通过超声辐射改变脂质体组成的方法

专利名称：：通过超声辐射改变脂质体组成的方法
技术领域：
：本发明涉及脂质体技术，特别是脂质体与低频超声(LFUS)组合的治疗应用。现有技术的目录下面是现有技术的目录，这些被认为是与描述本发明领域中技术现状有关的。1.Gao,Z.G.;Fain,H.D.;Rapoport,N.;Controlledandtargetedchemotherapybymicellarencapsulateddrugandultrasound(由月交束包佳十的药物和超声的受控的和耙向的化学疗法).J.Control.Release，2005.102(1):203-222.2.Pitt,W.G,;Husseini,G.A.;Staples,B.J.;Ultrasonicdrugdelivery—ageneralreview(超声药物递送-综迷).DragDe//v.2004,1(1):37-56.3.Lavon,I.;Kost,J.;Ultrasoundandtransdermaldrugdelivery(超声和透皮药物递送).EpertOpin.DrugDeliv.2004,9(15),670-676.4.Tang,H.;Wang,C.C.J.;Blankschtein,D.;Langer，R.,AnInvestigationoftheroleofcavitationinlow-frequencyultrasound-mediatedtransdermaldrugtransport(空化在低频超声介导的透皮药物转运中的作用的研究)P/7画.L2002,19(8),1160-1169.5.Anwerl,K.;Kao,G.;Proctor,B.;Anscombe,I.;Florack,V.;Earls,R.;Wilson,E.;McCreery,T.;Unger,E.;Rolland,A.;Sullivan,S.M,;Ultrasoundenhancementofcationiclipidmediatedgenetransfertoprimarytumorsfollowingsystemicadministration(全身给药后阳离子脂质介导的基因转移对原发性肿瘤的超声增强).rAera",2000,7,1833-1839.6.Duvshani-Eshet,M.;Bamch,L.;Kesselman,E.;Shimoni,E.;Machluf,M.;TherapeuticultrasoundmediatedDNAtocellandnucleus:bioeffectsrevealedbyconfocalandatomicforcemicroscopy(对纟田月包和才亥、治疗'〖生超声介导DNA:通过共焦和原子力显微镜揭示的生物效应).T7zera;乂2006.13,163-172.7.Sundaram,J.,MelleinB.R.和MitragotriS.,Anexperimentalandtheoreticalanalysisofultrasound-inducedpermeabilizationofcellmembranes(超声诱导的细胞膜渗透性的试验和理论分析).Bi叩hysicalJ.2003.84,3087-3101.8.Barenholz,Y.;Cevc,G.,StructureandpropertiesofmembranesinPhysicalChemistryofBiologicalSurfaces(膜在生物表面的物理化学中的结构和性质).MarcelDekker:NewYork,2000;第171-241页.9.Lin,H.誦Y.;Thomas,丄L.,PEG-LipidsandOligo(ethyleneglycol)SurfactantsEnhancetheUltrasonicPermeabilizabilityofliposomes(PEG"f匕月旨质和低聚(乙二醇)表面活性剂增强脂质体的超声渗透性).2003,19(4),1098-1105.10.Lin,H.-Y.;Thomas,J.L.,FactorsAffectingResponsivityofUnilamellarLiposomesto20kHzUltrasound(影响单层脂质体对20kHz超声的响应性的因素).丄，画>2004,20(15),6100-6106.11.Cohen画Levi,D.;Kost,J.;Barenholz,Y.Ultrasoundfortargeteddeliveryofcytotoxicdrugsfromliposomes,MScThesis(超声用于纟田胞毒性药物从脂质体中的草巴向递送，硕士论文).BenGurionUniversity,BeerSheva,Israel,2000.
背景技术：
：已显示超声特別是低频超声(LFUS)增强用于药物和基因递送的生物膜的渗透性"7。双层结构及很多脂质体膜的物理化学性质与生物膜很相似8,这引导我们测定LFUS是否能增加脂质体的渗透性从而以受控的方式释i丈包i里的药物。早期研究显示作为对20kHz超声辐射的响应，脂质体从脂质体内的水相中释放钙黄绿素9，1、另一项研究显示20kHz超声辐射比高频超声(l和3MHz)更有效地从脂质体中释放阿霉素u。进一步地，用阿霉素脂质体(Doxil)治疗接种人结肠癌肿瘤的BALB/c小鼠并且在该脂质体在所述肺瘤部位蓄积后，随后显示将该肺瘤暴露于LFUS能减少肿瘤大小。
发明内容本发明尤其基于下述的两个发现预制的脂质体的超声(US)辐射促进各种材料加载至脂质膜和/或至脂质体的脂质体含水核中。通过使用US辐射，受控和定量地释放加载至脂质体(在脂质体膜或在脂质体含水核中)的各种材料是可能的。特别地，已显示通过应用一系列US辐射时间，指导(dictate)加载于脂质体的材料的量子释放(quantumrelease)以使化合物以受控的方式从脂质体中分步释放是可能的。因此，根据本发明的第一方面(本文"本发'银辨y知裁'才面")，提供了一种用于将试剂加载至预制的脂质体的方法，所述方法包括(a)使所述预制的脂质体与所述试剂接触；和(b)对预制的脂质体进行超声(US)辐射；其中预制的脂质体与所述试剂的所述接触是在所述US辐射前或后；和所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性并由此允许将所迷试剂加载至所述脂质体的参数。根据本发明的加载方面，还提供了一种用于减少流体介质或组织中的物质量的方法，所述方法包括(a)使流体介质或组织与预制的脂质体接触；(b)对预制的脂质体进行US辐射；其中流体介质或组织与预制的脂质体的所述接触是在所述辐射前或后；和所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性，从而允许将所述物质加载至所述脂质体的参数，由此减少所述物质在所述介质或组织中的量。根据本发明的加载方面，进一步提供了用于减少物质在受治疗者机体中的水平的方法，所述方法包括(a)以允许所述预制脂质体(pre-liposomes)与所述物质之间接触的方式对所述受治疗者施用一定量的预制的脂质体；(b)对预制的脂质体进行US辐射；其中预制的脂质体的所述辐射是在施用脂质体至所迷受治疗者机体前或后；所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性并由此将所述物质加载至所述脂质体的参数，这导致所述物质在所述受治疗者机体中的水平的减少。根据本发明的加载方面，进一步提供试剂盒，其包括(a)预制的脂质体的组合物；(b)对所述预制的脂质体的组合物进行US辐射的说明书，所述说明书确定(identify)用于所述US辐射的辐射参数，所述US辐射诱导预制的脂质体渗透性增加，以使当受辐射的脂质体被带入而与物质接触时至少一部分所述物质^fe加载至所述脂质体中。最后，根据本发明的加载方面，提供了预制的脂质体用于制备从受治疗者机体去除物质的药物组合物的用途，当所述组合物在所述受治疗者机体内时，所述组合物预期与将所述预制的脂质体暴露于US辐射组合使用。根据本发明的第二方面(本文"本发明的释放方面")，提供了一种用于将稳定加载至所述脂质体的试剂从脂质体中量子释;^的方法，所述方法包括对所述脂质体进行一系列两次或更多次US辐射时间(session),所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性，由此允许从所述脂质体中释放一定量的所述试剂的参数。根据本发明的释放方面，进一步提供了试剂盒，其包括(a)加载有试剂的脂质体的组合物；(b)在对所述受治疗者施用所述脂质体的组合物后，对受治疗者机体应用一系列两次或更多次US辐射时间的说明书，所述说明书包括确定每次辐射时间的辐射参数和在确定的辐射时间期间从所述脂质体中释放的试剂的量的指示(index)。根据本发明释放方面的另一个实施方案，提供了试剂盒，其包括(a)加载有试剂的脂质体的组合物；(b)在对所述受治疗者施用所述脂质体的组合物后，对受治疗者机体应用一系列两次或更多次US辐射时间的说明书，所述说明书包括与患者和疾病相关的参数相对应的治疗方案的指示，所述治疗方案确定辐射参数。最后，根据本发明的释放方面，提供了加载有试剂的脂质体用于制备因暴露所述脂质体于US辐射而使得所述试剂从脂质体中量子释力文的药物组合物的用途。应了解，在本发明的上下文中，可组合本发明的加载和释^:方面。例如，加载有物质的脂质体在暴露于US辐射下可有效地释放所述物质，而同时或此后，在US辐射期间或此期间后有效地加载另一个存在于周围介质或组织的物质。为了理解本发明和为了了解在实践中如何进行本发明，下面将仅以非限制性的实施例的方式描述优选的实施方案，并参考下述附图，其中图1显示低频US(LFUS)辐射时间对膜不可渗透的荧光探针荧光黄(pyranine)从脂质体外介质中的脂质体摄取的影响；图2是柱状图，显示与阳离子脂质DOTAP、阴离子脂质DMPG、或对照(没有脂质)培育的脂质体在暴露于LFUS或未暴露于LFUS下的Zeta电位。图3显示超声振幅对曱基泼尼松龙半琥珀酸钠盐(MPS)从脂质体释放的影响。图4显示US对三种不同的脂质体(SSL)药物制剂的释放的影响(-■-)MPS、(-A-)阿霉素(阿霉素脂质体)、(-"顺柏(隐形顺铂)、和(-口-)具有高脂质体内/低脂质体外的醋酸钙梯度的SSL。图5显示连续O-)或脉冲(-口-)辐射方式后经LFUS触发的从脂质体的MPS释放。图6a-6c是在远程(remote)加载MPS前脂质体的低温透射式电子显微镜图像(图6a);在远程加载MPS后的脂质体(图6b);在暴露于LFUS(20kHz、120s、3.3W/cm勺后远程加载有MPS的脂质体(图6c)。图7显示LFUS辐射时间对脂质体的MPS分散体的影响浊度(左轴、-□-)、和动态光散射(DLS)信号强度(右轴、-▲-)。图8显示LFUS辐射时间对脂质体的MPS平均大小的影响，这通过90°时的动态光散射评价。图9显示在受LFUS辐射的脂质体分散体中总(脂质体的+非脂质体的)磷脂(_□_)和脂质体的磷脂(__)的浓度。图10是基于提取的脂质的TLC分析，显示LFUS对脂质化学稳定性的影响的图像。图11显示通过LFUS从隐形顺铂脂质体释放的顺铂对培养中的C26鼠结肠腺癌细胞的细月包毒性。具体实施例方式在过去的几年中，使用超声增加用于DNA转染和药物递送的细胞膜的渗透性已引起兴趣[Lin,H.-Y.等.La"g附wV2004,20(15),6100-6106]。不同双层膜显示对超声不同的响应性[Lin,H,Y.等.2003,19(4),1098-1105]。基于本文提出的结果，由此本发明人已明白超声诱导的脂质体的渗透性是用于将各种材料加载至脂质体及用于各种材料从脂质体中受控释放的重要工具。不希望受理论的束绰，但应理解根据本发明，认为从脂质体释;改、或加载至脂质体的机理是与形态学改变(不受理论的束縛)如在脂质体膜中的孔样缺陷(defect)的瞬时形成相关，材料可通过所述孔样缺陷^皮释放或引入至脂质体。这些缺陷大多数可能由发生在脂质体外介质的脂质体膜附近的USi秀导的空化(cavitation)，和/或脂质体内的水室(aqueouscompartment)中的小空化核引起。一旦US辐射停止(除非脂质体另外设计成下文将要讨论的)，所述膜中的孔样缺陷通常重新密封。下述的实施例显示暴露于US既不能改进受辐射的脂质体药物或脂质的化学性质，也不能改进这些药物的生物活性。因而，根据其第一方面，本发明提供了将试剂和物质加载至预制的脂质体、优选预制的脂质体的悬浮液的方法。本发明的这个方面是指本文的"本Jt'劳矽余虑才必"。根据其第二方面，本发明提供了用于试剂和物质从脂质体中受控释放的方法。本发明的这个方面是指本文的"本发坊矽#^才面"。根据本发明的两个方面，将脂质体设计成具有低渗透性。"^^邊遂"通常由每单位面积和单位时间渗透或渗漏的具体材料的量来确定。在本发明的上下文中，"^^邊'^"表示形成脂质体膜的脂质双层随时间自动地或一皮动地从脂质体膜的一边(如脂质体间的含水介质，也是指脂质体外的介质)至膜的另一边(如脂质体内的核)转运(没有如辐射或加热的操作)物质(如药物或其他试剂)的能力。脂质体的渗透性可通过本领域已知测定细胞和脂质体渗透性的方法来测定。例如，可通过使用如凝胶渗透色谱、透析(dialysis)、超滤法或类似的方法将脂质体与任何已渗漏出的材料分离和以已知的方式测定任何渗漏的材料来测量试剂的渗漏(还参见在下述书中涉及渗透性的相关部分Liposomes:APracticalApproach.VWeissig&VTorchilin(编)，第二版；New,R.C.C.,Liposomes:APracticalApproach,Oxford,第一版)。因此，在本发明的上下文中，术语"浙^^邊遂"定义为脂质体在至少一个月的贮存期内自发地释放不超过预先加载至脂质体的材料10%的能力，或选择性地，在至少一个月的贮存期内自发地加载不超过溶解或分散在围绕预制的脂质体的介质中的材料0.1%的能力。已经显示多种因素影响脂质体渗透性。在相变温度及其附近时渗透性增强；而通过并入甾醇(如胆固醇)渗透性降低。清洁剂(Detergent)和其他具有大头基的两亲物在远低于增溶作用需要的浓度时也增加渗透性。因此，通过在两个脂质体群(population)的双层内使用不同组分，可实现明显不同的渗透性。事实上，脂质组成是在测定脂质体渗透性中主要的因素，和如上文所述，这与脂质的Tm相关(当使用一种脂质形成脂质体)。当所有在双层中的脂质处于液态有序(LO)相时，胆固醇将放慢渗漏(即降低渗透性)(在很多含有PC的情况下，可获得等于或高于33摩尔％的胆固醇量)。对于主要由脂质体形成脂质的混合物组成的脂质体，如本领域技术人员所理解和已知，参数可能是复杂的。温度也影响渗透性。脂质体在液体无序(LD)相中的渗透性比在固体有序(SO)或液体有序(LO)相中脂质体的渗透性更高。脂质体的大小可对膜渗透性有一些影响，如大的脂质体(如100nm和更高)比小于100nm的脂质体的膜具有更小的曲率。大的和小的脂质体之间的另一个差异是表面积/体积比率，其中对于大的脂质体，所述比率比小的脂质体更小；因此与大的脂质体比较，更多材料从小的脂质体中渗漏。但是，可认为这些差异是轻微的。最后，应理解，对于通过多层嚢泡(vesicles)(MLV)膜的渗漏或渗透，要求所述材料跨过多于一个双层而成为游离的(或包埋的)。因此可认为MLV比单层脂质体具有更小的渗透性。相同的理解应该应用至多室囊泡(multivesicularvesicles)。但是，也在这种情况下，多室囊泡和单室囊泡之间的渗透性差异是轻微的。根据一个实施方案，通过使用具有确定的凝胶相至液晶相转变温度(geltoliquidcrystallinephasetransitiontemperatures)(Tm)的月旨质，来实现脂质体的渗透性。已知由脂质和脂质体进行的从凝胶(即固体或固体有序的，SO)至液晶(即流体或液体无序的，LD)或从液晶至凝胶相的热致相变影响脂质体的脂质双层的自由体积和牢固度。当处于LD相时，在形成双层的两个片层(leaflet)中的脂质依照它们亲水性和亲脂性区域"松散地"对齐。这种填充形成促进跨过脂质体膜的扩散的高水平的"自由体积"。在主要相变的范围下(即当处于SO相时)，脂质分子更紧密地填充，以及脂质双层具有更少的自由体积，因而渗透性将大幅度地降低，且可被完全消除。应了解，在LD和SO相共存的温度范围时，存在填充被干扰的界面区域；而当这两相互相不适合时，存在填充缺陷。在此范围时，渗透性通常是最高的。如上文所示，渗透性还可通过向脂质体组合物膜添加活性甾醇来设计(如上文简要讨论)。例如，在主要由PC和/或鞘磷脂组成(或任何其他脂质体形成脂质，除了具有多不饱和酰基链的那些)和具有25至50摩尔％量的胆固醇的脂质体中，所有双层都处于LO相。结果，与处于LD相的脂质体比较，渗透性降低。但是，通过此主要相变的没有风险，因为所述相变被高摩尔％胆固醇(或其他膜活性甾醇)消除。当将不同脂质体形成脂质的脂质体的渗透性与相同水平的膜活性甾醇(像胆固醇)比较时，渗透性将由每个脂质体形成脂质的Tm来确定。例如，HSPC/胆固醇的渗透性(HSPC的Tm为52°C)比DPPC/胆固醇(DPPC的Tm为41.4°C)或DMPC/胆固醇(DMPC的Tm为23.5。CM氐。还值得注意膜对材料的渗透性还取决于具体材料的特征，特别是材料的辛醇对水相分配系数(Kp)。例如，阿霉素具有低Kp，而布比卡因有更高的Kp。这解释了它们从相同脂质体或从类似组成的脂质体中渗漏速率的差异。因为这个原因，b邵isome(加载布比卡因的脂质体)在4。C贮存期间渗漏，而Doxil(加载阿霉素的脂质体)没有出现渗漏[还参见Haran,G.;等.jSz》p/y^.Jctof，5/omew6nawex1993,1151(2),201-215]]。具有相对高的Tm的脂质可称为"刚性的(rigid)"脂质，通常是具有饱和的长酰基链的那些脂质，而具有相对低的Tm的脂质可称为"流动的(fluid)"脂质。脂质体的流动性或刚性可通过选择具有预定流动性/刚性的脂质用作脂质体形成脂质来确定。具有特定Tm的脂质的选择将取决于实施所述方法时的温度。例如，当环境的温度为室温时，形成脂质体的脂质将是相变温度Im高于室温如高于25。C的脂质。进一步，作为一个例子，当在4。C实施本发明的方法时，则选择Tm高于4。C的形成脂质体的脂质。根据一个优选的实施方案，优选Tm等于或高于40。C的形成脂质体的脂质。具有高于40。C的Tm的形成脂质体的脂质的非限定性例子包括具有两条16个或更多个碳原子的酰基(或烷基)链的磷脂酰胆碱(PC)及其衍生物。本发明的上下文中形成低可渗透的脂质体的基础的PC衍生物一些优选的例子包括但不限于具有52°CTm的氬化大豆PC(HSPC)、具有41.3。CTm的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、具有41.2。CTm的N-棕榈酰鞘磷脂、具有55。CTm的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、具有48。CTm的N-硬脂酰鞘磷脂、具有55°CTm的二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和具有68°CTm的二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。所有这些Tm数据来自http:〃www.avantilipids.com/PhaseTransitionTemperaturesGlycerophospholipids.htm]_的相变温度或来自http:〃www.lipidat.chemistry.ohio-state.edu/home.stm，这些对本领域技术人员是已知的。本领域技术人员懂得如何选择具有等于或鬲于40。C的Tm的月旨质[还参见Barenholz,Y.,Liposomeapplication:problemsandprospects(月旨质体应用问题与前景).Cwr.Qpi".Co〃oW/w/^/ace6,66-77(2001);Barenholz,Y.和Cevc,G.,Structureandpropertiesofmembranes.InPhysicalChemistryofBiologicalSurfaces(Baszkin,A.和Norde,W.编)，MarcelDekker,NY(2000)，第171-241页]。为了减少膜的自由体积并由此减少其中加载的材料的渗透性和渗漏，除了脂质体形成脂质(像PC和鞘磷脂)，膜活性甾醇(如胆固醇)和/或磷脂酰乙醇胺可被包括在脂质体制剂中。因此，根据另一个实施方案，脂质体可包括胆固醇。独立地，脂质体群中的脂质体的脂质/胆固醇摩尔/摩尔比率可在约75:25与约50:50之间的范围内。一种更具体的摩尔/摩尔比率是约60:40。脂质体可包括其他组分。例如，诱导电荷的脂质如磷脂酰甘油还可被并入脂质体双层以减少嚢泡-嚢泡融合，和增加与细胞的相互作用。具有使脂质体表面pH接近中性的适合pH的緩冲液可减少水解。可使用加入抗氧化剂(如维生素E)或螯合剂(如除铁灵(Desferal)或DTPA)。通过使用脂质体形成脂质，来形成脂质体。在本发明的上下文中，术语/泉资体多^5Uf^^表示具有甘油骨架的那些脂质，其中在头基的至少一个、优选两个羟基被一个或多个酰基、烷基或烯基链、磷酸基、优选酰基链(形成酰基或二酰基衍生物)、任何上述的组合、和/或其衍生物取代；且脂质体形成脂质可在头基包括化学活性基(如胺、酸、醋、搭或醇)，由此提供极性头基。鞘脂质(特别是鞘磷脂)是甘油磷脂的好的替代物。通常，取代的链(如酰基、烷基或烯基链)长度为约14个至约24个碳原子，并且具有不同的饱和度，由此产生完全、部分或非氬化的(脂质体形成)脂质。进一步，脂质可以是天然来源的、半合成的或完全合成的脂质，和可以是中性的、带负电荷的、或带正电荷的。有多种合成的囊泡形成(vesicle-forming)脂质和天然存在的嚢泡形成脂质，包括磷脂类，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、l-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、l-椋榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)和鞘磷脂类，如具有12个至24个碳原子的酰基或烷基链的鞘磷脂(SM)。上迷的其烃链(酰基/烷基/烯基链)具有不同饱和度的脂质和磷脂可以市售得到或根据公开的方法制备得到。脂质体中包括的其他适合的脂质为甘油糖脂和鞘糖脂和甾醇(如胆固醇或植物甾醇)。阳离子脂质(单阳离子和多阳离子)也适于在本发明的脂质体中使用，在所述脂质体中该阳离子脂质可被包括作为脂质组合物的小组分或作为主要或唯一的组分。这种阳离子脂质通常具有亲脂部分如甾醇、酰基或二酰基链，并且该脂质具有总的净正电荷。优选地，所述脂质的头基携带正电荷。单阳离子脂质可包括，例如1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基丙烷铵(DMTAP);1,2-二油烯基氧基-3-(三甲氨基)丙烷(DOTAP);N-[l-(2,3,-双十四烷氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMR正)；N-[l-(2,3,-二油烯基氧基)丙基]-N,N-二曱基-N-羟乙基溴化铵(DORIE);N-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA);3卩[N-(N',N'-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol);和二甲基-双十八烷铵(DDAB)。聚阳离子脂质的例子可包括与单阳离子脂质所描述的那些类似的亲脂部分，所述亲脂部分与该聚阳离子部分连接。示例性的聚阳离子部分包括精胺或亚精胺(由DOSPA和DOSPER示例)、或肽(如聚赖氨酸或其他聚胺脂质)。例如，中性脂质(DOPE)可用聚赖氨酸衍生化以形成阳离子脂质。聚阳离子脂质包括但不限于N-[2-[[2,5-双[3-氨基丙基)氨基]-]-氧戊基]氨基〗乙基]-N,N-二甲基-2,3-双[(l-氧-9-十八烯基)氧基]-l-丙烷铵(DOSPA)和神经酰胺氨基甲酰基精胺(ccs)。进一步，脂质体还可包括脂质，所述脂质用亲水性聚合物衍生化以形成已知为术语脂质聚合物(lipopolymer)的新物质。脂质聚合物优选地包括在其头基用分子量等于或高于750Da的聚合物修饰的脂质。所述头基可以是极性或非极性；但优选极性的头基，所述头基与大的("50Da)、高度水合(每头基有至少60分子的水)的柔性聚合物连接。亲水聚合物头基与脂质区域的连接可以是共价的或非共价的连接；但是优选通过形成共价键(任选地经由连接子(linker))。亲水性聚合物链的最外表面包衣有效地提供体内具有长的血液循环生存期的脂质体。脂质聚合物可以下述两种不同的方式被引入至脂质体(a)将脂质聚合物添加至脂质混合物，由此形成脂质体，其中所述脂质聚合物将被并入和暴露在脂质体双层的内片层和外片层[UsterP.S.等.FEBBSLetters386:243(1996)];或(b)首先制备脂质体，然后通过在高于脂质聚合物和脂质体形成脂质的Tm的温度下培育，或通过短时间暴露于微波辐射，将脂质聚合物并入至预制的脂质体的外片层。脂质体可主要由脂质体形成脂质和脂质(如磷脂酰乙醇胺，它不是脂质体形成脂质)和此类脂质用亲水性聚合物的衍生化组成，后者形成的脂质聚合物在大多数情况下不是脂质体形成脂质。已经在下述中描述实例Tirosh等的[Tirosh等，Biopys.J.,74(3):1371-1379,(1998)]和美国专利第5,013,556号；第5,395,619号；第5,817,856号；第6,043,094号和第6,165,501号；通过引用并入本文；和WO98/07409。脂质聚合物可以是非离子型脂质聚合物(有时也称为中性脂质聚合物或未荷电的脂质聚合物)或具有净负电荷或净正电荷的脂质聚合物。有很多可与脂质连接的聚合物。通常用作脂质修饰物的聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、聚乳酸(也称为聚交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚曱基噁哇啉(polymethoxazoline)、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚天冬酰胺、聚轻丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基曱基醚、聚羟乙基丙烯酸酯、衍生化纤维素(如羟曱基纤维素或羟乙基纤维素)。该聚合物可^fe使用为均聚物或为嵌段或无规共聚物。尽管衍生成脂质聚合物的脂质可以是中性、带负电荷的或带正电荷的，即关于具体的(或没有)电荷没有限制，但是最常用和市售可得的衍生成脂质聚合物的脂质是基于磷脂酰乙醇胺(PE)、通常是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)的那些。可由本发明使用的脂质聚合物的具体家族包括与DSPE连接的单曱基化PEG(具有不同长度的PEG链，甲基化PEG是指本文的简称PEG)，其中PEG聚合物经由氨基曱酸酯连接键与脂质连接，这产生带负电荷的脂质聚合物。其他脂质聚合物是中性的曱基聚乙二醇二硬脂酰甘油(mPEG-DSG)和中性的甲基聚乙二醇氧基羰基-3-氨基-l,2-丙二醇二硬脂酰酯(mPEG-DS)[GarbuzenkoO.等，Langmuir.21:2560-2568(2005)]。PEG部分优选PEG头基的分子量从约750Da至约20,000Da。更优选，分子量从约750Da至约12,000Da,最优选在约1,000Da至约5,000Da之间。本文使用的一种具体的PEG-DSPE是具有2000Da的分子量的PEG部分，本文指定2000PEG-DSPE或2kpEG-DSPE。也已经描迷包括此类衍生化脂质的脂质体的制备，其中通常1-20摩尔百分比之间的此类衍生化脂质被包括在脂质体制剂中。不同类型的脂质体可在本发明的上下文中使用，这包括但不限于多层嚢泡(MLV)、小单层嚢泡(SUV)、大单层嚢泡(LUV)、空间稳定的脂质体(SSL)、多室囊泡(MVV)和大多室嚢泡(LMVV)。第一群的脂质体可具有与形成第二群的那些的相同类型，或可具有不同的类型。根据一个实施方案，第一群和第二群的脂质体是LMVV。LMVV可通过本领域已知的方法来制备。例如，LMVV可通过下述方法来制备(a)用含水溶液如硫酸铵溶液涡旋脂质膜；(b)使所得的悬浮液均质化以形成小单层嚢泡(SUV)的悬浮液；和(c)在液氮中、然后在水中重复冻融所述SUV的悬浮液。优选地，重复所述冻融至少5次。然后去除脂质体外的硫酸铵，例如通过对生理盐水透析。通过用治疗剂溶液培育LMVV脂质体的悬浮液，治疗剂被包封在脂质体内。这种方法也在国际专利^^布第WO/20000/9089号(LMVV在其中为简称GMV)中详细描述。回到所提及的本发明的加载方法，这些通常包括将待加载的材料(如下文确定的试剂或其他物质，一起、有时通常是指本文的术语"/余知戎^#^f，)带入而与预制的脂质体接触的步骤。接触可包括混合、悬浮等。另一个步骤包括对预制的脂质体进行US辐射。应理解，在加载的方法中的步骤次序是可互换的。因此，根据一些实施方案，预制的脂质体与材料的接触可在US辐射前，而根据本发明的一些其他实施方案，在其与待加载的材料接触前，辐射预制的脂质体。US辐射和受辐射的脂质体与被加载其中的材料的接触之间的时间跨度取决于辐射终止后具体的辐射时间对脂质体渗透性的影响。换而言之，待加载的材料被带入而与脂质体接触，只要它们保持可渗透的。尽管通常脂质体在US辐射期间是可渗透的，但是脂质体可被设计以使其在辐射后还保留渗透性达一段时间。在本发明上下文的各种方面中，术语"超声箱#'或本文有时使用的更短术语"籍^r表示将脂质体暴露于从一种或多种超声产生单元(如超声换能器)中产生的任何超声波。所述超声波可由一种或多种下述的参数表征辐射频率、辐射持续时间、辐射强度、每次辐射时间的辐射源的数目和部位(位置)(即几种辐射可^皮应用至体内不同的位置)、连续、序贯或脉沖辐射、聚焦或非聚焦辐射、均匀或非均匀(即频率和/或振幅调制的)輻射。在下述的描述中，超声波由其频率和持续时间表征。但是，应该理解，这两个参数的结合不应该以任何的方式被解释为限制本发明。例如，可由其在约0.1至10W/cm2之间的范围内的强度，选择性地确定US辐射。才艮据一个实施方案，超声辐射由约18kHz至约lMHz之间的频率表征。本发明优选的实施方案提供了以约20kHz和约300kHz之间，更优选约20kHz和100kHz之间的频率的US辐射。此范围有时被公认为术语"效舰,箱,(LFUS)。本发明的加载方法可利用连续辐射或脉冲辐射方式。进一步，该加载方法可利用一系列序贯的连续辐射。所述系列辐射可由相同或不同的辐射参数表征。例如，尽管系列辐射中的每次辐射时间的频率可以是相同的，但是辐射的持续时间可改变。本文已经显示增加脂质体渗透性的辐射积极地影响了材料至脂质体的加载(如没有辐射，材料不会一皮加载至脂质体中)。在本发明的上下文中，术语"水戎"表示将材料引入至脂质体的脂质双层、至双层的单片层(如不对称加载)或至双层的两个片层、至脂质体的含水核，或材料被吸附至脂质体的表面(例如，通过如DNA和siRNA复合物的离子相互作用)和其组合(即至片层、含水核和/或表面)。应该4艮好地理解，辐射具有非共价地附着至脂质体表面的物质的脂质体可导致脂质体膜的"无序化"，而这种"无序化"可导致物质在表面的松弛，由此导致它们从脂质体的释放。该材料可完全被封闭在脂质体的室内(完全被包埋在双层中和/或被包封在含水核内)，或部分地被暴露在脂质体的外表面(即其部分稳定结合在脂质体的外片层或两个片层)。材料被加载至其中的室可取决于所述材料的化学和物理特征。例如，加载疏水性(如胆固醇)或两亲性分子(如脂质)主要在脂质膜中。根据本发明加载方面的一个实施方案，材料是指术语"试剂"，以及实施了用于加载试剂的方法，其用于任何一种下述的应用用于制备治疗性组合物，其中该试剂可以是待包封在含水核和/或包埋在膜中的药物；用于制备显像的组合物，其中该试剂可以是标记分子，如被主要加载至脂质体膜的荧光团标记的脂质或放射性的脂质；或小分子量造影剂，其可以被包封至含水核中；用于修饰预制的脂质体的特征，其中该试剂可以是经修饰的脂质，如脂质聚合物(如PEG化脂质)；膜相容的組分(其可影响脂质体膜的流动性/刚性因而影响渗透性)、脂肪酸、带电荷的脂质和脂质样物质(其可促进脂质体的靶向(如用于细胞转染))。当在将治疗剂加载至脂质体前或在此期间它们在脂质体中的存在可以降低加载效力时(即它们的存在可以干扰药物的加载)，则将此类物质加载至预制的脂质体可具有优势；用于加载水溶性分子或在生理性介质中基本上可溶的分子，在所述情况下该分子将被引入至脂质体内的水相；用于大分子如脂质、聚合物、多糖的加载；用于在实际使用前将不稳定的脂质体组分(如不稳定的脂质)并入至预制的脂质体；用于加载颗粒物质，如纳米粒子或微米粒子(如碳纳米管)、量子点、聚合物聚集物。在这种情况下，先决条件是所述粒子具有比预制的脂质体平均直径更小的直径以便允许将该粒子有效地引入至脂质体的水室。应了解，迄今为止，在制备脂质体的期间规定了脂质体的组成。本发明提供在事实上已经形成脂质体后，使技术人员"种植，，材料至脂质体膜的技术。这允许技术人员形成某些脂质组成的脂质体，并且在已经形成脂质体后，随后将其他材料加入至脂质体膜。可使用这种新概念，例如形成某些脂质组成的脂质体，然后通过跨膜活性的加载将药物加载至脂质体，并且只有药物被加载以使脂质加至脂质体膜。此过程的优势是在添加的脂质干扰药物加载的情况下使脂质体的药物加载最大化。已经理解本发明的加载方面的本领域技术人员应该很好地理解，各种类型的试剂可被加载至脂质体，因而上文详述的一些类型的试剂仅用于示列表。根据本发明的加载方面的另一个实施方案，提供了一种用于减少材料(称为物质)在流体介质(fluidmedium)中的量的方法。根据此实施方案的方法包括使流体介质与预制的脂质体接触；和对预制的脂质体进行US辐射，所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性并由此允许将所述物质加载至所述脂质体的参数。如上文所述，步骤的次序是非限制性的，原则上流体介质与预制的脂质体的所述接触可在所述辐射前或后。流体介质可以是任何介质，在所述介质中脂质体的完整性基本上得以保持。根据一个实施方案，流体介质是需要纯化或清洗的生物流体(biologicalfluid)或任何含水介质(如溶液)。术语“生物流体”包括从活体中(体液)或从植物原料中提取的任何流体。如本领域技术人员所理解，生物流体可包括任何细胞外液(ECF)，如对其不加限制，全血、血浆、血清、组织液、淋巴液、脑脊液、GI道液、滑液、眼睛和耳朵的流体、胸膜液、心包液、腹膜液、肾小球滤液等。根据一个实施方案，生物流体可从受治疗者机体提取，经离体(exv/vo)处理以便从其中去除至少一部分物质，然后将经处理的流体重引入至相同或其他的受治疗者。本领域技术人员可以理解，这些方法可代替常规的肾透析、血浆置换方案以用于血液解毒作用及用于其他应用。根据本发明的加载方面的又一个实施方案，提供了一种用于减少物质在受治疗者机体中的水平的方法(有时是指本文的#《加载方法)，所述方法包括以允许所述脂质体与所迷物质之间接触的方式对所述受治疗者(受治疗者的血流或器官或组织)施用一定量的预制的脂质体；和对预制的脂质体进行US辐射，所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性以便允许将所述物质加载至所述脂质体的参数，因而导致所述物质在所述受治疗者的水平的减少。同时在此情况中，方法步骤的次序可互换，以使预制的脂质体的辐射可发生在施用脂质体至所述受治疗者前或后不久。本领域技术人员还应该理解，在受治疗者体内捕获物质后，脂质体可通过常规方法如通过透析、血浆置换、使用磁性颗粒和通过在体内的天然生化过程来去除。本发明应该不受限于去除加载的脂质体的具体机理。在受治疗者体内的物质可被限制于受治疗者的特定区域或器官或组织，或在受治疗者体液和/或循环系统之内是游离的。根据一个实施方案，物质在受治疗者体内是游离的。本发明这个实施方案的上下文中的术语"游庠，，用于表示物质不是化学或物理地与受治疗者体内的细胞、组织或器官结合，即基本上在其存在的流体介质内自由移动。一旦在受治疗者体内，预制的脂质体的辐射需要这样的辐射参数(在本文前面描述)所述辐射基本上不会对受治疗者机体(如组织或器官)造成不可逆的损害。损害是指以不可逆的方式损伤了受辐射的细胞、组织或器官的才几能的效应。根据本发明的^在加载方法，物质可以是任何物质，其在体内有不希望的生化效应，或以在体内产生(以所迷浓度)不希望的生化效应的浓度存在，或在体内不再需要其存在。这可包括但不限于，例如药物(如在药物过量的情况下)；显像剂(在显像程序后)；毒剂(如因为中毒或在暴露于毒素或任何其他化学化合物(如包含金属的络合物)后)；脂肪酸、脂质、代谢物、激素、蛋白质、肽(如当此类物质以不平4軒/高的水平在体内存在时)；矿物质等。此外，本发明也可用于在细胞内的物质的去除和由预制的空脂质体捕获该物质。这种应用的例子可涉及过量胆固醇或过量铁(如在地中海贫血患者)的去除。应了解，"辐射时间"后，本文指出机体可被辐射单次(单辐射处理)或几次。不同的辐射时间可包括辐射范围从几毫秒至几小时、和有时几天的时间窗。进一步，当辐射体内的特定靶如特定器官或其部分时，辐射可以是连续辐射或脉冲辐射(如避免使受辐射的靶过热)。所述靶也可通过使用单辐射源(如单超声换能器)或通过使用从被聚焦在同一靶区域上的不同部位的几种源来辐射。根据本发明的加载方面，还提供了试剂盒，该试剂盒包括预制的脂质体的组合物和对所述预制脂质体的组合物进行US辐射的说明书，所述说明书确定辐射参数，所述辐射参数诱导预制的脂质体渗透性的增加，以便当受辐射的脂质体被带入而与试剂接触时至少一部分所述试剂被加载至所述脂质体。当使用用于物质的原位加载的试剂盒时，该说明书还可包括制备施用至受治疗者机体的预制的脂质体的组合物必需的步骤、施用的剂量和方式、和为了进行本发明的原位方法必需的任何其他说明书。根据本发明的加载方面，还提供了预制的脂质体用于制备从受治疗者机体去除物质的药物组合物的用途，当所述组合物在所述受治疗者体内时，所述组合物预期与将所述预制的脂质体暴露于US辐射组合使用。现在提及本发'效付#^乂方^，其特别提供了一种用于稳定加载至所述脂质体的试剂从脂质体中受控的量子释放的方法，所述方法包括对所述脂质体进行一系列两次或更多次US辐射时间，每次US辐射时间包括有效地增加所述脂质体的渗透性的参数，由此允许在相同部位或在不同的机体部位上从所述脂质体中释放预定量的所述试剂。本文所用的术语"《#好#^^^^"表示一定量的试剂从脂质体分步释放至脂质体周围，所述量通过使用特定的膜组成和/或所选的辐射参数来控制。分步释放还表示在每次辐射时间中释放的试剂量是脂质体内试剂的起初总量的一部分。例如，受控的量子释放可被设计以便在一系列的10次辐射中，每次辐射时间释放试剂总量的约10%。选择性地，根据治疗方案，释放可被调整以便在每次辐射时间释放不同量的试剂，不管根据预定计划还是根据在个体中测试的临床参数。为了促进这样的释放特征，辐射时间不需要纟皮相同的参数限定。例如，为了控制试剂从脂质体的量子释^:,根据预定的特征，首次辐射时间可最短(如毫秒)和随后的每次辐射时间可以是稍微更长的持续时间。频率还可在辐射时间和其他辐射参数之间变化。本发明的释》丈方法可尤其适用于水溶性分子或在生理性介质中基本上可溶的分子的释放，在所述的情况下分子被包封在脂质体内的水相中；大分子如脂质、聚合物、多糖等的释放，所述大分子可^f皮结合在脂质膜和/或脂质体内的水相中；颗粒物质如纳米粒子或微米粒子(如碳纳米管)、量子点、聚合物聚集物等的释放。在后者的情况下，先决条件是所述粒子具有比预制的脂质体平均直径更小的直径以便允许将该粒子包封在脂质体的水室中。应了解，为了促进从脂质体受控的量子释放试剂，先决条件是试剂稳定地加载在脂质体内。稳定的加载表示在4。C贮存至少一个月的期间从脂质体释放的试剂不超过10%。在两次或更多次辐射时间的系列中辐射之间的时间期限可从几毫秒、几小时至几天变化。应该了解，施用后脂质体有时可存在于血液循环中且其半衰期超过70小时，和存在于靶组织且其半衰期如200小时一样长。因此，根据本发明的释放方面的方法可包括几种施用脂质体的时间表，每次施用后是一系列两次或更多次辐射时间。进一步，根据本发明的释放方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括包封试剂的脂质体组合物，和施用所迷脂质体组合物至所述受治疗者后，对受治疗者机体应用一系列两次或更多次US辐射时间的说明书，所述说明书包括在确定的辐射时间的期间确定每次辐射时间的辐射参数和从所述脂质体释放的试剂量的指示。选择性地，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括包封试剂的脂质体组合物，和施用所述脂质体组合物至所述受治疗者后，对受治疗者机体应用一系列两次或更多次US辐射时间的说明书，所述说明书包括与患者和疾病相关的参数对应的治疗方案的指示，所述治疗方案确定辐射参数。所述指示可以各种形式提供。根据一个实施方案，指示可以校准曲线或表的形式被提供，其绘制作为辐射参数函数的试剂从脂质体释放的百分比/量。贯穿本申请的说明书和权利要求，单数形式"一个，、"一种，和"该，包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有说明。因此，例如所提及的"一种脂质体"是指一种或多种脂质体的涵义，和"一种试剂"是指一种或多种试剂。贯穿本申请的说明书和权利要求，用语的复数形式也包括单数涵义，除非上下文中清楚地另有说明。然而，贯穿本申请的说明书和权利要求，用语"逸^，和"舍^，及其变化(例如"逸^，和"逸無7")是指"逸在但不厲f，并不是用来(和不会)排除其他部分、添加物、组分、整体或步骤。下面将通过非限定性实施例，来描述本发明。一些非限定性实施例的描述实施例1-使用超声(us)加载至脂质体低频US对膜完整性和荧光黄(Pvranine)摄取的影响在下述的试l^中，随后将高亲水的、膜不可渗透的荧光化合物荧光黄(MolecularProbes,Eugene,OR)4聂取至SSL。为此，将荧光黄加至SSL的外介质，如由Avnir等[Avnir,Y.;Barenholz,Y.,v4w"/.ftoc/2ew.2005,347(1),34-41]描述。然后将SSL分散体暴露于LFUS(3.3W/cm2)，并加入阴离子交换树脂Dowex1X8以去除非脂质体荧光黄。脂质体内的焚光黄检测基于在507nm的荧光发射强度、pH独立的等吸光点(在415nm激发)[Bing,S.G.;等爿附，J.P/y^zo/.Ce〃尸/2",0/.1998,275(4),C1158陽C1166〗。为了衰变任何残留的非脂质体焚光黄的荧光，在膜不可渗透的荧光淬灭剂DPX(对二曱苯-二溴化吡咬，MolecularProbes)的存在下进行荧光测量[Clerc,S.;Barenholz,Y.,说oc/n'附.说'o//jj^.爿cto'说o附em/)raw^1995,1240(2),257-265],这将在下文讨论，脂质体渗透性在暴露于LFUS期间瞬时升高，因而诱导荧光黄加载至脂质体间的水室。低温透射式电子显微镜(低温TEM)在Hannah和GeorgeKrumholz高级显微镜实验室(HannahandGeorgeKmmholzLaboratoryforAdvancedMicroscopy,Technion,Haifa,Israel)进行低温TEM操作。对于每个试验，以在5%(w/v)右旋糖中50mM和5mM的浓度、总体积400jiL使用脂质分散体。在25。C和100%相对湿度下在控制的环境玻璃化系统中制备样本，并在120kV下操作的PhilipsCM120低温电子显微镜检定。低于-178。C下在显微镜中平衡样本，然后以低剂量显像方式检定以使电子束辐射损害降至最小，且在4-7nm额定的弱聚焦时记录以增强相差[Simberg,D.等J.说W.Oem.2001,276(50),47453-47459]。使用OxfordCT-3500冷却台。通过GatanMultiScan791CCD照相机使用DigitalMicrograph3.1软件包数字记录图像。结果LFUS瞬时破裂脂质体膜基于获得的结果及不受特定机理的束缚，因而提出LFUS诱导脂质体脂质双层的瞬时破裂，从而释放加载的药物。如果在这种情况下，然后LFUS还可导致脂质体外的介质溶质渗漏至脂质体内的水室。这通过在辐射前将水溶性、带高负电荷的、膜不可渗透的荧光团一荧光黄一加至脂质体外的含水介质来测试。然后辐射脂质体分散体，定量荧光黄在脂质体内的水室中的水平。图l显示荧光黄被吸收至脂质体的水室，并具有与SSL于LFUS的暴露时间成比例的摄取水平。这些发现支持瞬时的脂质体膜破裂和/或孔样膜缺陷的形成作为LFUS诱导的快速药物释放的机理，随后脂质双层重排/重新密封的假设。一级释放动力学数据(参见上文讨论)也支持这种机理。实施例2—通过LFUS将脂质和其他物质引入至脂质体下述实施例提出在形成脂质体后，使用LFUS将脂质引入至脂质体膜。才才泮牛和方法将HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱，Lipoid,Ludwigshafen,Germany)48mM、胆固醇(Sigma,St.Louis,MO)36mM和OG誦PE國(OregonGreen-l,2-双十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺[DMPE]，MolecularProbes)0.336pmol每2mL脂质体分散体于70。C下溶解至无水乙醇中，然后被快速注射至以乙醇对緩沖液l:10(体积)比率的醋酸钙(Sigma)含水緩冲液(200mM,pH6.5)，以形成多层嚢泡。使用Lipex挤压机(NorthernLipids,Vancouver,Canada),将这些多层嚢泡分步挤压通过聚碳酸酯膜(Osmonics,Trevose，PA)而使其被缩小(downsize)至直径400nm。将300脂质体的分散体置于HPLC玻璃样品管形瓶(0.5mL)，并在室温下保持在水浴中。用乙醇稀释20摩尔％的阳离子脂质1,2-二油酰基-3-三曱基-丙烷氯化铵(DOTAP)或阴离子脂质1,2-二肉豆蔻酰基-训-甘油基+二氧磷基-消旋画(1-甘油)]钠盐(DMPG)(都得自AvantiPolarLipids(Alabaster,AL)),然后加至脂质体分散体。然后使用保持在离样品管形瓶-5mm的距离的13-mm直径探针，通过LFUS(20kHz,VC400SonicsandMaterials,Newtown,CT)以4.2W/cm2，辐射样品60秒。分析将每种样品的10等分试样在1mL20mMHEPES(pH7.5)中稀释，4吏用ZetasizerNano-Z(MalvernInstruments,UK)在25。C下分才斤斗立^圣和zeta电位(3次，每次30秒)。结果图2显示用阳离子脂质DOTAP培育(-0.05mV)或用阴离子脂质DMPG培育(0,005mV)的脂质体的zeta电位与对照的相似(-0.0031mV)。在另一个方面，在用阳离子或阴离子脂质培育且暴露于LFUS的脂质体中测量到显著的zeta电位改变。对于用阳离子脂质DOTAP培育的脂质体，在暴露于LFUS后zeta电位值升高至36.13mV,而用DMPG培育且暴露于LFUS的脂质体显示zeta电位值-61.53mV。这些数据表明LFUS能将脂质并入至脂质体的膜，甚至在形成脂质体后。此外，必须了解，发现经LFUS处理和未处理的脂质体的平均直径相似(土3%),并且暴露于LFUS但并不是荷电脂质的脂质体的zeta电位保持在基线(对照)。因此，可以得出结论，LFUS是有助于将脂质并入至脂质体膜的有效手段，甚至在脂质体形成后一段长的时间。实施例3-使用超声(US)从脂质体受控释放药物材料与方法脂质体制备将51摩尔％分子量为750的氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)(Lipoid,Ludwigshafen,Germany)、5摩尔％分子量为2774的聚乙二醇二硬脂酰磷酸乙醇胺(m，OpEG陽DSPE)(Genzyme,Liestal,Switzerland)和44摩尔％胆固醇(Sigma,St.Louis,MO)于62-65。C(高于HSPC的脂质相变温度Tm,53°C)在无水乙醇(Gadot,Haifa,Israel)中溶解。在62-65。C下将所得溶液加至醋酸4丐、硫酸铵或顺铂的含水溶液，以形成多层嚢泡(MLV),在[Pons,M.等./W.J.尸/2wtw.1993,95(1),51-56]描述。使用Lipex挤压机(NorthernLipids,Vancouver,Canada)将MLV分步挤压通过聚^友酸酯膜(Osmonics,Trevose,PA)而使MLV缩小(其孔径开始为400nm、最后为50nm)，从而形成小单层嚢泡(SUV)。因此，本研究所用的所有脂质体制剂空间稳定(SSL)、脂质组成相同(HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE)和粒径分布相同(100nm)，^旦包封的药物和药物加载的方法不同。药物加载^差/关Vg在V^芋磁磁^鉤^fM尸S)使用高脂质体内/低脂质体外(介质)的跨膜醋酸钓梯度将分子量为496.53、高效抗炎类固醇、弱酸(pKa4.65)的甲基泼尼松龙半琥珀酸钠盐(MPS)(Pharmacia,Puurs,Belgium)远程加载至脂质体，这先前已有开发[Clerc,S.等.5/oc/h'柳.^S/o/7/2;^.爿"a，5z'o附e附Z)rafwes1995,1240(2),257-265],而最近适用于MPS的远程加载[参见国际专利申请公开WO2006/027787]。对于SSL-MPS的制备(MPS被加载至空间稳定的脂质体)，脂质在醋酸钙(200mM)、右旋糖(5%,w/v)含水溶液(pH6.5)中水合以形成MLV,然后通过^f压使其缩小以形成100nmSUV(参见2.1)。通过透析，由用5%右旋糖(pH4.0)替代非脂质体的醋酸钙建立跨膜醋酸钓梯度。然后通过62-65°C下于8mg/mLMPS在5%右旋糖中的溶液培育脂质体分散体1小时，将MPS加载至脂质体。通过对5%右旋糖透析和/或通过阴离子交换剂Dowex1X8(Sigma)去除未加载的MPS。最后MPS-SSL具有0.33的药物对^M旨摩尔比率。/^#,使用抗癌脂质体药物Doxil，其中利用高脂质体内/低脂质体外的硫酸铵梯度将两亲性弱碱化疗剂阿霉素远程加载至SSL[Haran,G.等A》c/Hm.说op/2，.说omem^ra"es1993,1151(2),201-215]。平均脂质体直径为~100nm和药物对脂质摩尔比率为0.3。ALZA(MountainView,CA)的赠品Doxil以与10%w/v蔗糖的等渗悬浮液供应，所述悬浮液每mL的10mM组氨酸缓冲液(pH6.5)包含2mg阿霉素。/,韵4要,瞎、Peleg-Shulman在[Peleg誦Shulman,T.等.6/oc/2/柳.B/o//2>w.jctaf,说owe附Z)rawes2001,1510(1-2),278-291]的描述，制备被动加载有抗癌化疗剂顺铂的SSL("隐形"顺铂)。平均脂质体直径为110nm和药物对脂质摩尔比率为0.032。ALZA的赠品隐形顺铂以等渗悬浮液供应，所述悬浮液含有10%w/v蔗糖中的1mg/mL顺粕、1mM氯化钠和10mM组氨酸緩冲液(pH6.5)。表1总结了三种药物加载的参数表l:药物脂质体特征<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>药物/脂质(摩尔比率)0.330.300.032脂质組成51摩尔。/。氬化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、5摩尔°/。聚乙二醇二硬脂酰磷酸乙醇胺(mPEG2000-DSPE)和44摩尔％胆固醇直径~100nm超声装置斜使用20-kHz低频超声处理仪，LFUS(VC400,Sonics&Materials,Newtown,CT)。在含有3mL脂质体分散体的玻璃闪烁管形瓶中浸入超声探针(13mm直径)。在变化的强度(从0至7W/cm"和持续时间(O至180秒)以全工作周期进行辐射。将样品管形瓶置于温度可控的水浴中，并且在整个试验中监控其温度(37。C)以防止热诱导的脂质体的药物释放[Mamyama,K.等说oc&附.说o/7/y^.1993,1149(2),209-16;Sharma,D.等Afd朋omato.1998,8(3),240-244;和Unezaki,S.等尸A謹.to.1994,11(8),1180-5]。谬^渗寻.将在200不含血清的pH7.4磷酸盐緩冲盐水(PBS)中悬浮的一百万个J6456淋巴瘤肺瘤细胞腹膜内(i.p.)注射至13只8周龄的BALB/c雌性小鼠(HarlanLabs,Jerusalem,Israel)[Gabizon,A.等.4<iv.Z)rwgDWveo;Wev.1997,24(2-3),337-344]。细胞接种后一周，观察腹部肿瘤。动物分成三个试验组(i)对照(安慰剂)、(ii)不进行LFUS的脂质体顺柏；和(iii)脂质体顺铂+LFUS。秀浙浴《脂质体顺铂组(ii和iii)用2mLPBS中的脂质体分散体(15mg药物每kg体重)直接i.p.施用至肿瘤~2cm的深处。对照组用2mLPBS治疗。然后，在乙醚浴中麻醉三个组的所有小鼠，两小时后将之处死。从肿瘤中提取药物并对其定量(参见下文)。超声^理药物治疗后，将用脂质体顺铂+LFUS治疗的組的动物麻醉，去除其肿瘤之上的腹部毛。使用硅橡胶糊剂(siliconepaste)(Bayer)将两端开口的橡胶圓筒密封至肿瘤之上的腹部。将LFUS探针插入至高出皮肤5mm的水填充的圆筒。以5.9W/cm2的强度进行LFUS辐射达120秒。浙定/^#傳逸封时々斧放的>^凝治疗后两小时，处死动物，将2mLPBS注射至肺瘤，按摩(massague)腹部区域以使肺瘤细胞和细胞外液游离(free)。使用注射器吸取胂瘤液，将其离心以从细胞外液分离细胞。通过凝胶渗透色谱法(GPC)用色谱法分析细胞外液，从而分离未释放的、脂质体包封的顺铂(SSL-顺铂)与释放的顺铂。通过原子吸收光i普法(specrosc叩y)(AAS)定量GPC馏分和肺瘤细胞(参见章节2.4.5.2)。分析试-验步骤遞i^C^逸y法薄层凝胶色谱法(TLC)用于测定通过暴露于超声辐射是否在脂质体脂质中诱导任何化学变化。在超声辐射前和后，通过Bligh和Dyer试验步骤提取脂质体分散体的脂质[Bligh,E.G.和Dyer,W.,Ca".</.说oc/em.尸/^wo/.1959,37,911-917]，并通过TLC(silicagel60,Merck,Darmstadt,Germany)对其分析，这使用氯仿/曱醇/水(体积比65:25:4)溶剂系统展开。通过用在6.8%v/v磷酸(BioLab,Jerusalm,Israel)中的1.6M硫酸铜(Sigma)喷雾板并用热空气千燥板，进行点检测[Brailoiu,E.等.说owedC/2ram加ograp/2.1994,8(4),193-5;Rodriguez,S.等.2000，35(9),]033-1036;和B細holz,Y.禾口Amselem,S.,gwa/砂co欣o//wf/ie<ieve/o/wewf"wdCca/wse0//^paowe-Z)ased/or附M/c^/ows丄^cwo/werec/7"o/ogy.第二片反；CRC:BocaRaton,FL,1993]。^^^谬义v、^^r为Vf使用装备有ALV-5000/EPP多重数字相关器的ALV-NIBS/HPPS粒度仪(ALV,Langen,Germany),通过动态光散射(DLS)以173。的散射角，测量LFUS辐射前和后的脂质体大小分布。使用ALV/CGS-3紧凑测角仪系统(ALV),以三个其他角度(30。、90。、150。)的DLS来验证这些测量结果。对于后者，还测量DLS信号的强度。使用在5mL聚丙烯柱(直径1cm)(Pierce,Rockford,IL)中填充的润湿的SephadexG-50细(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上的GPC，用色^普法分析受超声辐射和未受辐射的脂质体顺铂分散体；通过以580g离心去除过量柱水。然后，将150脂质体分散体的等分试样加至柱，并以580g离心。收集空隙体积处的SSL[Druckmann,S.等万/oc/h附.S,o;/2"'.^cto1989,980(3),381-4;Gabizon,A.等C/,力.尸/麵腳/b威2003,42(5),419-436]，使用改进的Bartlett方法，定量SSL裤脂[Gabizon,A.等.C/肌尸/2"wwcoA:/m".2003,42(5),419-436和Bartlett，G.R.说V/.C7e附.1959,234(3),466-468]。通过AAS(参见下面2.4.5.2)测定顺铂水平，计算药物对脂质摩尔比率。顺钩生物活性用顺铂敏感性的C26鼠结肠腺癌细胞测试SSL顺铂、和经暴露于LFUS而从SSL释放的顺铂、和游离顺铂的细胞毒性。细胞培养基由RPMI1640与L-谷氨酰胺90%、胎牛血清(过滤了病毒)9%和青霉素-链霉素溶液1%(所有得自BiologicalIndustries,BeitHaemek,Israel)组成。将每孑L800细胞的等分试样置于96孔板(Nunc,Roskilde,Denmark),并在5%C02下于37。C培育24小时。将等量的(15^L)未受辐射的和受LFUS辐射的SSL顺铂分散体、和游离的未受辐射的顺铂(O至45在盐水中的1昭/mL顺粕(Sigma))加至各自的孔，并培育24小时。然后，通过与在水中的2.5%v/v戊二醛(Sigma)培育15分钟来固定存活细胞。用水然后用0.1MpH8.7的硼酸緩冲液(Sigma)洗掉未固定的细胞，通过在37。C培育1小时用1%亚甲蓝(Sigma)染色。处理后，从孔中洗去过剩染剂。通过加入0.1MHC1后测量620nm时的吸光度，定量细胞存活率[Oliver,M.H.等丄Ce〃1989,92(3),513-518]。药物和梯度定量LFUS辐射后即刻去除释放的药物，定量在脂质体中剩余的药物。使用离子交换树脂吸附释放的药物MPS用Dowex1X8阴离子交换剂(Sigma)和阿霉素用Dowex50W阳离子交换剂(Sigma)[Storm,G.等.S/oc/h'朋.Bz'op/y^.爿cto，BiomewZ)ra!wm1985,818(3),343-351]。4吏用Sepharose6B(Sigma)，通过凝胶排阻色谱法去除LFUS释放的顺铂[Diederichs,J.E.,五/e"ra;/2wu^1996,17(3),607-611;Mora,R.等.J丄—t/版1990,31(10),1793-1807]。定量在SSL中剩余的药物水平对于MPS通过HPLC，对于阿霉素用焚光，以及对于顺铂用AAS(参见下文)。M尸S使用HPLC测定MPS浓度和化学完整性(HewlettPackardLiquidChromatograph1090)。ChemStation软件(HewlettPackard)控制所有才莫块，和其用于色谙数据的分析。所使用的分析柱是C185-微米Econosphere,长度为150mm，内径为4.6mm(Alltech,Carnforth,UK)。样品注射体积为20jxL。以245nm波长和10nm带宽监控洗脱液。以1mL/分钟的流动速率递送pH5.8醋酸盐緩冲液和乙腈(67:33,Wv)的流动相[Smith,M.D.,J.C/^cwatogr.1979,164(2),129-137;Smith,M.D.等.J.C/2ramatog.1979,168(1),163-9]。MPS平均洗脱时间为2.9分钟，和样品运行时间为5分钟。,韵通过195PtNMR光语法进行超声释放的顺铂的完整性分析。使用标准脉冲序列，借助INOVA500-MHz光镨仪(Varian,PaloAlto,CA)进行试验。相对于K2PtCU的外部参考信号(设定在-l,624ppm),确定Pt化学位移。正常应用300Hz的语线增宽，并且使用VNMR软件(Varian)处理数据[Peleg-Shulman,T.等.5z'oc/'w.5z'op/;^.爿cto，S/owe/w^/^wes2001,1510(1-2),278-291〗。使用Zeeman原子吸收光谱仪SpectAA300(Varian)，通过在2700°C(X=265.9nm)Pt的AAS,对照标准Pt溶液(BDHChemicals,Poole,UK)，定量顺鉑。阿霉素使用装备有WinLabPE-FL软件(PerkinElmer)的LS50B发光光谱仪(PerkinElmer,Wellesley,MA),在酸性异丙醇(0.075NHC1)中崩解脂质体后，通过测定在590nm时(480nm激发)荧光发射强度，对照阿霉素标准曲线，定量阿霉素[Gabizon,A.等.Ca"c^^".1994,54(4),987-992]。醋酸盐梯度使用Megazyme(Wicklow,Ireland)醋酸检测试剂盒，酶法测定LFUS释放的醋酸盐和脂质体内的醋酸盐的水平。脂质体内的醋酸盐的测定需要经乙醇的脂质体溶出度，因而用与分析物中相同量的乙醇制作醋酸标准曲线[W02006/027787]。结果超声振幅对药物释放的影响初次检验证实了脂质体药物释放对超声振幅的依赖性。通过LFUS60秒，辐射加载药物的脂质体分散体[本发明选择的此辐射持续时间处于曲线的部分，在所述曲线部分中药物释放不会趋于平稳]。样品之间辐射振幅的增加各异，范围从0W/cm、未辐射，即对照)至7W/cm2。图3显示脂质体MPS释放对超声振幅的依赖性是双相性的。两相都是线性，但它们的斜率不同，低斜率(3.9[。/。释放/(W/cm勺])达1.3W/cm2的振幅，和较高斜率(16.1)高于此振幅。高于~1.3W/cr^药物释放的增加通过高于此能量阈值瞬时空化的启动(即在液体中气泡的形成、生长和内爆塌陷)来解释[Mitragotri,S.;Kost,J.,Asv.Z)n/gDe/zveo;itev.2004,56(5),589-601]。因此，应了解，空化发生在脂质体膜附近、在脂质体外介质中和/或通过小空化核在脂质体内的水室中。当保持在37。C时，在试验期间含有三种药物(阿霉素、顺铂和MPS)中每一种的未受辐射的SSL释放加载的药物。。/。。进一步了解，未受辐射的SSL显示在6个月期间药物渗漏少于10%(数据未显示)。辐射时间对释;^丈水平的影响通过LFUS以等幅(3.3W/cm2),辐射含有药物阿霉素、顺铂或MPS的SSL、或具有高脂质体内/低脂质体外的醋酸盐梯度的SSL(用于远程加载MPS的驱动力)达0至180秒不同的时间。对于加载有MPS的SSL，在辐射的前150秒释放药物的~80%，之后药物释;^丈趋于平稳。其他制剂阿霉素、顺铂和醋酸盐具有相似的曲线特征，但略微更低的释放水平(图4)。这些数据显示脂质体药物的基本释放可通过短期暴露于LFUS来获得。因而此效应定义为"倾卸(dumping)",意味着大多数包封的药物在短时段内释放，从而在受辐射的SSL附近形成药物的高浓度。分析药物释放数据揭示了以固定的超声振幅超声触发的脂质体的药物释放(达150秒)遵循一级动力学或以其积分形式log(^^4)="，其中dA/dt是浓度随时间的变化，A是一级速率常数，A是加载在脂质体中药物的初始量，和j是辐射时间z后脂质体中药物的剩余量，这表示对于给定的脂质体药物，释^:取决于辐射时间。下述是针对LFUS诱导的释放测定的一级速率常数⑨对于MPS为0.0053s"，对于顺铂为0.0029，对于阿霉素为0.0033，和对于醋酸盐为0.0031(R2分别为0.994、0,995、0.992和0.992)。LFUS辐射特征对药物释放的影响以3.3W/cn^的振幅辐射含有MPS的脂质体分散体达不同的时间，将连续辐射的样品的药物释放与通过脉冲的方式辐射达相同的累积辐射时间的那些比车支。图5显示就暴露于LFUS的实际时间而言，连续和脉冲的LFUS方式的药物释放特征几乎相同，这表明药物释放仅取决于实际辐射时间以及表明辐射对脂质体药物释;^丈的影响是累积的。因而，可以连续或脉冲的方式实施辐射来获得相同的药物释放。这些结果对临床应用很重要，其中几次重复的短暴露通常优于一次长暴露，为了防止对组织产生与加热相关的伤害。秀務#",爻仅在菜/^LR/S雀處好河/^发'^:应很好地理解，LFUS能增加生物膜的渗透性，以及辐射结束后渗透性增加将保持一l殳长的时间[Kost,丄；Langer,R.,J.v4cow立1989,86(2),855;Duvshani-Eshet,M.等.77^.2006,13(2),163-172;Rap叩ort,N.等爿rc/.5/oc/e附.说o//2"'.1997,344(1),114-124]。目前显示LFUS能增加脂质体膜的渗透性，继而使药物释放。测试渗透性增加是否会延长或仅限于辐射期间。为此，以3.3W/cm2辐射脂质体分散体达30至180秒的时间，并且在辐射后和72小时以后立即测定药物释^L。释放的药物水平在两种时间下是相同的(数据点重叠，未显示)。这表明脂质体膜增加的渗透性是瞬时的且仅在暴露于LFUS期间发生；辐射终止后脂质体膜再次成为不可渗透的，同时药物释放停止。将这些结果与脉沖释放中显示的数据组合，表明LFUS可用于控制在延长时段的药物释放水平，这对于成功的药物递送是非常重要的。腐群潜种顺温7W为、浙通过低温透射式电子显微镜(低温TEM)，检测暴露于LFUS前和后的脂质体结构。图6a显示用MPS加载前和暴露于LFUS前的脂质体。清楚地注意到脂质体膜作为围绕内部的水室的脂质体略微更暗的周界。图6b显示借助于醋酸钙跨膜梯度，用MPS远程加载的SSL。最有可能作为MPS钓沉淀物的加载的药物显示为在SSL水室内更暗的区域。图6c显示以3.3W/cm2辐射达120秒的脂质体MPS。辐射后注意到脂质体膜的外观或脂质体大小没有变化。在所有的情况中，通过低温TEM指示的脂质体直径与DLS测量值具有很好的相关性(在3.3.5中提供)。但是，LFUS看来对脂质体内的MPS沉淀物的外观具有很大的影响。尽管未受辐射的SSL显示在脂质体内的水相中有大量的沉淀(图6b),但是受辐射的脂质体(图6c)看来是空的或有非常少的沉淀，这与通过暴露于LFUS释放MPS相一致，如图4所示。不受理论的束縛，这些发现表明LFUS诱导在脂质体膜中的瞬时多孔的缺陷，继而使药物释放成为可能，这仅在暴露于LFUS的期间发生，所述期间之后，膜完整性恢复。丄f77S渗导命》V^傘W破袭目前发现当LFUS辐射时间增加时，脂质体分散体的浊度减少。此效应发生在所有三种脂质体药物制剂阿霉素、顺铂和MPS以及也在不含药物的脂质体中(对于MPS在图7中示例)。不受理论的束博，这种浊度的变化可能的解释是脂质体大小的减小[Woodbury,D.丄等.J.丄/》owwe尺m.2006,16(1),57-80;Pereira國Lachataignerais,J.;等.C&附.尸/y^.丄/p/A2006,140(l曙2),88-97]。通过以四个不同的角度(30。、卯。、150°和173。)使用动态光散射(DLS)，测量受LFUS辐射的脂质体的直径，来测试这种假设；实施宽广和狭窄的角度的使用，以分别更敏感地测试更小或更大的脂质体的存在[Hiemenz,P.C,W脂》/eso/Co〃o/(iSw/^fceC7ze她吵.第三版；MarcelDekker:NewYork,1997;Beme,B.丄；Pecora,R.,D，画/c丄妙f&a"m>7g.JohnWiley和Sons:NewYork,2000])。此结果表示脂质体直径保持不受影响，不依赖辐射时间(参见图890。时的DLS数据)。因此，本文提出浊度的减少不是归因于SSL直径减小或药物释放的减少，而是归因于分散体中因一些脂质体分解而导致的脂质体数目的降低。以两种不同的方式测试这种假设(i)通过记录受辐射达不同时间的脂质体分散体的DLS信号强度，(ii)通过直接评价相对于在暴露于LFUS达不同时间的分散体中总磷脂浓度(月旨质体+非脂质体)的脂质体磷脂浓度。对于相同大小分布的脂质体制品，DLS信号强度与在每种分散体中存在的脂质体浓度成比例(每单位体积脂质体的数目)[Hiemenz,P.C,PrinciplesofColloidandSurfaceChemistry,第三版；MarcelDekker:NewYork,1997;Berne,B.J.;Pecora,R.,DynamicLightScattering.JohnWiley和Sons:NewYork,2000]。DLS信号强度随辐射时间的降低(在图7中显示)表明在分散体中存在的脂质体的浓度的降低。总磷脂和脂质体磷脂(在GPC中的脂质体峰)的量的测定揭示了脂质体磷脂的量减少，尽管总磷脂随LFUS辐射时间保持不变(图9)。这进一步支持本文提出的假设，即部分脂质体通过LFUS分解。LFUS辐射140秒后分解的脂质体的分数是受辐射的脂质体的~23%;这与DLS信号强度和在600nm时OD的降低相一致(图9)。但是，在大多数的脂质体中，LFUS仅仅诱导膜的瞬时多孔性而不是完全的脂质体分解，因此，主要的效应是增加的脂质体渗透性，而不是改变脂质体大小分布。受超声辐射的磷脂和药物的化学完整性测试脂质体制剂(包括受辐射的药物和脂质)的化学完整性对于阿霉素和MPS通过HPLC，对于顺铂通过NMR，和对于脂质通过TLC。对包含MPS、阿霉素和顺铂的SSL分散体进行辐射(20kHz,3.3W/cm2)达30秒至180秒的时间，然后使用未受辐射的脂质体分散体作为对照对其分析。受LFUS辐射和未受辐射的药物的HPLC色谱图相同，对于阿霉素和MPS都是，以及受辐射的和未受辐射的顺铂的NMR光谱相同(数据未显示)，这表明在所用的条件下LFUS没有诱导这三种药物的任何化学变化。受辐射和未受辐射的SSL的脂质体脂质提取物通过TLC的分析显示(图10):暴露于LFUS，没有显著的化学变化发生。通过LFUS从SSL释放的药物的细胞毒性通过辐射隐形顺铂达不同的时段，测试LFUS释放的药物的细胞毒性。将这些受LFUS辐射的分散体的等分试样加至顺铂敏感性的C26鼠结肠腺癌细胞的培养物中用于评价药物细胞毒性。随着辐射时间增加，更多的顺铂从脂质体释放。发现细胞毒性与脂质体辐射时间成比例(图11)，且与等量加至细胞的未受辐射的游离顺铂的细胞毒性相似。因此表明经LFUS释放的脂质体顺柏保持其生物活性。^薦^g^^r型^遂丄fi/s斧放^應多廢韵在鼠淋巴瘤^t型中测试LFUS对体内释放药物的可行性。将隐形顺铂直接注射至肿瘤2cm的深处。然后通过LFUS辐射该肿瘤，且如上文所述定量药物释放。暴露于LFUS的几乎90。/。的隐形顺铂被释放，与从未受辐射的脂质体释放少于15%比较(数据未显示)，因而验证经LFUS诱导的脂质体药物体内释放的可行性权利要求1.一种用于将试剂加载至预制的脂质体的方法，所述方法包括(a)使所述预制的脂质体与所述试剂接触；和(b)对所述预制的脂质体进行超声(US)辐射，所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性并由此允许所述物质加载至所述脂质体的参数；所述预制的脂质体与所述试剂的所述接触在所述US辐射前或后。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述US辐射参数包括辐射频率、辐射持续时间、辐射强度、每次辐射时间辐射源的数目、辐射部位、辐射部位的数目、连续辐射或脉冲辐射。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述US辐射是以约18kHz至约1MHz的频率。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述US辐射是以约20KHz至约100kHz的频率。5.才艮据权利要求1至4任何一项所述的方法，其中所述US辐射是连续辐射或脉冲辐射。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连续US辐射或脉冲辐射中的单次辐射时间基于因所述辐射而允许增加所述预制的脂质体的渗透性的辐射参数。7.根据权利要求1至6任何一项所述的方法，其包括所述预制的脂质体的一次或多次、连续或脉冲US辐射时间。8.根据权利要求7所述的方法，其包括具有相同或不同的辐射参数的一系列两次或更多次US辐射时间。9.根据权利要求1至8任何一项所述的方法，其用于将试剂加载至脂质体的一个或两个片层。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述试剂是疏水性分子或两亲性分子。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述试剂是脂质。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述脂质是脂质体形成脂质或非脂质体形成脂质。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述脂质是荷电的脂质、或经修饰的脂质。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述经修饰的脂质包括脂质聚合物、荧光团标记的脂质或;^射性脂质。15.根据权利要求1至8任何一项所述的方法，其用于将所述试剂加载至脂质体含水核。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述试剂是基本上水溶性的分子或基本上在生理性介质中可溶的分子。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述试剂是具有比所述预制的脂质体的平均直径更小的直径的颗粒物质。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述试剂选自碳纳米粒子、量子点、聚合物聚集物。19.根据权利要求1至18任何一项所述的方法，其中所述试剂是药物、脂质或经修饰的脂质、聚合物、蛋白质、多糖、脂肪酸、显像剂、毒剂。20.根据权利要求1至11任何一项所述的方法，其中所迷预制的脂质体在所述辐射前具有低渗透性。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种脂质体形成脂质，所述脂质体形成脂质具有等于或高于40。C的凝胶相至液晶相转变温度(Tm)。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种与胆固醇组合的脂质体形成脂质。23.根据权利要求22所述的方法，其中在所述脂质体中所述胆固醇的量是使得脂质体形成脂质对胆固醇摩尔比率在75:25和50:50之间的量。24.根据权利要求21所述的方法，其中具有等于或高于4(TC的Tm的所述脂质体形成脂质选自氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、N-棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、N-硬脂酰鞘蜂脂、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。25.—种用于减少物质在流体介质或组织中的量的方法，所述方法包括(a)使所述流体介质或组织与预制的脂质体接触；(b)对所述预制的脂质体进行US辐射，所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性并由此允许将所述物质加载至所述脂质体的参数；所述流体介质或组织与所述预制的脂质体的所述接触在所述US辐射前或后。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述流体介质是生物流体。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物流体从受治疗者机体提取，在该生物流体去除至少一部分所述物质后用于重引入至相同或另一受治疗者。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述预制的脂质体被封装于所述生物流体转运通过的柱内。29.根据权利要求26至28任何一项所述的方法，其中所述生物流体包括细胞外液(ECF)。30.—种用于减少物质在受治疗者中的水平的方法，所述方法包括(a)以允许所述脂质体与所述物质之间接触的方式对所述受治疗者施用一定量的预制的脂质体；(b)对所述预制的脂质体进行US辐射，所述US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性并由此加载所述物质至所述脂质体的参数，由此减少在所述受治疗者中所述物质的水平。31.根据权利要求30所迷的方法，其中所述物质在所述受治疗者机体内的区域中或在才几体内的细胞外液中。32.根据权利要求25至31任何一项所述的方法，其中所述US辐射参数包括辐射频率、辐射持续时间、辐射强度、每次辐射时间辐射源的数目、辐射部位、辐射部位的数目、连续辐射或脉冲辐射。33.根据权利要求25至32任何一项所述的方法，其中所述辐射是以约18kHz至约1MHz的频率。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述辐射是以约20kHz至约100kHz的频率。35.根据权利要求25至34任何一项所述的方法，其中所述辐射是连续辐射或脉冲辐射。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述连续辐射或所述脉沖辐射中的单次辐射时间基于因所述辐射而允许增加所述预制的脂质体的渗透性的辐射参数。37.根据权利要求30至36任何一项所述的方法，其中所迷辐射发生在当所述预制的脂质体在所述受治疗者机体内和所述辐射参数基本上不会由于所述辐射而对至少一部分所述受治疗者机体造成不可逆的损害时。38.根据权利要求25至37任何一项所述的方法，其中所述物质被加载至脂质体的膜或至脂质体的含水核。39.根据权利要求30至37任何一项所述的方法，其中所述辐射包括所述预制的脂质体的一次或多次连续或脉冲辐射时间。40.根据权利要求39所迷的方法，其包括具有相同或不同辐射参数的一系列两次或更多次US辐射时间。41.根据权利要求30至40任何一项所述的方法，其中所述物质是药物、显像剂、毒剂、脂肪酸、脂质、代谢物、激素、蛋白质、肽、矿物质、包含金属的化合物、希望从所述流体介质或所述受治疗者机体中去除的物质。42.根据权利要求30至41任何一项所述的方法，其中所述预制的脂质体在辐射前具有低渗透性。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种脂质体形成脂质，所述脂质体形成脂质具有等于或高于4(TC的凝胶相至液晶相转变温度Tm。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种与胆固醇组合的脂质体形成脂质。45.根据权利要求44所述的方法，其中在所述脂质体中所述胆固醇的量是使得脂质体形成脂质对胆固醇摩尔比率在75:25和50:50之间的量。46.根据权利要求43所述的方法，其中具有等于或高于4CTC的Tm的所述脂质体形成脂质选自氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、N-棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、N-硬脂酰鞘裤脂、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。47.根据权利要求30至46任何一项所述的方法，其中所述辐射包括使用两种或更多种辐射源对所述受治疗者机体内确定的靶同时辐射。48.—种试剂盒，其包括(a)预制的脂质体的组合物；(b)对所述预制的脂质体的组合物进行US辐射的说明书，所述说明书确定辐射参数，所述辐射参数诱导所述预制的脂质体渗透性增加，以使当受辐射的脂质体被带入而与试剂接触时至少一部分所述试剂被加载至所述脂质体。49.根据权利要求48所述的试剂盒，其用于实施权利要求1至47任何一项所述的方法。50.预制的脂质体用于制备从受治疗者机体去除物质的药物组合物的用途，当所述组合物在所述受治疗者机体内时，所述组合物预期与将所述预制的脂质体暴露于US辐射组合使用。51.—种用于从脂质体受控的量子释放稳定包封在其中的试剂的方法，所述方法包括对所述脂质体进行一系列两次或更多次的US辐射时间；每次US辐射包括有效地增加所述脂质体的渗透性由此允许从所述脂质体释放一定量的所述试剂的参数。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述US辐射参数包括辐射频率、辐射持续时间、辐射强度、每次辐射时间辐射源的数目、辐射部位、辐射部位的数目、连续辐射或脉沖辐射。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述两次或更多次US辐射时间包括相同或不同的辐射参数。54.根据权利要求51所述的方法，其中所述两次或更多次US辐射时间是以约18kHz至约1MHz之间的相同或不同的频率。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述两次或更多次US辐射时间是以约20kHz至约100kHz之间的相同或不同的频率。56.根据权利要求51至55任何一项所述的方法，其中提供了所述脂质体未被辐射的每次辐射时间之间的时间窗，所述时间窗包括几小时至几天。57.根据权利要求51至56任何一项所述的方法，其中所述脂质体在所述辐射前具有低渗透性。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种脂质体形成脂质，所迷脂质体形成脂质具有等于或高于4(TC的凝胶相至液晶相转变温度Tm。59.根据权利要求57所述的方法，其中所述脂质体包括一种或多种与胆固醇组合的脂质体形成脂质。60.根据权利要求59所述的方法，其中在所述脂质体中所述胆固醇的量是使得脂质体形成脂质对胆固醇摩尔比率在75:25和50:50之间的量。61.根据权利要求58所述的方法，其中具有等于或高于40。C的Tm的所述脂质体形成脂质选自氬化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、N-棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、N-硬脂酰鞘裤脂、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)。62.—种试剂盒，其包括(a)加载有试剂的脂质体的组合物；(b)在对所述受治疗者施用所述脂质体的组合物后，对所述受治疗者机体应用一系列两次或更多次US辐射时间的说明书，所述说明书包括确定每次辐射时间的辐射参数和在确定的辐射时间期间从所述脂质体中释放的试剂量的指示。63.—种试剂盒，其包括(a)加载有试剂的脂质体的组合物；(b)在对所述受治疗者施用所述脂质体的组合物后，对所述受治疗者机体应用一系列两次或更多次US辐射时间的说明书，所述说明书包括与患者和疾病相关参数相对应的治疗方案的指示，所述治疗方案确定辐射参数。64.根据权利要求62或63所述的试剂盒，其中所述指示以校准曲线的形式提供，所述校准曲线绘制作为辐射参数函数的试剂从所述脂质体释;故的百分比。65.根据权利要求62至64任何一项所述的试剂盒，其中所述脂质体包括在辐射前具有低渗透性的脂质体形成脂质。66.根据权利要求62至65任何一项所述的试剂盒，其中所述辐射参数描迷增加持续时间的一系列两次或更多次辐射时间，因而在每次辐射时间期间允许基本上等量的试剂从所述脂质体释放。67.根据权利要求62至66任何一项所述的试剂盒，其用于实施权利要求51至61任何一项所述的方法。68.加载有试剂的脂质体用于制备药物组合物的用途，所迷组合物用于因将所述脂质体暴露于US辐射而使得所述试剂从所述脂质体中受控的量子释放。全文摘要本发明提供用于将试剂和物质加载至预制的脂质体、优选预制的脂质体的悬浮液的方法，和用于将试剂和物质从脂质体中受控的量子(分步)释放的方法。本发明方法的一个主要的特征是将脂质体暴露于具有预定参数的超声辐射，从而导致所述脂质体渗透性的增加，因而分别允许试剂和物质加载至所述脂质体，和/或允许试剂和物质从所述脂质体中释放。文档编号A61K9/00GK101365424SQ200680052544公开日2009年2月11日申请日期2006年12月7日优先权日2005年12月8日发明者伊齐基尔·巴伦霍兹,约瑟夫·考斯特,艾薇·斯科罗德申请人:耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司;奈格夫研究与发展管理局本古里安大学