用于水产动物病害防治的序列、质粒、工程菌及其应用的制作方法

专利名称：用于水产动物病害防治的序列、质粒、工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和水产动物病害防治领域。具体来说，涉及一种适用于水产动物病害防治的含多拷贝CpG基序免疫刺激序列(ISS)的质粒以及含该质粒的酵母工程菌的研制，以及利用该质粒和工程菌制备水产用免疫增强剂，应用于水产动物病害防治。
背景技术：
水产动物病害是目前严重影响水产养殖业健康可持续发展的世界性难题，在我国尤其突出，我国每年因鱼类病害造成的水产养殖经济损失高达数百亿元，但长期来，一直缺乏有效的防治方法，造成抗生素、杀虫剂等滥用，严重威胁食品安全。随着我国加入WTO和食品安全法的颁布，对环境和食品安全的标准和要求越来越高，当前一大批抗生素、杀虫剂等已被明令禁用，水产动物病害防治已面临无药可施的困境，因此研制开发替代抗生素和农药的安全、高效、天然水产动物病害防治药物及其相关应用技术已迫在眉睫。
长期以来，DNA都被认为是一种重要的遗传物质，但是近年来的研究发现，某些特殊的DNA序列具有免疫刺激活性，能促进机体的免疫应答。这种特定DNA往往含有未甲基化的CpG(胞嘧啶-鸟嘌呤)二核苷酸，因而被称为CpG motif或者免疫激活序列(immunostimulatory sequences，ISS)。CpG motifs主要存在于细菌、病毒及无脊椎动物的基因组中，能直接促进高等动物B淋巴细胞的增殖、分化和成熟，诱导分泌免疫球蛋白，激活单核细胞、树突状细胞等分泌炎症因子和Th1型细胞因子，改变抗原递呈细胞表面分子的表达，促进Th细胞向Th1型分化，从而引发天然和适应性免疫反应。
CpG具有独特而强烈的免疫激活作用，近年来引起国内外研究者的强烈兴趣，目前应用CpG作为免疫治疗药物和免疫佐剂在人类癌症、过敏、哮喘和传染性疾病等的预防和治疗方面，已取得较大进展，但在水产动物病害防治领域仍然未见相关报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适用于水产动物病害防治的序列、及含有该序列的质粒和工程菌。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于水产动物病害防治的免疫刺激序列，该序列含有串联排列的18CpG基序，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种利用上述串联序列衍生的序列，该衍生序列为含有至少2个拷贝的18CpG基序的串联序列。
本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有5个拷贝的SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含有上述重组质粒的工程菌，该菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株(INVSC1-ODN5)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2006年10月19日，保藏号CGMCC 1846。
本发明还提供了上述序列、衍生序列、重组质粒以及工程菌在水产动物病害防治中的应用。
本发明是通过如下的构思所获得的物种对CpG DNA的识别具有一定的种属特异性，刺激某一物种免疫系统的最佳序列(未甲基化CpG二核苷酸与侧翼序列)通常与另一物种的最佳序列有较大差别，因此，我们通过系统筛选，选择出了能同时激活鱼虾水产动物的10条CpG序列，并使之依次串联，首先人工合成了含有18个CpG基序的长片段(18CpG)，全长226bp。在此基础上，为了尽可能提高CpG基序在质粒中的拷贝数和免疫刺激活性，我们进一步增加了CpG基序在质粒中的拷贝数，将18CpG串联序列重复五次插入pYES2载体，构建成pYES2-90CpG质粒，免疫生物学功能研究表明，该质粒能直接活化鱼头肾的巨噬细胞，促进淋巴细胞增殖，诱导分泌NKEF、TNF-α等免疫相关基因表达；增强对虾酚氧化酶、溶菌酶等活性，促进杀菌力。pYES2-90CpG ISS的鱼和虾抗感染实验表明，经pYES2-90CpG ISS注射或饲喂的鱼和虾，其抗病能力增强，具有显著的免疫保护活性。
因此，我们研制的pYES2-90CpG ISS可有效应用于水产养殖业，增强水产养殖品种的免疫保护力。其免疫效果好、使用安全等特点能降低长期应用抗生素所引起的耐药菌株增加、动物体内药物残留等影响。但是，人工合成的ISS成本高、产量低，不适用于大规模生产，我们尝试将pYES2-90CpG质粒导入酿酒酵母，利用质粒和酵母的自身繁殖，加工成水产抗病饲料添加剂，有效地解决了成本昂贵，生产率低的问题，同时由于酿酒酵母本身安全无毒性，可直接作为酵母饲料，适合于投喂，发酵生产成本低，是水产动物活性因子开发应用的理想系统。
酿酒酵母目前主要用于啤酒工业，此外也可作为酵母饲料而用于饲料工业。酵母饲料是指利用酵母菌的新陈代谢和繁殖菌体，经过发酵和干燥等工艺制成的含有菌体和酵母细胞代谢产物的安全、无污染、无残留的优质饲料。目前利用酿酒酵母表达外源基因，已在乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等药物开发中得以应用，但在鱼类药物开发中的应用很少。此外，酿酒酵母应用于生产具有生长繁殖迅速，工艺简单等优点，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本，具有很强的实用性。
本发明筛选到对鱼虾类有显著免疫激活作用的含CpG基序的免疫激活序列(ISS)共10条，相互串联并人工合成，然后五次重复克隆于细菌-酵母穿梭质粒pYES2载体中，构建成含多拷贝ISS序列(90个拷贝)的质粒(pYES2-90CpG ISS)和酵母工程菌。并分别以鲈鱼、鲫鱼和南美白对虾为材料，评价pYES2-90CpG ISS在鱼类和虾类中的免疫活性指标。免疫指标包括体外诱导鲈鱼、鲫鱼巨噬细胞呼吸爆发(O2-活性)和杀菌力(KI)变化，诱导外周血淋巴细胞增殖转化(SI)；体内诱导免疫相关因子(MHCIIβ、天然杀伤细胞增强因子、肿瘤坏死因子-α和Mx)的表达变化以及对虾血清中的酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LYZ)活性和抗菌力。
实验结果显示，pYES2-90CpG ISS对两种鱼的巨噬细胞均产生明显的激活作用，O2-水平显著增加，并且随着浓度的增加，变化增大，呈剂量依赖效应；增强巨噬细胞对嗜水气单胞菌的杀菌活性，同时pYES2-90CpG ISS能诱导鲫鱼、鲈鱼外周血淋巴细胞的增殖反应。另外，本发明的研究还显示，一定剂量的pYES2-90CpG ISS能诱导鲫鱼头肾中Mx的表达，刺激NKEF、TNF-α和MHCIIβ分子表达量的增加，与ploy IC诱导的基因表达情况相似。
pYES2-90CpG ISS对虾的免疫活性也具有激活作用，表现在pYES2-90CpG ISS对南美白对虾酚氧化酶的活力、溶菌酶活性和抗菌活性均有有明显的增强作用，并且不同的给予剂量对酚氧化酶、溶菌酶活性的促进作用不尽相同，不同的作用时间作用效果也不尽相同，说明ISS的多串联体可作为非特异性免疫增强剂，用于提高养殖对虾的非特异免疫力，并存在着最佳使用剂量和有效持续时间。
在此基础上，本发明还探讨了pYES2-90CpG ISS对养殖鱼虾病害的免疫防治作用，分别用注射、灌注口服和饲料添加等方式，测定了pYES2-90CpG ISS对养殖过程中鱼类、虾类病害防治的最适剂量和药效时间。结果表明，鱼类注射和灌注口服最适剂量分别为10μg/尾和20μg/尾；鱼虾病害防治饲料添加最适剂量为20μg/克；连续饲喂鱼虾加入pYES2-90CpGISS序列的饲料(每克饲料含20μg微克ISS)3～5天可维持药效10天左右，而连续饲喂10～15天，可维持药效20～30天左右。
本发明还证明了pYES2-90CpG ISS作为一种免疫增强剂，对哈氏弧菌疫苗具有免疫佐剂效应，与正常免疫组相比，使用ISS的实验组的保护率增加了11.66％，抗体效价增加1.52倍，表明pYES2-90CpG ISS序列是一种有效的鱼类疫苗佐剂。
本发明还制备了含pYES2-90CpG ISS序列的酵母工程菌，并进行了病害防治实验，结果显示，使用含pYES2-90CpG ISS酵母抗病饲料的实验鱼虾组，成活率分别提高21.74％和20.12％，免疫保护率分别达到66.57％和64.45％，表明pYES2-90CpG ISS通过酵母饲料形式饲喂鱼虾，也能明显提高鱼虾的免疫抗病能力，是一种有效的免疫增强剂；且其生产工艺简单，成本低廉，适用于大规模生产；并且可有效降低长期应用抗生素所引起的耐药菌株增加、药物残留等负面影响，具有很强的实用性。
本发明筛选了在鱼虾水产类动物中具有最佳免疫刺激作用的10条CpG免疫刺激序列(ISS)，将该10条序列多次串联重复，构建成含90个CpG基序的多拷贝pYES2-90CpG质粒，以及含该质粒的酵母与大肠杆菌菌株，最终研制成对鱼虾等多种水产养殖品种具有广谱、高效免疫激活作用的分子免疫增强剂。该免疫增强剂对鲫鱼、鲈鱼和对虾的巨噬细胞、淋巴细胞、酚氧化酶、溶菌酶等具有显著增强活性，并对哈氏弧菌疫苗具有免疫佐剂效应。因此，这种含多拷贝ISS的质粒作为分子免疫增强剂，可有效增强鱼、虾等水产养殖品种的天然免疫能力。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1为本发明人工合成的含18CpG基序的串联序列，其中阴影部分标出的是CpG基序序列。
图2为本发明实施例中含不同ISS拷贝数的重组质粒双酶切鉴定图。
其中M为DL2000marker；1-5分别为含1个、2个、3个、4个和5个ISS拷贝数的重组质粒。
图3为本发明一种实施例的重组表达质粒pYES2-90CpG构建图(含pYES2-18CpG的构建)。
图4为本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG对鲈鱼、鲫鱼巨噬细胞产生O2-的影响。其中a和b分别表示鲫鱼、鲈鱼巨噬细胞经不同浓度的pYES2-90CpG(黑)、空质粒(灰)、培养基(白)体外诱导24h后O2-的变化，图中数据用平均值±标准差表示，n＝4，*p＜0.05**p＜0.01。
图5为本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG对鲈鱼、鲫鱼头肾巨噬细胞的杀菌活性(由KI表示)的影响。其中a和b分别表示鲫鱼、鲈鱼的头肾巨噬细胞经50μg/ml的质粒DNA体外诱导24h后杀菌力的变化。图中数据用平均值±标准差表示，n＝4。
图6为本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG对鲈鱼、鲫鱼外周血淋巴细胞增殖率(由SI表示)的影响。a和b分别表示鲫鱼、鲈鱼的外周血淋巴细胞经不同浓度的pYES2-90CpG(黑)、空质粒(灰)，10μg/ml LPS体外诱导3d后相对于非诱导组细胞(经培养基处理)的增殖情况。图中数据用平均值±标准差表示，n＝4，*p＜0.05**p＜0.01。
图7为经本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG诱导前后鲫鱼头肾中免疫基因表达情况。
图8为本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG对南美白对虾血清酚氧化酶活性的影响。其中a为对虾经不同浓度的pYES2-90CpG(黑)、pYES2(灰)注射12h后PO活性变化；b为经10μg/ml pYES2-90CpG(黑)、pYES2(灰)、PBS(白)注射数小时后PO活性变化。图中数据用平均值±标准差表示，n＝4，*p＜0.05**p＜0.01。
图9为本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG对南美白对虾血清溶菌酶活性的影响。其中a为对虾经不同浓度的pYES2-90CpG(黑)、pYES2(灰)注射12h后LSZ活性变化；b为经10μg/ml pYES2-90CpG(黑)、pYES2(灰)、PBS(白)注射数小时后LSZ活性变化。图中数据用平均值±标准差表示，n＝4，*p＜0.05**p＜0.01。
图10为本发明一种实施例的重组质粒pYES2-90CpG对南美白对虾血清抗菌活力的影响。图中的细菌生长抑制曲线表示50μl质粒DNA注射南美白对虾12h后，其血清抑制嗜水产气单胞菌的生长变化趋势。OD570值越小，血清对细菌的抑制作用越强。
具体实施例方式
实施例1 鱼虾最适ISS的合成与筛选1.1含不同CpG基序的ISS合成选择实验室自行设计和国际上部分实验室报道的在人、小鼠、鱼等不同动物中具有显著免疫激活效应的CpG ISS序列共25条(见表1)，由上海生工生物工程公司合成，全链硫代修饰，PAGE纯化，纯度为99.99％。
表1.待筛选的CpG ISS特征


1.2不同ISS对鲈鱼巨噬细胞的激活作用巨噬细胞的活性与功能是反映鱼类免疫水平的重要指标，而呼吸爆发和吞噬杀菌又是反映巨噬细胞活性与功能的主要指标。本发明以鲈鱼巨噬细胞呼吸爆发(产生O2-和H2O2)以及吞噬杀菌为指标，测定了25条不同ISS对巨噬细胞活性与功能的激活效应。首先分离鲈鱼的巨噬细胞取鲈鱼肾脏和脾脏，剪碎，悬浮于Hanks’液中，经150目不锈钢网过滤到培养皿中，吸取1.5ml细胞悬液轻轻加到3ml 34％和51％Percoll界面上，400g离心30min，吸取34％和51％Percoll交界面的巨噬细胞层，用Hanks’液和L-15培养液各洗涤一次，用添加0.1％小牛血清、100μg/ml青霉素和100U/ml链霉素的L-15调整至2×106个/ml，按每孔100μl接种于96孔培养板，27℃培养3～5h，取贴壁生长细胞备用。
将表1所列的不同ISS分别以不同浓度(0.5、2.5、5和10uM/ml，约2.5、12.5、25和50μg/ml)与巨噬细胞共培养24小时，然后分别测定巨噬细胞产生O2-和H2O2活性。O2-测定方法为将培养巨噬细胞的96孔板经3000rpm 4℃离心10min，弃上清，每孔加入1mg/ml NBT(氯化硝基四唑兰，L-15配制)100ul，27℃培养1.5～2h后取出，3000rpm 4℃离心10min，倾出上清，用甲醇固定15min，每孔120ul；96孔板再经3000rpm 4℃离心10min，弃上清，用70％甲醇洗一次，气干，每孔加入120ul 2M KOH和140ul DMSO轻轻振荡混匀，用Elx 800 BIO-TEK型酶标仪测630nm波长光吸收值，测定O2-含量(结果见表2)。H2O2测定方法为将96孔板经3000rpm4℃离心10min，弃上清，每孔加入100ulRPS液(含140mM NaCl、5.5mM葡萄糖、0.56mM酚红的10mM磷酸钾缓冲液pH7.0，临用前加入100ug/ml辣根过氧化物酶)，27℃培养1.5～2h后取出，每孔加入10ul 1M NaOH中止反应，用酶标仪测定630nm波长的光吸收值。反应中设调零孔、阴性对照孔和实验孔，实验重复4次(结果见表3)。
巨噬细胞经不同ISS(5μM/ml)作用24小时后，用PBS洗三次，完全除去青霉素和链霉素，每孔加入100μl无双抗(含5％FCS)的L-15培养液，加入终浓度为2×104/孔或4×103/孔的嗜水产气单胞菌，轻轻振荡片刻，150g离心5min，使细菌和细胞充分接触，27℃作用0h和5h后，移弃上清，每孔加入50μl 0.2％Tween 20裂解细胞，再加入100μl细菌培养液，27℃培养16h，最后加入10μl MTT(5mg/ml，PBS配制)，轻摇15min，酶标仪570nm波长测光吸收值。杀菌力用杀菌指数(killing index，KI)表示，KI＝(OD570nm0h-OD570nm5h)/OD570nm0h。(结果见表4)数据显示，编号为1826、2006、1670、D、1668、1651、1681、1669、2133、2102和2143的ISS序列，对巨噬细胞的呼吸爆发和杀菌活性有明显激活作用，有效激活剂量为2.5～10μM/ml，表现为上述序列在2.5μM/ml时，对巨噬细胞的呼吸爆发活性有显著影响(P＜0.05)，当浓度增加至5μM/ml和10μM/ml时，对巨噬细胞的呼吸爆发和杀菌活性产生极显著影响(P＜0.01)，而编号为2080、2007、17、D29、1585的ISS序列，仅在较高剂量(10μM/ml)时对巨噬细胞的呼吸爆发活性有一定促进作用(P＜0.05)，但对杀菌力的影响并不显著，而其它序列则无论是对呼吸爆发还是杀菌力均没有显著影响。
表2.不同ISS对鲈鱼巨噬细胞O2-产生量的作用


注*P＜0.05，**P＜0.01，n＝4表3.不同ISS对巨噬细胞H2O2产生量的作用


注*P＜0.05，**P＜0.01，n＝4表4.不同ISS对巨噬细胞杀菌活力的影响


1.3不同ISS对南美白对虾的免疫激活作用酚氧化酶、溶菌酶和血清杀菌活性是反映对虾免疫水平的重要指标，因此，本发明采用这些指标，开展不同ISS序列对对虾免疫激活作用的比较研究。将南美白对虾分为25组，每组20尾，于对虾第二腹节分别用20μl微量注射器注射PBS(对照组)和由PBS配制的相应浓度的ISS，每尾注射20μl，最终剂量分别为5、10和20μg/尾。24小时后采血，150g离心10min，取上清，4℃保存，分别测定血清溶菌酶(LSZ)活性、酚氧化酶(PO)活性和血清抗菌活力，具体做法如下1.3.1血清溶菌酶(LSZ)活性测定溶壁微球菌在37℃用LB培养基培养，2500rpm 15min离心收集菌体，用4ml丙酮洗涤细菌，2500rpm离心3min，去上清，重复两次，用4ml乙醚洗涤细菌，2500rpm离心3min，重复一次，将细菌28℃干燥，磨成粉末，作为活性测定底物，用0.1mol/L磷酸钾缓冲液配成A570≈0.3的菌悬液，取85μl菌悬液与15μl待测血清于96孔板中混匀，调零孔加入0.1mol/L磷酸钾缓冲液100μl，于570nm处测定其OD，然后将试管置于37℃水浴保温30min，立即置冰浴中10min以终止反应，测定OD570值。溶菌活力定义如下吸光度下降0.001每分钟为一个活性单位。
1.3.2酚氧化酶(PO)活性测定参照Munoz等方法进行，以L-dopa为底物，将1％SDS 14μl与0.1mol/L L-dopa 8μl及待测血清100μl加入96孔板，于室温下混匀，调零孔加入0.1mol/L磷酸钾缓冲液100μl，与等量SDS、L-dopa每隔5min测定其光密度OD490值，以OD490对反应时间作图，以每分钟A490增加0.001为一个酶活力单位。
1.3.3血清抗菌活力测定血清抗菌活性用细菌生长抑制浊度检测法。先在96孔板中加入50μl不同浓度的血清，然后再加入5×107/ml嗜水产气单胞菌100μl(细菌OD600为0.05)，混匀，调零孔加入150μl0.1mol/L磷酸钾缓冲液，27℃每隔1小时检测OD570，以每小时OD570值作抑制曲线，测定抗菌活性。
1.3.4活力测定结果各项活力测定结果见表5-7。实验数据用平均值±标准差(S.D.)表示，用t-检验比较对照组与实验组的差异，应用单因子方差分析比较各实验组之间的差异，p＜0.05代表显著差异，用*表示，p＜0.01代表极显著差异，用**表示。数据分析表明，编号为1826、2006、1670、1668、1651、1681、1669、2133、2102、2143和2080的ISS序列，对南美白对虾酚氧化酶、溶菌酶和血清杀菌活性有明显激活作用，表现在注射5μg/尾时，其活性与对照组相比，有显著增加(P＜0.05)，当剂量增加至10μg/尾和20μg/尾时，其活性与对照组相比，有极显著增加(P＜0.01)，编号为D和2007的ISS序列，仅在较高剂量(20μg/尾)时对酚氧化酶、溶菌酶和血清杀菌活性有一定促进作用(P＜0.05)，而其它序列均没有显著影响。
表5.不同ISS对南美白对虾酚氧化酶(PO)活性的影响


注*P＜0.05，**P＜0.01，n＝4表6.不同ISS对南美白对虾溶菌酶活性的影响


注*P＜0.05，**P＜0.01，n＝4表7.不同ISS对南美白对虾血清杀菌活性的影响


注*P＜0.05，**P＜0.01，n＝41.4适合于水产动物鱼虾免疫激活作用的ISS的比较与选择综合上述不同ISS对鱼虾免疫激活效应的研究结果，选择出了同时对鱼虾具有显著免疫激活作用的ISS序列共10条，即1826、2006、1670、1668、1651、1681、1669、2133、2102和2143，因此，将这10条序列作为含多拷贝ISS序列质粒和工程菌构建的序列。
实施例2、含多拷贝(90 CpG基序)ISS质粒的构建2.1含18CpG串联序列的pYES2载体(pYES2-18CpG)的构建将实施例1中得到的10条ISS(含18CpG基序)依次串联起来，并在3’末端引入Xho I位点，串联的DNA链全长226bp，由上海英俊生物技术公司合成，并定向克隆于pMD18-T载体，克隆后的质粒称pMD18-T/18CpG，包含10条ISS序列共18个CpG基序(见图1)，然后用Xho I(位于18CpG)、Sal I(位于pMD18-T)对pMD18-T/18CpG进行双酶切，与Xho I单酶切的载体pYES2进行连接，转化大肠杆菌。连接和转化方法按照《分子克隆实验指南》进行。阳性重组子用Hind III/Xba I双酶切和PCR方法进行鉴定，PCR鉴定引物如下上游引物5’-AAAACCCCGGATCGGACTAC-3’下游引物5’-GGGAGGGCGTGAATGTAAGC-3’2.2含多拷贝CpG基序的质粒(pYES2-90CpG)构建18CpG插入pYES2的Xho I位点后，同尾酶Sal I/Xho I连接处“焊死”，不再被Sal I和Xho I所识别；而另一端仍是Xho I酶切位点。利用Sal I、Xho I同尾酶的这一特性，经过一系列的酶切、连接和片段串联策略，将18CpG五次重复重组于载体pYES2中，构建成含90个CpG基序的串联子质粒载体(pYES2-90CpG)，并转化大肠杆菌，用HindIII/XbaI双酶切和PCR方法进行鉴定(双酶切鉴定结果如图2所示)，并由Invitrogen公司对pYES2-90CpG进行测序。pYES2-90CpG的构建过程如图3所示。
实施例3、含pYES2-90CpG质粒的酵母工程菌构建3.1重组质粒电转化酵母细胞碱裂解法抽提少量质粒，方法参见《分子克隆实验指南》。制备酵母感受态细胞，方法如下挑取YPD培养基中一单克隆INVSC1于2mlYPD液体培养基中，30℃，250～300rpm振荡培养过夜；取少量SC悬浮液涂SC平板，鉴定表型；取200ul接种至100ml含YPD培养基的三角摇瓶中，30℃，250～300rpm振荡培养过夜至OD600为1.3～1.5；细胞冰浴15min，终止生长；4℃3000rpm 5min离心收集细胞，用100ml预冷的无菌水重悬；4℃3000rpm 5min离心收集细胞，用50ml预冷的无菌水重悬；4℃3000rpm 5min离心收集细胞，用4ml预冷的1M山梨醇重悬；4℃2000rpm 5min离心收集细胞，用100ul预冷的1M山梨醇重悬，终体积约为200～300ul，按40ul/管分装，4℃，保存一周；获得酵母感受态细胞后，用电脉冲转化方法将重组质粒转入酿酒酵母，方法如下将40ul酵母悬浮液与小于5ul质粒DNA混合于预冷的电穿孔管(0.2cm)，轻摇管底，以确保样品与铝管两侧接触，冰浴5min；脉冲参数V＝1.5kV，25uF，200 Ohms，4-5ms；电转化后立刻加1ml预冷的1M山梨醇，用无菌移液管转移至无菌eppendorf管；涂布SC-U培养基中选择培养，每200ul涂布一块平板；将平板至于30℃培养，直至单个菌落出现。
此菌落即为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(INVSC1-ODN5)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2006年10月19日，保藏号CGMCC 1846。
3.2筛选阳性转化子用酵母质粒小提试剂盒提取酵母质粒DNA(天为时代，DP112)。将得到的酵母质粒重新转化大肠杆菌，碱裂解法抽提质粒(方法参见《分子克隆实验指南》)，PCR检测阳性转化子。
实施例4含多拷贝ISS质粒pYES2-90CpG对鱼类免疫的激活作用碱裂解法(方法参见《分子克隆实验指南》)抽提Top10-pYES2-90CpG菌株质粒或酿酒酵母菌中的质粒pYES2-90CpG(天为时代，DP112)，分光光度计测定质粒DNA纯度及浓度，100℃煮沸10min，冰浴冷却10min，使DNA变性为单链，置-20℃保存备用。然后分离鲈鱼和鲫鱼的巨噬细胞(方法同实施例1)和外周血淋巴细胞(PBL)，分离PBL的方法为用加肝素的注射器从鲈鱼、鲫鱼尾部静脉抽取血液，按血液与淋巴细胞分离液(密度1.077±0.002)之比1∶2，注入已灭菌的离心管中，400g离心30min后收集细胞，用Hanks’液和RPMI1640培养液各洗涤一次，500g离心10min，加入RPMI1640培养液调整至106个/ml，按每孔200μl接种于96孔细胞培养板，27℃培养。
将培养好的巨噬细胞和外周血淋巴细胞加入含90个ISS序列拷贝的pYES2-90CpG质粒(pYES2-90CpG ISS)，终浓度分别为1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml和100μg/ml，并设对照组、阴性组和阳性组(外周血淋巴细胞)，27℃分别诱导24小时(巨噬细胞)、3天(外周血淋巴细胞)后收集细胞进行测定。
4.1免疫细胞的活性测定巨噬细胞O2-测定和杀菌力测定同实施例1，外周血淋巴细胞(PBL)增殖转化试验做法如下淋巴细胞经上述方法处理后，弃去RPMI1640培养液，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，继续培养4-8h，弃去MTT，细胞经PBS洗涤一次，再用200μl DMSO溶解沉淀物，充分混匀后，用酶标仪在490nm波长下测定OD值。细胞增殖转化率用刺激指数(StimulatingIndex，SI)表示，SI为刺激后的细胞OD值与未经刺激的细胞OD值之比。
结果显示，pYES2-90CpG ISS诱导巨噬细胞时，在低浓度1μg/ml经过24h作用，没有检测到诱导组和对照组细胞的差异；但从10μg/ml逐渐增加至100μg/ml时，与对照组相比，O2-水平显著增加(*p＜0.05或**p＜0.01)，并且随着pYES2-90CpG ISS浓度的增加，变化增大，刺激MΦ活性呈剂量依赖效应。pYES2-90CpG ISS诱导鲈鱼、鲫鱼巨噬细胞氧自由基活性的最低有效浓度分别为10μg/ml和50μg/ml。而pYES2空质粒只有在浓度达到50、100μg/ml时，才能刺激鲈鱼MΦ产生少量O2-(*p＜0.05)，但明显低于pYES2-90CpGISS诱导组，而对鲫鱼MΦ产生O2-的影响不明显。说明pYES2-90CpG ISS对鲈鱼、鲫鱼巨噬细胞O2-产生的作用主要来自90CpG序列，而且鲈鱼巨噬细胞对90CpG更敏感(图4)。
在巨噬细胞杀菌力测定实验中，细菌数量由每孔105减少到104甚至103，诱导组的KI曲线逐渐上升，斜率增大，反映了巨噬细胞的吞噬杀菌能力逐渐增强，而正常对照组和阴性对照组中，KI曲线平缓，斜率接近于0，吞噬杀菌能力无明显变化，且数值始终低于诱导组KI值。这说明正常细胞和经50μg/ml pYES2处理的细胞，其杀菌能力明显不如pYES2-90CpG ISS处理的细胞(图5)。
外周血淋巴细胞的增殖效应由刺激指数(SI)表示，结果显示，pYES2-90CpG ISS在1、10、50μg/ml浓度体外分别诱导鲫鱼外周血淋巴细胞3d后，没有检测到诱导组和对照组(RPMI 1640培养基处理)SI值的明显差异。但浓度达到100μg/ml后，诱导组的SI值显著增加(**p＜0.01)，反映了外周血淋巴细胞明显增殖，而空质粒作用时SI值并无明显变化，接近1(图6a)；在鲈鱼PBL体系中，当pYES2-90CpG ISS达到10、50μg/ml时，SI值极显著上升(**p＜0.01)，甚至高于10μg/ml LPS处理的阳性组，而空质粒作用时仍无明显变化。可是，高浓度的pYES2-90CpG ISS(100μg/ml)处理的鲈鱼淋巴细胞SI值反而下降(图6b)。这说明，pYES2-90CpG ISS在适当的浓度下，能显著促进鱼类外周血淋巴细胞的增殖。
4.2 pYES2-90CpG ISS体内诱导鲫鱼免疫相关因子的表达鲫鱼背鳍皮下注射pYES2-90CpG质粒，每尾按50μg/500g体重剂量；对照组注射等体积的PBS液；阳性组注射polyIC，每尾2mg，48h后用RT-PCR方法检测Mx和NKEF、TNF-α等基因的表达。总RNA提取使用用TRizol(Gibco BRL，USA)，提取方法按说明书进行，然后用逆转录试剂盒RNA PCR kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa，USA)进行逆转录和PCR扩增。引物序列如表8所示。扩增产物用电泳进行鉴定，鉴定结果如图7所示，诱导组NKEF、TNF-α的表达量与正常对照组相比，表达量显著增加；I型IFN诱生蛋白Mx在正常机体中是不表达的，但鱼体经pYES2-90CpG ISS注射诱导后，Mx表达；MHC II属于组成型表达，PCR扩增结果显示，不论是正常头肾还是经诱导的头肾，都扩增到MHC IIβ片段，且在诱导组中表达量增高。pYES2-90CpG ISS与ployIC(阳性对照)诱导的上述四种基因表达量相似。
表8免疫相关因子表达检测所用引物

实施例5含多拷贝ISS质粒pYES2-90CpG对南美白对虾天然免疫的影响按照实施例4中的方法得到pYES2-90CpG质粒，由PBS配制的相应浓度(5、10、20μg/ml)，注射南美白对虾。同时设对照组(注射PBS)和阴性组(注射pYES2)，每尾注射20μl。6、12和24小时后采血，制备血清样品，按照实施例1中的方法测定溶菌酶(LSZ)活力、酚氧化酶(PO)活力和抗菌活力，各免疫指标重复4次试验。
结果显示，对虾注射不同浓度的pYES2-90CpG ISS后，其血清PO活性均有显著提高(*p＜0.05或**p＜0.01)，呈剂量依赖效应，浓度达到20μg/ml时，酶活性趋于平缓，见图8(a)；10μg/ml的pYES2-90CpG ISS在注射对虾6h后PO活性无显著变化，而注射12h后显著增强，见图8(b)。注射空质粒的对虾血清PO活性与对照组相近，无明显变化。
经5、10、20μg/ml的pYES2-90CpG ISS注射对虾12h后血清溶菌酶(LSZ)活力均显著增强(*p＜0.05或**p＜0.01)，有效刺激浓度为10～20μg/ml，见图9(a)；其中10μg/ml的pYES2-90CpG ISS在注射对虾12h后，LSZ活性显著增强，见图9(b)。而注射空质粒的对虾血清LSZ活性上升平缓，与对照组(PBS注射)相近，直至注射对虾24h后才有显著变化，见图9(a.b)。这与血清PO活性变化趋势基本一致，说明pYES2-90CpG ISS注射南美白对虾，可显著提高其血清免疫酶活性。
在抗菌力测定中，10和20μg/ml的pYES2-90CpG ISS注射组，其血清在与细菌共培养1h后就产生抑菌能力，且抑菌作用随着作用时间的延长，更为明显。这表明诱导组血清具有显著的抗菌活性，与血清免疫酶活性的结果基本符合(图10)。
实施例6 pYES2-90CpG ISS对养殖鱼虾病害的免疫防治作用6.1鱼类病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定6.1.1注射方式试验实验分7组，每组20尾，对照组在背鳍处皮下注射空白PBS，试验组在背鳍处皮下分别注射1、5、10、20、30和40μg pYES2-90CpG ISS，每隔12小时注射一次，连续注射3次，在最后一次注射12小时后，人工感染鲈鱼皮肤溃疡病致病菌(哈氏弧菌，VibrioHarveyi)，背鳍处肌肉注射，细菌剂量为3×107/尾，维持水温20～25℃，1周后统计发病死亡率，试验重复4次，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率(Relative Percent Survival，RPS)，RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
结果显示，四组人工感染病原菌的发病死亡率达到100％，而注射不同浓度pYES2-90CpG ISS的试验组均得到不同程度的免疫保护作用，注射1μg/尾的试验组，其发病死亡率比对照组下降15％，注射5μg/尾的试验组，发病死亡率下降30％，而注射10～40μg/尾的实验鱼，发病死亡率下降46.25％～48.75％，但在注射10、20、30和40μg/尾的试验组间，发病死亡率下降的差异并不显著，表现为10μg/尾的注射剂量，就可以达到较高的保护率，而随着剂量的增加，保护率不再进一步增加，因此可以认为，10μg/尾的注射剂量是注射方式的合适剂量(表9)。
表9.鱼类病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定(注射方式)


6.1.2灌注口服方式试验实验分7组，每组20尾，对照组灌注口服空白PBS，试验组分别灌注口服1、5、10、20、30和40μgpYES2-90CpG ISS序列，每隔12小时灌注口服一次，连续灌注口服3次，在最后一次灌注12小时后，人工感染鲈鱼皮肤溃疡病致病菌哈氏弧菌，背鳍处肌肉注射，细菌剂量为3×107/尾，维持水温20～25℃，1周后统计发病死亡率，试验重复4次，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率RPS。
结果表明，空白PBS的四组对照组，其人工感染发病死亡率为100％，而灌注口服不同浓度pYES2-90CpG ISS的试验组与注射方式相似，也均得到不同程度的免疫保护作用，其中灌注口服1μg/尾的试验组，其发病死亡率比对照组下降5％，灌注5μg/尾的试验组，发病死亡率下降16.2％，灌注10μg/尾的试验组，发病死亡率下降28.75％，而灌注20、30和40μg/尾的实验鱼，发病死亡率分别下降了38.75％和37.5％，结果显示20μg/尾的灌注口服剂量，可以达到较高的保护率，而随着剂量的增加，保护率不再进一步增加，因此可以认为，20μg/尾的灌注口服剂量是合适剂量(表10)。
表10.细菌病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定(灌注口服方式)

6.1.3饲料添加方式试验将pYES2-90CpG ISS添加入饲料，每克饲料分别含ISS 1、5、10、20、30、40微克，实验分7组，每组20尾，对照组饲喂不含pYES2-90CpG ISS的正常饲料，试验组分别饲喂每克含1、5、10、20、30和40μg pYES2-90CpG ISS序列的饲料，每天饲喂2次，连续饲喂5天，然后人工感染鲈鱼皮肤溃疡病致病菌哈氏弧菌，背鳍处肌肉注射，细菌剂量为3×107/尾，维持水温20～25℃，1周后统计发病死亡率，试验重复4次，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率RPS。
结果表明，正常对照组鲈鱼经人工感染，其发病死亡率为97.5％，而饲喂含不同浓度pYES2-90CpG ISS饲料的试验组均得到不同程度的免疫保护，其中含1μg/克pYES2-90CpGISS的试验组，其发病死亡率比对照组下降2.5％，5μg/克的试验组，发病死亡率下降13.75％，10μg/克的试验组，发病死亡率下降18.75％，而20、30和40μg/克的试验组，发病死亡率分别下降了23.75％和22.50％，结果显示，以20μg/克的添加剂量，可以达到较高的保护率，而随着剂量的增加，保护率不再进一步增加，因此可以认为，20μg/克添加剂量是合适剂量，该结果与上述直接灌注口服的效果相一致(表11)。
表11.细菌病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定(饲料添加方式)

6.2鱼类病害防治中ISS药效时间的测定将pYES2-90CpG ISS添加入鲈鱼配合饲料，剂量为每克饲料含20微克，分别连续饲喂鲈鱼3、5、10和15天，每天2次，按鲈鱼体重的0.6％，然后分别在饲喂后的第5、10、15、30和60天人工感染试验，背鳍处肌肉注射哈氏弧菌，感染剂量为3×107/尾，维持水温20～25℃，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率RPS，每组实验鱼20尾，试验重复3次，同时设饲喂正常饲料的对照组。
结果显示，连续饲喂pYES2-90CpG ISS 3天和5天的实验组，其发病死亡率在停止喂药10天后显著下降，而连续饲喂10天和15天的实验组，其发病死亡率在停止喂药约20天后显著下降，表明pYES2-90CpG ISS的免疫保护作用与其在体内维持的时间有关，连续饲喂3～5天，可维持药效10天左右，而连续饲喂10～15天，可维持药效20～30天左右(表12)。
表12.鱼类病害防治中pYES2-90CpG ISS药效时间的测定

6.3对虾病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定采用饵料添加方式进行试验，将pYES2-90CpG ISS序列添加入配合饵料，每克饵料分别含pYES2-90CpG ISS 1、5、10、20、30、40微克，实验对虾分别采用中国对虾和南美白对虾。实验分7组，每组100尾，对照组饲喂不含pYES2-90CpG ISS的正常饵料，试验组分别饲喂每克含1、5、10、20、30和40μg pYES2-90CpG ISS序列的饵料，每天饲喂2次，连续饲喂5天，然后人工感染白斑综合症病毒(WSSV)。病毒感染采用投喂毒饵的方法进行，每天早晚各一次，连续投喂3天，维持水温20～25℃，1周后统计发病死亡率，计算相对免疫保护率RPS，试验重复3次。
结果表明，正常对照组中国对虾和南美白对虾经人工感染WSSV，其发病死亡率分别为100％和90.67％，而饲喂含不同浓度pYES2-90CpG ISS饵料的试验组均得到不同程度的免疫保护，其中中国对虾试验组，含1μg/克pYES2-90CpG ISS试验组的发病死亡率比对照组下降5.67％，5μg/克的试验组，发病死亡率下降12.67％，10μg/克的试验组，发病死亡率下降17.66％，而20、30和40μg/克的试验组，发病死亡率分别下降了21.67％、21.33％和20.67％(表13)；南美白对虾试验组，也得到相似结果，表现为含1μg/克pYES2-90CpGISS试验组的发病死亡率比对照组下降6.34％，5μg/克的试验组，发病死亡率下降13.34％，10μg/克的试验组，发病死亡率下降17.34％，而20、30和40μg/克的试验组，发病死亡率分别下降了22.34％、20.34％和21.01％；上述结果显示，以20μg/克的添加剂量，可以达到较高的保护率，而随着剂量的增加，保护率不再进一步增加，因此可以认为，20μg/克添加剂量是合适剂量，该结果与鲈鱼中的结果相类似(表14)。
表13.中国对虾病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定(饲料添加方式)

表14.南美白对虾病害防治中pYES2-90CpG ISS最适剂量的测定(饲料添加方式)

6.4对虾病害防治中pYES2-90CpG ISS药效时间的测定将pYES2-90CpG ISS序列添加入对虾配合饵料，剂量为每克饵料含20微克，分别连续饲喂中国对虾3、5、10和15天，每天2次，然后分别在投喂后的第5、10、15、30和60天进行人工感染WSSV试验，感染采用投喂毒饵的方法进行，方法同前，维持水温20～25℃，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率RPS，每组实验虾100尾，试验重复3次，同时设饲喂正常饵料的对照组。
结果显示，连续饲喂pYES2-90CpG ISS 3天和5天的实验组，其发病死亡率在停止喂药15天后显著下降，而连续饲喂10天的实验组，其发病死亡率在停止喂药20天后显著下降，连续饲喂15天的实验组，发病死亡率在停止喂药30天后显著下降，表明pYES2-90CpG ISS的免疫保护作用与其在虾体内的维持时间有关，连续饲喂3～5天，可维持药效10天左右，而连续饲喂10～15天，可维持药效20～30天左右(表15)。
表15.对虾病害防治中pYES2-90CpG ISS药效时间的测定

6.5 pYES2-90CpG ISS对鲈鱼哈氏弧菌疫苗的免疫佐剂效应分析首先制备疫苗花鲈皮肤溃疡病致病菌哈氏弧菌(Vibrio Harveyi)由本实验室保存，用常规福尔马林灭活法制备哈氏弧菌全细胞疫苗，福尔马林浓度0.5％(V/V)，灭活时间36小时，弧菌经灭活后，用PBS洗涤3次，4000rpm 30分钟沉淀收集菌体，-20℃保存备用。
pYES2-90CpG ISS对哈氏弧菌疫苗的免疫佐剂效应分析实验方法如下实验分9组，每组20尾，其中3组为接种空白PBS的对照组，3组为分别单独接种疫苗的试验组，采用腹腔注射接种，疫苗浓度5×108细菌/ml，接种量0.2ml/尾，另3组在接种疫苗的同时，接种pYES2-90CpG ISS序列，背鳍处皮下肌肉注射，剂量为20μg/尾，第一次免疫30天后，进行第二次免疫，同时再注射一次pYES2-90CpG ISS。50天后从尾柄静脉采取少量血样，制备血清，测定血清凝集抗体效价，每组随机测定5尾，凝集反应用灭活的哈氏弧菌进行，将血清作2倍连续稀释，以能产生凝集反应的最高稀释度作为凝集抗体效价，同时进行人工感染攻毒试验，从背鳍处肌肉注射哈氏弧菌，剂量为3×107/尾，维持水温20～25℃，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率(Relative Percent Survival，RPS)，RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
结果显示，pYES2-90CpG ISS序列能有效提高鱼类细菌疫苗的免疫保护力，增强抗体的效价，与正常免疫组相比，使用pYES2-90CpG ISS的实验组的保护率增加了11.66％，抗体效价增加1.52倍，表明pYES2-90CpG ISS序列是一种有效的鱼类疫苗佐剂(如表16和表17所示)。
表16.pYES2-90CpG ISS对哈氏弧菌疫苗的免疫佐剂效应分析

表17.pYES2-90CpG ISS对血清凝集抗体活性的影响

实施例7 pYES2-90CpG ISS对养殖鱼虾病害防治的应用试验7.1含pYES2-90CpG ISS序列的酵母工程菌制备工程菌用10L发酵罐进行小规模发酵，挑取单菌落种子工程菌，加入200ml SC-U培养基中，30℃振荡培养过夜；取培养物测OD600值，按发酵培养基初始OD值需达到0.4的剂量计算在10L发酵培养基中所需接种的培养物量。4℃ 1500g离心收集种子细胞，用适量发酵培养基悬浮后，接种入发酵罐中，30℃发酵培养14小时。发酵后酵母细胞采用离心法(5000rpm，20min)沉淀收集，15～25kHz超声破碎，100℃水浴处理5分钟，4℃冰浴冷却，25～30℃气流干燥，制成酵母菌粉。同时取适量酵母菌，用酵母质粒小提试剂盒提取酵母质粒DNA，紫外分光光度法测定浓度。按每公斤鱼虾人工配合饲料含20mgpYES2-90CpG ISS的剂量，添加含pYES2-90CpG ISS的酵母工程菌粉(pYES2-90CpG ISS在酵母中的重量含量一般可达到6％左右，则在每公斤鱼虾人工配合饲料中添加165mg左右的酵母菌粉)。
7.2病害防治试验试验在6～9月份进行，将养殖鲈鱼和南美白对虾的网箱分别分别分成6组，其中3组网箱为试验组，3组为对照组，试验组饲喂添加了pYES2-90CpG ISS的抗病饲料，对照组饲喂不含pYES2-90CpG ISS的正常饲料(添加正常酵母粉)，连续投喂4周，统计自然发病死亡率，计算免疫保护率RPS。
结果如表18和19所示，使用含pYES2-90CpG ISS抗病饲料的实验鱼虾组，成活率分别提高21.74％和20.12％，免疫保护率分别达到66.57％和64.45％，表明pYES2-90CpG ISS能明显提高鱼虾的免疫抗病能力。
表18养殖鲈鱼抗病试验结果

表19养殖南美白对虾抗病试验效果表


最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO.1accgatgtcg ttgccggtga cgtccatgtc gttcctgatg cttcgtcgtt ggttgtcgtt60ttggttcgtc gttttgacgt tttgtcgttt tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtttcgtcg120ttttgtcgtt ttgtcgtttc catgacgttc ctgacgttac cgataacgtt gccggtgacg180tccatgacgt tcctgatgct tccatgacgt ccctgatgct ctcgag22权利要求
1.一种用于水产动物病害防治的串联序列，其特征在于该序列含有18CpG基序，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种利用如权利要求1所述的串联序列衍生的序列，其特征是所述衍生序列为含有至少2个拷贝的18CpG基序的串联序列。
3.一种重组质粒，其特征在于该重组质粒含有5个拷贝的SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
4.一种含有权利要求3所述的重组质粒的工程菌，其特征是所述菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(INVSCl-pYES2-IFN)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2006年10月19日，保藏号CGMCC 1847。
5.如权利要求1所述的序列在水产动物病害防治中的应用。
6.如权利要求2所述的衍生序列在水产动物病害防治中的应用。
7.如权利要求3所述的重组质粒在水产动物病害防治中的应用。
8.如权利要求4所述的工程菌在水产动物病害防治中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于水产动物病害防治的串联序列，该序列含有18CpG基序，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种利用上述串联序列衍生的序列，该衍生序列为含有至少2个拷贝的18CpG基序的串联序列。本发明还公开了一种重组质粒，该重组质粒含有5个拷贝的SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。本发明还公开了一种保藏号CGMCC 1847的工程菌。本发明还公开了上述串联序列、衍生序列、重组质粒和工程菌在水产动物病害防治中的应用。
文档编号A61K48/00GK1970772SQ200610154980
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月1日 优先权日2006年12月1日
发明者邵健忠, 胡向东, 项黎新, 彭博, 陈颖 申请人:浙江大学, 浙江皇冠科技有限公司