连接效应分子与蛋白质的方法

专利名称：连接效应分子与蛋白质的方法
连接效应分子与蛋白质的方法本发明涉及连接效应分子与蛋白质的方法，且更具体地说，提供 了一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的位点特异性 连接的改进的方法。带有连接的效应分子的蛋白质用于许多不同目的，既包括诊断应 用，又包括治疗应用。例如，抗体可变区的高度特异性和亲和力使得它们成为理想的诊断和治疗剂，特别是用于调节蛋白质蛋白质相互 作用。在Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab)2和其它抗体片段中编码的靶向功能 可以与一个或多个效应分子，诸如细胞毒性药物、毒素或聚合物分子 结合以便增加功效。例如，由于这些片段缺乏Fc区，所以它们在动物 中具有短的循环半衰期，而这一情况可以通过结合某些类型的聚合物， 诸如聚乙二醇(PEG)得以改善。已经证实增加结合的PEG的大小使循环 半衰期从数分钟增加到多个小时并且已经证实了使用5kDa - 100kDa 的PEG修饰Fab' (Chapman等，1999， Nature Biotechnology, 17， 780-783; Leong等，2001， Cytokine, 16， 106-119; Chapman, 2002， Advanced Drug Delivery Reviews, 54， 531-545)。聚乙二醇化的抗 体片段，诸如CDP870目前正在进行临床试验，其中结合的PEG的作用 使得循环半衰期对治疗而言达到了可接受的水平。人工引入的蛋白质中的反应基团与蛋白质连接。这类基团包括胺类(赖 氨酸)、硫醇类(半胱氨酸、甲硫氨酸)、酚类(酪氨酸)、羧酸类(天冬氨酸、谷氨酸)或其它氨基酸侧链。效应分子的连接位点可以是随机的 或位点特异性的，不过，通常优选位点特异性连接。来自含硫的氨基酸半胱氨酸的巯基残基为常用的可以用于选择 性偶联效应分子与蛋白质的反应基团。例如，效应分子与抗体的位点 特异性连接最常见的是通过连接半胱氨酸残基实现的，因为这类残基
在抗体片段中相对不常见。抗体铰链区为位点特异性连接的普通区， 因为它们包含半胱氨酸残基并且远离可能参与抗原结合的抗体的其它区。合适的铰链区天然存在于片段中或可以使用重組DNA技术生成(例 如，参见US 5， 677， 425; WO 98/25971; Leong等，2001 Cytokine, 16， 106-119; Chapman等，1999 Nature Biotechnology, 17， 780-783)。 或者可以将位点特异性半胱氨酸改造进入抗体片段，以例如，形成表 面暴露的半胱氨酸(US 5,219, 996)。如果效应分子通过半胱氨酸进行位点特异性连接，那么蛋白质中 的乾巯基通常被小的发酵相关肽产物，诸如谷胱甘肽封端或有意地被 蛋白质(例如抗体片段)提取和纯化过程中的化学添加剂，诸如5,5'-二硫代双(2-硝基苯曱酸)(DTNB)封端。需要除去这些封端剂以便在连 接效应分子前活化靶巯基。在许多情况中，需要选择性活化一个或多个靶半胱氨酸，以便在不还原蛋白质中其它半胱氨酸的情况下进行效 应分子连接。例如，抗体Fat/片段在重链与轻链恒定区(CHl与CJ之间具有天然链间二硫键，且由此以便选择性还原抗体中的另外处，例 如铰链区的耙半胱氨酸，还原必须在一定谨慎条件下进行，使得CL: CH1 间二硫键保持完整并且避免效应分子与链间半胱氨酸连接。因此，"适 度，，还原条件常用于除去巯基封端剂并且在与效应分子反应前活化靶 巯基。这种适度还原通常通过孵育抗体片段与基于巯基的还原剂，诸 如P -巯基乙醇(P -ME) 、 P -巯基乙胺(P -MA)或二硫苏糖醇(DTT)实现 (例如，参见EP 0948544)。在还原并且与效应分子(在这些条件下)反 应后，大比例的抗体片段不具有任何连接的效应分子并且必须从具有 正确数量的连接的效应分子的抗体片段中纯化出它们。这种低效率的 效应分子连接在重要的是实现最高生产效率的修饰治疗抗体片段的大 规模生产过程中可能是一个缺陷。本发明提供了选择性连接一个或多个效应分子与蛋白质中一个 或多个半胱氨酸的改进的方法。在本发明的方法中，与现有技术的方 法相比，较大比例的蛋白质得以正确修饰，从而显著提高了效应分子 的连接效率。
因此，本发明提供了连接一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的方法，包括a) 通过对不能形成分子内二硫键的单巯基还原剂或多巯基还原 剂渗滤蛋白质来活化蛋白质中的一个或多个半胱氨酸；和b) 使处理的蛋白质与效应分子反应。本文所用的术语"蛋白质"包括含有可以用于效应分子连接的一 个或多个半胱氨酸的蛋白质，多肽及其片段。例如，可以修饰蛋白质 以便产生其变体和片段，只要必要时，所需的生物特性(例如结合靶位 点的能力)得以保留。例如，可以通过使用各种遗传工程或蛋白质工程 技术修饰蛋白质以便将半胱氨酸引入蛋白质，从而用作效应分子的连 接位点。因此，用于效应分子连接的半胱氨酸可以天然存在于蛋白质 中和/或可以通过重组DM技术进行改造进入蛋白质中。因此，根据蛋 白质的预期应用和所需效应分子的数量的不同，得到具体地控制可用 于连接效应分子的半胱氨酸的数量和位置。合适的蛋白质的实例包括，但不限于酶；激素；抗体；受体； 生长因子；血清蛋白，诸如白蛋白、脂蛋白和血纤蛋白原；纤维蛋白 溶酶，诸如组织纤溶酶原激活物(t-PA)、链激酶和尿激酶；生物反应 调节物，诸如白细胞介素、干扰素和集落刺激因子；红细胞生成素； 和肽激素，诸如黄体生成素、生长激素、胃泌素、促卵胞激素、TSH、 ACTH、 IGF结合蛋白；可溶性受体，诸如IL-1R、 TNFR、 IL-17R等。优选本发明方法中效应分子所连接的蛋白质为抗体或其片段。本 文所用的术语"抗体"是指完整抗体及其功能活性片段或衍生物，其 可以为，但不限于多克隆、单克隆、人源化或嵌合抗体、单链抗体、 Fv、 Fab片段、Fab'和F(ab')2片段以及任何上述的表位结合片段。合 适的抗体片段的另外的实例还包括WO 2005003169 、 WO 2005003170 和WO 2005003171中所述的那些抗体片段。优选用于本发明的蛋白质 为Fab'片段。因此，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部 分，即含有特异性结合抗原的抗原结合部位的分子。本发明的免疫球 蛋白分子可以属于任何类别(例如IgG、 IgE、 IgM、 IgD或IgA)或免疫 球蛋白分子的亚类并且可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、 鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼羊、山羊或人。人源化抗体为具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(例如，参见US 5， 585， 089)。嵌合抗体为那些由免疫球蛋白基因编码的抗体，所述的免疫球蛋 白基因已经被遗传改造，使得轻链和重链基因由属于不同物种的免疫 球蛋白基因区段组成。优选重链和轻链恒定区为人的而可变区来源于 另一物种。可以通过本领域中公知的任何方法制备单克隆抗体，诸如杂交瘤 技术(Kohler & Milstein， 1975， 256， 495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，/迈迈"/7o7og7 1983， 4， 72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，"Monoclonal Antibodies和 Cancer Therapy", pp. 77-96， Alan R. Uss， Inc., 1985)。还可以通过任何其它合适的方法获得抗体，诸如那些描述在 Babcook， J.等，/Voc. yVa〃. Jcad. Sc/. 〃W, 1996， 93 (15)， 7843-7848、 W0 92/02551、 WO 2004/051268和W0 2004/106377中的 方法。可以使用任何合适的酶切割和/或消化技术，例如通过使用胃蛋 白酶处理从任何完整的抗体，尤其是完整的单克隆抗体中获得抗体片 段。或者或此外，可以通过使用重组DM技术，包括操作和重新表达 编码抗体可变和/或恒定区的DNA来制备抗体片段。可以使用标准分子 生物学技术来修饰、添加或缺失所需的氨基酸或结构域。对可变或恒 定区的任何改变仍然包括在本文所用的术语"可变"和"恒定"区中。(例如，参见Boss等，US 4， 816， 397; Cabilly等，US 6,331,415; Shrader等，W0 92/02551; Ward等，1989， Nature, 341, 544; Orlandi 等，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 3833; Riechmann等，1988， Nature, 322, 323; Bird等，1988, Science, 242， 423; Queen等， US 5,585,089; Adair， WO91/09967; Mountain和Adair, 1992， Biotechnol. Genet. Eng. Rev， 10， 1-142; Ve纖等，1998， Journal of Immunological Methods, 216， 165-181)。用于本发明的抗体和抗体片段可以具有天然或修饰的铰链区，其 包含可以用作效应分子连接位点的一个或多个半胱氨酸。天然铰链区 为通常与抗体分子的CH1结构域结合的铰链区。修饰的铰链区为在长 度和/或组成方面不同于天然铰链区的任何铰链区。这类铰链区可以包 括来自其它物种的铰链区，所述的其它物种诸如人、小鼠、大鼠、兔、 鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼羊或山羊的铰链区。其它修饰的铰链 区可以包含来源于不同类别或来自CH1结构域类别的亚类抗体的完整 铰链区。因此，例如，Yl类别的CJ结构域可以与y4类别的铰链区 连接。或者，修饰的铰链区可以包含部分天然铰链区或重复单元，其 中重复中的各单元来源于天然铰链区。在另一个备选方案中，可以通 过将一个或多个半胱氨酸或其它残基转化成天然残基，诸如丝氨酸或 丙氨酸，或通过将适当定位的残基转化成半胱氨酸残基来改变天然铰 链区。通过这类方式，铰链区中半胱氨酸的数量可以得到增加或减少。 其它修饰的铰链区可以为完全合成的并且可以被设计成具有所需特 性，诸如长度、半胱氨酸组成和挠性。例如，在US 5， 677， 425、WO 9915549、WO 9825971和W0 2005003171 中已经描述了许多修饰的铰链区，并且将这些文献引入本文作为参考。 在一个实例中，用于本发明的蛋白质为具有天然或修饰的铰链区的 Fab'片段。或者或此外，例如，可以将用于效应分子连接的位点特异性半胱 氨酸改造进入抗体或其片段，以便生成表面暴露的半胱氨酸(例如，参 见US 5， 219, 996和WO 2006034488)。因此，通过使用合适的改造技 术，可以改变抗体或其片段中的半胱氨酸数量以便为效应分子连接提供特定数量的位点。因此，在本发明的一个实施方案中，蛋白质为抗体FaV片段且 效应分子所连接的各半胱氨酸均位于铰链区中。在另 一个实施方案中，蛋白质为抗体Fab'或Fab片段且效应分子所连接的至少一个半胱氨酸 为改造的半胱氨酸，优选表面暴露的半胱氨酸。在一个实施方案中， 两个或两个以上效应分子与抗体FaV片段连接并且所述分子中的至 少一个与铰链区中的半胱氨酸连接。如果本发明的蛋白质为抗体或其片段，那么该抗体一般能够选择 性结合抗原。所述的抗原可以为任何细胞伴随抗原，例如，诸如细菌 细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞这类细胞上的细胞表 面抗原，或所述的抗原可以为可溶性抗原。抗原还可以为任何医学相 关抗原，诸如那些在疾病或感染过程中被增量调节的抗原，例如受体 和/或其相应的配体。细胞表面抗原的具体实例包括黏着分子，例如 整联蛋白，诸如P1整联蛋白，例如VLA-4; E-选择蛋白、P选择蛋白 或L-选择蛋白;CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD7、 CD8、 CDlla、 CDllb、 CD18、 CD19、 CD20、 CD23、 CD25、 CD33、 CD38、 C歸、0D45、 CDW52、 CD69; 癌胚抗原(CEA);人乳脂小球蛋白(HMFG1和2); MHC I类和MHC II类 抗原；和VEGF，且如果合适，还有其受体。可溶性抗原包括白细胞 介素，诸如IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-8、 IL-12、 IL-16或IL-17;病毒抗原，例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原； 免疫球蛋白，诸如IgE;干扰素，诸如干扰素a、干扰素P或干扰素y; 肿瘤坏死因子-a、肿瘤坏死因子-P;集落刺激因子，诸如G-CSF或 GM-CSF;和血小板衍生生长因子，诸如PDGF-a和PDGF-p，且如果合 适，还有其受体。在本发明的方法中，至少一个效应分子通过位于蛋白质中的半胱 氨酸残基的巯基共价连接。该共价键一般为二硫键、硫醚键，或特别 是硫-碳键。可以使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物， 诸如马来酰亚胺、吡啶基二硫代、乙烯基砜、硪乙酰基、溴乙酰基和 半胱氨酸衍生物。本文所用的术语"效应分子"包括，例如，抗肿瘤药、药物、毒 素(诸如细菌或植物来源的酶促活性毒素及其片段，例如蓖麻毒素及其
片段)；生物活性蛋白，例如酶；其它抗体或抗体片段；合成或天然存 在的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、 RNA及其片段；放射性核素， 特别是放射性碘、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团， 诸如荧光化合物或可以通过NMR或ESR光镨法检测的化合物。应该认 识到效应分子可以包含单一效应分子或两个或两个以上如此连接以便 形成可以使用本发明的方法与蛋白质连接的单一部分的这类分子。具体的抗肿瘤药包括细胞毒性和细胞生长抑制剂，例如烷基化 剂，诸如氮芥(例如苯丁酸氮芥、美法仑、双氯乙基甲胺、环磷酰胺或 尿嘧啶氮芥)及其衍生物；三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白 消安或顺铂；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、 阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟代乙酸或氟代柠檬酸；抗生素，诸如博来霉素(例如硫酸博来霉素)、多柔比星、柔红霉素、丝裂霉素(例 如丝裂霉素C)、放线菌素类(例如放线菌素D)、普卡霉素、刺孢霉素 及其4汙生物或esperamicin及其4汙生物；有丝分裂抑制剂，诸如依托泊 苷、长春新碱或长春碱及其衍生物；生物碱类，诸如椭圆玫瑰树碱； 多元醇类，诸如紫杉萜酯-I或紫杉萜酯-II;激素，诸如雄激素(例如 屈他雄酮或睾内酪)、黄体酮(例如醋酸甲地孕酮或醋酸甲羟孕酮)、雌 激素(例如二曱基己烯雌酚双磷酸酯、聚磷酸雌二醇或磷酸雌二醇氮芥) 或抗雌激素药(例如他莫昔芬)；蒽醌类，诸如米托蒽醌；脲类，诸如 羟基脲；肼类，诸如丙卡巴肼；或咪唑类，诸如丙卡巴肼。螯合金属包括具有2 - 8个(包括端点)配位数的二-或三价金属 的螯合物。这类金属的具体实例包括锝(Tc)、铼(Re)、钴(Co)、铜(Cu)、 金(Au)、银(Ag)、铅(Pb)、铋(Bi)、铟(In)、镓(Ga)、钇(Y)、铽(Tb)、 钆(Gd)和钪(Sc)。 一般而言，所述的金属优选为放射性核素。具体的 放射性核素包括^Tc、 186Re、 mRe、 58Co、 6°Co、 67Cu、 195Au、 199Au、 mAg、 203Pb、 2°6Bi、 2°7Bi、 mIn、 67Ga、 68Ga、 88Y、 9°Y、 "°Tb、 153Gd和47Sc。例如，螯合的金属可以为与任何合适的聚腺苷酸螯合剂螯合的上 述类型的金属之一，所述的聚腺苷酸螯合剂例如为非环状或环状多胺类、聚醚类(例如冠醚类及其衍生物)；聚酰胺类；卟啉类；和碳环衍生物。一般而言，螯合剂的类型将取决于使用中的金属。然而，本发明 的结合物中一组特别有用的螯合剂为非环状或环状多胺类，尤其是多氨基羧酸类，例如二亚乙基三胺五乙酸及其衍生物；和大环胺类，例 如环三-氮杂和四-氮杂衍生物(例如国际专利说明书WO 92/22583中所 述)；和聚酰胺类，尤其是去铁草酰胺及其衍生物。其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。所关注的酶包括，但不限于 蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。所关注的蛋白质、 多肽和肽包括，但不限于免疫球蛋白；白蛋白；毒素，诸如相思豆 毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌内毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如胰岛 素、肺瘤坏死因子、oc-干扰素、p-干扰素、神经生长因子、血小板 衍生生长因子或组织纤溶酶原激活物；血栓形成剂或抗血管生成剂， 例如制管张素或内皮抑制素；或生物反应调节物，诸如淋巴因子、白 细胞介素-l (IL-1)、白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-6 (IL-6)、 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。其它效应分子可以包括例如在i貪断中有用的可检测物质。可检测 物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、 放射性核素、正电子发射金属(用于正电子成像术)和非放射性顺磁金 属离子。对于可以与用作诊断剂的抗体结合的金属离子一般参见美国 专利US 4， 741， 900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素、抗生物 素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、罗丹明红、 罗丹明绿、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、德克萨斯红、太 平洋蓝(Pacific blue)、马里那蓝(Marina blue)、俄勒冈绿(Oregon green)和Alexa Fluor系列350， 405， 430， 488， 500， 514， 532, 546， 555， 568， 594， 610， 633， 647， 660， 680， 700和750;合适的发 光物质包括鲁米诺；合适的生物发光物质包括萤光素酶、萤光素和水 母发光蛋白；且合适的放射性核素包括1251、 mI、川ln和"Tc。
用作效应分子的合成或天然存在的聚合物包括，例如，任选取代 的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化亚烷基聚合物或支链或非 支链多糖类，例如同-或杂-多糖，诸如乳糖、直链淀粉、葡聚糖、淀 粉或糖原。可以存在于上述合成聚合物上的具体可选取代基包括一个或多 个羟基、曱基或曱氧基。合成聚合物的具体实例包括任选取代的直链 或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任 选取代的聚(乙二醇)，诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。本文所用的"衍生物"意欲包括反应衍生物，例如巯基-选择性反应基，诸如ot-囟代羧酸或酯，例如碘乙酰胺；二酰亚胺，例如马来酰 亚胺，乙烯基砜或二硫化马来酰亚胺等。反应基可以直接与聚合物连 接或通过连接基部分与聚合物连接。可以理解该基团的残基在某些情 况中构成作为蛋白质与聚合物之间连接基的产物的组成部分。可以为直链或支链的聚合物的大小可以根据需要改变，但一般的 平均分子量范围为500Da - 100， OOODa,优选5， 000 - 40, OOODa，且更 优选10， 000 - 40， 000Da和20, 000 - 40, 000Da。聚合物的大小可以特 別基于产物的预期应用来选择，例如定位于某些组织，诸如肿瘤的能 力或延长的循环半衰期(就综述而言，参见Chapman, 2002， Advanced Drug Delivery Reviews, 54， 531-545)。因此，例如，如果打算使 产物脱离循环并且渗入组织，例如用于治疗肿瘤，那么使用小分子量 聚合物，例如具有约5，000Da分子量的聚合物可能是有利的。就产物 保留在循环中的应用而言，使用较高分子量的聚合物，例如具有 25， OOODa - 40， OOODa分子量的聚合物可能是有利的。特别优选的聚合物包括聚亚烷基聚合物，诸如聚(乙二醇)或尤其 是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物；且尤其是具有约10， OOODa-约 40， OOODa范围分子量的聚(乙二醇)或其衍生物。本发明的聚合物可以通过商购获得(例如购自NipponOil和Fats; Nektar Therapeut ics)或可以使用常规化学操作步骤由可商购的原料 制备。
在本发明的优选的方面中，与蛋白质连接的效应分子中的至少一个为聚合物分子，优选PEG或其衍生物。 一般就连接聚(乙二醇)(PEG) 部分而言，参照"Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992， J.Milton Harris (ed)， Plenum Press, New York; "Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997， J. Mi 1 ton Harris和S. Zalipsky (编辑)，American Chemical Society ， Washington DC 和 "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998， M. Aslam和A. Dent, Grove Publishers， NewYork。 在本发明的一个实例中，与蛋白质连接的各效应分子为PEG,该 蛋白质为抗体片段并且各PEG分子通过马来酰亚胺基与抗体片段中的 一个或多个巯基共价连接。在一个优选的实施方案中，所述的蛋白质 为抗体Fab'片段且PEG分子通过马来酰亚胺基与铰链区中的单个半胱 氨酸连接。PEG可以为直链或支链的。为了连接支链的PEG分子，赖 氨酸残基优选与马来酰亚胺基共价连接。与赖氨酸残基上的每个胺基 团优选连接曱氧基聚(乙二醇)聚合物。在一个实例中，每个聚合物的 分子量约为20， 000Da且整个聚合物分子的总分子量因此约为 40， 000Da。可以使用本文所述的方法同时或通过重复该方法依次〗吏两个或 多个效应分子与蛋白质中的半胱氨酸连接。优选如果使两个或多个效 应分子与蛋白质连接，那么应同时连接它们。本发明的方法还可以扩展至本文所迷的方法之前和/或之后的一 个或多个步骤，其中使用任何合适的方法，例如通过其它可利用的氨 基酸侧链，诸如氨基和亚氨基使另外的效应分子与蛋白质连接。可以 使用标准化学或重组DNA操作步骤使其它这类效应分子与蛋白质连 接，其中所述蛋白质与所述效应分子直接或通过偶联剂连接。用于使 这类效应分子与抗体结合的技术为本领域众所周知的(参见 Hellstrom等，Controlled Drug Delivery, 2nd Ed. ， Robinson等， eds.， 1987， pp. 623-53; Thorpe等，1982 , Immunol, Rev.，62: 119-58和Dubowchik等，1999， Pharmacology and Therapeutics， 83， 67-123)。具体的化学操作步骤包括例如那些描述在国际专利说 明书WO 93/0623KWO 92/22583、WO 90/09195、WO 89/01476、WO 9915549 和WO 03031581中的操作步骤。或者，如果效应分子为蛋白质或多肽， 那么可以使用重组DNA操作步骤，例如欧洲专利说明书第392745号中 所述的操作步骤实现连接。在本发明的方法中，在连接效应分子之前的步骤(a)中活化一个 或多个半胱氨酸。本文所用的术语"活化"是指产生步骤(b)中效应分 子所连接的每个半胱氨酸中的游离巯基的过程。在一个实例中，"活 化"是指除去与半胱氨酸结合的加合物，诸如谷胱甘肽。在另一个实 例中，"活化，，是指还原不同多肽链中的两个半胱氨酸之间的二硫键， 例如还原F(ab02的一个或多个铰链半胱氨酸之间的二石危键，以便活 化形成的FaV片段的铰链半胱氨酸。在一个实施方案中，通过除去与 半胱氨酸结合的加合物来活化Fab'片段的铰链半胱氨酸。在另一个实 施方案中，通过还原F(ab')2中两个这样的铰链半胱氨酸之间的二硫 键来活化Fab'片段的铰链半胱氨酸。优选在所述方法的步骤(a)中活化的每个半胱氨酸不在同一多肽内具有另一个半胱氨酸的二硫键上。例如，如果蛋白质为抗体或其片 段，那么在步骤(a)中活化的半胱氨酸优选不为重链的链间半胱氨酸、 CH1或轻链的链间半胱氨酸、G或重链或轻链的链间半胱氨酸。因此， 本发明提供了一种方法，由此效应分子可以有效和选择性地与特定的 半胱氨酸残基连接并且可以保留蛋白质内的其它所需的二硫键。在本发明的一个实施方案中，其中蛋白质为抗体FaV片段，该 方法的产物为抗体Fab'片段，其中效应分子与铰链区中的单个半胱氨 酸连接并且重链与轻链(CJ与CJ之间的链间二硫键得以保留。在另一个实施方案中，使用本发明的方法使两种或两种以上蛋白 质通过一个或多个效应分子连接。如果合适，可以使用合适的连接基 使可以为相同或不同的蛋白质通过一个或多个效应分子连接。在一个 实例中，可以通过包含共价连接的效应分子的链间桥连接二价抗体。 在一个这样的实例中，使用本发明的方法使两个Fab'片段通过合适的 连接基与PEG分子连接，以便产生多价抗体。在一个这样的实例中， 如WO 99/64460中所迷使两个Fab'片段与聚乙二醇化的二马来酰亚胺 桥交联以便产生DFM-PEG。通过对不能形成分子内二硫键的单巯基还原剂或多巯基还原剂 渗滤蛋白质来选择性地活化本发明方法的步骤(a)中的半胱氨酸。渗滤 为本领域中众所周知的技术并且常用于改变蛋白质样品中的緩冲液。 渗滤池为可商购的，例如Amicon搅拌池和Pall Centramate系统。通过保留蛋白质并且能够进行緩冲液更换的膜渗滤一般在緩冲液中的蛋 白质样品。随着时间的流逝，用新的緩冲液替代包含蛋白质的原始緩 沖液。在本发明中，术语"对不能形成分子内二硫键的单巯基还原剂 或多巯基还原剂渗滤，，是指蛋白质对含有合适的还原剂的溶剂，适宜 的是緩冲液的渗滤。该方法的步骤(a)—般在緩冲水溶液中进行，其实例包括，但不 限于磷酸盐或柠檬酸盐緩沖液。蛋白质可以在与渗滤緩冲液相同的緩 冲液中或它们可以是不同的。优选緩冲液的pH在2. 0-10. 0，更优选 4.0-7.0的范围内。在一个优选的实施方案中，緩冲液的pH在6.0 -7.0。该緩沖液可以任选地含有螯合剂，诸如EDTA、 EGTA、 CDTA或 DTPA。优选该緩沖液含有1 - 5mM，优选2mM的EDTA。或者或此外，该 緩沖液可以为螯合緩沖液，诸如柠檬酸、草酸、叶酸、N，N-二甘氨酸、 两性离子緩冲剂、tris或ADA。适用于本发明的还原剂为不能形成分子内二疏键的单巯基还原 剂和多巯基还原剂。用于本发明的单巯基还原剂为本领域中广为皆知的，其实例包 括，但不限于p-巯基乙胺、巯基乙醇、半胱氨酸和谷胱甘肽。优选用于本发明的单巯基还原剂为P-巯基乙胺。其它合适的还原剂包括不能形成分子内二硫键的多巯基还原剂。 本文所用的术语"不能形成分子内二硫键的多巯基还原剂"是指包含 不能在巯基之间形成分子内二硫键的两个或多个巯基的还原剂。这类
还原剂的实例如下所示:<formula>formula see original document page 16</formula>用于本发明的不适宜的还原剂为能够形成分子内二硫键的多巯 基还原剂，例如可以在其两个巯基之间形成分子内二硫键的二硫苏糖 醇。对本领域技术人员而言显而易见的是，可以通过确定在步骤(a) 中使用还原剂处理蛋白质后产生的游离巯基的数量或通过，例如经大 小排阻色谱法确定步骤(b)中连接的效应分子的数量来鉴定适宜的还 原剂。用于确定游离巯基的方法为本领域中众所周知的，例如，参见 Lyons等，1990， Protein Engineering, 3， 703。
还可以由本领域技术人员根据经验确定还原剂的合适的浓度。优选以0. 3 - 5raM，更优选0. 3 - 4mM，甚至更优选0. 3 - 3mM，更优选0. 3 -2mM的浓度使用还原剂。优选浓度为1， 1.5， 2， 2.5, 3， 3.5， 4， 4.5或5mM。优选还原剂的浓度较低，以便实现对靶半胱氨酸的选择性 活化。因此，在一个实施方案中，还原剂的浓度不超过5mM。在一个 实施方案中，还原剂的浓度不超过4mM。在一个实施方案中，还原剂 的浓度不超过3mM。在一个实施方案中，还原剂的浓度不超过2mM。在 一个实施方案中，还原剂的浓度不超过lmM。在本发明的一个实施方案中，在步骤(a)中的渗滤开始之前，蛋 白质样品中不存在还原剂并且通过渗滤使蛋白质与还原剂接触。因此， 在一个实施方案中，将还原剂仅掺入渗滤緩沖液中并且在该方法的步 骤(a)之前，在蛋白质样品中不存在还原剂。在另一个实施方案中，在步骤(a)中的渗滤之前，也将还原剂加 入到蛋白质中。优选在开始渗滤前即刻将还原剂加入到蛋白质中。加同。在每种情况下，所用的各还原剂优选为不能形成分子内二石克键的 单巯基还原剂或多巯基还原剂。因此，在一个实施方案中，加入到蛋 白质样品中的还原剂与渗滤緩冲液中的还原剂不同。优选加入到蛋白 质中的还原剂与渗滤緩沖液中的还原剂相同，即不能形成分子内二硫 键的单巯基还原剂或多巯基还原剂。优选蛋白质样品中和渗滤緩冲液 中的还原剂为13 -巯基乙胺。优选渗滤前蛋白质样品中还原剂的起始浓 度为渗滤緩冲液中还原剂浓度的0. 5 - 1. 5倍，更优选0. 75 - 1. 25倍， 甚至更优选0. 9- 1. 1倍。在一个实施方案中，渗滤开始时蛋白质样品 中还原剂的浓度与渗滤緩冲液中还原剂的浓度大致相同，优选是相同 的。应该认识到本领域技术人员可以通过改变所用的还原剂、还原剂 的浓度、蛋白质的浓度、反应的pH、温度、渗滤的时间期限和流速来 优化本发明方法的步骤(a)中蛋白质中半胱氨酸的活化。因此，本领域技术人员可以根据经验确定合适的渗滤流速。合适
的流速包括1-15个渗滤体积/小时。还可以使用较低的流速，例如 0. 2-0. 9个渗滤体积/小时。在一个实施方案中，流速为0. 5个渗滤 体积/小时。渗滤可以在任何合适的温度，例如约5'C -约70°C,例如在室温 下进行。使该方法的步骤(a)进行足以活化步骤(b)中效应分子所连接的 各半胱氨酸的时间。本领域技术人员可以根据经验确定合适的时间期 限。 一般而言，渗滤进行1-20小时的期限。在一个实施方案中，渗 滤进行1 - 10小时的期限， 一般为4， 5， 6， 7， 8， 9或10小时。在 一个实施方案中，渗滤进行6. 5小时的期限。本领域技术人员还可以基于蛋白质类型的不同，根据经验确定用 于本发明方法的蛋白质的合适的浓度。例如，如果蛋白质为抗体Fab' 片段，那么合适的浓度包括1 - 200mg/1 ，优选2 - 30mg/1,优选20mg/1 。任选地，在对还原剂渗滤后，可以降低还原剂的水平或使用本领 域中公知的任何适宜的方法在该方法的步骤(a)与(b)之间除去还原 剂。在一个实施方案中，通过对不含任何还原剂的緩沖液渗滤蛋白质， 例如通过对这种新的緩沖液继续进行步骤(a)的渗滤来降低还原剂的 浓度。在另一个实施方案中，通过对包含低浓度还原剂的緩冲液渗滤 来降低还原剂的水平。在另一个实施方案中，通过凝胶过滤来降低还 原剂的水平或从蛋白质样品中除去还原剂。在该方法的步骤(b)中，使一个或多个效应分子与该方法的步骤 接。 ； '、、一 ， 、"，、'该方法的步骤(b)—般可以在溶剂，例如緩冲水溶液，诸如磷酸 盐、柠檬酸盐或乙酸盐中进行。 一般而言，其为通过凝胶过滤渗滤或 转移至蛋白质样品中的緩沖液。该反应 一般可以在任何合适的温度下， 例如约5。C -约70°C，例如在室温下进行。该緩冲液可以任选地包含 螯合剂，诸如EDTA、 EGTA、 CDTA或DTPA。优选该緩冲液包含EDTA1 -5mM，优选2mM的EDTA。或者或此外，该緩冲液可以为螯合緩冲液，
诸如柠檬酸、草酸、叶酸、N，N-二甘氨酸、两性离子緩冲剂、tris或 ADA。 一般以与蛋白质浓度至少等摩尔的浓度使用该效应分子，即至少 为1:1。 一般而言，以与蛋白质浓度相比过量的浓度使用该效应分子。 一般而言，该效应分子为1.1-100倍摩尔过量，优选l. 1， 1.5， 2， 3， 5， 10或50倍摩尔过量。合适的效应分子浓度的其它实例包括1.2， 1.25， 1. 3和1. 4倍摩尔过量。或者，如果2种或2种以上蛋白质与一个或多个效应分子连接，那么该效应分子不可以过量，例如效应分 子与蛋白质之比可以为0. 1 - 1，优选0.5。本领域技术人员可以根据 经验确定反应期限并且一般为1-20小对。在一个实施方案中，该反 应进行14-16小时的期限。如果必要，可以通过常规手段，例如通过色谱技术，诸如离子交 换、大小排阻或疏水作用色谱法从任何原料或该方法过程中生成的其 它产物中分离包含所需数量的效应分子的所需产物。因此，在一个实 施方案中，本发明的方法进一步包括步骤(c)，其中纯化带有所需数量 的连接的效应分子的蛋白质。实施例现在仅通过实施例描述本发明，其中参照 附

图1 :还原时间对Fab'聚乙二醇化效率的作用。 附图2:还原条件对聚乙二醇化效率的作用比较。 附图3:还原剂类型对聚乙二醇化效率的作用比较。 附图4:还原剂浓度对聚乙二醇化效率的作用。 附图5: pH对聚乙二醇化效率的作用。在所有附图中的术语"Fat/-PEG"均代表带有一个与单一铰链区 半胱氨酸连接的40， 000 PEG的Fab'。在所有附图中的术语"多-PEG，，均代表高分子量聚乙二醇化材料， 其中1个以上PEG分子与抗体Fab'片段连接。实施例1 通过在带有10000 MWCO膜的8050 Amicon搅拌池中对2mM 2-巯 基乙胺、0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6渗滤还原在0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6中包含10mg/ml单铰链巯基的20ml Fal/。在开始渗滤前即刻将 2-巯基乙胺加入到FaV溶液中至终浓度为2mM。在渗滤过程中，每隔30分钟除去一次lml保留液的等分部分并 且通过在使用0. 1M磷酸盐、2raM EDTA pH6平衡的PD10柱上进行严格 凝胶过滤从所述的等分部分中除去还原剂。使还原的Fab'在环境温度 下在具有~3倍摩尔过量的40kPEG-马来酰亚胺(Nektar)的相同緩冲 液中聚乙二醇化16小时。通过大小排阻HPLC测定FaV的聚乙二醇化 (聚乙二醇化百分比)。附图1表示在渗滤5小时后，反应随着时间的流逝进行到~80% Fat/单聚乙二醇化的平衡。实施例2在环境温度下，通过在带有10000 MWCO膜的8010 Amicon搅拌 池中对均在0. 1M磷酸盐、2mMEDTA pH6中的lmM2-巯基乙胺或lmM 2-巯基乙醇或1mM还原态谷胱甘肽或lmM二硫苏糖醇渗滤16小时还原在 0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6中包含10mg/ml单铰链巯基的8ml Fab' 样品。然后通过在环境温度下使FaV对0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6 继续渗滤4小时除去还原剂。使还原的Fab'在环境温度下在具有5倍 摩尔过量的40kPEG-马来酰亚胺(Nektar)的相同緩冲液中聚乙二醇化 16小时。平行进行的是，在环境温度下，通过与5mM2-巯基乙胺或5mM2-巯基乙醇或5mM还原态谷胱甘肽或5mM二硫苏糖醇一起孵育30分钟还 原在0. 1M磷酸盐、2mMEDTApH6中包含10mg/ml单铰链巯基的0. 5ml Fab'样品。通过在使用0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6平衡的PD10柱上 进行严格凝胶过滤除去还原剂。在环境温度下使用5倍摩尔过量的40k PEG-马来酰亚胺(NektarM吏还原的Fab'聚乙二醇化16小时。通过大小排阻HPLC以及还原和非还原SDS-PAGE测定Fab'的聚
乙二醇化。SDS-PAGE分析证实在Fat/ -PEG (单聚乙二醇化)中保留了链 间二硫键。附图2表示与导致大比例Fab'保持未聚乙二醇化的孵育相比， 渗滤还原推进了朝着更多单聚乙二醇化Fab'的平衡。使用2-巯基乙胺 渗滤使单聚乙二醇化的Fab'的百分比从55%增加到85%。类似地，使 用谷胱甘肽或2-巯基乙醇渗滤使单聚乙二醇化的Fab'的百分比分别 从25°/。增加到58%和从22%增加到42%。附图2还表示如果还原剂为能 够形成分子间二硫键的二硫醇，例如二硫苏糖醇，那么它会将在单聚 乙二醇化后的平衡推进至链间半胱氨酸上不理想的广泛多聚乙二醇 化。实施例3在环境温度下，通过在带有10000 MWCO膜的8010 Amicon搅拌 池中对均在0. 1M磷酸盐、2mMEDTA pH6中的lmM:2-巯基乙胺或lmM 2-巯基乙醇或lmM还原态谷胱甘肽或lmM L-半胱氨酸渗滤16小时还原 在0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6中包含1 Omg/ml单铰链巯基的8ml Fab' 样品。然后通过在环境温度下使FaV对O.IM磷酸盐、2mM EDTA pH6 继续渗滤4小时除去还原剂。在环境温度下使用5倍摩尔过量的40k PEG-马来酰亚胺(Nektar)使还原的Fab'聚乙二醇化16小时。通过大小排阻HPLC以及还原和非还原SDS-PAGE测定Fab'的聚 乙二醇化。附图3表示P-巯基乙胺和半胱氨酸特别有效地还原Fab'而达到 高水平的单聚乙二醇化。实施例4在环境温度下，通过在带有10000 MWCO膜的8010 Amicon搅拌 池中对在0. 1M磷酸盐、2mMEDTApH6中的0. 3raM或lmM或3mM或5mM 2-巯基乙胺渗滤16小时还原在0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6中包含 10mg/ml单铰链巯基的6ml Fab'样品。然后通过在环境温度下将Fab's 对0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH6继续渗滤4小时除去还原剂。在环境 温度下使用3倍摩尔过量的40k PEG-马来酰亚胺(Nektar)使还原的 Fab'聚乙二醇化16小时。通过大小排阻HPLC以及还原和非还原 SDS-PAGE测定Fab'的聚乙二醇化。附图4表示还原效率取决于还原剂的浓度。发现在这些条件下 lmM对这种Fat/为最佳。应该认识到可以通过改变所用的还原剂、还 原剂的浓度、蛋白质的浓度、反应的pH、温度、通过蛋白质的还原剂 的量和通过蛋白质的还原剂的流速来优化任何蛋白质的还原。实施例5在环境温度下，通过在带有10000 MWC0膜的8010 Amicon搅拌 池中对在0. 1M柠檬酸盐、2mM EDTA pH4， 5， 6或7中的lmM 2-巯基 乙胺渗滤16小时还原在0. 1M柠檬酸盐、2mM EDTA pH4， 5， 6或7中 的6. 5ml Fab'样品。通过在使用0. 1M柠檬酸盐、2mM EDTA pH4， 5， 6 或7平衡的PD10柱上进行严格凝胶过滤除去还原剂。在环境温度下使 用4倍摩尔过量的40k PEG-马来酰亚胺(Nektar)使还原的Fab'聚乙二 醇化5小时。通过大小排阻HPLC测定Fab'的聚乙二醇化。附图5表示pH对产生的Fab'-PEG的量的作用。实施例6在环境温度下，通过使用10000 MWCO膜在l5-20升的体积中对 在0. 1M磷酸盐、2mM EDTA pH 6. 8中的lmM 2-巯基乙胺以1个渗滤体 积/小时的流速渗滤6. 5小时还原在0. 1M磷酸盐、2mM EDTA， pH 6. 8 中的20mg/ml(士2mg/ml)抗体Fat/。在渗滤开始前即刻将2-巯基乙胺 加入到Fab'溶液中至终浓度为lmM。在渗滤后，通过以8个渗滤体积/ 小时对20mM乙酸钠pH 4. 5继续渗滤1 - 1. 5小时除去还原剂。在环境 温度下将还原的Fat/与1. 25摩尔过量的40k PEG-马来酰亚胺(Nektar) 一起孵育16-20小时。
通过大小排阻HPLC测定Fab'的聚乙二醇化。达到85%的聚乙二醇化。经证实该渗滤方法以大规模是有效的，从而导致高效率的聚乙二醇化。
权利要求
1.连接一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的方法，包括a)通过对不能形成分子内二硫键的单巯基还原剂或多巯基还原剂渗滤蛋白质活化蛋白质中的一个或多个半胱氨酸；和b)使处理的蛋白质与效应分子反应。
2. 权利要求1所述的方法，其中不能形成分子内二硫键的单巯 基还原剂或多巯基还原剂在步骤(a)前存在于蛋白质样品中。
3. 权利要求2所述的方法，其中蛋白质样品中还原剂的浓度为渗 滤緩冲液中还原剂浓度的0. 5-1.5倍。
4. 权利要求3所述的方法，其中蛋白质样品中还原剂的起始浓度 与渗滤緩沖液中的还原剂浓度相同。
5. 权利要求l-5中任意一项所述的方法，其中还原剂的浓度为lmM。
6. 权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中在步骤(a)-步骤 (b)之间从蛋白质样品中除去还原剂。
7. 权利要求6所迷的方法，其中通过凝胶过滤除去还原剂。
8. 权利要求6所述的方法，其中通过渗滤除去还原剂。
9. 权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述还原剂选自P -巯基乙胺、P-巯基乙醇、谷胱甘肽或半胱氨酸。
10. 权利要求1-9中任意一项所述的方法，进一步包括步骤(c), 其中纯化带有所需数量的效应分子的蛋白质。
11. 权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗 体或其片段。
12. 权利要求ll所述的方法，其中所述蛋白质为抗体Fab'片段。
13. 权利要求11或权利要求12所述的方法，其中效应分子所连 接的至少一个半胱氨酸存在于抗体铰链区中。
14. 权利要求11-13中任意一项所述的方法，其中效应分子所连 接的半胱氨酸各自存在于抗体铰链区中。
15. 权利要求1-14中任意一项所述的方法，其中所述效应分子为PEG。
16. 权利要求15所述的方法，其中所述效应分子为40， 000 PEG-马来酰亚胺。
全文摘要
本发明提供了连接一个或多个效应分子与蛋白质中一个或多个半胱氨酸的方法，包括a)通过对不能形成分子内二硫键的单巯基还原剂或多巯基还原剂渗滤蛋白质来活化蛋白质中的一个或多个半胱氨酸；和b)使处理的蛋白质与效应分子反应。
文档编号A61K39/395GK101212984SQ200680023411
公开日2008年7月2日 申请日期2006年6月29日 优先权日2005年7月6日
发明者S·P·海伍德 申请人:Ucb医药有限公司