具有减少的毒性的治疗剂的制作方法

专利名称：具有减少的毒性的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有减少的体内毒性的新治疗剂，包含新治疗剂的组合物，用于在体内减少治疗剂毒性的方法以及包括施用新治疗剂的用于治疗患者的方法。
背景技术：
已尝试使用抗体-药物偶联物(ADC)来局部递送细胞毒剂或细胞生长抑制剂，即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Payne，G.(2003)CancerCell 3207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26151-172；US4975278)。理论上，在全身施用这些未偶联的药物试剂对正常细胞会产生无法接受的毒性水平下，药物部分应靶向肿瘤并被内在化(Baldwin等，(1986)Lancet pp.(Mar.15，1986)603-05；Thorpe，(1985)″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review，″in Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，A.Pinchera等(编辑)，pp.475-506)。
多克隆抗体和单克隆抗体都已被用于制造ADC(Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21183-87)。在这些方法中使用的药物包括道诺霉素、多柔比星、甲氨喋呤和长春地辛(Rowland等，(1986)同上)。抗体-毒素偶联物中使用的毒素包括诸如白喉毒素的细菌毒素，诸如蓖麻毒蛋白的植物毒素，诸如格尔德霉素(Mandler等(2000)J. of the Nat.Cancer Inst.92(19)1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters101025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13786-791)、美登素类(EP1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 938618-8623)和加利车霉素(Lode等(1998)Cancer Res.582928；Hinman等(1993)CancerRes.533336-3342)的小分子毒素。新近，已将auristatin肽、auristatin E(AE)和monomethylauristatin(MMAE)以及多拉司他汀的合成类似物(WO02/088172)与全长抗体偶联(如Klussman，等(2004)，Bioconjugate Chemistry15(4)765-773；Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7)778-784；Francisco等(2003)Blood 102(4)1458-1465；US2004/0018194；WO04/032828；Mao，等(2004)Cancer Res.64(3)781-788；Bhaskar等(2003)Cancer Res.636387-6394；WO03/043583；Mao等(2004)Cancer Res.64781-788)。在US5767237；US6124431中也披露了auristatin E的变体。
ZEVALIN(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen Idee Inc.)是一种抗体-放射性同位素偶联物，由针对见于正常和恶性的B淋巴细胞表面的CD20抗原的鼠IgGlκ单克隆抗体和111In或90Y放射性同位素通过硫脲接头-螯合剂连接组成(Wiseman等(2000)Eur.J. Nucl.Med.27(7)766-77；Wiseman等(2002)Blood 99(12)4336-42；Witzig等(2002)J. Clin. Oncol.20(10)2453-63；Witzig等(2002)J. Clin.Oncol. 20(15)3262-69)。虽然，ZEVALIN具有针对B-细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，但是在大多数患者中施用引起严重及持久的血细胞减少症。MYLOTARGTM(吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一种由连接加利车霉素的CD33抗体组成的抗体药物偶联物，在2000年被批准通过注射用于治疗急性髓细胞样白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)686；US专利号4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)，一种由通过二硫化物接头SPP连接美登素类药物部分DM1的huC242抗体组成的抗体药物偶联物(Xie等(2004)J. of Pharm.and Exp. Ther.308(3)1073-1082)，正进入用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌等等的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，一种由连接美登素类药物部分DM1的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体组成的抗体药物偶联物，正在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。
业已尝试了多种方法以改善小分子或生物治疗剂的半衰期。例如，已将糖基化位点导入分子中(Keyt等，1994，PNAS USA 913670-74)，以及将分子与PEG偶联(Clark等，1996，J. Biol.Chem.，27121969-77；Lee等，1999，Bioconjugate Chem.10973-981；Tanaka等，1991，CancerRes.513710-14)以增加分子的大小和增加消除半衰期(elimination half-time)。一些人已尝试使用人血清清蛋白来改善药物的治疗用途。例如，清蛋白业已连接上小分子(Syed等，1997，Blood 893243-3252；Burger等，2001 Int.J. Cancer92718-724；Wosikowski K，等，Clin Cancer Res.2003 May 9(5)1917-26)；CD4(Yeh等，1992，PNASUSA 891904-1908)；IgG的Fc部分(Ashkenazi等(1997)Curr.Opin in Immunol.9195-200；IL-2(Yao，Z等，(2004 May)CancerImmunol Immunother.53(5)404-10)以及在抗-gp72抗体和甲氨喋呤分子之间的桥接(Affleck，K等，(1992)Br J Cancer.65(6)838-44)。
还已研究了清蛋白结合多肽的用途。已报道了与来自链球菌G蛋白的清蛋白结合域融合的人1型可溶性补体受体(sCR1)的体内半衰期延长(Makrides等，(1996) J. Pharmacol.Exptl.Ther.277532-541)。已描述了标记的G蛋白的清蛋白结合域(EP0486,525)。申请人已描述了一些噬菌体展示衍生的清蛋白结合肽。参见WO01/45746，美国专利公开号2004/0001827，和Dennis，MS，等，(2002)JBC 277(38)35035-43。理论上，血清清蛋白结合肽在体内与血清清蛋白非共价结合。照此，血清清蛋白结合肽是血清清蛋白自身从体内循环机制中除去的步骤所必需的。
描述如下的本发明提出了在上下文与靶向剂/细胞毒剂的偶联物中，清蛋白结合肽的出乎意料的有利用途。
发明概述本发明涉及包含共价连接的至少一个血清清蛋白结合部分(SABM)、靶向剂(TA)和细胞毒剂(CA)的组合的偶联物分子。根据一个实施方案，偶联物分子包含2个或更多个CA。根据一个实施方案，偶联物分子包含2个或更多个TA。
根据本发明的一个实施方案，SABM包含至少50％同一于DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)序列的氨基酸序列，其中氨基酸序列具有两个Cys残基，在Cys残基之间具有5个氨基酸残基。根据一个实施方案，氨基酸序列与SEQ ID NO8具有选自至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性和至少99％同一性的同一性百分数。
根据另一个实施方案，SABM包含DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)氨基酸序列的变体，其中除Cys残基外，SEQ ID NO8的1-5个任何残基为不同的氨基酸残基所取代。
根据另一个实施方案，SABM包含线性或环状氨基酸序列，选自Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-XaaPhe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys[SEQ ID NO1]Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe[SEQ ID NO2]Cys-Tyr-Xaal-Pro-Gly-Xaa-Cys[SEQ ID NO3]Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp[SEQ ID NO4]Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys[SEQ ID NO5]；Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp[SEQ ID NO6]；CXXGPXXXXC[SEQ ID NO21]XXXXCXXGPXXXXCXXXX[SEQ ID NO22]CXXXXXXCXXXXXXCCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO23]CCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO24]CCXXXXXCXXXXCXXXXCC[SEQ ID NO25]CXCXXXXXXXCXXXCXXXXXX[SEQ ID NO26]XXXXXDXCLPXWGCLWXXXX[SEQ ID NO155]XXXXDXCLPXWGCLWXXX[SEQ ID NO156]DXCLPXWGCLW[SEQ ID NO423]XXXXDICLPRWGCLWXXX[SEQ ID NO424]，XXXXXDICLPRWGCLWXXXX[SEQ ID NO425]XXEMCYFPGICWMXX[SEQ ID NO426]XXDLCLRDWGCLWXX[SEQ ID NO427]其中X是任意氨基酸残基。
根据一个优选的实施方案，上述通式的SABM序列，特别是SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，在N-末端(Xaa)x和C-末端(Xaa)z处包含额外的氨基酸，其中Xaa是一种氨基酸，x和z是大于或等于0(零)的整数，一般小于100，优选小于10以及更优选为0，1，2，3，4或5，更优选4或5，Xaa1选自Ile、Phe、Tyr和VaI。在一个实施方案中，本发明涉及包含序列DICLPRWGCLW[SEQ ID NO 8]的清蛋白结合肽的用途。根据一个实施方案，SABM包含任一选自SEQ ID NOs7-20、27-154和157-421的氨基酸序列。根据一个优选的实施方案，SABM包含选自SEQID NOs7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列。
根据另一个实施方案，SABM包含下列氨基酸序列Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak，其中i、j和k的和为约25或更少，Xaa是任意氨基酸残基。根据一个优选的实施方案，i、j和k的和为约18个残基或更少。根据另一个优选的实施方案，i、j和k的和为约11个残基或更少。
根据另一个实施方案，SABM包含表1-9中所描述的任意一个的肽序列。
根据本发明的一个实施方案，所有上述的SABM序列与血清清蛋白结合，具有约100μM或更低的Kd。根据另一个实施方案，Kd选自约10μM或更小、约1μM或更小、约500nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小和约10nM或更小。
根据另一个实施方案，TA是包含能与靶细胞表面蛋白结合的氨基酸序列的多肽，其中TA包含细胞表面蛋白的配体、粘附素或抗体、或能与细胞表面蛋白结合的上述任一的片段的氨基酸序列。根据一个实施方案，要被靶向的细胞表面蛋白是B细胞表面标志。根据另一个实施方案，要被靶向的受体选自HER2、CD20、EGFR、PDGFR、BR3、Flt-1、KDR和EphB2。根据另一个实施方案，TA是针对任一那些受体的抗体。根据一个优选的实施方案，抗体以任一下列形式存在Fab、F(ab)2、scFv和双抗体。根据另一个实施方案，TA包含本文中所述的VH或VL序列(如包含SEQ ID NO428和429的抗原结合部分的抗-HER2抗体)。
根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428和429的可变区。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列的变体，其中至少一个或多个选自根据Kabat编号系统编号的Q27(VL)、D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)和T94(VL)的氨基酸为除丙氨酸之外的任何氨基酸所取代。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列的变体，其中可变区的至少一个或多个氨基酸具有选自D28(VL)Q、D28(VL)G、N30(VL)S、T31(VL)S、A32(VL)G、Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V、F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W和T94(VL)S的取代。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列的变体，其中可变区包含至少三个取代Y49(VL)D、F53(VL)W和Y55(VL)W。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列的变体，其中可变区包含至少三个取代N30(VL)S、H91(V1)F和Y92(VL)W。
根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，其中至少一个或多个选自根据Kabat编号系统编号的W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)和Y102(VH)的氨基酸为除丙氨酸之外的任何氨基酸所取代。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ IDNO429的重链可变区序列的变体，其中可变区包含至少一个或多个选自W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P、F100(VH)L、F100(VH)M、F100(VH)W、Y100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K和Y102(VH)L的取代。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，其中可变区包含至少F100(VH)P和Y102(VH)K的取代。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，其中可变区包含至少F100(VH)P和Y102(VH)L的取代。
根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列和SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，其中至少一个或多个选自根据Kabat编号系统编号的D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、T94(VL)、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)和Y102(VH)的氨基酸为除丙氨酸之外的任何氨基酸所取代。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列和SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，包含至少一个或多个下列取代D28(VL)Q、D28(VL)G、N30(VL)S、T31(VL)S、A32(VL)G、Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V、F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W、T94(VL)S、W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P、F100(VH)L、F100(VH)M、Y100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K和Y102(VH)L。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列和SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，包含至少下列的取代Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P和Y102(VH)K。根据一个实施方案，抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428的轻链可变区序列和SEQ ID NO429的重链可变区序列的变体，包含至少下列的取代Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P和Y102(VH)L。根据另一个实施方案，所述抗-HER2抗体是任何披露于2003年4月9日提交的美国专利公开号2003/0228663A1；WO03/087131；Carter等，(1992)PNAS894285-4289的抗-HER2抗体，这些出版物在此特别并入作为参考。
根据一个实施方案，除与细胞外表面上的蛋白质结合的能力之外，TA具有额外的生物活性。根据另一个实施方案，所述其他的生物活性是阻断配体介导的细胞通过细胞发信号的能力。根据另一个实施方案，所述其他的生物活性是诱导被靶向的细胞凋亡的能力。根据另一个实施方案，TA是与所考虑的细胞上的蛋白质结合，具有选自10uM或更小、1uM或更小、500nm或更小、100nm或更小和10nm或更小的Kd的多肽。
根据一个实施方案，与正常细胞相比，TA结合的感兴趣细胞上的蛋白质在癌细胞中过表达。根据另一个实施方案，被TA靶向的细胞是致病细胞，诸如肿瘤细胞。
根据一个优选的实施方案，细胞毒剂是monomethylauristatin(MMAE)。
根据另一个优选的实施方案，偶联物分子包含位于所述SABM和靶向剂或细胞毒剂之间的接头部分。在一个实施方案中，接头部分包含氨基酸序列GGGS(SEQ ID NO422)。
根据另一个实施方案，SABM与人清蛋白结合。根据另一个实施方案，SABM被偶联至TA的重链或轻链可变区的N-或C-末端区。
本发明提供了包含与药用载体混合的偶联物分子的组合物。本发明还提供了偶联物分子在药物制备中的应用。
本发明还提供了用于减少治疗剂毒性的方法，包括用偶联有治疗剂的血清清蛋白结合部分(SABM)产生治疗剂的步骤。该方法可进一步包括比较具有SABM的治疗剂与没有SABM的治疗剂的毒性的步骤。根据一个实施方案，该方法进一步包括测定治疗剂SABM偶联物毒性的步骤。
本发明提供了减少哺乳动物中治疗剂毒性的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的根据本发明的偶联物分子。根据一个实施方案，该方法进一步包括测定治疗剂SABM偶联物毒性的步骤。根据一个优选的实施方案，哺乳动物患有自身免疫性疾病或癌症。
本发明提供了治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包括用治疗有效量的与肿瘤细胞或肿瘤周围的脉管系统结合的本发明的偶联物分子处理患有肿瘤的哺乳动物的步骤。本发明还提供了治疗哺乳动物中自身免疫性紊乱的方法，包括用治疗有效量的本发明的偶联物分子处理患有自身免疫性紊乱的哺乳动物的步骤。根据一个优选的实施方案，偶联物分子与有助于或引起自身免疫性紊乱的B-细胞结合。本发明还提供了治疗哺乳动物中细胞增殖性紊乱的方法，包括用治疗有效量的本发明的偶联物分子处理患有细胞增殖性紊乱的哺乳动物的步骤。根据另一个实施方案，本发明提供了用于消减哺乳动物中B细胞的方法，包括用治疗有效量的与B细胞结合的本发明的偶联物分子处理哺乳动物的步骤。
根据一个实施方案，本发明的治疗方法进一步包括测定哺乳动物中偶联物分子的毒性的步骤。
根据一个实施方案，毒性显示为选自体重减轻、造血毒性、肾毒性、肝毒性、胃肠毒性、减少的定向造血干细胞(造血祖细胞)由骨髓至外周血的动员、贫血、骨髓抑制、各类血细胞减少、血小板减少、嗜中性粒细胞减少、淋巴细胞减少、白细胞减少、口炎、脱发、头痛和肌肉痛的任一项。
本发明还提供了包含容器、在容器中的包含本发明的偶联物分子的组合物、含有施用治疗有效剂量的使用说明的包装插页的产品。
附图简述

图1显示了在注射对照媒介(圆形)、Herceptin-vc-Pab-MMAE(正方形)、Ab.Fab4D5-H-vc-PAB-MMAE(菱形)、Fab3D4-vc-PAB-MMAE(三角形)和Ab.Fab对照-vc-PAB-MMAE(空心圆形)之后，随着时间的过去的肿瘤体积。
图2显示了在施用Herceptin-vc-MMAE(正方形)、Herceptin-F(ab′)24D5-vc-MMAE(十字形)、游离MMAE(圆形)之后，体重的组变化(groupchange)。
图3显示了在施用Herceptin-vc-MMAE(菱形)、Fab4D5-vc-MMAE(三角形)、AB.Fab4D5-H-vc-MMAE(圆形)和PBS(正方形)之后，体重的组变化。
图4显示了人源化抗-HER2抗体的轻链可变区[SEQ ID NO428]和人源化抗-HER2抗体的重链可变区[SEQ ID NO429]的氨基酸序列。
优选实施方案的详述I.定义术语“血清清蛋白结合肽”或“血清清蛋白结合部分”(“SABM”)指包含结合血清清蛋白的氨基酸序列的化合物或多肽。根据一个优选的实施方案，SABM结合人血清清蛋白。根据一个实施方案，SABM包含至少一个序列表中所述的结合兔、大鼠、小鼠或人血清清蛋白的任一序列。根据另一个实施方案，SABM包含至少一个序列表中所述的结合多种物种的血清清蛋白的任一序列。根据一个实施方案，SABM包含至少一个表1-9中所述的结合兔、大鼠、小鼠或人血清清蛋白中任何一种或组合的任一序列。根据另一个实施方案，SABM包含至少一个表1-9中所述的结合多种物种的血清清蛋白的任一序列。多种物种结合物的例子包括那些至少结合人和大鼠血清清蛋白的SABM；那些至少结合人、大鼠和兔血清清蛋白的；那些至少结合人和兔血清清蛋白的；及那些至少结合人和小鼠血清清蛋白的。
根据一个优选的实施方案，SABM肽是能结合清蛋白的非天然存在的氨基酸序列。在本发明上下文中的SABM可以是小于约50个氨基酸残基，优选小于约40个氨基酸残基的受约束的(也就是说，具有一些结构元件，例如，存在起始β-转角或β-折叠片的氨基酸，或者例如，通过成二硫键的Cys残基的存在而环化)或无约束的(线性)氨基酸序列。小于约40个氨基酸残基的SABM优选是在约10个至约30个氨基酸残基之间的SABM，特别是约20个氨基酸残基的SABM。但是，在阅读本公开书后，熟练的技术人员应当认识到不是特定SABM的长度，而是其与清蛋白结合的能力才能用于辨别本发明的SABM。
本发明的“靶向剂”或“TA”会以足够的亲和力和特异性结合细胞表面上的靶分子，如果TA在体外及优选在体内“归巢”至、“结合”或“靶向”靶分子，诸如携带靶分子的特定细胞类型的话(参见例如，Pasqualini和Ruoslahti，1996 Nature，380364-366和Arap等，1998 Science，279377-380中术语“归巢至”、“归巢”和“靶向”的应用)。一般而言，TA会以特征为解离常数Kd小于约10μM、优选小于约100nM和小于约10nM的亲和力结合靶分子。但是，在本发明上下文中，对靶分子具有小于约1nM和优选在约1pM和1nM之间的亲和力的多肽或小分子同样可能胜任TA。优选地，TA是多肽(如抗体)。一般而言，可通过任何一种本领域已知的诸多技术分离并鉴定上述与特定靶分子结合的TA。
TA是上述可含有天然及非天然存在的氨基酸残基的氨基酸序列，诸如噬菌体展示衍生的抗体。在本发明上下文中，所谓的包括模拟特定氨基酸或肽的非氨基酸化学结构的“肽模拟物”和“肽类似物”可以是TA。这样的模拟物或类似物通常表征为展现见于它们的肽对应物中的，存在于适当的空间取向中的类似的物理特性，诸如大小、电荷或疏水性。肽模拟化合物的一个具体例子是其中一个或多个氨基酸之间的酰胺键为例如碳-碳键或其他本领域众所周知的键所取代的化合物(参见例如Sawyer，1995，InPeptideBased Drug Design pp.378-422，ACS，Washington DC)。
“B细胞表面标志”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达、可用结合它的拮抗剂靶向它的抗原。例示性B细胞表面标志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志(描述参见《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等人编，AcademicPress，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标志包括RP105、FcRH2、CD79A、C79B、CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、BTLA、NAG14(aka LRRC4)、SLGC16270(ala LOC283663)、FcRH1、IRTA2、ATWD578(aka MGC15619)、FcRH3、IRTA1、FcRH6(akaLOC343413)和BCMA(aka TNFRSF17)。
特别感兴趣的B细胞表面标志在B细胞上较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先表达，且可在前体B细胞和成熟B细胞二者上表达。本文中优选的B细胞表面标志是CD20和CD22。
“CD20”抗原是在超过90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并保留至浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上。CD20在文献中的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”B1和“Bp35”。CD20抗原记载于例如Clark et al.，PNAS(USA)821766(1985)。人CD20的氨基酸序列显示于《The Leukocyte Antigen Facts Book》，Barclay等人，见上文，第182页；及EMBL基因库编号X12530和Swissprot P11836。
“CD22”抗原，也称为BL-CAM或Lyb8，是分子量约130(缩短的)至140kD(未缩短的)的1型整合膜糖蛋白。它在B淋巴细胞的细胞质和细胞膜二者中表达。CD22抗原在B细胞淋巴细胞分化的早期出现，大约在与CD19抗原相同的阶段。与其它B细胞标志不同，CD22膜表达局限于成熟B细胞(CD22+)和浆细胞(CD22-)之间包含的分化晚期。CD22抗原记载于例如Wilson et al.，J. Exp.Med. 173137(1991)和Wilson et al.，J.Immunol.1505013(1993)。
“CD19”抗原指通过例如HD237-CD19或B4抗体鉴定的抗原(Kiesel etal.，Leukemia Research II 121119(1987))。CD19见于原B细胞、前B细胞、未成熟的和成熟的、激活的及记忆B细胞上，直到终未分化成浆细胞之前的那一刻。CD19和CD20两者都不在造血干细胞或浆细胞上表达。拮抗剂对CD19的结合可引起CD19抗原的内在化。人CD19的氨基酸序列显示于《The Leukocyte Antigen Facts Book》，Barclay等人，见上文，第180页；及EMBL基因库编号M28170和Swissprot P11836。
在用于本文时，“B细胞消减”指在药物或抗体处理后，与处理前的水平相比，动物或人中B细胞水平的降低。B细胞水平可使用已知测定法测量，诸如通过获取全部血细胞计数，通过对已知B细胞标记染色的FACS分析，及通过诸如实验实施例中描述的方法。B细胞消减可以是部分的或完全的。在一个实施方案中，表达CD20的B细胞的消减是至少25％。在接受B细胞消减药的患者中，B细胞消减的持续时间通常是药物在患者体内循环的时间及B细胞恢复的时间。
因此，术语“氨基酸”在本发明的范围内以其最广义使用，意图包括天然存在的Lα-氨基酸或残基。本文中使用了天然存在氨基酸的常用单字母和三字母缩写(Lehninger，A.L.，1975，《Biochemistry》，第2版，第71-92页，Worth Publishers，New York)。标准单字母代码和标准三字母代码之间的对应关系是熟练技术人员众所周知的，复述于此A＝Ala；C＝Cys；D＝Asp；E＝Glu；F＝Phe；G＝GIy；H＝His；I＝Ile；K＝Lys；L＝Leu；M＝Met；N＝Asn；P＝Pro；Q＝Gln；R＝Arg；S＝Ser；T＝Thr；V＝VaI；W＝Trp；Y＝Tyr。该术语包括D-氨基酸以及经化学修饰的氨基酸诸如氨基酸类似物，通常不掺入蛋白质的天然存在氨基酸诸如正亮氨酸，及具有本领域已知为氨基酸特征之特性的化学合成化合物。例如，容许与天然苯丙氨酸或脯氨酸相同的对肽化合物的构象限制的Phe或Pro类似物或模拟物包括在氨基酸的定义内。这样的类似物和模拟物在本文中称为氨基酸的“功能等效物”。氨基酸的其它例子列于Roberts和Vellaccio，1983，在《The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology》中，Gross和Meiehofer编，第5卷，第341页，Academic Press，Inc.，N.Y.，收入本文作为参考。
通过例如标准固相合成技术合成的SABM和TA不限于基因编码的氨基酸。通常遇到的、不是遗传密码编码的氨基酸包括例如那些国际公开号WO90/01940中记载的，诸如例如对于Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad)；对于Glu和Asp的2-氨基庚二酸(Apm)；对于Met、Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基丁酸(Abu)；对于Met、Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基庚酸(Ahe)；对于Gly的2-氨基异丁酸(Aib)；对于Val、Leu和Ile的环己基丙氨酸(Cha)；对于Arg和Lys的高精氨酸(Har)；对于Lys、Arg和His的2，3-二氨基丙酸(Dpr)；对于Gly、Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；对于Gly、Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；对于Asn和Gln的N-乙基天冬酰胺(EtAsn)；对于Lys的羟基赖氨酸(Hyl)；对于Lys的别羟基赖氨酸(AHyl)；对于Pro、Ser和Thr的3-(和4-)-羟基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)；对于Ile、Leu和Val的别异亮氨酸(AIle)；对于Ala的对脒基苯丙氨酸；对于Gly、Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)；对于Ile的N-甲基异亮氨酸(MeIle)；对于Met和其它脂肪族氨基酸的正缬氨酸(Nva)；对于Met和其它脂肪族氨基酸的正亮氨酸(Nle)；对于Lys、Arg和His的鸟氨酸(Orn)；对于Thr、Asn和Gln的瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亚砜(MSO)；对于Phe的N-甲基苯丙氨酸(MePhe)、三甲基苯丙氨酸、卤代(F，Cl，Br和I)苯丙氨酸、三芴基苯丙氨酸。
SABM和TA在本发明的语境中可以是“(工程)改造的”，即可以是非天然的或非天然存在的TA。“非天然的”或“非天然存在的”意味着特定SABM的氨基酸序列在自然界中找不到。也就是说，非天然的或非天然存在的TA或SABM的氨基酸序列无需对应于天然存在蛋白质或多肽的氨基酸序列。这种TA或SABM可使用多种技术生成或选择，包括那些熟练技术人员众所周知的。例如，利用本领域标准技术，例如Lowman et al.，1998，Biochemistry 378870-8878，可在噬菌体上随机产生并展示受约束或无约束的肽文库。
SABM和TA及细胞毒剂在本发明的语境中使用时可彼此“偶联”。术语“偶联”以其最广义使用，涵盖本领域已知的共价附着或连接的所有方法。例如，在一个典型的实施方案中，SABM是一种蛋白质，TA是SABM的C-或N-末端的一段氨基酸延伸。另外，短氨基酸接头序列可位于蛋白质治疗剂和SABM之间。在这种情况中，SABM、任选的接头和TA将由这样的核酸编码，它包含编码SABM的序列且其可操作连接(就DNA序列是连续的且处于读码框中)任选的编码如下所述的短多肽的接头序列和编码TA的序列。在该典型情况中，认为SABM与TA任选经接头序列“偶联”。在一个相关实施方案中，SABM氨基酸序列可中断或取代TA氨基酸序列的一部分，当然，倘若SABM氨基酸序列的插入不干扰蛋白质治疗剂的功能的话。在另一个典型的实施方案中，SABM将与TA或其它治疗剂任选经接头序列通过例如化学偶联而连接。典型的是，根据此实施方案，SABM将与TA经TA中部不干扰TA识别靶活性的能力的某处氨基酸的侧链连接。再次，认为SABM与TA“偶联”。
术语“抗体”以最广义使用，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现期望生物学活性。
本发明抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区或可变区或者保留FcR结合能力的抗体Fc区。抗体片段的例子包括线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的，每种针对一种或两种抗原性位点，通常是一种位点。另外，与针对一种抗原由动物衍生使得数种抗体针对不同决定簇(表位)的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们是通过杂交瘤培养合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J. Mol. Biol.222581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们展现期望生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。在极大程度上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体互补决定区(CDR)的残基为具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代。在有些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基为相应非人残基所取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体和输入CDR或框架序列中都未找到的残基。进行这些修饰以进一步改善和最大化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上整个可变区，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些，尽管FR区可包含一处或多处改善结合亲和力的氨基酸替代。FR中这些氨基酸替代的数目通常在H链中不超过6个，在L链中不超过3个。人源化抗体最好还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。更多细节参见Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature 332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。人源化抗体包括PRIMATIZED抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用目的抗原免疫猕猴产生的抗体。制备人源化抗体的方法是本领域已知的。
还可使用本领域已知的多种技术生成人抗体，包括噬菌体展示库。Hoogenboom and Winter，J. Mol. Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole等人，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan R.Liss，第77页，1985；Boerner et al.，J. Immunol.147(1)86-95(1991)。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
“融合蛋白”和“融合多肽”指具有至少两个共价连接的部分的多肽，其中每个部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物学特性，诸如体外或体内活性。所述特性还可以是简单的化学或物理特性，诸如与靶分子的结合、催化反应等。所述部分可通过单个肽键直接连接，或者经由包含一个或多个氨基酸残基的肽接头。通常，所述部分和接头将彼此处于读码框中。
“分离的”多肽或抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的。其天然环境的污染性成分指将会干扰该多肽或抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分将不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
人源化抗ErbB2(HER2)抗体包括如美国专利5,821,337表3中记载的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，明确收入本文作为参考；如共同未决的申请流水号09/811115中记载的人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗体，及包含WO03/087131和美国专利公开号2003/0228663中披露的抗HER2变体的可变区的抗体，收入本文作为参考。在整篇公开书中，术语“huMAb4D5-8”和“hu4D5-8”可互换使用。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。细胞毒剂应当能够内在化和/或能够从细胞外抑制细胞生长而无需结合细胞表面。根据一个优选的实施方案，该药剂是小分子。根据另一个实施方案，细胞毒剂的活性部分是1100道尔顿或更小。该术语意图包括放射性同位素，如At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Bi213、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素(如MMAE)，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤或抗癌药或者生长抑制剂。下文描述了其它细胞毒剂。根据一个优选的实施方案，细胞毒剂不是放射性同位素。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras和EGFR的抑制剂(如erlotinib(TarcevaTM))；及任何上述物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、TAXOL紫杉醇(paclitaxel)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis ofCancer)》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。
“生长抑制剂”的例子包括表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(如erlotinib(TarcevaTM))，血小板衍生生长因子抑制剂(如GleevecTM(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib))和其它生物活性及有机化学剂等。
术语“治疗有效量”指偶联物分子有效“减轻”或“处置”受试者中疾病或紊乱的量。就偶联物分子可防止现有癌细胞生长和/或杀死其而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的(细胞毒性的)。
“处置”或“治疗”指疾病或紊乱的改善或缓解。需要处置的受试者包括早就患有紊乱的受试者以及要预防紊乱的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的偶联物后，患者在特定疾病的一项或多项征候和症状中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者成功“治疗”了癌症或自身免疫病。例如，对于癌症，癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；消退期延长；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。疾病的征候或症状的减轻还可以由患者感受到。处置可实现完全响应，定义为癌症的所有征候消失，或者部分响应，其中肿瘤体积缩小，优选超过50％，更优选75％。如果患者病情稳定，那么该患者也视为得到治疗。在一个优选的实施方案中，癌症患者在1年后，优选在1 5个月后癌症仍然没有进展。用于评估疾病的成功治疗和改善的这些参数易于通过本领域具有适当技能的医师所熟悉的常规流程测量。在一个优选的实施方案中，与可接受缺少SABM的相同偶联物分子处置的受试者相比，受试者显示不适的改善，同时经受的副作用更少。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中典型的以细胞生长不受调节为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑癌、以及头和颈癌，及相关转移。
术语“细胞增殖性紊乱”和“增殖性紊乱”指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊乱。在一个实施方案中，细胞增殖性紊乱是癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。
B细胞调节的自身免疫病包括关节炎(类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)，银屑病，皮炎包括特应性皮炎；慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，系统性硬皮病和硬化，与炎性肠病(IBD)有关的应答(克罗恩氏(Crohn)病、溃疡性结肠炎)，呼吸窘迫综合征，成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，变应性鼻炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，变应性状况，湿疹，哮喘，牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的状况，动脉粥样硬化，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮(包括狼疮肾炎、非肾狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)，幼发型糖尿病，多发性硬化，变应性脑脊髓炎，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答、结核病，结节病，肉芽肿病包括韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎(包括ANCA)，再生障碍性贫血，库姆斯氏(Coombs)阳性贫血，戴-步二氏(Diamond Blackfan)贫血，免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血，纯红细胞再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，牵涉白细胞渗出的疾病，CNS炎性紊乱，多器官损伤综合征，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜疾病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet)病，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征，雷诺氏(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏(Sjogren)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，实体器官移植排斥(包括预处理针对高反应性抗体滴度组、组织中的IgA沉积等)，移植物抗宿主病(GVHD)，大疱性类天疱疮，天疱疮(都包括寻常型、落叶型)，自身免疫性多内分泌腺病，莱特氏(Reiter)病，僵人综合征，巨细胞动脉炎，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多神经病或IgM介导的神经病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板减少症，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症；自身免疫性内分泌病，包括自身免疫性甲状腺炎，慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)，亚急性甲状腺炎，特发性甲状腺功能减退症，阿狄森氏(Addison)病，格雷夫斯氏(Graves)病，自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和席汉氏(Sheehan)综合征；自身免疫性肝炎，淋巴样间质性肺炎(HIV)，梗阻性细支气管炎(非移植)较之NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barre)综合征，大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎)，强直性脊柱炎，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，急进性肾小球性肾炎，原发性胆汁性肝硬变，口炎性腹泻(麸质肠病)，冷球蛋白血症，ALS，冠状动脉病。
B细胞瘤包括CD20阳性何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；毛细胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低级/滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病(bulky disease)NHL、类浆细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症。还设想了这些癌症复发的处置。LPHD是一类在放射或化疗处置后仍趋于频繁复发的何杰金氏病，特征为CD20阳性的恶性细胞。CLL是白血病的四种主要类型之一。称为淋巴细胞的成熟B细胞的一种癌症，CLL表现为细胞在血液、骨髓和淋巴组织中渐进累积。缓慢进展淋巴瘤是一种缓慢发展的不治之症，其中在多个缓解和复发期后，患者的平均存活为6-10年。
为了处置的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物指人。将依照本发明处置的受试者是哺乳动物。
“紊乱”指将受益于包含本发明偶联物分子的组合物的处置的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括那些使哺乳动物易患所讨论紊乱的病理状况。
“消除半衰期”以其通常含义使用，如《Goodman and Gillman′s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics》，第21-25页，Alfred Goodman Gilman，Louis S.Goodman和Alfred Gilman编，第6版，1980中所述。简而言之，该术语意图涵盖药物消除时程的定量测量。由于药物浓度通常未达到那些饱和消除过程所要求的，因此大多数药物的消除是指数式的(即遵循一级动力学)。指数过程的速率可表述为其速率常数，k，其表示每单位时间分数变化，或者表述为其半衰期，t，所述过程完成50％所需要的时间。这两个常数的单位分别是时间-1和时间。反应的一级速率常数和半衰期是简单相关的(kxt＝0.693)，因此可互换。由于一级消除动力学指示每单位时间药物丧失的恒定分数，因此药物浓度的对数对时间的曲线在初始分布阶段后(即在药物吸收和分布完成后)一直是线性的。可根据这样的图精确测定药物消除的半衰期。根据本发明的一个优选实施方案，与缺少SABM的偶联物分子相比，本发明的偶联物分子具有更长的半衰期和更低的毒性。
“转染”指宿主细胞对表达载体的摄取，不管任何编码序列事实上是否表达。本领域普通技术人员知道多种转染方法，例如CaPO4沉淀和电穿孔。当宿主细胞内出现该载体运转的任何迹象时，一般认为转染是成功的。
“转化”指将DNA导入生物体使得DNA可复制，或是作为染色体外元件或是作为染色体组成部分。根据所用宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等人，1989，《Molecular Cloning》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，NY的1.82节所述，采用氯化钙的钙处理通常用于原核生物或具有坚固细胞壁屏障的其它细胞。如Shaw et al.，Gene 23315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859所述，使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于转化某些植物细胞。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，优选Sambrook等人，见上文的16.30-16.37节中所描述的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般情况已记载于1983年8月16日公告的Axel的美国专利4,399,216。酵母的转化通常依照VanSolingen et al.，J. Bact.130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)763829(1979)的方法进行。然而，也可使用将DNA导入细胞的其它方法，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合。
在用于本文时，术语“肺部施药”指通过吸入经肺施用本发明的配制剂。在用于本文时，术语“吸入”指摄入空气至肺泡。在具体的例子中，摄入可通过吸气时本发明配制剂的自我施用，或者通过经呼吸机如给予呼吸机上的患者的施用而发生。关于本发明的配制剂使用时，术语“吸入”与“肺部施药”同义。
在用于本文时，术语“肠胃外”指通过除肠之外的途径将本发明的化合物导入体内，特别是静脉内(i.v.)、动脉内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)、心室内和皮下(s.c.)路径。
在用于本文时，术语“气雾剂”指空气中的悬浮液。具体而言，气雾剂指本发明配制剂的颗粒化(particlization)及其在空气中的悬浮。根据本发明，气雾剂剂型是一种包含本发明的化合物，适于在空气中气雾化(aerosolization)即颗粒化和悬浮，供吸入或肺部施药的剂型。
II.实施本发明的方式A.SABM本发明语境中的SABM结合清蛋白。优选的结合血清清蛋白的SABM包括线性肽和环状肽，优选包含下列公式的环状肽化合物或为与下列公式的肽竞争结合特定哺乳动物物种的血清清蛋白的肽Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-XaaPhe-Cys-Xaa-Asp-Typ-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys[SEQ ID NO1]Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe[SEQ ID NO2]Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys[SEQ ID NO3]知Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp[SEQ ID NO4]优选的是在N-末端(Xaa)x和C-末端(Xaa)z包含额外的氨基酸的前述通式的肽化合物，其中Xaa是氨基酸，x和z是大于或等于0(零)的整数，一般小于100，优选小于10，更优选0、1、2、3、4或5，还优选4或5，并且其中Xaa选自Ile、Phe、Tyr和Val。
更优选的结合血清清蛋白的SABM规定为在本文的语境中所描述的下列通式Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys(SEQ ID NO5)and Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp[SEQ ID NO6]其中额外的氨基酸可位于N-末端(Xaa)x及C-末端(Xaa)z，其中Xaa是氨基酸，x和z是大于或等于0的整数，一般小于100，优选小于10，更优选0、1、2、3、4或5，还优选4或5。
根据本发明的该方面，选择结合哺乳动物血清清蛋白的肽配体可参考下文实施例，特别是其中所包含的表格，它们显示了尤其例示性肽以及适当的氨基酸。在一个优选的方面，选择交叉结合几种物种的血清清蛋白的SABM可参考表7。
根据本发明的该方面，优选的化合物包括
DLCLRDWGCLW(SEQ ID NO7)DICLPRWGCLW(SEQ ID N08)MEDICLPRWGCLWGD(SEQ ID NO9)QRLMEDICLPRWGCLWEDDE (SEQ ID NO10)QGLIGDICLPRWGCLWGRSV (SEQ ID NO11)QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK (SEQ ID NO12)EDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO13)RLMEDICLPRWGCLWEDD (SEQ ID NO14)MEDICLPRWGCLWEDD (SEQ ID NO15)MEDICLPRWGCLWED(SEQ ID NO16)RLMEDICLARWGCLWEDD (SEQ ID NO17)EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG (SEQ ID NO18)RAPESFVCYWETICFERSEQ (SEQ ID NO19)EMCYFPGICWM(SEQ ID NO20)在一个优选的实施方案中，本发明的SABM结合人血清清蛋白，并可在使用具有如下所示通式的SABM的体外测定中通过其竞争结合人血清清蛋白的能力来鉴定，在所述通式中额外的氨基酸残基可存在于N-末端(Xaa)x和C-末端(Xaa)zDXCLPXWGCLW (SEQ ID NO4)FCXDWPXXXSC (SEQ ID NO1)VCYXXXICF(SEQ ID NO2)CYX1PGXCX(SEQ ID NO3)其中Xaa是氨基酸，x和z优选4或5，Xaa选自Ile、Phe、Tyr和Val。
在特定的实施方案中，本发明的SABM会与任一在此上述的SEQ IDNO7-20所示的SABM竞争，并优选会与SEQ ID NO10竞争与人血清清蛋白的结合。
由前文将领会，术语“竞争”和“竞争的能力”是相关的术语。因此，上述术语在用于描述本发明的SABM时，指在本文所述标准竞争测定法中以50μM存在时，优选以1μM存在时，更优选100nM，及优选以1nM或更少存在时，对例如SEQ ID NO10所代表的肽的结合产生50％抑制的SABM。然而，对血清清蛋白具有小于约1nM，优选约1pM-1nM的亲和力的SABM同样可能是本发明语境中的SABM。
对于用于确定肽或其它化合物是否具有与SABM竞争结合本文所述血清清蛋白的“能力”的体外测定系统，本领域技术人员可采用多种标准竞争测定法中的任一种。竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争结合有限量的配体的能力。测试样品中分析物的量与变成与配体结合的标准品的量成反比。
因此，本领域技术人员可采用下述流程来确定肽或其它化合物是否具有与SABM竞争结合清蛋白的能力，包括但不限于使用下述技术的竞争性测定系统，诸如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“三明治式”免疫测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和免疫电泳测定法，恕不一一列举。
为了这些目的，选择的SABM将用可检测模块标记(经可检测标记的SABM此后称为“示踪物”)并在竞争测定法中用于与候选化合物竞争结合清蛋白。可利用多种可检测标记物，它们可优选分为以下几类(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。SABM可使用例如Coligen等人编，1991，《Current Protocols in Immunology》，第1和2卷，Wiley-Interscience，New York，N.Y.中所描述的技术用放射性同位素标记。放射性可使用闪烁计数测量。
(b)可利用荧光标记物，诸如稀土金属螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰(dansyl)、丽丝胺(lissamine)、藻红蛋白和得克萨斯红(Texas Red)。荧光标记物可使用例如《CurrentProtocols in Immunology》(见上文)中所披露的技术与肽化合物偶联。荧光可使用荧光计定量。
(c)可利用多种酶-底物标记物，美国专利4,275,149提供了其中一些的综述。酶优选催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可催化可通过分光光度法测量的底物的颜色变化。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应成为电子受激的，然后可发出可测量的光(例如使用化学发光光度计(chemiluminometer))或将能量授给荧光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶、等等。
酶-底物组合的例子包括例如(i)辣根过氧化物酶(HRP)及作为底物的过氧化氢，其中过氧化氢氧化染料前体(如ABTS、邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸化物(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)及作为底物的对硝基苯基磷酸酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)及显色底物(如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷。
根据一种特定测定法，示踪物与固定化靶物一起在存在不同浓度的未标记候选化合物时温育。提高成功的候选化合物的浓度有效竞争示踪物与固定化靶物的结合。最大结合示踪物的50％遭到置换时未标记候选化合物的浓度称为“IC50”，它反映了候选化合物的靶物结合亲和力。因此，IC50为1mM的候选化合物展示出比IC50为1μM的候选化合物实质性弱的与靶物的相互作用。
在有些噬菌体展示ELISA测定法中，突变(“mut”)序列的结合亲和力使用Cunningham et al.，EMBO J.132508(1994)中所描述的方法直接与对照(“con”)肽比较，并表征为参数EC50。测定法在EC50(con)/EC50(mut)将近似Kd(con)/Kd(mut)的条件下进行。
因此，本发明提供了在所述体外测定法中“有能力竞争”清蛋白诸如人血清清蛋白结合的化合物。优选的是，化合物对靶物诸如人血清清蛋白具有小于1μM的IC50。在这些化合物中优选具有小于约100nM，优选小于约10nM或小于约1nM的IC50的化合物。在根据本发明该方面的另一个优选实施方案中，化合物对靶分子诸如人血清清蛋白展示出小于约100pM，更优选小于约10pM的IC50。
用于测定候选化合物与本文所述SABM竞争的能力的一种优选的体外测定法如下，而且在实施例中有更完整的描述。在优选的实施方案中，候选化合物是肽。候选化合物与经标记SABM示踪物竞争结合人血清清蛋白的能力使用ELISA监测。将候选化合物在缓冲液中的稀释液与示踪物一起加至用人血清清蛋白包被(如实施例部分所述)的微量滴定板达1小时。将微量滴定板用清洗缓冲液清洗，并测量与人血清清蛋白结合的示踪物的量。
B.SABMTA细胞毒剂组合SABM与TA细胞毒剂连接而形成包含至少一个每种组分(即至少三个不同组分)的偶联物分子。每种组分可任选经柔性接头域互相连接。
根据连接的类型及其产生方法，SABM域可经其N-或C-末端连接TA的N-或C-末端。例如，在通过重组技术制备本发明的偶联物分子时，编码SABM的核酸将可操作连接编码TA序列的核酸，任选经接头域。典型的是，构建体编码其中SABM的C-末端连接TA的N-末端的融合蛋白。然而，尤其是在采用合成技术时，例如其中SABM的N-末端连接TA的N-或C-末端的融合蛋白也是可能的。
在有些情况中，SABM域可插入TA分子内，而非连接TA的N-或C-末端。此构造可用于实践本发明，只要SABM域和TA的功能得到保留。例如，SABM可插入免疫球蛋白的非结合轻链CDR，而不干扰免疫球蛋白与其靶物结合的能力。可以凭经验鉴定TA分子中可容纳SABM域插入的区域(即通过随机选择插入位点，对所得偶联物测定TA的功能)，或者通过在相关TA的家族中进行序列比较(如对于是蛋白质的TA)以定位低序列同源性的区域。与非常保守的区域相比，低序列同源性区域更有可能容忍SABM域的插入。对于其三维结构已知(如通过X-射线结晶学或NMR研究)的TA，该三维结构可提供SABM插入位点的指导。例如，与更高级别结构的区域或涉及配体结合或催化的区域相比，环或具有高灵活性(mobility)的区域(即大的温度或“B”系数)更有可能容纳SABM域插入。
C.接头域SABM域任选经接头连接TA。本发明偶联物分子的接头组分不是必需参与的，但可能有助于偶联物分子的功能。因此，接头域定义为在TA和SABM域之间提供空间桥接的任何分子基团。
接头域可以是不同长度和组成的，然而，对于建立空间桥接来说，重要的是接头域的长度而非其结构。接头域优选容许偶联物分子的SABM结合靶分子，基本上没有空间和/或构象限制。因此，接头域的长度取决于偶联物分子的两个“功能”域即SABM和TA的特性。
本领域技术人员应认识到，基于不同键之间的已知距离，不同原子组合提供不同长度分子。参见例如Morrison和Boyd，1997，《(OrganicChemistry》，第3版，Allyn and Bacon，Inc.，Boston，MA。接头域可以是不同长度的多肽。多肽的氨基酸组成决定了接头的特性和长度。在一个优选的实施方案中，接头分子包含柔性的、亲水性的多肽链。例示性接头域包含一个或多个Gly和/或Ser残基，诸如那些下文实施例部分中所描述的。
D.重组合成本发明涵盖物质组合物，其包含编码本文所述SABM或包含SABM和多肽TA的偶联物分子的分离的核酸，优选DNA。编码本发明肽的DNA可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于通过Engels et al.，1989，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28716-734(其完整公开书收入本文作为参考)中所描述的任何方法的化学合成，诸如三酯、亚磷酸酯、亚磷酰胺和H-膦酸酯化学合成法。在一个实施方案中，编码DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码子。或者，编码肽的DNA可通过使用重组DNA技术改变成编码一种或多种变体，诸如位点特异诱变(Kunkel et al.，1991，Methods Enzymol.204125-139；Carter et al.，1986，Nucl.Acids Res.134331；Zoller et al.，1982，Nucl.Acids Res.106487)、盒式诱变(Wells et al.，1985，Gene 34315)、限制性选择诱变(Carter，1991，在《Directed MutagenesisAPractical Approach》，M.J.McPherson编，IRL Press，Oxford)、等等。
根据上述优选方面，核酸编码能够结合靶分子的SABM。靶分子包括例如胞外分子诸如各种血清因子，包括但不限于血浆蛋白质诸如血清清蛋白、免疫球蛋白、载脂蛋白或运铁蛋白，或者在红细胞或淋巴细胞表面上发现的蛋白质，当然，倘若SABM与细胞表面蛋白质的结合基本上不干扰细胞的正常功能的话。优选用于本发明的是以期望亲和力结合血清清蛋白的SABM，例如，以高亲和力，或以促进与SABM融合的生物活性分子的有用组织摄取和扩散的亲和力。
根据本发明的另一个优选方面，核酸编码包含SABM序列和TA的偶联物分子。在本发明的该方面，TA可包含可用作治疗剂或诊断剂的任何多肽化合物，如酶、激素、细胞因子、抗体或抗体片段。根据本发明该方面的核酸分子编码偶联物分子，而且编码SABM序列的核酸可操作连接(就DNA序列是连续的且处于读码框中而言)编码生物活性剂的核酸。任选的是，这些DNA序列可经编码接头域氨基酸序列的核酸序列连接。
根据该方面，本发明进一步包含与编码本发明肽的DNA分子可操作连接的表达控制序列；包含所述DNA分子的表达载体，诸如质粒，其中控制序列受到用该载体转化的宿主细胞的识别；及用该载体转化的宿主细胞。一般而言，质粒载体包含衍生自与宿主细胞相容的物种的复制和控制序列。载体通常携带复制位点以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。
对于在原核宿主中表达，合适的载体包括pBR322(ATCC No.37,017)、phGH107(ATCC No.40,011)、pBO475、pS0132、pRIT5、pRIT20或pRIT30系列的任何载体(Nilsson and Abrahmsen，1990，Meth.Enzymol.185144-161)、pRIT2T、pKK233-2、pDR540和pPL-λ。包含本发明表达载体的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株294(ATCC No.31,446)、大肠杆菌菌株JM101(Messing et al.，1981，Nucl.AcidRes.9309)、大肠杆菌菌株B、大肠杆菌菌株_1776(ATCC No.31537)、大肠杆菌c600、大肠杆菌W3110(F-，γ-，原养型，ATCC No.27,325)、大肠杆菌菌株27C7(W3110，tonA，phoA E15，(argF-lac)169，ptr3，degP41，ompT，kanr)(美国专利5,288,931，ATCC No.55,244)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和假单胞菌属(Pseudomonas)物种。
除原核生物外，真核生物体，诸如酵母，或衍生自多细胞生物体的细胞可用作宿主细胞。对于在酵母宿主细胞中表达，诸如常见的面包酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，合适的载体包括基于2微米质粒的附加型复制载体、整合型载体及酵母人工染色体(YAC)载体。对于在昆虫宿主细胞中表达，诸如Sf9细胞，合适的载体包括杆状病毒载体。对于在植物宿主细胞中表达，特别是双子叶植物宿主，诸如烟草，合适的表达载体包括衍生自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的载体。
有用的哺乳动物宿主细胞的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(为在悬浮培养中生长而亚克隆的293或293细胞，Graham et al.，1977，J. Gen Virol. 3659)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin，1980，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，774216)；小鼠塞尔托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。对于在哺乳动物宿主细胞中表达，有用的载体包括衍生自SV40的载体、衍生自巨细胞病毒的载体诸如pRK载体包括pRK5和pRK7(Suva et al.，1987，Science 237893-896；EP307,247(3/15/89)；EP278,776(8/17/88))、衍生自牛痘病毒或其它痘病毒的载体、及逆转录病毒载体诸如衍生自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)的载体。
任选的是，编码目的肽的DNA可操作连接分泌前导序列，导致宿主细胞将表达产物分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括STII、大肠杆菌素、lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶和α因子。也适用于本文的是蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen et al.，1985，EMBO J. 43901)宿主细胞用上述本发明的表达或克隆载体转染和优选转化，并在为诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而恰当改良的常规营养培养基中培养。
用于生成本发明肽的原核生物宿主细胞可大体如Sambrook等人，见上文中所述培养。
用于生成本发明肽的哺乳动物宿主细胞可在多种培养基中培养。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，本领域有记载的任何培养基(例如Ham and Wallace，1979，Meth.Enz.5844；Barnes and Sato，1980，Anal.Biochem.102255；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；美国专利复审30,985；或美国专利5,122,469，各自公开书收入本文作为参考)都可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可视需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GentamycinTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。任何其它必需补充物还可以本领域技术人员应当知道的适当浓度包括在内。培养条件，诸如温度、pH、等等，就是那些先前用于为表达而选择的宿主细胞的，对于本领域普通技术人员是显而易见的。
本公开书中提及的宿主细胞涵盖体外培养中的细胞以及宿主动物内的细胞。
E.化学合成生成本发明SABM的另一种方法牵涉化学合成。这可通过使用本领域众所周知的方法学来实现(参见Kelley and Winkler，1990，在《GeneticEngineering Principles and Methods》中，Setlow，J.K.编，Plenum Press，N.Y.，第12卷，第1-19页；Stewart et al.，1984，J.M.Young，J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL。还可参见美国专利4,105,603；3,972,859；3,842,067；3,862,925)。
本发明的SABM可使用固相肽合成方便的制备。Merrifield，1964，J. Am.Chem.Soc.852149；Houghten，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825132。固相肽合成还可用于制备本发明的偶联物分子组合物，如果TA是多肽或包含多肽的话。
固相合成开始于新生肽的羧基末端，通过将受保护的氨基酸偶联至惰性固相支持物。惰性固相支持物可以是能够充当起始氨基酸C-末端的锚的任何大分子。典型的是，大分子支持物是如Stewart和Young，见上文的第2和4页图1-1和1-2中所示的交联聚合物树脂(如聚酰胺或聚苯乙烯树脂)。在一个实施方案中，C-末端氨基酸偶联至聚苯乙烯树脂以形成苄酯。大分子支持物的选择应使得肽锚连接在肽合成中用于受封闭氨基酸的α-氨基脱保护的条件下是稳定的。如果使用碱不稳定的α-保护基，那么期望在肽和固相支持物之间使用酸不稳定连接。例如，酸不稳定的醚树脂对于碱不稳定的Fmoc-氨基酸肽合成是有效的，如Stewart和Young，见上文的第16页所述。或者，可使用对酸解作用差异不稳定的肽锚连接和α-保护基。例如，氨甲基树脂诸如苯乙酰胺甲基(Pam)树脂结合Boc-氨基酸肽合成运转很好，如Stewart和Young，见上文的第11-12页所述。
在起始氨基酸偶联至惰性固相支持物之后，用例如二氯甲烷中的三氟乙酸(TFA)除去起始氨基酸的α-氨基保护基，并在例如三乙胺(TEA)中中和。在起始氨基酸的α-氨基脱保护之后，添加合成中的下-个α-氨基和侧链受保护的氨基酸。然后通过缩合以期望次序顺序偶联剩余的α-氨基和必要时侧链受保护的氨基酸，以获得与固相支持物连接的中间化合物。或者，有些氨基酸可彼此偶联以形成期望肽的片段，随后将肽片段加至生长中的固相肽链。
可依照常用的缩合方法进行两个氨基酸、或氨基酸和肽、或肽和肽之间的缩合反应，诸如axide法、混合酸酐法、DCC(N，N’-二环己基碳二亚胺)或DIC(N，N’-二异丙基碳二亚胺)法、活性酯法、对硝基苯酯法、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三[二甲氨基]膦六氟磷酸酯)法、N-羟基琥珀酸亚氨酯法等、及Woodward试剂K法。
在肽的化学合成中常常用合适的保护基保护氨基酸的任何反应性侧链基团。最终，在顺序装配好期望多肽链之后，除去这些保护基。同样，常常在氨基酸或肽片段的C-末端羧基与生长中的固相多肽链的游离N-末端氨基起反应时保护氨基酸或肽片段上的α-氨基，然后选择性除去α-氨基以容许将下一个氨基酸或肽片段加至固相多肽链。因此，在多肽合成中常常生成含有每个氨基酸残基且它们在肽链中以期望顺序定位的中间化合物，其中各个残基仍然携带侧链保护基。这些保护基可在从固相上除去之后基本上同时除去，以生成期望的多肽产物。
α-和ε-氨基侧链可用苄氧羰基(缩写为Z)、异烟氧羰基(iNOC)、邻氯苄氧羰基[Z(2Cl)]、对硝基苄氧羰基[Z(NO2)]、对甲氧基苄氧羰基[Z(OMe)]、叔丁氧羰基(Boc)、叔戊氧羰基(Aoc)、异冰片氧羰基、金刚烷氧羰基、2-(4-联苯基)-2-丙氧羰基(Bpoc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、甲磺酰乙氧羰基(Msc)、三氟乙酰基、酞(酰)基、甲酸基、2-硝基苯亚磺酰基(NPS)、二苯基硫膦基(Ppt)和二甲基硫膦基(Mpt)、等等保护。
用于羧基官能团的保护基的例子有苄基酯(OBzl)、环己基酯(Chx)、4-硝基苄基酯(ONb)、叔丁基酯(Obut)、4-吡啶基甲基酯(OPic)、等等。通常期望特定氨基酸诸如具有氨基和羧基以外官能团的精氨酸、半胱氨酸和丝氨酸受到合适保护基的保护。例如，精氨酸的胍基可用硝基、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、金刚烷氧羰基、对甲氧基苯磺酰基、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺酰基(Nds)、1，3，5-三甲基苯磺酰基(Mts)、等等保护。半胱氨酸的巯基可用对甲氧苄基、三苯甲基、等等保护。
上述受封闭氨基酸中的许多可从商业来源获得，诸如Novabiochem(SanDiego，CA)、Bachem CA(Torrence，CA)或Peninsula Labs(Belmont，CA)。
Stewart和Young，见上文提供了关于制备肽的方法的详细信息。α-氨基的保护记载于第14-18页，侧链封闭记载于第18-28页。用于胺、羟基和巯基官能团的保护基列表提供于第149-151页。
在完成期望氨基酸序列之后，肽可从固相支持物上切下，回收，并纯化。肽通过能够破坏肽-固相连接的试剂从固相支持物上切下，并任选对肽上受封闭的侧链官能团脱保护。在一个实施方案中，肽用液体氢氟酸(HF)通过酸解作用从固相上切下，HF还除去了任何残余的侧链保护基。优选的是，为避免肽中的残基烷化(例如甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基的烷化)，酸解反应混合物含有硫甲酚和甲酚清除剂。HF切割后，用醚清洗树脂，并通过乙酸溶液的连续清洗从固相萃取游离肽。将合并的清洗液冻干，将肽纯化。
F.偶联物分子的化学偶联在某些实施方案中，偶联物分子可包含作为具有诊断或治疗用途的有机化合物的TA，或者，SABM和多肽TA之间、其构造不能在一条核酸中编码的融合物。后一种实施方案的例子包括SABM的氨基末端和TA的氨基末端之间的融合物，或SABM的羧基末端和TA的羧基末端之间的融合物。
化学偶联可用于制备偶联物分子的这些实施方案，使用多种双功能蛋白质偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。可用于将细胞毒剂与多肽诸如抗体偶联的方法是已知的。
G.二硫键连接的肽如上所述，本发明的有些实施方案包括环化的SABM。SABM可通过在半胱氨酸残基之间形成二硫键而环化。此类肽可通过如上所述的化学合成然后通过二硫键形成中所使用的任何方便方法来制备。例如，肽可以从固相合成回收其巯基处于还原形式，溶解于稀溶液，其中分子内半胱氨酸浓度超过分子间半胱氨酸浓度以优化分子内二硫键形成，诸如25mM-1μM的肽浓度，优选500μM-1μM，更优选25μM-1μM，然后通过将游离巯基暴露于足以产生分子内二硫键的弱氧化剂而氧化，如具有或没有催化剂诸如金属阳离子、铁氰化钾、连四硫酸钠、等等的分子氧。或者，肽可以如Pelton et al.，1986，J. Med.Chem.292370-2375中所述而环化。
环化可通过例如能够形成二硫键的第一和第二残基，例如Cys、Pen、Mpr和Mpp及其含2-氨基的等效物之间二硫键或内酰胺键的形成来实现。能够形成内酰胺桥的残基包括例如Asp、Glu、Lys、Orn、αβ-二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基苯甲酸和巯基苯甲酸。本文中的化合物可以经由例如内酰胺键而环化，可利用不相邻残基的侧链基团以形成与Cys或其它氨基酸的N-末端氨基的共价附着。备选桥结构也可用于环化本发明的化合物，包括例如可经S-S、CH2-S、CH2-O-CH2、内酰胺酯或其它连接环化的肽和肽模拟物。
H.药用组合物包含本发明偶联物分子的药用组合物可以任何合适的方式施用，包括肠胃外、局部(topical)、口服或局部(local)(诸如气雾剂或经皮肤)，或其任意组合。
其它合适的本发明组合物包含任何上述偶联物分子及制药学可接受载体。载体的性质随施药方式而不同。例如，对于口服施药，优选固体载体；对于静脉内施药，通常使用液体盐溶液载体。
本发明的组合物包含与受试者和本发明蛋白质相容的制药学可接受组分。这些通常包括悬浮液、溶液和酏剂，最尤其是生物学缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、Dulbecco氏培养基、等等。气雾剂也可以使用，或是诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、等等的载体(在口服固体制剂的情况中，诸如粉剂、胶囊和片剂)。
在用于本文时，术语“制药学可接受的”通常意味着得到联邦或州政府管理机构的批准或者列于美国药典或其它公认的药典，供动物、更特别的是人使用。
选择的配制剂可使用多种前述缓冲剂，或甚至赋形剂包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠纤维素、碳酸镁、等等来完成。组合物的“PEG化”可使用本领域已知的技术来实现(参见例如国际专利公开号WO92/16555；Enzon的美国专利5,122,614；和国际专利公开号WO92/00748)。
本发明的优选施药路径是气雾剂或吸入形式。本发明的化合物，与分散剂组合，可作为干粉以气雾剂施用或者与稀释剂以溶液或悬浮液施用。
在用于本文时，术语“分散剂”指帮助化合物气雾化或蛋白质在肺组织中吸收或二者的药剂。优选的是，分散剂是制药学可接受的。合适的分散剂是本领域众所周知的，包括但不限于表面活性剂等等。例如，可使用本领域通常用于减少溶液雾化形成液体气溶胶所引起的表面诱导的化合物，尤其是肽化合物的聚集的表面活性剂。此类表面活性剂的非限制性例子是诸如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，及聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯的表面活性剂。表面活性剂的用量可以变化，通常在配制剂重量的约0.001％至约4％的范围内。在一个特定的方面，表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯或山梨聚糖三油酸酯。合适的表面活性剂是本领域众所周知的，可根据具体剂型、化合物浓度、稀释剂(在液体剂型中)或粉末形式(在干粉剂型中)等等，基于期望特性来选择。
此外，根据偶联物分子的选择、期望的治疗效果、肺组织的品质(如患病或健康的肺)及许多其它因素，液体或干燥剂型可包含其它组分，如下文进一步讨论的。
液体气雾剂剂型通常在生理学可接受稀释剂中含有偶联物分子和分散剂。本发明的干粉气雾剂剂型由细微分散的固体形式的偶联物分子和分散剂组成。无论是液体还是干粉气雾剂剂型，该剂型都必须气雾化。也就是说，它必须碎裂成液体或固体颗粒，以确保气雾化剂量真正到达肺泡。一般而言，团块中间动态直径(mass median dynamic diameter)应为5微米或更小，以确保药物颗粒到达肺泡(Wearley，1991，Crit. Rev. in Ther.Drug CarrierSystems 8333)。术语“气雾剂颗粒”在本文中用于描述适于肺部施用，即应到达肺泡的液体或固体颗粒。其它考虑事项诸如投递装置的构造、配制剂中的其它组分及颗粒特性是重要的。药物肺部施用的这些方面是本领域众所周知的，而且剂型的操作、气雾化手段及投递装置的构造至多要求本领域普通技术人员进行例行试验。
对于投递装置的构造，本领域已知的任何气雾化形式，包括但不限于液体剂型的喷雾(nebulization)、雾化(atomization)或泵雾化(pumpaerosohzation)及干粉剂型的烟雾化(aerosolization)，都可用于本发明的实践。预见了为施用固体剂型而独特设计的投递装置。通常，液体或干粉剂型的气雾化需要推进剂。推进剂可以是本领域通常使用的任何推进剂。此类有用推进剂的具体非限制性例子是氯碳氟化物(chlorofluorocarbon)、氢碳氟化物(hydrofluorocarbon)、氢氯碳氟化物(hydochlorofluorocarbon)或碳氢化合物(hydrocarbon)，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。
在本发明的一个优选方面，用于气雾化的装置是压力定量吸入器(metered dose inhaler)。压力定量吸入器在施药时提供特定剂量，而非依赖于施用的可变剂量。此类压力定量吸入器可以与液体或干粉气雾剂剂型一起使用。压力定量吸入器是本领域众所周知的。
一旦偶联物分子到达肺，许多依赖剂型的因素会影响药物吸收。应当领会，在处置要求化合物的循环水平的疾病或紊乱时，诸如气雾剂颗粒尺寸、气雾剂颗粒形状、感染存在与否、肺疾病或栓塞的因素可影响化合物的吸收。对于本文中描述的每种剂型，某些润滑剂、吸收增强剂、蛋白质稳定剂或助悬剂可能是恰当的。这些额外药剂的选择将随目的而变化。应当领会，在希望或寻求局部投递化合物的情况中，诸如吸收增强等变量将不太重要。
I.液体气雾剂剂型本发明的液体气雾剂剂型通常将与喷雾器一起使用。喷雾器可以是压缩空气驱动的或者是超声波的。本领域已知的任何喷雾器都可与本发明联合使用，诸如但不限于Ultravent，Mallinckrodt，Inc.(St.Louis，MO)；AcornII喷雾器(Marquest Medical Products，Englewood CO)。可与本发明联合使用的喷雾器记载于1986年11月25日公告的美国专利4,624,251；1972年11月21日公告的3,703,173；1971年2月9日公告的3,561,444；和1971年1月13日公告的4,635,627。
配制剂可以包含载体。载体是可溶于循环系统的大分子，它是生理学可接受的，其中生理学可接受的意味着本领域技术人员将认可给患者注射所述载体，作为治疗方案的一部分。载体优选是在循环系统中相对稳定的，具有可接受的消除半衰期。这样的大分子包括但不限于大豆卵磷脂、油酸和山梨聚糖三油酸酯，优选山梨聚糖三油酸酯。
此实施方案的配制剂还可包含可用于稳定蛋白质或调节渗透压的其它药剂。药剂的例子包括但不限于盐类，诸如氯化钠或氯化钾，和碳水化合物类，诸如葡萄糖、半乳糖或甘露糖，等等。
J.气雾剂干粉剂型还设想了本发明的药用配制剂将作为包含细微分散的粉末形式的SABM和分散剂的干粉吸入剂型使用。化合物的形式将通常是冻干粉末。偶联物分子的冻干形式可通过标准技术获得。
在另一个实施方案中，干粉剂型将包含含有一种或多种本发明化合物的细微分散的干粉、分散剂及填充剂。可以联合本发明配制剂使用的填充剂包括诸如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇的药剂，其量促进粉末从装置散布。
本文中引用的所有出版物(包括专利和专利申请)完整收入本文作为参考。
在此说明书和权利要求书全文中，词语“包含”或变化诸如“包括”或“含有”应理解为意指含括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
下列实施例作为例示提供，绝非限制。说明书中所有引文的公开内容明确收入本文作为参考。
实施例实施例1-材料为了这些研究，与p185HER2(HER2)的胞外结构域结合的人源化抗体的Fab被重组改造以包括清蛋白结合肽(AB)。在该研究中使用的抗体humAb4D5-8的可变区序列可见于Carter等，(1992)PNAS 894285-4289。之前，人源化的Fab业已衍生自鼠单克隆抗体muMAb4D5(在此4D5)，该单克隆抗体是由在美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia)保藏并具有ATCC入藏登记号CRL 10463的杂交瘤产生的。制备人源化的抗-Her-2抗体的方法及例示可变区序列的鉴定提供于如美国专利5,821,337和6,054,297和Carter等，(1992)PNAS 894285-4289中。
通过编码接头序列，GGGS(SEQ ID NO422)的核酸序列，将编码清蛋白结合肽(“AB”)，QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(SEQ ID NO1)的核酸序列与编码Fab的核酸序列连接。编码接头的核酸序列连接到Fab的重链C-末端KTHT残基上。作为对照，通过重组DNA工程，构建通过其轻链与AB融合的含有D3H44抗体可变区的抗组织因子Fab。关于D3H44氨基酸序列，参见Presta，L.，等，(2001)Thromb.Haemost.85379-389。
将所得到构建体作为融合蛋白(“AB.Fab4D5-H”或“rhuABFabATFL”)自大肠杆菌表达并分泌，然后分离并纯化。接着，融合蛋白被偶联至monomethylauristatin(MMAE)。对于肿瘤功效研究，通过具有马来酰亚胺部分和对氨基苄基氨基甲酰(PAB)间隔物的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂，将融合蛋白与MMAE连接。关于将MMAE与抗体连接的方法的例子参见Klussman，K等，(2004)Bioconjugate Chem.15765-773。对于毒性研究，经例如使用琥珀酰亚胺基乙酰硫代乙酸酯(succinimidylacetylthioacetate)(Sata)以产生游离的硫醇，之后偶联到缬氨酸-瓜氨酸-MMAE(“vc-MMAE”)，通过融合蛋白的赖氨酸与使用马来酰亚胺己酰基(maleimidocaproyl)的活化衍生物改性的MMAE的偶联，将融合蛋白与MMAE连接。MMAE在所得到的AB.Fab4D5-H上的比率通常平均在约1∶1左右，最高4∶1，最低0∶1，使得0-4个MMAE部分被随机分配到暴露的赖氨酸上，总平均数为每个AB.Fab4D5-H约1个MMAE。
实施例2-使用MMAE偶联物的功效研究对已建立的MMTV-HER2转基因乳房肿瘤(Fo5)测试AB.Fab-4D5-H-MMAE偶联物。该肿瘤系不应答Herceptin，但很好地应答Herceptin-MC-vc-PAB-MMAE偶联物。
将单剂静脉内的1650μg MMAE/m2rhuAB.Fab-4D5-H-vc-MMAE(即带有AB)、rhuFab4D5vcMMAE(即没有AB)或rhuABFabATFL-vc-MMAE(阴性对照)施用给带有mMMTV-HER2 Fo5肿瘤的小鼠。每只处理的小鼠具有100-200mm3的平均肿瘤体积。在研究的第0天，施用MMAE偶联的分子或磷酸盐缓冲盐水(“媒介”)，并每周进行两次肿瘤测量，持续17天。使用一种已知有效的MMAE偶联物Herceptin-MC-vc-PAB-MMAE在1245μg/m2MMAE剂量下作为比较。实施基于肿瘤倍增时间的对数细胞杀死(Log Cell Kill)分析。对数细胞杀死分析使用了基于与对照相比，处理开始后肿瘤大小倍增所需时间的肿瘤生长延迟的数学计算。该数学方程式为
图1显示了通过Fisher氏PSLD，在rhuAB.Fab4D5-H-vc-MMAE和Herceptin-MC-vc-PAB-MMAE组之间没有显著差异(p＝0.0001)，而阴性MMAE对照Fab，rhuABFabATFL-vc-MMAE与媒介对照没有显著差异(p＝0.6)。
实施例3-IgG-MMAE、F(ab’)2-MMAE偶联物和游离的MMAE的毒性将重量在75-80克之间的雌性Spraque-Dawley(SD)大鼠(Charles RiverLaboratories，Hollister，CA)用于下列研究以比较游离的MMAE、Fab-MMAE和F(ab')2-MMAE偶联物的毒性。
给药组
给药组对于Herceptin-val-cit-MMAE，使用718作为MMAE的分子量(MW)和145167作为Herceptin的分子量计算μg MMAE/m2。对于HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE，使用718作为MMAE的分子量和100000作为HerceptinF(ab’)2的分子量计算μg MMAE/m2。体表面积计算如下{[(体重克数0.667)x 11.8]/10000}。(产业指导和评论。在用于成年健康志愿者的治疗剂的临床试验中估计安全起始剂量。美国健康和公共事业部食品与药品管理局，药物评估和研究中心(CDER)，生物制剂评估和研究中心(CBER)。2002年12月(Guidance for Industry and Reviewers.Estimating the SafetyStarting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers.U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Research(CDER)，Center for BiologicsEvaluation and research(CBER)，December 2002))。
在研究的第1天，以10mL/kg的剂量体积(在PBS中稀释)，通过单次静脉内推注，经尾静脉注射施用剂量溶液。每日进行一次常规临床观察。每日进行两次发病率和死亡率检查(上午和下午)。在研究的第1天给药前测定动物的体重，此后每日测定一次。将全血收集在含有EDTA的试管中用于血液学参数(如平均血清AST水平、ALT水平、GGT水平和胆红素水平)以及不同细胞计数(如平均白细胞计数和血小板计数)。将全血收集在血清分离管中用于临床化学参数。在研究的第-4天给药前、研究的第3天和第5天在尸体剖检时收集血样。在尸体剖检时，还将全血收集在含有肝素锂的试管中，并将血浆冷冻于-70℃供随后的分析。在尸体剖检中收集下列组织肝、肾、心、胸腺、脾、脑、胸骨和胃肠道(GI tract)切片，包括胃、大肠和小肠。在尸体剖检时，仅称重脾和胸腺。对第5天的体重进行所有的统计分析，使用One Way ANOVA，Tukey’s检验，(SigmaStat 2.03软件)。
在研究的第3天，第4和5给药组(分别为27.14mg/kg HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE和516ug/kg游离的MMAE)的动物濒死。所有第4和5组的动物都极度昏睡，且大多数在泌尿生殖区中具有黄色排出物。在第3天对这些给药组中的动物进行尸体剖检。在研究的第5天，第3给药组(10.83mg/kg HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE)中的动物也在泌尿生殖区中具有黄色排出物。
仅获得第1-3组的临床化学和血液学数据的完全集(基线，第3和5天)；第4和5组的第5天数据无法得到，因为由于明显的病态或体重减轻这些动物在第3天就被尸体剖检了。当与在第5天结束的动物中观察到的那些结果比较时，在判读这些动物的组织学变化时还应当考虑这些发现。
在第3天，第4组(高剂量的HerceptinF(ab’)2)和第5组(游离的MMAE)的动物在肝相关的血清酶ALT、AST和GGT中显示最高的升高，以及最低的血小板和白细胞计数。在这两组中AST和ALT升高是类似的，但是，与第5组相比，第4组显示显著更高的GGT和总胆红素升高。GGT和总胆红素升高可指示肝排泄功能或胆道系统出问题。对于该观察结果，组织学评估并不显示形态学上的相关，而且不清楚是否游离的MMAE与免疫偶联物之间的PK特性差异就能解释该发现。在第3天，低剂量HerceptinF(ab’)2-vc-MMAE第3组显示短暂的肝功能检查的升高，其在第5天回归基线水平。但是，在第5天血小板和白细胞计数保持减少，没有恢复的迹象。用全长免疫偶联物Herceptin-vc-MMAE(MMAE的剂量匹配于第4和5组)处理的动物显示肝功能检查增强和白细胞及血小板减少的典型毒理学特征(profile)。在5天期间，除胆红素之外的所有参数都显示了有进展；但是，在第3天，与第4和5组相比，第2组中的变化较小。
在形态学上，在第2-5组中观察到的毒性样式是相同的，且与之前的研究中所看到的匹配。尽管只有少数器官被评估，临床病理学数据并不暗示在其他部位有明显的器官特异性损伤。在第3组(低剂量HerceptinF(ab’)2)中形态变化最小，而在第4和5组(高剂量HerceptinF(ab’)2和游离的MMAE)中最大。所述变化包括骨髓细胞过少，带有明显凋亡活性的胸腺萎缩，在具有不同程度粘膜退化和萎缩的肠粘膜中有丝分裂和凋亡细胞数增加，以及在肝细胞和胆道上皮中有丝分裂和凋亡细胞数增加。第2、4和5组的动物也显示了肝细胞失控(dropout)和偶见的肝坏死区的迹象。
与第1天的体重相比，第4和5组(分别为27.14mg/kg HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE和516ug/kg游离的MMAE)中的动物在第3天分别损失14.5和12克体重。施用可比较的量MMAE(2105ug MMAE/m2)的第2组动物体重减少并不如第4和5组动物严重。如图2所示，与Fa(b′)2用药法(没有血清清蛋白结合蛋白)一样，游离的MMAE用药法产生类似的体重减轻特征(profile)。体重减轻是毒性的指示。
总之，HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE(赖氨酸)以剂量依赖性方式引起急性毒性。与接受相同量的药物像Herceptin-val-cit-MMAE的动物相比，高剂量HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE中的动物显示明显更大的体重减轻。以与高剂量的HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE可比较的剂量(2150ug/m2)施用游离的MMAE的动物具有可比较的体重减轻和肝相关的血清酶水平以及白细胞和血小板计数的变化。所述发现与施用抑制微管蛋白形成的药物一致(Wood KW，Cornwell WD和Jackson JR.Past and future ofthe mitotic spindle as an oncology target.Current Opinion in Pharmacology，1370-377.2001)。
实施例4-使用MMAE-Fab偶联物的毒性研究在雌性Sprague-Dawley大鼠(80-100克)中比较Herceptin-monomethylauristatin(MMAE)免疫偶联物、Fab4D5-MMAE和AB.Fab4D5-H-MMAE免疫偶联物的毒性。
以10ml/kg的剂量体积(在PBS中稀释)，经尾静脉注射给雌性大鼠施用等效剂量(2105ug MMAE/m2)。所有的剂量溶液以单次推注注射施用。
给药组1＝PBS，6只雌性2＝20.2mg/kg Herceptin-val-cit-MMAE，6只雌性3＝5.7mg/kg Fab4D5-vc-MMAE4＝14.24mg/kg Fab4D5-vc-MMAE，6只雌性5＝7.85mg/kg AB.Fab4D5-H-vc-MMAE6＝19.62mg/kg AB.Fab4D5-H-vc-MMAE，6只雌性在之前的研究中，Herceptin-val-cit-MMAE的2105ug MMAE/m2剂量引起肝相关的血清酶水平和血液学参数中等严重的变化。在目前的研究中，也施用5.7mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE和7.85mg/kgrhuFab4D5-H-val-cit-MMAE的剂量，以得到大约840ug MMAE/m2的MMAE暴露。
在这些测定中，一般在研究的第-3天(给药前)和第3天，在异氟烷麻醉下通过眼窝后窦(retro-orbital sinus)收集血样(大约500ul)用于临床化学和血液学。也在第5天尸体剖检时在氯胺酮麻醉下，通过下腔静脉收集血液。临床观察和体重记录每日进行一次，笼侧死亡率检查每日进行两次(上午/下午)。使濒死的动物安乐死。
在研究的第5天尸体剖检过程中，通过腹主动脉收集大鼠的血液用于临床化学和血液学。收集下列组织心、肺、气管、肝、肾、胸腺、脾、脑、腋窝淋巴结、完整的胃肠道、皮肤、膀胱和骨髓。此外，记录肝、胸腺、脾和脑的器官重量。在尸体剖检中，称重肝、脾和胸腺。检验包括动物体重、白细胞计数、血小板计数、AST水平、ALT水平、GGT水平和血清胆红素水平的组平均值变化的检验。
在研究的第4天，第3和4给药组(5.7和14.25mg/kgrhuFab4D5-val-cit-MMAE)中的动物具有中等的竖毛，许多动物昏睡。在第4天，在14.25mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE给药组中的两只动物濒死，并对其进行尸体剖检。
auristatin E偶联的全长抗体(Herceptin-MC-val-cit-PAB-MMAE，第2组)显示了与之前研究中所看到的相同的毒性特征(profile)在第3和5天，肝功能检查是升高的，并显示了除GGT之外的在第5天恢复的迹象。在5天的研究中，相同的动物显示进行性的嗜中性粒细胞和血小板减少症。用两种类型的抗体片段(rhuFab4D5和rhuFab4D5-H)处理的动物显示剂量依赖性毒性。在第3和5天，对于第3和5组(分别为低剂量的rhuFab4D5和rhuFab4D5-H)，肝相关的血清酶水平基本上相同于媒介处理的动物。在第5组(rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE)的动物中，AST和ALT十分轻微的升高，但是，无论该变化是否是统计显著的，无论其是否实际上代表了肝毒性是不清楚的。在第5天，第3组(低剂量rhuFab4D5-val-cit-MMAE)中的动物显示了十分轻微的血小板减少症，白细胞减少50％，而在第5天，第5组中的动物显示正常的白细胞计数(在第3天轻微的短时间的下降之后)，且在第5天有轻微的血小板增多。在第3和5天，第4和6组(分别为高剂量的rhuFab4D5和rhuFab4D5-H)中的动物显示清楚的毒性迹象。在第4组中，毒性似乎更严重，在第4天，基于病态征兆使两只动物安乐死。在这两个时间点，与第2和6组(可比较的药物剂量的Herceptin-val-cit-MMAE和rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE)相比，第4组中的动物的AST、ALT和GGT水平更高。与第2组相比，第6组中的动物的水平稍微更低。在第5天，第4和6组中的动物显示十分严重的血小板和白细胞减少。与那些在第2组动物中所看到的相比，水平更低，第6组中的动物似乎稍微更好于第4组中的动物。
组织病理学评估的结果与临床观察(体重测定)以及临床病理学数据十分相关。第2、3、4和6组中的动物显示明显的骨髓细胞减少；再生的迹象仅出现在第3组的动物中。与此相反，第5组中的动物显示接近正常细胞构成的骨髓。在胸腺中观察到了类似的发现第2、4和6组的动物显示明显的萎缩和凋亡活性，而第3和5组的动物则显示轻微的萎缩，没有明显的凋亡活性。肝、小肠和大肠中的变化更难以定量，但是，与第3和5组相比，在第2、4和6组动物的这些器官中的有丝分裂和/或凋亡细胞数似乎更大。小区域的坏死仅在第4组的两只动物中观察到。有趣的是，只有第5组的动物(在媒介处理的动物之外)在肝中保留髓外造血的小焦点(foci)，暗示在这些动物中有较低水平的游离药物。与用全长抗体偶联物处理的动物相比，在用Fab免疫偶联物处理的动物中，临床病理学或组织病理学数据并没有显示任何不同的毒性样式的迹象。
用两种类型的抗体片段处理的动物显示剂量依赖性毒性。在第3和5天，施用高剂量rhuFab 4D5-val-cit-MMAE和rhuFab 4D5-H-val-cit-MMAE(含有清蛋白结合肽)的动物显示清楚的毒性征兆。在rhuFab 4D5组中毒性似乎更严重，在第4天使两只动物安乐死，因为它们是濒死的。组织病理学评估结果与临床观察结果(体重测定)和临床病理学数据十分相关。与用全长抗体偶联物处理的动物相比，在用Fab免疫偶联物处理的动物中，临床病理学或组织病理学数据并没有显示任何不同的毒性样式的迹象。所述发现与施用抑制微管蛋白形成的药物的结果一致(Wood等，2001)。
图3表明清蛋白结合肽能改变药物偶联物的毒性。与Fab4D5-vc-MMAE相比，在研究的第5天，在大鼠中Ab.Fab4D5-H-vc-MMAE(含有清蛋白结合肽)具有明显更小的毒性。在施用5.7mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE和7.85mg/kg rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE(第3和5组)的动物中，体重的组平均变化彼此之间并无显著差异。第2、4和6给药组(分别为20.2mg/kgHerceptin-val-cit-MMAE、14.24mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE和19.62mg/kg rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE)都接受了2105ug/M2MMAE。在第2和4组动物中，体重的组平均减少较第6组动物更严重。
实施例5-通过表面等离振子共振进行亲和力测定使用BIAcore 3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)获得SA肽和清蛋白之间的结合亲和力。在大约5000共振单位(RU)下使用胺偶联在CM5芯片中捕获清蛋白。将SA肽(0、0.625、1.25、2.5、5和10μM)以20μl/min流速注射30秒。在基质再生之前，使用10mM甘氨酸，pH3让结合的肽解离5分钟。
将来自通过未偶联的槽(cell)的注射的信号减去固定的槽(cell)的信号以产生相应于作为时间的函数结合的肽的量的传感图。所运行的缓冲液，含有0.05％TWEEN-20T的PBS，被用于所有的样品稀释。BIAcore动力学评估软件(v 3.1)用于根据结合和解离速率确定解离常数(Kd)，使用了一对一结合模型。
通过BIAcore测定以及SA08肽竞争性测定评估所选择的肽结合人(HAS)、兔(BuSA)、大鼠(RSA)和小鼠(MSA)清蛋白的亲和力。如下表8所显示的数据证明了在竞争性测定中获得的IC50值能顺利地与在BIAcore测定中获得的Kd值比较。在竞争性测定中，代表用于结合兔清蛋白的共有肽的肽SA15具有最低的IC50值，但通过表面等离振子共振对兔清蛋白具有最高的亲和力。一种相同于SA06，但两个Cys残基都改变为Ala的线性肽，具有大于50μM的IC50，证明了二硫键的重要性。
实施例6-相对Kd的测定引言在评估蛋白质之间的结合能力中，所选择的方法是ELISA。由于容易开发高特异性和定量的测定，因此使得ELISA能得到广泛应用。但是，在蛋白质直接固定在固体表面的情况下，由于变性或遮蔽结合表位，可出现潜在的伪像。
为检测与Fab分子(Fab-H)偶联的清蛋白结合肽对清蛋白的亲和力，我们开发了两种ELISA。第一种包括将清蛋白吸附在孔表面，并用山羊-抗-huFab-HRP检测结合的Fab。第二种包括在溶液中用清蛋白结合Fab-H，并测定解离常数(Kd)。第二种测定的基本原理是在溶液中让恒定浓度的Fab-H与不同量的清蛋白结合以达到平衡，并在包被着清蛋白的ELISA孔中测定未结合的Fab-H。可使用斯卡查德分析(Scatchard Analysis)通过分析数据确定Kd值(Munson等，1980，Anal.Biochem.，107220)。
材料和方法材料小鼠清蛋白-冻干形式，目录号A3139大鼠清蛋白-冻干形式，目录号A6414兔清蛋白-冻干形式，目录号A0639通过将10mg清蛋白溶解在10ml PBS中制备1mg/ml清蛋白溶液。将溶液贮藏在4℃。
测定缓冲液PBS+0.5％鸡蛋清蛋白(Sigma#A5503)+0.5％Tween 20，pH7.4。
直接结合的ELISA测定在4℃下，将小鼠、大鼠或兔清蛋白(Sigma)以2μg/ml固定在NUNCMaxisorp 96孔平板上过夜。在除去包被液之后，在25℃下用结合缓冲液(PBS，0.5％卵清蛋白和0.05％Tween 20)封闭平板1小时。将在结合缓冲液中连续稀释的Fab-Hx以100ul/孔添加，并在25℃下使之结合包被的清蛋白30分钟。通过用0.05％PBS/Tween20洗涤孔除去未结合的Fab-Hx，通过在25℃下与山羊抗人Fab’2-HRP温育1小时检测结合的Fab-Hx分子。然后，用四甲基联苯胺(TMB)/H2O2溶液测定结合的HRP。在温育15分钟后，通过添加1M磷酸淬灭反应。用650nm的参比波长读出在450nm的吸光度。
Kd(带有预温育的溶液结合)ELISA测定首先，在溶液中温育固定浓度的Fab-H(在上述结合的ELISA中测定的)和不同浓度的溶于测定缓冲液的清蛋白。在室温下≥2小时温育后，将100μl的混合液转移到清蛋白包被的ELISA平板中。然后，通过如上所述的直接结合的ELISA测定游离的Fab-Hx的浓度。
固定浓度的Fab-H和起始浓度的清蛋白列于下表中。清蛋白以1∶3连续稀释8次。
结果Friguet等在1985年首先公开了使用ELISA的亲和力测定。在测定Kd以及选择HER2 ECD的人源化抗体中，我们已使用该方法(Carter等，Proc.Natl.Acad. Sci.89，4285，1992)。
一般而言，结合平衡研究要求抗体的浓度应当接近于，或低于解离常数值。因为解离常数是事先未知的，因此在用于测定游离的Fab-Hx的结合ELISA中最好选择给出足够的吸光度的总Fab-H浓度。通过在直接结合的ELISA中滴定Fab-Hx测定该浓度。
为检验抗体-清蛋白已达到平衡，将Fab-H与兔清蛋白温育1小时、2小时及过夜，然后在结合的ELISA中测定反应混合液。在2小时温育后，到达平衡。
为确定游离的Fab-H结合孔中的包被的清蛋白需要的最佳时间，将Ab-清蛋白混合液与孔中包被的清蛋白温育15、30、45、60和120分钟。基于该测定，确定30分钟是结合所有的游离的Fab-H所需要的最少时间。Kd(带有预温育的溶液结合)ELISA测定的结果如表10所示。
序列表
表1清蛋白结合噬菌体肽的物种特异性
表2
表3多物种结合物
表4在大鼠清蛋白上选择的序列
表4(续)
表4(续)
表4(续)
表5在兔清蛋白上选择的序列
表6在人清蛋白上选择的序列
表7结合多物种清蛋白的肽
表8表面等离振子共振肽竞争Kd(nM) IC50(nM)
表9
表10Kd(带有预温育的溶液结合)ELISA测定
权利要求
1.一种偶联物分子，包含至少一个血清清蛋白结合部分(SABM)、至少一个靶向剂(TA)和至少一个细胞毒剂(CA)。
2.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM包含至少50％同一于DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)序列的氨基酸序列，其中氨基酸序列具有两个Cys残基，在Cys残基之间具有5个氨基酸残基。
3.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM包含DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)的氨基酸序列的变体，其中除Cys残基外，SEQ ID NO8的1-5个任何残基为不同的氨基酸残基所取代。
4.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM包含线性或环状氨基酸序列，选自Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-XaaPhe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys[SEQ ID NO1]Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe[SEQ ID NO2]Cys-Tyr-Xaal-Pro-Gly-Xaa-Cys[SEQ ID NO3]Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp[SEQ ID NO4]Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys[SEQ ID NO5]；Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp[SEQ ID NO6]；CXXGPXXXXC[SEQ ID NO21]XXXXCXXGPXXXXCXXXX[SEQ ID NO22]CXXXXXXCXXXXXXCCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO23]CCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO24]CCXXXXXCXXXXCXXXXCC[SEQ ID NO25]CXCXXXXXXXCXXXCXXXXXX[SEQ ID NO26]XXXXXDXCLPXWGCLWXXXX[SEQ ID NO155]XXXXDXCLPXWGCLWXXX[SEQ ID NO156]D X C L P X W G C L W[SEQ ID NO423]X X X X D I C L P R W G C L W X X X[SEQ ID NO424]，X X X X X D I C L P R W G C L W X X X X[SEQ ID NO425]X X E M C Y F P G I C W M X X[SEQ ID NO426]X X D L C L R D W G C L W X X[SEQ ID NO427]其中X是任意氨基酸残基。
5.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM包含任一选自SEQ IDNOs7-20、27-154和157-421的氨基酸序列。
6.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM包含选自SEQ ID NOs7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列。
7.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM包含表1-9中所描述的任一肽序列。
8.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM与血清清蛋白结合，具有约100μM或更小的Kd。
9.根据权利要求1的偶联物分子，其中TA是抗体。
10.根据权利要求9的偶联物分子，其中抗体是Fab、F(ab)2、scFv或双抗体。
11.根据权利要求1的偶联物分子，其中TA与在癌症中升高的细胞表面蛋白结合。
12.根据权利要求11的偶联物分子，其中细胞表面蛋白是HER2、PSMA、PCMA、KDR和Flt-1。
13.根据权利要求11的偶联物分子，其中细胞表面蛋白是B细胞表面标志。
14.根据权利要求11的偶联物分子，其中细胞表面蛋白是B细胞表面标志，是CD20或BR3。
15.根据权利要求1的偶联物分子，其中TA是抗-HER2抗体。
16.根据权利要求15的偶联物分子，其中TA是具有SEQ ID NO428和429的VH和VL序列的抗体。
17.根据权利要求15的偶联物分子，其中TA包含抗-HER2抗体的变体序列，所述抗-HER2抗体包含SEQ ID NO428和SEQ ID NO429。
18.根据权利要求1的偶联物分子，其中细胞毒剂是monomethylauristatin(MMAE)。
19.根据权利要求1的偶联物分子，其中位于所述的SABM和靶向剂或细胞毒剂之间的接头部分是GGGS。
20.根据权利要求1的偶联物分子，其中SABM结合人清蛋白。
21.一种用于治疗用途的组合物，包含与药用载体混合的根据权利要求1的偶联物分子。
22.一种用于减少治疗剂毒性的方法，包括用偶联有治疗剂的血清清蛋白结合部分(SABM)产生治疗剂的步骤。
23.一种用于减少哺乳动物中治疗剂毒性的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1的偶联物分子。
24.根据权利要求22或23的方法，进一步包括测定体内治疗剂SABM偶联物毒性的步骤。
25.一种治疗哺乳动物癌症的方法，包括用治疗有效量的根据权利要求1的偶联物分子治疗患有癌症的哺乳动物的步骤。
26.一种治疗哺乳动物自身免疫性紊乱的方法，包括用治疗有效量的根据权利要求1的偶联物分子治疗患有自身免疫性紊乱的哺乳动物的步骤，所述偶联物分子与有助于或引起自身免疫性紊乱的B-细胞结合。
27.一种产品，包含容器、容器中包含根据权利要求1的偶联物分子的组合物、含有施用治疗有效剂量的使用说明的包装插页。
全文摘要
本发明涉及具有减少的毒性的治疗剂，包含血清清蛋白结合肽(SABP)、靶向剂和细胞毒剂。本发明还涉及用于减少治疗剂毒性的方法以及使用具有减少的毒性的治疗剂治疗的方法。
文档编号A61K39/395GK101072581SQ200580041758
公开日2007年11月14日 申请日期2005年9月22日 优先权日2004年10月5日
发明者马克·S·丹尼斯 申请人:健泰科生物技术公司