领域技术人员可以将多聚核苷酸插入到合适的复制载体中，并将该载体插入到合适的宿主细胞中(原核或真核)以进行复制和放大。如此经过放大的DNA可通过本领域技术人员已知的方法从细胞中分离出来。本发明进一步涉及用于通过这个方法得到多聚核苷酸的步骤，和由此得到的多聚核苷酸。
RNA可以通过首先将DNA多聚核苷酸插入到合适的宿主细胞中获得。该DNA可以通过任何合适的方法插入，如通过使用合适的基因传递媒介(如，脂质体、质粒或载体)或通过电穿孔。当细胞复制和DNA被转录为RNA时；该RNA可以随之通过本领域技术人员已知的方法分离出来，如在Sambrook等(1989)supra中描述的那样。例如，mRNA可以根据Sambrook，等(1989)supra中描述的步骤使用各种细胞溶解性酶或化学溶液分离出来，或按照生产商提供的说明用核酸结合树脂提取出来。
反义核酸是DNA或RNA分子，它们与特定转录RNA分子的至少一部分是互补的。在细胞中，该反义核酸杂化到相应的转录RNA中，形成双链分子，从而干扰mRNA的翻译，因为细胞不翻译双链mRNA。约15个核苷的反义低聚体是优选的，因为它们容易合成，而且与较大分子相比，它们较少可能地产生问题。使用反义方法抑制基因体外翻译是本领域已知的。Marcus-Sakura，Anal.Biochem.(1988)172289和DeMesmaeker，等.，Curr.Opin.Struct.Biol.(1995)5343-355。这些出版物中公开的信息是本领域技术人员已知的，它们与本发明的说明书结合就可以使本领域技术人员了解和使用反义DNA或RNA分子作为治疗剂。
用低聚核苷酸阻止转录是已知的三螺旋策略(triplex trategy)，因为该低聚物围绕在双螺旋DNA周围，形成三链螺旋。三螺旋化合物被设计成能识别所选基因上的唯一位点。Maher，等.，Antisense Res.AndDev.(1991)1(3)227，Helene，C.，Anticancer Drug Design(1991)6(6)569。
核酶是具有专一性切断其它单链RNA能力的RNA分子，采取的方式类似于DNA限制性内切酶。通过修饰编码这些RNA的核苷序列就可能设计出能识别RNA分子中的专一核苷序列的分子，并将其切断。该方法的主要优点是仅具有特定序列的mRNA因其序列专一性而被失活。
美国专利No.6,458,559公开了如何生产和使用RNA适配体分子来抑制基因表达。该专利中公开的内容和本发明的说明书结合可以使本领域技术人员使用适配体作为CTGF抑制分子。
美国公开的专利文件US20030180744公开了生产和使用对生长因此具有高亲和力的低聚核苷酸配体的方法。该专利中公开的内容和本发明的说明书结合可以使本领域技术人员使用低聚核苷酸配体作为治疗分子。
美国公开的专利文件US20030051263公开了将双链RNA引入到活细胞中从而在该细胞中抑制靶基因基因表达的方法。抑制是序列专一性的，因为RNA的双螺旋区的核苷序列和靶基因的一部分的核苷序列是相同的。该专利中公开的内容和本发明的说明书结合可以使本领域技术人员了解并使用双链RNA分子作为治疗剂。见，如Elbashir，S.M等，Nature(2001)411494。
当治疗剂是核酸时，可以通过本领域已知的方法将其加入细胞培养物中，所述方法包括但不限于磷酸钙沉淀、微注射或电穿孔法。它们可以单独加入或与合适的载体(如药学可接受的载体如磷酸盐缓冲的食盐水)一起加入。或者或此外，可以将该核酸整合到表达或插入载体中以整合进入细胞中。即含有启动子又含有克隆位点(其中多聚核苷酸可以有效地与该位点连接)的载体是本领域已知的。这样的载体可以体外或体内转录RNA，并可从如Stratagen(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)这样的供源处购得。为了使表达和/或体外转录最优化，有必要在转录水平或翻译水平除去、加入或改变克隆物中5′和/或3′未翻译部分，以排除另外的、潜在的不合适的替代翻译起始码或其它可能会干扰或减少表达的序列。或者，共有的核糖体结合位点可以被立即插入到起始码的5′中以提高表达。载体的例子为病毒，如杆状病毒和反转录病毒、噬菌体、腺病毒、腺相关病毒、粘粒、质粒、真菌载体和其它常用于本领域的重组媒介，它们已经被公开在各种真核和原核宿主中进行表达，并可以用于基因治疗和用于简单的蛋白质表达。
在这些载体中，有一些非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物，及靶向的病毒蛋白DNA复合物。为了提高向细胞的传递，本发明的核酸和蛋白质可以共轭到结合细胞表面抗原的抗体上或其结合片段上。脂质体(也包括靶向抗体或其片段)可以用在本发明的方法中。本发明还涉及用于本发明公开的方法中的靶向复合物。
使用本领域已知的方法将多聚核苷酸插入载体基因组中。例如，插入物和载体DNA可以在合适的条件下与限制酶接触以在每个分子(可以相互配对，并通过连接酶连在一起)上产生互补端。或者，可以将合成的核酸连接用小分子(linker)连接在被限制的多聚核苷酸的末端。这些合成的连接用小分子含有对应于载体DNA中特定限制位点的核酸序列。此外，含有终止编码子和合适的限制位点的低聚核苷酸可经配合以用于插入载体中，该载体含有，例如，下述中的一些或全部可选择的标记基因，如用于在哺乳动物细胞中进行稳定或短暂转染选择的新霉素基因；用于高水平转录的来自人类CMVimmediate早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于合适的附加型复制的复制SV40多起源和ColE1；通用的多克隆位点；和用于体外sense和反义RNA转录的T7和SP6RNA启动子。其它方法是本领域已知的，可以得到。
本发明还涉及经分离的由表2到表5所列基因(如，CTGF基因)编码的多肽。一方面，所述CTGF多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。另一方面，该多肽通过用保守氨基酸取代得到修饰。另一方面，通过使用后面给出的实施例可以确定该多肽具有与SEQ ID NO2多肽相同的功能，并且该多肽经在合适的条件下运行的序列比对程序如BLAT确定，其与SEQ ID NO2的序列同源性大于80％，或者大于85％，或者大于90％，或者大于95％，或者大于97％，或者大于98％或99％。一方面，该程序是在默认参数的条件下进行的。本发明还涉及这些实施方案中的活性片段。
本发明方法中使用的肽通过任何常用的方法获得。例如，肽可以通过使用标准技术的化学合成来制备。特别方便的方法是固相肽合成技术。自动的肽合成仪可以购得，作为它们用途所需的试剂。
在一个实施方案中，本发明经分离的肽可以使用合适的固相合成方法进行合成。Steward and Young，eds.(1968)SOLIDPHASEPEPTIDESYNTHESIS，Freemantle，San Francisco，Calif.一个方法就是Merrifield方法。Merrifield，Recent Progress in Hormone Res.(1967)23451。一旦得到本发明经分离的肽，其可以通过标准方法进行纯化，这些方法包括色谱法(如，离子交换、亲和及体积柱色谱)、离心、溶解度差异或通过任何其它用于蛋白质分离的常规技术。对于免疫亲和色谱，抗原决定表位的分离是通过与含有抗体(该抗体用于对抗肽，或本发明中的相关肽)的亲和柱结合进行的，并且所述抗体附在固定的载体物上。
或者，可以将亲和标签，如hexa-His(Invitrogen)、Maltose结合区(New England Biolabs)、流感壳序列(Kolodziej等，MethodsEnzymol.(1991)194508-509)和谷胱甘肽-S-转移酶与本发明的肽相连，从而能使肽在通过合适的亲和柱后较容易地得到纯化。经分离的肽也可以利用诸如蛋白质水解、核磁共振和X射线结晶等方法进行物理性表征。
或者，所述多聚核苷酸可以通过PCR或基因克隆技术进行复制。这样，本发明还涉及有效连接在某些要素上的本发明的多聚核苷酸，这些要素对于这些多聚核苷酸在宿主细胞中的转录和/或翻译是必需的。一方面，所述多聚核苷酸是用于插入到宿主细胞中的基因传递媒介物的组分。用于将细胞与表达重组体(expression construct)转换的途径包括但不限于微注射、电穿孔、转导、转染、脂质转染、磷酸钙颗粒轰击介导的基因转移或者直接注射核酸序列，或其它本领域技术人员已知的方式(Sambrook等，(1989)supra)。转化哺乳动物细胞的各种技术参见，如Keown等，Methods in Enzmology(1990)185527-537。
宿主细胞包括真核细胞和原核细胞，如细菌细胞、酵母菌细胞、猿细胞、鼠细胞和人细胞。这些细胞可以在受试者体内培养或临时分离。宿主细胞在多肽重组生产或多聚核苷酸重组复制所必需的条件下培养。本发明进一步涉及重组生产的多聚核苷酸和/或多聚核苷酸。
本发明在其范围内还包括在翻译期间或翻译后经不同修饰的多肽，例如通过磷酸化、糖基化、交联、乙酰化、蛋白裂解、与抗体分子，膜分子或其它配体相连。Ferguson等，Ann.Rev.Biochem.(1988)57285-320。这可以通过各种化学方法实现，或通过在不同的宿主细胞中表达多聚核苷酸实现，所述宿主细胞为例如，细菌、哺乳动物、酵母菌或昆虫细胞。
本发明还提供了单独的或与载体结合的肽片段，如免疫原或抗原部分。本发明的抗原肽表位可以以各种制剂形式使用，制剂形式根据使用目的而变化。
本发明的抗原肽表位可以共价或非共价连接(复合)到各种其它分子上，其类型可以根据具体目的而变化。例如，本发明的肽可以共价或非共价复合到大分子载体上，该载体包括但不限于天然或合成的聚合物、蛋白质、多糖、多(氨基酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，和脂质。肽可以共价到脂肪酸上以用于引入到脂质体中。美国专利No.5,837,249。本发明的合成肽可以共价地或非共价地与固相载体物复合，许多固相载体物是本领域已知的。本发明的抗原肽表位可以与含有或不含有共刺激分子的抗原存在基质(antigen-presenting)相连，这一点下面要详细描述。
蛋白质载体物的例子包括但不限于超抗原、血清蛋白、破伤风类毒素、卵蛋白素、甲状腺球蛋白、肌球蛋白和免疫球蛋白。
肽蛋白载体聚合物可以使用常用的交联剂形成，所述交联剂为如碳二酰亚胺。碳二酰亚胺的例子为1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二酰亚胺(CMC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)和1-乙基-3-(4-氮鎓-44-二甲基戊基)碳二酰亚胺。
其它合适的交联剂为溴化氰、戊二醛和丁二酸酐。通常，可以使用同双官能试剂中的任何一个，所述同双官能试剂包括同双官能醛、同双官能环氧化物、同双官能亚氨酸酯、同双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯、同双官能马来酰亚胺、同双官能烷基卤代物、同双官能吡啶基二硫化物、同双官能芳基卤代物、同双官能酰肼、同双官能重氮衍生物和同双官能光反应化合物。还包括杂双官能化合物，如具有胺反应基团和巯基反应基团的化合物和具有胺反应基团和光反应基团的化合物，和具有羰基反应基团和巯基反应基团的化合物。
这样的同双官能交联剂的具体例子包括双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯，二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯和二琥珀酰亚胺基酒石酸酯；双官能酰亚胺酯二甲基己二酰亚胺酯、二甲基庚二酰亚胺酯和二甲基亚胺；双官能巯基反应交联剂1，4-二-[3′-(2′-吡啶二硫代)戊酮-酰亚胺]丁烷、双马来酰亚胺己烷和双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷；双官能芳基卤代物1，5-二氟-2，4-二硝基苯和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基砜；双官能光反应试剂如双-[b-(4-叠氮基水扬基氨基)乙基]二硫化物；双官能醛类，甲醛、丙二醛、琥珀醛、戊二醛和己二醛；双官能环氧化物，如1，4-丁二醇二缩水甘油醚、双官能酰肼，己二酸二酰肼、羰酰肼和琥珀酸二酰肼；双官能二氮鎓邻甲基苯胺、二氮化的和双二氮化的对二氨基联苯；双官能卤代烷基，N1N′-亚乙基-双(碘代乙酰胺)，N1N′-十一亚甲基-双(碘代乙酰胺)，和卤代苯甲烷和卤代芥子气(halomustards)，分别如a1a′-二碘代-对二甲苯磺酸和三(2-氯乙基)胺。
其它常见的能使蛋白质结合到肽上的杂双官能交联剂的例子包括但不限于SMCC琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、MPBH(4-(4-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼、M2C2H(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼)、SMPT(琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)和SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)。
交联可以通过还原氨化将羰基偶联到胺基团或酰肼基团上完成。
本发明的肽可以作为单体的非共价附属物通过离子的、吸附的或生物专一性的相互作用进行配制。具有高正电荷或负电荷分子的肽复合物可以在低离子强度的环境中(如在去离子水中)通过形成盐桥来制备。大的复合物可以使用带电荷的聚合物如分别带有大量负电荷和正电荷的聚-(L-谷氨酸)或聚-(L-赖氨酸)制备。肽也可被吸附到诸如微粒、乳胶粒或其它疏水聚合物的表面，形成能有效模拟交联的或化学聚合的蛋白质的非共价连接的肽-超抗原复合物。最后，肽可以通过利用与其它分子之间的生物专一性相互作用进行非共价连接。例如，利用生物素对蛋白质(如抗生物素蛋白或链霉亲和素或它们的衍生物)的强亲和力可以形成肽复合物。这些生物素结合蛋白质含有四个结合位点，这些位点可以在溶液中与生物素相互作用，或可以经共价连接到另一分子上。Wilchek，Anal Biochem.(1988)1711-32。可以使用常见的生化试剂对肽进行修饰以使其拥有生物素基团，所述生化试剂为如D-生物素(NHS-生物素)的N-羟基琥珀酰亚胺酯，该试剂与蛋白质上的胺基团反应。然后，生物素化的肽可以与抗生物素蛋白或链霉亲和素一起培养以产生大的复合物。这样得到的聚合物的分子量可以通过仔细控制生物素化的肽对抗生物素蛋白或链霉亲和素的摩尔比率进行调节。
本发明还提供了共轭连接到可检测试剂上的本发明描述的肽和多肽在诊断方法中的用途。例如，经可检测标记的肽和多肽可以结合到柱上，并用于检测和纯化抗体。它们也可以用作免疫原用来生产抗体，如下所述。
本发明的肽也可以与各种液相载体结合，所述液相载体为如无菌的或含水溶液，药学可接受的载体、悬浮液和乳液。非水溶剂包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。当被用于制备抗体时，这些载体也可以包括助剂以用于非专一性增加特定免疫反应。熟练技术人员可以很容易地判定是否需要助剂，和选择哪一种助剂。然而，为了说明目的，合适的助剂包括但不限于Freund′s Complete和Incomplete，矿物盐和多聚核苷酸。
本发明的蛋白质和多肽可以通过利用商业可购得的自动合成仪进行的化学合成获得，所述合成仪为如由Perkin Elmer/Applied BiosystemsInc，430A或431A型，Foster City，CA，USA制造的那些。经合成的蛋白质或多肽可以经沉淀和进一步纯化，例如通过高效液相色谱法(HPLC)。相应地，本发明还提供通过提供蛋白质序列和试剂(如氨基酸和酶)，并将所述氨基酸按正确的方向连接来化学合成该蛋白质的方法，及线性序列。
人们可以通过细胞分裂、细胞分化或CTGF表达减少来判断本发明的方法的目的(即，细胞或组织的病理状态得到逆转)是否完成。细胞分化可以通过组织学方法进行监测，或通过监测某些细胞表面标记是否存在或丢失。人体内病理状态的逆转可以通过使用NMR来测量胆囊(或肾)体积的减小。
该方法也可以通过向感染的组织传递有效量的治疗剂(如阻断或抑制抗体或其衍生物或小分子)来实施。实例性抗体在下文中将提到。它们可以单独传递或与载体如药学可接受的载体结合传递。
本领域技术人员通过使用本发明的蛋白质可以很容易地生产另外的能专一性结合到蛋白质或其片段上的抗体。这样的抗体可以是单克隆或多克隆的。它们可以是嵌合的、人类化的或完全人类抗体。可以使用抗体的任何功能片段或衍生物，包括Fab，Fab′，Fab2，Fab′2，和任何单链可变区。抗体可以在细胞培养物中、在抗菌素中或在各种动物体内产生，所述动物包括但不限于牛、兔、羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猴子、猩猩、猿等。只要所述片段或衍生物对蛋白质或其片段保持结合专一性，其就可以使用。抗体的结合专一性可以通过在给定的一组条件下将其与合适抗原结合和其与不相关抗原或抗原混合物的结合进行比较来测试。如果抗体与合适抗原的结合比其与不相关抗原或抗原混合物的结合多2、5、7，优选10倍，则该抗体被认为是专一性的。
制备这种部分到完全人抗体的技术是本领域已知的，任何这样的技术都可以使用。根据一个实施方案，完全人类抗体序列是在转基因小鼠体内制备的，该转基因小鼠已经被改造来表达人类重或轻链抗体基因。已经制备了这种转基因小鼠的多链，其可以产生不同种类的抗体。能产生所需抗体的来自转基因小鼠的B细胞可经融合后生产杂化瘤细胞系用于所需抗体的连续生产。见，例如，Russel，N.D.等，Infectionand Immunity(2000)2000年4月1820-1826；Gallo，M.L.等，European J.of Immun.(2000)30534-540；Green，L.L.，J.of Immun.Methods(1999)23111-23；Yang，X-D等，J.of Leukocyte Biology(1999A)66401-410；Yang，X-D，Cancer Research (1999B)59(6)1236-1243；Jakobovits，A.，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)3133-42；Green，L.and Jakobovits，A.，J.Exp.Med.(1998)188(3)483-495；Jakobovits，A.，Exp.Opin.Invest.Drugs(1998)7(4)607-614；Tsuda，H.et al.，Genomics(1997)42413-421；Sherman-Gold，R.，Genetic EngineeringNews(1997)17(14)；Mendez，M.等，NatureGenetics(1997)15146-156；Jakobovits，A.，WEIR′SHANDBOOK OFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY，THEINTEGRATEDIMMUNESYSTEMVOL.IV，(1996)194.1-194.7；Jakobovits，A.，Current Opinion in Biotechnology(1995)6561-566；Mendez，M.等.，Genomics(1995)26294-307；Jakobovits，A.，CurrentBiology(1994)4(8)761-763；Arbones，M.等，Immunity(1994)1(4)247-260；Jakobovits，A.，Nature(1993)362(6417)255-258；Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1993)90(6)2551-2555；Kucherlapati，等，美国专利No.6,075,181。
抗体还可以通过噬菌体展示技术进行制备。这样的技术用于分离起始抗体或用于产生具有不同专一性或亲和力特征的变体。也可以使用单链Fv，其是方便的。如果需要，它们可以从经接种的转基因小鼠制备。抗体也可以在细胞培养物、噬菌体或在各种动物中生产，所述动物包括但不限于牛、兔、羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猴子、猩猩、猿等。
抗体可以用可检测部分进行标记，所述可检测部分为如放射性原子、发色团、荧光团等。这种经标记的抗体可以用于在体内或在分离的测试样品中进行的诊断技术。抗体也可以共轭连接到例如药物中(如化学治疗药物或毒素)。它们可以连接到细胞因子、配体或另一个抗体上。用于结合到抗体上以获得抗肿瘤效果的合适的制剂包括细胞因子，如白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)；用在光动力治疗中的光敏剂，包括四磺酸酞菁铝(III)、血卟啉和酞菁；放射性核素，如碘-131(131I)、钇-90(90Y)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、锝-99m(99mTc)、铼-186(186Re)和铼-188(188Re)；抗生素类，如阿霉素(doxorubicin)、阿霉素(adriamycin)、柔红霉素(daunorubicin)、甲氨喋呤、柔红霉素(daunomycin)、新抑癌蛋白和卡铂；细菌、植物和其它毒素，如白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄菌外毒素A、相思豆A毒素、蓖麻毒蛋白A(去糖基化蓖麻毒蛋白A和天然蓖麻毒蛋白A)、TGF-α毒素、来自中国眼镜蛇的细胞毒素(浙江眼镜蛇)和gelonin(植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白质，如restrictocin(由局限霉素产生的核糖体失活蛋白质)、saporin(来自石碱花的核糖体失活蛋白质)和RNase；酪氨酸激酶抑制剂；1y207702(二氟化嘌呤核苷酸)；含有抗囊肿剂的脂质体(如，反义低聚核苷酸、编码毒素的质粒、甲氨喋呤，等)；和其它抗体或抗体片段，如F(ab)。
诊断方法一方面，本发明提供了一种有助于诊断存在组织中的囊肿异常的方法。通过CTGF基因、针对其受体的基因的差异表达或它们的表达产物来识别细胞或组织的病理状态。通常，基因表达是通过关注测试系统中基因表达的量(如果有，例如发生改变)进行判断的，例如，表达差异是通过从基因转录过来的mRNA水平的增加(或在某些方面减少)至少1.5倍，2.5倍，或者至少5倍，或者10倍来判断的。在单独的实施方案中，多肽或由基因编码的蛋白质水平的增加说明细胞存在病理状态。该方法可以用于帮助诊断ADPKD相关的肾囊肿和在其它器官(包括肝脏、胰腺、脾脏和卵巢)中通常会在ADPKD中发现的囊肿异常。
此外，通过在异常囊肿形成之前检测蛋白质或基因表达异常，人们就可以预测患囊肿异常的可能性和/或可以较早进行诊断和治疗。
用于本发明的细胞或组织样品包括体液、实体组织样品、组织培养物或从它们衍生得到的细胞和它们的子代，及从这些来源中的任何一个制备的切片或涂片，或任何其它可能含有具有表达异常细胞的样品。优选的样品是从受试者肾小管中制备得到的样品。
利用重组DNA技术和生物信息学的诊断方法一方面，本发明提供了通过测定CTGF基因的表达水平或其受体，并将测定的表达水平和所述疾病或其进展联系起来进行诊断或监测囊肿异常(如与ADPKD疾病相关的那些)的组合物和方法。已知有许多方法可以用来量化感兴趣的基因的表达，所述方法包括但不限于杂化分析(RNA印记分析)和基于PCR的杂化分析。
在分析mRNA水平变化时，首先要将样品中的核酸根据本领域的标准方法提取出来。例如，根据上述Sambrook等(1989)描述的步骤利用各种细胞溶酶或化学溶液将mRNA分离出来，或者通过核酸结合树脂按照制造商提供的说明提出出来。作为例子，在提取的核酸样品中的CTGF mRNA可以接着按照标准步骤分别通过杂化(如，RNA印记分析)和/或通过使用核酸探针和/或引物的扩增程序进行检测。
在诊断方法中，具有至少10个核苷的、对CTGF表现出序列互补和同源性的核酸分子可用作CTGF杂化探针或CTGF PCR引物。本领域已知的是，特定杂化不需要“完美相配”的探针。由于取代、消除或插入而导致的探针序列的细小变化不会影响杂化专一性。通常，可以允许多达20％的碱基对失配(当最佳排列时)。例如，用于检测CTGFmRNA的探针与含在在先识别的序列(如，见SEQ ID NO1)中的相同大小的同源区中的至少80％相同。或者，在同源区排列后，所述探针与相应基因序列的至少85％，或至少90％相同。片段的总长度，和互补序列段的长度依赖于用途或特定核酸片段的应用。基因的更小片段通常可以用于杂化方案中，其中根据人们希望检测的互补序列，互补区的长度会发生变化，如从约10个到约100核苷，或甚至是全长。
具有在长度上多于10个核苷的互补序列段的核苷探针能增加稳定性和杂化的选择性，从而提高所得特定杂化分子的专一性。人们可以设计含有在长度上具有大于约25个甚至更多，优选多于约50个核苷的基因互补序列段的核酸分子，或者根据需要该互补序列段可以更长。这样的片段可以很容易进行制备，例如，通过化学方法经由通过核酸复制技术直接合成该片段，所述核酸复制技术为如在美国专利No.4,603,102中公开的具有两个启动低聚核苷酸的PCRTM技术，或者将选择的序列引入到重组载体中以进行重组生产。
在特定实施方案中，有利的是采用本发明的核酸序列，并与合适的手段相结合，如标签，用于检测杂化和由此得到的互补序列。许多种合适的指示方式是本领域已知的，包括荧光的、放射性的、酶的或其它配体，如抗生物素蛋白/生物素，它们可以提供可检测的信号。也可以使用荧光标签或酶标志(如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化酶)以代替放射性的或其它对环境不利的试剂。在使用酶标志的情况下，比色指示剂物质是已知的，可以采用该物质以提供一种人眼可视或通过分光光度计能检测的方法以识别含有互补核酸的样品的特定杂环。
杂化反应可以在不同“严格度”的条件下进行。相关的条件包括温度、离子强度、培养时间、反应混合物中其它溶质的存在(如甲酰胺)，和洗涤步骤。较高严格度的条件是如较高的温度和较低钠离子浓度，这样的条件需要杂化元素之间较高的最低互补度以形成稳定的杂环复合体。增加杂化反应严格度的条件是公知的，并公开在现有技术中。见，上述Sambrook等，(1989)。
人们也可以进行检测，并使用定量PCR或利用高通量分析如在Velculescu，V.等，Science(1995)270484-487中描述的基因表达系列分析来量化mRNA水平或其表达。简言之，该方法包括从被认为含有转录的细胞或组织样品中分离多mRNAs。任选地，所述基因转录可以被转化为cDNA。基因转录的样品经序列专一性分析和量化。将这些基因转录序列的丰度与参考数据库序列丰度(包括患病的和健康病人的正常数据组)对比。病人患有某种疾病，患有该疾病的病人的数据组大多数紧密相关并且对于本申请而言包括转录差异。
本发明的核苷探针也可用作启动子用于基因或基因转录的增殖和检测。用于检测差异表达的mRNA的启动子与相同长度的基因或多聚核苷酸的同源区的至少约80％相同。为了本发明的目的，增殖是指采用能够以合理可信度复制靶序列的启动子依赖型聚合酶的任何方法。增殖可以通过天然或重组DNA-聚合酶如T7 DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶的Klenow片段和反转录酶进行。
PCR的常用步骤在MacPherson等，PCRA PRACTICALAPPROACH，(IRL Press at Oxford University Press(1991))中公开。然而，针对每个反应所使用的PCR条件要根据经验进行判断。许多参数影响反应的成功。其中，退火温度和时间、持续时间、Mg2+APT浓度、pH和启动子的相对浓度、模板和脱氧核苷酸。
在增殖后，所得DNA片段可以通过凝胶电泳，然后溴化乙锭着色和紫外光照进行检测。感兴趣的差异表达基因的特定增殖可以通过证明该增殖的DNA片段具有预测的长度、具有预期的限制性消化图样和/或杂化到正确的经克隆的DNA序列上得到证实。
探针也可以利用本领域已知的方法连接到固体载体上以用在高通量筛选分析中。例如，国际PCT申请No.WO 97/10365和美国专利号5,405,783，5,412,087和5,445,934公开了含有一个或多个序列的高密度低聚核苷酸芯片的构建。该芯片可以在衍生的玻璃表面上利用美国专利Nos.5,405,783；5,412,087；5,445,934中公开的方法进行合成。可以将光保护的亚磷酸核苷结合到玻璃表面上，利用光刻掩膜通过光解进行选择性地脱保护，并与另一种经保护的亚磷酸核苷反应重复进行。该结合/脱保护过程直到得到所需要的探针。
基因表达水平可以通过将被猜测含有多聚核苷酸的样品暴露在探针修饰的芯片上来检测。对提取出的核酸优选在增殖步骤进行标记，例如，用荧光标签。经标记的样品的杂化是在合适的严格度水平进行的。探针-核酸杂化的程度利用检测设备(如共聚焦显微镜)定量测量。见，美国专利Nos.5,578,832和5,631,734。将所得的测量结果直接与基因表达水平联系起来。
所述探针和高密度低聚核苷酸探针阵列也提供了监测基因多样性表达的有效方法，其中之一就包括基因。因此，该表达监测方法可以用在许多情况中，包括疾病的检测、鉴别从同一病人经一段时间间隔分离得到的样品之间的差异基因表达或筛选在同一时间(或者相反，在一段时间内)上调或下调基因表达的组合物。
杂化的探针和样品核酸可以通过本领域已知的各种方法进行检测。例如，经杂环的核酸可以通过检测与样品核酸相连的一个或多个标记进行检测。该标记可以通过本领域技术人员已知的众多方法中的任何一个进行结合。一方面，该标记是在制备样品核酸中在增殖步骤中同时结合的。这样，例如，与经标记的启动子或经标记的核苷进行的聚合酶链反应(PCR)将提供经标记的增殖产物。在单独的实施方案中，如上所述，使用经标记的核苷(如，荧光标记的UTP和/或CTP)的转录增殖将标记结合进入到转录核酸中。
或者，可以将标记直接加到起始核酸样品中(如，mRNA、polyA、mRNA、cDNA，等)或在增殖完成后直接加到增殖产物中。将标记连接到核酸上的方法是本领域技术人员已知的，包括例如，通过核酸激酶进行的缺口平移或末端标记(如，使用标记的RNA)，然后与连接样品核酸和标记(如，荧光团)的连接用分子相连。
适用于本发明的可检测标记包括任何通过分光镜的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电学的、光学的或化学方法可检测的任何组合物。本发明有用的标记包括用标记的链霉素亲和素共轭物着色的生物素、磁珠(如，DynabeadsTM)、荧光染料(如，荧光素、德州红、罗丹明、绿色荧光蛋白质，等等)、放射标记物(如，3H、125I、35S、14C或32P)酶(如，辣根过氧化酶、生物碱磷酸酶和其它ELISA中常使用的酶)和比色标记，如胶体金或彩色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯、聚丙烯、橡胶，等等)珠。公开这些标记的用途的专利包括美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。
检测这些标记的方法是本领域技术人员已知的。因此，例如，放射标记可以使用胶卷或闪烁计数器进行检测，荧光标记物可以使用光电探测器来检测发射出的光。酶标记通过将酶与底物接触，并检测酶在底物上作用时产生的反应产物进行检测，比色标记可以通过简单观察彩色标记进行检测。
专利公开WO97/10365公开了在杂化之前，或在杂化之后将标记加到靶(样品)核酸中的方法。这些是在杂化之前直接连接到或结合进入靶(样品)核酸中的可检测的标记。相反，“非直接标记“是在杂化之后连接到杂环双链上。通常，所述非直接标记是与在杂化之前已经连接到靶核酸上的结合部分相连。这样，例如，靶核酸可能在杂化之前经生物素化。在杂化之后，抗生物素蛋白-共轭的荧光团将结合到含有杂化双链的生物素上，从而得到可很容易检测到的标记。有关标记核酸和检测经标记的杂化核酸的方法的详细综述参见LABORATORYTECHNIQUES INBIOCHEMISTRY ANDMOLECULARBIOLOGY，24卷Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸样品也可利用在国际PCT申请No.WO97/10365中公开的方法在杂化之前经修饰成高密度探针阵列，以减少样品复杂度，从而减少背景信号和提高测量敏感度。
从芯片分析得到的结果通过利用计算机软件进行分析。见，例如，EP 0717 113A2和WO 95/20681。将杂化数据读进程序，其会计算靶基因的表达水平。将该图与现存的针对患病的和健康的个体的基因表达数据组对比。所得数据和患病个体数据之间的关联说明疾病已经在受试病人体内发生。
检测和量化蛋白质或多肽的诊断方法另一方面，本发明提供了通过检测和/或量化经下面表2到5中所列的存在在样品中的基因表达所得的蛋白质或多肽来诊断或检测囊肿异常(如与ADPKD疾病相关的那些)的方法和组合物。本领域有许多技术可用于蛋白质分析，包括但不限于放射免疫分析、ELISA(酶连免疫放射性分析)、“三明治”免疫分析、免疫放射性分析，原位免疫分析(使用例如，胶体金、酶或放射同位素标记)、western印记分析、免疫沉淀分析、免疫荧光分析和PAGE-SDS。
在诊断由基因差异表达表征的疾病时，人们通常进行受试者和合适的对照物之间的比较分析。优选地，诊断测试包括衍生自受试者的对照样品(下面统称为“阳性对照”)，其表现出病理的或异常的基因表达水平。有用的，还要包括“阴性对照”，该对照缺少病理状态的临床特征，并且其基因表达水平在正常的范围内。受试者与阳性对照之间在经确定的改变方面具有阳性关系，则说明患有或可能会患有疾病。受试者和阴性对照之间缺少关联则肯定了诊断结果。
人们也可以改变已知的免疫分析方法以检测和量化表达。基因产品的确定需要测量发生在对基因产品有反应的抗体之间的免疫专一性结合的量。为了检测和量化免疫专一性结合，或在杂化或增殖步骤产生的信号，可以采用数字影像分析系统，其包括但不限于使用检测探针放射性或化学发光的数字影像分析系统。
确定治疗剂的方法本发明还提供了用于确定先导药物的筛选和逆转细胞或组织病理状态的方法，或选择性抑制细胞或组织生长或增生的方法。一方面，所述筛选确定了能用于治疗囊肿异常或治疗或改善与ADPKD相关的症状的先导化合物或生物制剂。该筛选可以在体外或体内进行。
一方面，需要确定能结合到可溶CTGF，或其受体(从而抑制受体的活化的候选药物。在某些应用中，希望得到能够抑制蛋白质与其受体结合的候选药物。对于某些应用，能够结合受体的候选药物的确定可能用作传递治疗剂或诊断剂的方法。对于其它应用，希望得到能模拟固有CTGF活性的候选药物。这样，通过操纵受体的结合配体复合体，人们就可以促进或抑制囊肿病灶的加剧。
用于筛选的实验物质可以通过各种来源获得。它们可以来自天然产物库、组合化学库、通过重组库得到的生物产品，等等。实验物质的来源对于本发明来说并不是重要的。本发明提供了筛选化合物和组合物的方法，所述化合物和组合物可能在先前的其它筛选方案中被忽略了。
为了进行体外筛选和分析，首先要得到合适的细胞培养物或组织培养物。所述细胞可能是经培养的细胞或经基因修饰的差异表达基因的细胞。或者，所述细胞可以来自组织切片。美国专利No.5,789,189公开了生产多囊肾病细胞(来自体外囊肿)培养物的方法。该细胞在一定条件(温度、生长或培养介质和气(CO2))下培养足够的时间以获得指数增生而没有密度依赖型限制。也希望保留另外的单独的细胞培养物；没有给予带测试药物的培养物作为对照。
本领域技术人员可以显然易见的是，将合适的细胞在微孔板上培养，几个制剂可以同时测试，注意观察遗传型变化、表型变化和/或细胞死亡。一方面，所述筛选使用了下文中要提到的组合物和MDCK囊肿分析方法。
当制剂是组合物而不是DNA或RNA核酸分子时，可以将合适的条件直接施用到细胞培养物上或加到培养介质中以进行添加。本领域技术人员已知的是，“有效”量必须根据经验确定。
所述筛选包括将制剂与差异表达基因的测试细胞接触，然后分析细胞的基因表达水平。在某些方面，可能需要在分析之前确定基因的表达水平。这提供一个基线以对比在向细胞培养物给予所述制剂之后的表达。在另一实施方案中，测试细胞是从已建立的差异表达CTGF基因的细胞系得到的经培养的细胞。如果一个制剂能将基因表达恢复(减少和增加)到正常细胞中存在的状态，则该制剂就是治疗剂。
在另一方面，将测试细胞或组织样品从要进行治疗的受试者中分离出来，筛选出一个或多个有潜能的制剂来针对那个病人确定最佳治疗和/或疗程。例如，肾或肝组织适合这种分析。
为了实现本发明的目的，“制剂”包括但不限于生物或化学化合物如简单的或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质或低聚核苷酸。可以合成大量的化合物，例如，低聚体如寡肽和寡核苷，和基于各种核心结构的合成有机化合物也包括在术语“制剂”中。此外，各种天然来源也能为筛选提供化合物，如植物或动物提取物，等等。应该可以理解的是，尽管没有总是详细说明，但是所述制剂可以单独使用或与其它用本发明筛选确定的具有相同或不同生物活性的制剂一起使用。这些制剂和方法也可与其它治疗结合使用。它们可以同时给药或顺序给药。
所述筛选在动物如大鼠或小鼠中的应用，该方法提供了一种方便的动物模型系统，该系统可以在治疗剂临床实验前使用或者用于先导物优化。在这个系统中，如果基因表达与未经处理的具有病理细胞的动物相比恢复到正常水平或与含有CTGF基因差异表达的细胞的存在相关的症状得到改善，则该候选药物是具有潜力的药物，可能适合进一步开发。在该筛选中使用单独的健康的和未经处理的细胞或动物的阴性对照组也是有用的，可以提供另一个比较基准。
诊断和治疗性抗体组合物本发明也提供了一种能专一性地与本发明的蛋白质或多肽形成复合体的抗体，其可用于本发明的诊断和治疗方法中。术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体及它们的衍生物(如上所述)。抗体包括但不限于小鼠、大鼠、兔或人抗体。抗体可以在细胞培养物、噬菌体或各种动物中产生，所述动物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴子、黑猩猩、猿，等等。该抗体还可用于识别和纯化治疗性和/或诊断用多肽。
制备多克隆抗体和单克隆抗体的实验室方法，和推导出它们相应的核酸序列的方法是本领域已知的，见上述Harlow和Lane(1988)supra和Sambrook等，(1989)。本发明的单克隆抗体可以通过将蛋白质或其片段引入到动物(如小鼠或兔)体内进行生物性生产。将在动物体内生产细胞的抗体分离出来，并与骨髓瘤细胞或异骨髓瘤细胞融合产生杂化细胞或杂化瘤细胞。因此，本发明还提供了产生单克隆抗体的杂化瘤细胞。
为了进行说明，通过以分类号No.TP143(Torrey Pines Biolabs)或SC-14939(Santa Cruz Biotechnology，Inc)获得的抗-CTGF抗体和已知方法，本领域技术人员就可以生产并筛选出本发明的杂化瘤细胞和抗体以得到具有结合CTGF蛋白质或多肽能力的抗体。
如果经测试的单克隆抗体与蛋白质或多肽结合，则该经测试的抗体和本发明杂化瘤细胞提供的抗体是相同的。也可以不进行过多实验就确定一个抗体是否与本发明的单克隆抗体具有相同的专一性，方式是通过确定经测试的抗体是否阻止本发明单克隆抗体与蛋白质或多肽结合(通常，所述的单克隆抗体对蛋白质和多肽是有反应的)。如果进行测试的抗体与本发明的单克隆抗体进行竞争(表现为本发明的单克隆抗体的结合降低)，则说明可能两种抗体结合到相同的或非常相似的表位上。或者，人们可以预先将本发明的单克隆抗体与通常该抗体会对其有反应的蛋白质一起培养，并确定进行测试的单克隆抗体与抗原结合的能力是否受收到抑制。如果进行测试的单克隆抗受到抑制，则非常有可能的是，该抗体与本发明的单克隆抗体具有相同或非常相关的表位专一性。
术语“抗体”也包括所有同型抗体。单克隆抗体特定的同型可以直接通过从起始融合中选择进行制备，或其次，从分泌不同同型单克隆抗体的亲本杂化瘤通过使用同系选择技术来分离class switch variants，使用Steplewski，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)828653或Spira等，J.Immunol.Methods(1984)74307中描述的方法。
本发明还提供了上述多克隆和单克隆抗体的生物活性片段。这些“抗体片段”保留了某些选择性地与其抗原或免疫抗原结合的能力。这样的抗体片段包括但不限于Fab；Fab′；F(ab′)2；Fv，和SCA。
“生物活性抗体片段”的具体例子是抗体的CDR区。制备这些片段的方法是本领域已知的，见例如，上述Harlow和Lane(1988)。
本发明的抗体可以经修饰后产生嵌合抗体和人化抗体。Oi，等，BioTechniques(1986)4(3)214。嵌合抗体是那些其中抗体的各种重和轻链域是经来自一种以上种类的DNA编码的。
能分泌具有本发明单克隆抗体专一性的单克隆抗体的其它杂化瘤细胞的分离也可以由本领域技术人员通过产生抗独特型抗体来完成。Herlyn，等，Science(1986)232100。抗独特型抗体是能识别存在在单克隆抗体(由感兴趣的杂化瘤细胞产生)上的唯一决定簇的抗体。
两个杂化瘤细胞单克隆抗体之间的独特性识别说明两个单克隆抗体在对相同的表位决定簇识别方面是一样的。因此，通过使用抗体针对存在在单克隆抗体上的表位决定簇就可以识别其它表达具有相同表位专一性的单克隆抗体的杂化瘤细胞。
也可以使用抗独特型抗体技术生产能模拟表位的单克隆抗体。例如，针对第一个单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体将在超变量区具有结合域，该超变量区是由第一个单克隆抗体结合的表位的镜像。这样，在这种情况下，所述抗独特型单克隆抗体可以用于免疫作用以生产这些抗体。
在本发明中所使用的术语“表位”包括对本发明的单克隆抗体具有专一亲和力的任何决定簇。表位决定簇通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，并通常具有专门的三维结构特征，和专门的电荷特征。
本发明的抗体可以连接到可检测的制剂或标记上。有许多本领域技术人员已知的不同的标记和标记方法。
将抗体结合到小分子量的半抗原上会增加分析的敏感度。然后，通过另一个反应对所述半抗原进行专一性检测。例如，通常使用半抗原如生物素，其会与抗生物素蛋白反应，或者二硝基苯酚、吡哆醛和荧光素，它们会与专门的抗半抗原抗体反应。见上述Harlow和Lane(1988)supra。
本发明的抗体也可与许多不同的载体结合。因此，本发明还提供组合物，该组合物含有所述抗体和另一种活性或惰性物质。已知的抗体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁石。这些载体的性质可以是可溶的或不可溶的，根据发明的目的决定。本领域技术人员会了解用于结合单克隆抗体的其它合适的载体，或能够根据常规实验进行判断。
含有抗体、其片段或产生该抗体的细胞系也在本发明的保护范围内。当这些组合物用于药物用途时，它们也可以与药学可接受的载体结合。
下面实施例用于解释而不是限制本发明。
实验方法表达分析将两种不同的表达谱技术联合用于确定CTGF为治疗靶点，这两种技术是SAGE(上述Velculescu，V等(1995))和微阵列。由于SAGE不能很容易地在大量样品上进行，所以首先产生四个永生化的正常的和囊肿的细胞系的SAGE谱，然后第二步，基于SAGE结果定制PKD cDNA微阵列并构建多重ADPKD肾样品。这些高产量染色体分析不仅给出了基因表达谱的生物芯片(snapshot)，而且它们也揭示了疾病的分子机理。
对来自健康或感染ADPKD的供者的肝和肾表皮细胞系进行全面SAGE分析(每个库50,000-60,000标记)以描述功能基团和疾病专一性途径。见下面表1A和1B。最后，得到了针对正常的和表型的ADPKD综合基因表达谱。确定了多个在囊肿形成中可能起作用的新型基因，所述囊肿形成由于数个功能性途径(见下面的表2-5)。这些途径包括增生、代谢、ECM重塑和发炎。
高分辩2D凝胶电泳如Lopez(1999)Meth，Biol12111-127中所述的，对从病人分离得到的囊肿流进行高分辩2D凝胶电泳，并进行了下述小的改动。用固定的干条(Immobiline dry strips)(非线性pH范围3-10；AmershamBiosciences)进行等电聚焦。这样的干条用蛋白质样品(100μg)通过胶体内倒灌13小时而进行再次水合，并经电泳(总32kVh)。第二方向是在10％Duracryl聚丙烯酰胺SDS凝胶中进行的，用Investigator 2D电泳系统运行的(Genomic Solutions，Ann Arbor，MI，USA)。如在Rabilloud，“Methods in molecular biologyProteom analysisprotocols”(1999)112297-305中描述的那样进行银染。使用强度计算的Phoretix Powder扫描软件V.3.0扫描凝胶，并用Phoretix高级软件v.5.0分析(Non Linear Dynamics Ltd，Durham，NC)。为了利用肽质量指纹谱确定蛋白质，需要用SYPRO Ruby蛋白质凝胶染料根据制造商的说明对凝胶进行染色(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)。
结果显示在图3中。
抗CTGF抗体阻止囊肿的形成将MDCK细胞在完全MEM(最少必需介质)中生长直到80％融合，该MEM含有10％热失活的胎牛血清、青霉素/链霉素(Gibco，Rockville，MD)。如前面在Pollack等，Dev.Biol.(1998)20467-79中所述那样培育MDCK囊肿。简言之，通过如下步骤将MDCK细胞接种在胶原基质中第一天确保它们处于对数生长期，MDCK细胞受胰蛋白酶作用，并铺展到100mm培养皿中(BD Bissciences)。第二天，在冰上混合2.1ml I型大鼠尾部胶原(BD Biosciences，Bedford，MA)，6.74ml完全MEM，0.98ml 140mM NaHCO3和0.169ml 142mM的NaOH，然后将50μl转移到96孔板(BD Biosciences)的井中，在37℃培养直到固化。在第1天，将井用胰酶消化并接种，用胶原混合物重新悬浮，使最终浓度为4X104细胞/ml，分布为50μl/井。将井在37℃培养30分钟使胶原固化，并用100μl完全MEM覆盖。在第4天，用含有抗体的完全MEM替代介质。每隔一天更新介质。
将两个CTGF抗体在MDCK体外囊肿分析中进行测试以判定它们阻止囊肿形成的能力。如制造商建议的那样，在使用前，将商业购得的抗体制剂重新悬浮，透析对抗PBS以除去NaN3，通过0.2μm过滤器灭菌。兔抗-CTGF(Torrey Pines Biolabs，Inc.，San Diego，CA)、兔IgG对照(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc，West Gruz，PA)、羊抗-CTGF抗体(Santa Gruz Biotechnology，Inc.，Santa Gruz，CA)和羊IgG对照(Sigma/Aldrich)以2倍稀释液使用，从25μg/ml开始，直到0.02μg/ml。用Zeiss Axiovert25 inverted Microscope和Hamamatsu数码相机结合QED影像软件(QED Imaging Inc，Pittsburg，PA)使囊肿可视化。
CTGF免疫组织化学从经CO2窒息的动物(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)获得jck(50天大)或cpk(10天大)小鼠的肾脏。从4％多聚甲醛-PBS固定的石蜡包埋的肾脏制备切片(5μm厚)，并在100％二甲苯中培养2次，时间为5分钟，在100％乙醇中培养两次，时间为5分钟、在95％乙醇中培养2次，时间为5分钟，在80％乙醇中培养两次，时间为5分钟，在蒸馏水钟培养两次，时间为5分钟，在磷酸盐缓冲的食盐水(PBS)中培养两次，时间5分钟。将玻片在含有3％(w/vol)牛血清白蛋白(PBS/BSA)的PBS中封闭30分钟。通过将切片在胰酶溶液(Sigma/Aldrich)中在室温培养30分钟将抗原暴露出来，然后用PBS洗涤5每次，每次5分钟。切片在20μg/ml兔抗-CTGF(AbCam，Cambridge，MA)PBS/BSA中在室温培养2小时，然后用PBS洗涤5次，每次5分钟。用1∶100稀释度(vol/vol)(在PBS/BSA中)的抗-兔抗体(Sigma/Aldrich)培养切片1小时，然后用PBS洗涤5次，每次5分钟。将玻片浸在含有0.001％伊万氏兰复染剂中30秒，然后用PBS洗涤5次，每次5分钟。将玻片用固封剂(Vector Labs H1000)固封在玻璃盖片下。可以用Olympus1X70显微镜在UV照明下观察玻片。
可以理解的是，尽管本发明结合上述实施方案进行说明，但是前述说明和实施例仅用于说明而不是限制本发明。本发明范围内的其它方面、优点及改变对于本领域技术人员来说是显而易见的，本发明也涉及这些内容。
表1A.SAGE库的总结
表1B
A.U.任意单元表2CL中前20个上-和下调基因
表3.CK中前20个上-和下调基因
表4CK和CL常见的上调基因＞5x
表5-A CL中上调基因的功能基团1-生长因子，趋化因子和炎症应答相关因子
2-受体和细胞表面抗原
3-转录因子和信号传导调节物
5-细胞骨架
6-细胞外基质
7-蛋白酶
8-离子通道和转运蛋白
9-其它
表5-B，CK中上调基因的功能基团1-生长因子，趋化因子和炎症应答相关因子
2-受体和细胞表面抗原
3-转录因子和信号传导调节物
4-凋亡
5-细胞骨架
6-细胞外基质
7-蛋白酶
8-离子通道和转运蛋白
9-其它
序列表<110>0·易卜拉欣贝利-别斯克罗夫纳亚<120>治疗多囊病的方法和组合物<130>GZ 3127.20<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2312<212>DNA<213>人<400>1tccagtgacg gagccgcccg gccgacagcc ccgagacgac agcccggcgc gtcccggtcc60ccacctccga ccaccgccag cgctccaggc cccgcgctcc ccgctcgccg ccaccgcgcc120ctccgctccg cccgcagtgc caaccatgac cgccgccagt atgggccccg tccgcgtcgc180cttcgtggtc ctcctcgccc tctgcagccg gccggccgtc ggccagaact gcagcgggcc240gtgccggtgc ccggacgagc cggcgccgcg ctgcccggcg ggcgtgagcc tcgtgctgga300cggctgcggc tgctgccgcg tctgcgccaa gcagctgggc gagctgtgca ccgagcgcga360cccctgcgac ccgcacaagg gcctcttctg tgacttcggc tccccggcca accgcaagat420cggcgtgtgc accgccaaag atggtgctcc ctgcatcttc ggtggtacgg tgtaccgcag480cggagagtcc ttccagagca gctgcaagta ccagtgcacg tgcctggacg gggcggtggg540ctgcatgccc ctgtgcagca tggacgttcg tctgcccagc cctgactgcc ccttcccgag600gagggtcaag ctgcccggga aatgctgcga ggagtgggtg tgtgacgagc ccaaggacca660aaccgtggtt gggcctgccc tcgcggctta ccgactggaa gacacgtttg gcccagaccc720aactatgatt agagccaact gcctggtcca gaccacagag tggagcgcct gttccaagac780ctgtgggatg ggcatctcca cccgggttac caatgacaac gcctcctgca ggctagagaa840
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Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro130 135 140Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys145 150 l55 160Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly165 170 175Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro180 185 190Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala195 200 205Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp210 215 220Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg225 230 235 240Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys245 250 255Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly260 265 270Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr275 280 285Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu290 295 300
Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile305 310 315 320Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe325 330 335Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala340 34权利要求
1.一种抑制在适当的组织中发生的囊肿疾病或异常的方法，该方法通过将所述组织与有效量的能调节表2到5中所列的基因或多聚核苷酸生物活性的制剂接触，从而抑制囊肿异常。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述适当的组织选自肾小管组织、肝脏组织或胰腺组织。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述适当的组织是从患有ADPKD的受试者中分离得到的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节剂为调节表2到5中所列多聚核苷酸或基因活性或表达的多聚核苷酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述制剂为专一性的结合到基因或多聚核苷酸表达产物上的抗体或配体。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述制剂选自反义多聚核苷酸、核酶或多价RNA适配物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述制剂选自抗体、抗体衍生物或抗体变体。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述制剂为多克隆抗体或单克隆抗体。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述制剂选自抗体片段、人化抗体或嵌合抗体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂为小分子，其能修饰、阻止或增加基因或多聚核苷酸表达产物的翻译后修饰。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂为小分子，其能调节多聚核苷酸或基因表达产物的前体的活化。
12.一种抑制多囊损伤在受试者体内形成的方法，该方法包括向受试者给予能调节表2到5中所列基因生物活性的制剂，从而抑制多囊损伤的形成。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述调节剂是抑制或增加CTGF多聚核苷酸活性或表达的多聚核苷酸。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述制剂是专一性结合到基因或多聚核苷酸表达产物上的抗体或配体。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述制剂选自反义多聚核苷酸、核酶或多价RNA适配物。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述制剂是选自下列的抗体单克隆抗体、抗体衍生物或抗体变体。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述制剂是多克隆抗体或单克隆抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述制剂选自抗体片度、人化抗体或嵌合抗体。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述制剂是小分子，其能修饰、阻止或增加表2到5所列基因或多聚核苷酸表达产物的翻译后修饰。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述制剂是修饰表2到5所列多聚核苷酸或基因表达产物前体活化的分子。
21.一种预防或治疗适当的受试者患有的常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)的方法，该方法包括向需要的受试者给予有效量的经分离的能调节表2到5中所列基因或其表达产物多囊生物活性的分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述经分离的分子是能调节CTGF多聚核苷酸活性或表达的多聚核苷酸。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述分子是能专一性结合到基因或多聚核苷酸表达产物上的抗体。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述分子选自反义多聚核苷酸、小分子、核酶或多价RNA适配物。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述分子是选自抗体、抗体衍生物或抗体变体。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述制剂是多克隆抗体或单克隆抗体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述制剂选自抗体片段、人化抗体或嵌合抗体。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述分子是小分子，其能修饰、抑制或增加基因或多聚核苷酸或表2到5中所列基因的表达产物的翻译后修饰。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述分子是能修饰表2到5所列多聚核苷酸或基因表达产物前体活化的分子。
全文摘要
本发明涉及通过抑制目前与多囊病表现相关的基因来诊断和治疗该疾病的组合物和方法。仅作为举例说明，连接组织生长因子基因即为这样的基因之一。本发明还涉及治疗或改善异常胆囊机能障碍和与组织中胆囊形成相关的疾病的方法和组合物。所述方法和组合物通过抑制或增加基因表达或该基因表达产物或其受体的生物活性来治疗和改善组织中病态囊肿形成。
文档编号A61K39/395GK1976727SQ200580021831
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者O·别斯克罗夫纳亚, H·于松 申请人:建新公司