专利名称：一种血栓溶解酶的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种血栓溶解酶的制备方法及其应用，特别是涉及一种用海洋生物单环刺螠制备血栓溶解酶的方法，并将其应用于制备治疗心脑血管疾病的抗凝血或溶解血栓。
背景技术：
海洋生物单环刺螠俗称“海肠子”，是生活在沿海泥沙底质的底栖生物，繁殖力强，资源丰富。单环刺螠为螠虫动物门(Echiurioidea)，螠纲(Echiurida)，无管螠目(Xenopneusta)，刺螠科(Urchidae)。目前对单环刺螠仅限于相关的基础生物学研究，如形态结构、胚胎发育、生活史、人工育苗技术及营养成分分析等。关于单环刺螠的开发应用尚未见报道，特别是未见用它制备血栓溶解酶及其应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用海洋生物单环刺螠制备血栓溶解酶的方法，并用它制备一种新型抗凝血、溶解血栓药物进行开发，以弥补一种血栓溶解酶的制备方法，其特征是以单环刺螠的整体或它的体腔液为材料，通过组织捣碎和/或过滤、离心，得离心上清液，经超滤；再经冷冻干燥，制得干粉或经低温丙酮沉淀，抽滤，制得沉淀物；经溶解、凝胶柱分离纯化，再经冷冻干燥。
上述血栓溶解酶在制备治疗心脑血管疾病的抗凝血或溶解血栓药物中的应用。
本发明的血栓溶解酶具有很好的抗凝溶血栓效果，具有研究开发前景。
具体实施例方式
实施例1
取鲜活单环刺螠1000g，剖开体壁，取体腔液共计480ml，用绢布过滤除去消化道等不溶物，将所得滤液于4℃下10000rpm离心30min，得离心上清液350ml，将该上清液装入膜超滤装置，除去分子量8KD以下的小分子物质，得超滤液200ml，经冷冻干燥制得干粉5.5g。将该干粉用pH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲水溶液溶解配制成25ml液体，再经冷冻离心机4℃下15000rpm离心30min，取上清液，上SephadexG-50凝胶分离柱(Φ5×100cm)，用pH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲水溶液洗脱分离，收集具有酶活性的洗脱峰部分，合并，再经冷冻干燥，得纯化的血栓溶解酶制品0.8g。
实施例2取冷冻的单环刺螠500g，室温下解冻，放入组织捣碎机中，300ml冰冷的pH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲液，进行组织捣碎，用绢布过滤除去不溶物，将所得滤液于4℃下10000rpm离心30min，得离心上清液体350ml，将液体进行冰浴，冷却至0℃，搅拌下慢慢加入-30℃的丙酮液至45％浓度，立即抽滤收集沉淀物，加入冰冷的pH7.4的0.01mol/L磷酸缓溶解，体积20ml，4℃下15000rpm冷冻离心30min，取上清液，上Sephadex G-50凝胶分离柱(Φ5×100cm)，用0.01mol/L磷酸缓冲液洗脱分离，收集具有酶活性的洗脱峰部分，合并，再经冷冻干燥，得纯化的血栓溶解酶制品0.46g。
实施例3体外抗凝血、溶血栓试验(1)抗凝血试验称取50mg实施例1中纯化的单环刺螠血栓溶解酶溶解于10mlpH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲液(含0.8％NaCl)，得单环刺螠血栓溶解酶液，备用。分别取6支洁净玻璃试管，其中3管分别加入血栓溶解酶1.0ml，另外3支分别加入1.0ml pH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲液作为对照组，取新西兰兔全血，立即分别向每管中加入1.0ml，封口，轻轻摇匀，放置37℃，观察各管的抗凝血情况。结果表明单环刺螠血栓溶解酶具有明显的抗凝血作用，结果见表1。
表1单环刺螠血栓溶解酶抗凝血作用(37℃)
(2)溶解血栓试验分别取6支洁净玻璃试管，分别加入新西兰兔新鲜血液1.0ml，室温下凝固30min形成血块，向其中的3支试管中分别加入抗凝血试验(1)中所配制的单环刺螠血栓溶解酶1.0ml，其余3支试管加入0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲液(含0.8％NaCl)1.0ml，封口，于37℃下摇床上振荡(100rpm)，观察血块的变化。结果表明单环刺螠血栓溶解酶在本实验条件下3小时能将血块全部溶解，且对红细胞无明显影响，结果见表2。
表2单环刺螠血栓溶解酶溶解血块作用(37℃)
2、大鼠体内溶解血栓试验取体重为250±20g的Wistar大鼠20只，用1％(重量百分数)的戊巴比妥水溶液，按0.1ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉。麻醉后行颈部正中切口，分离出右侧颈总动脉长约10mm，先用动脉夹先后夹闭动脉远心端和近心端，使两端相距5mm，并有血液在动脉中充盈。两端通直流电5mA 20min，电凝结束松开动脉夹，制作大鼠颈动脉血栓模型。取实施例2中纯化的单环刺螠血栓溶解酶，用注射用生理盐水配制浓度为10mg/ml的单环刺螠血栓溶解酶10ml，无菌过滤。取颈动脉血栓模型大鼠10只，每只动物静脉注射单环刺螠溶解酶液2ml，作为实验组。再取颈动脉血栓模型大鼠10只，静脉注射同样体积的生理盐水，作为对照组。实验结果表明，72hr后，实验组动物肢体行动恢复正常，而对照组动物肢体活动无明显改善。说明单环刺螠血栓溶解酶具有很好的溶解血栓的作用。
以上实验结果表明，按照实施例1和2制备的酶产品，经体外抗凝血、溶血栓试验和动物溶血栓模型试验，证明有很好的抗凝溶血栓效果，具有研究开发前景。
权利要求
1.一种血栓溶解酶的制备方法，其特征是以单环刺螠的整体或它的体腔液为材料，通过组织捣碎和/或过滤、离心，得离心上清液，经超滤；再经冷冻干燥，制得干粉或经低温丙酮沉淀，抽滤，制得沉淀物；经溶解、凝胶柱分离纯化，再经冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的血栓溶解酶在制备治疗心脑血管疾病的抗凝血或溶解血栓药物中的应用。
全文摘要
一种血栓溶解酶的制备方法，其特征是以单环刺蜢的整体或它的体腔液为材料，通过组织捣碎和/或过滤、离心，得离心上清液，经超滤；再经冷冻干燥，制得干粉或经低温丙酮沉淀，抽滤，制得沉淀物；经溶解、凝胶柱分离纯化，再经冷冻干燥，制得血栓溶解酶。该血栓溶解酶可在制备治疗心脑血管疾病的抗凝血或溶解血栓药物中获得应用。本发明的血栓溶解酶具有很好的抗凝溶血栓效果，具有研究开发前景。
文档编号A61K38/48GK1834238SQ20061004337
公开日2006年9月20日 申请日期2006年3月28日 优先权日2006年3月28日
发明者刘万顺, 韩宝芹, 王佃亮, 杨艳 申请人:中国海洋大学