专利名称：中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因克隆及体外重组表达技术，具体地说是从中华绒鳌蟹cDNA文库中克隆出中华绒鳌蟹抗脂 多糖因子基因的cDNA全序列并对该序列进行了原核重组表达，还涉及到 该基因及其表达产物在药物生产、词料添加剂以及防腐剂和保鲜剂及人类 败血病治疗生产中的应用。
技术背景细菌内毒素引发败血症休克的防治长期以来难获重要突破，其发病率 和死亡率仍呈上升趋势。目前已发现多种具有中和内毒素作用的蛋白质， 如多粘菌素B(PMB)、杀菌渗透性增强蛋白(BPI)等，然而这些中和蛋白多 需预先或在LPS攻击同时给予才有效。抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor, ALF)是一种通过特异性识别R型革兰氏阴性菌LPS亚单位脂质A 而结合并中和内毒素的蛋白质。动物实验研究表明，在内毒素血症发生时、 甚至在内毒素血症的晚期给予ALF，都对实验动物具有良好的保护作用， 其保护作用可能与ALF降低脂多糖(LPS)诱导的炎症因子NO的产生并增加 抗炎因子IL-10的分泌有关。同时，ALF显示了对某些菌株的生长抑制活 性，还可抑制LPS对家兔的致热反应。因此，ALF逐渐成为临床中防治内 毒素血症^一条重要途径。但对于该基因的研究却与其重要的应用前景不 相符。目前仅在丄/mw/ws / o/yp/7em附 (Tanaka et al, 1982) 、 Zito/ e"aews va朋ame/ (Gross et al, 2001)， T^c/^/ /ews ^r/cfewto加(Wang et al， 2001)， 附o朋fifow (Supimgul et al, 2002; Supungul et al, 2004)， Fe朋era/ e朋ews c/n'wews/s (Liu et al, 2004)禾口 Manswpewaews _/apow/cws (Nagoshi et al, 2006)中获得该基因的同源分子。中华绒鳌蟹(五Woc/2e/w/wera/s)又名河蟹，因其营养丰富、味道鲜美而 深受人们喜爱，是我国重要的水产养殖品种之一。自20世纪80年代以来， 中华绒螯蟹养殖业发展迅速，到2000年全国养殖产量已超过100， 000吨， 年产值达120-150亿元，已成为水产养殖支柱产业之一(崔朝霞等，2003)。 但随着养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给中华绒螯蟹养殖产业 造成了巨大损失。养殖中华绒鳌蟹病害的不断爆发及病因的多样性迫切要 求从河蟹自身的免疫防御因子入手，研究其抗病机制和制定新的疾病防治 措施。考虑到当前分离到甲壳类的病原菌多为革兰氏阴性菌，抗脂多糖因 子作为一种重要的结合LPS的抗菌肽势必会在其免疫防御中发挥着非常重 要的作用。发明内容本发明的目的是从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列， 并对其实现原核表达及重组产物的活性鉴定，为进一步研究中华绒鳌蟹防 御机制提供基础，并为中华绒鳌蟹的病害防治、基因辅助选育及进一步开 发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No:l中碱基 序列。其是从从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该序列 全长700bp，包括363bp的开放阅读框，编码120个氨基酸，5'非编码区长 20bp， 3'非编码区长317bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该 基因在中华绒鳌蟹免疫防御方面发挥着重要作用。利用pET32a表达载体在 大肠杆菌BL21(DE3)plysS中重组表达了该蛋白，表达产物对藤黄微球菌 M/cracoccws /她ws和齒弧菌a"炉7an/m和大肠杆菌TOP10F均具有明显的杀菌活性。其中对于藤黄微球菌的杀菌活性为100%;而对于革兰氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀菌活性分别是80%和26.42%.其编码蛋白具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，分子量为13273.42 Da，等电点为8.59，其中编码序列的1一25位为信号肽序列，成熟肽分子 量为10588.14 Da，等电点为8.79，有11个净正电荷，并且具有典型的抗脂 多糖因子W(T)CPG(S)WT模体结构。分析该成熟肽序列发现其N-端具有明 显的疏水性，呈现(3-折叠结构，而C-端亲水性较强，具有典型的a-螺旋结 构。中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物可作为动物饲料添加 剂、食品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE) 技术从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子基因cDNA全长序列，通过PCR 技术，扩增编码抗脂多糖因子成熟肽的基因片断并将其克隆到pET32a表达 载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中实现了原核体外重组表达。重组产 物经HiTrap chelating柱纯化和透析复性后，对藤黄微球菌和鳗弧菌均表现 出明显的杀伤活性。其中对于藤黄微球菌的杀菌活性为100%;而对于革兰 氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀菌活性分别是80%和26.42%。 本发明可为进一步研究中华绒鳌蟹免疫防御机制提供基础，并为中华绒鳌 蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂奠定基础，同时为进一步开发 治疗人类败血病医药产品提供了更多的选择。本发明利用构建的中华绒鳌蟹cDNA文库，采用RACE技术及体外重 组表达技术，对中华绒鳌蟹抗脂多糖因子进行了研究，首次从中华绒鳌蟹 中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该基因具有序列表中所示的序列， 并利用原核重组技术表达了具有较强杀菌活性的重组蛋白。
图1为本发明重组抗脂多糖因子和融合标签杀菌活性图谱。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此( 实施例1.一种克隆得到的中华绒鳌蟹抗脂多糖因子，具有以下序列序列表(1) SEQIDNOl的信息 序列特征 长度700碱基对链型双链 拓扑结构线形 分子类型DNA特性名称CDS (21—383)来源中华绒鳌蟹(En'oc/ie/r !^)序列描述GAATTCGTCAAACCACCAGTATGGCACGCCTGTCGCTGTTCCTTCTCGTTGTGGCTGTTGCCGTGTTTACTCCAAACATTCCACAGTGTGAAGCTGGCTGGCTGGACCGGATTATTGGTACAGCAGTTGATTCTGTTGCTGAATTCGGAACCACTAATATAGTGGACCAAATCTGCAACACCCGTGTGATGCCCACCATAAAGAAGTTTGAACTGTACTTCAGGGGGAGAGTGTGGTGCCCAGGCTGGACAACAATCCAGGGGGAGTCTCTGACTCGCAGCAGGACCAGGGTGGTGAACAAAGCTGTGGAAGACTTCGCCAGGAAGGCTGTCGCTGCAGGCCTCATGACGCAGGAGGATGCTAACCCTTTGCTGAATGCCTGATCATGGAGCAGGACGCCACACCTCTGGGGCACATGGCTATCCTGATGTAGAGCAGGATTTCTTAACCTTTTCTAGCATCTGAACCCTTGTACTAAAAAGAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAA (2) SEQIDN0 2的信息序列特征 长度120 个氨基酸链型单链 拓扑结构线形特性编码蛋白分子量为13273.42Da，等电点为8.59，其中编码序列 的l一25位为信号肽序列，成熟肽分子量为10588.14 Da，等电点为8.79， 有11个净正电荷，并且具有典型的抗脂多糖因子W(T)CPG(S)WT模体结 构。分析该成熟肽序列发现其N-端具有明显的疏水性，呈现卩-折叠结构， 而C-端亲水性较强，具有典型的a-螺旋结构。来源中华绒鳌蟹(2Hoc/ie/r s/"eraz》序列描述MARLSLFLLWAVAVFTPNIPQCEAGWLDRIIGTAVDSVAEFGTTNIVDQI KAVAAGLMTQEDANPLLNA本发明的中华绒鳌蟹抗脂多糖因子cDNA序列克隆及其体外重组表 达，包括下列步骤a) 中华绒鳌蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；b) 中华绒鳌蟹cDNA文库构建；c) 中华绒鳌蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；d) 中华绒鳌蟹EST序列的同源性分析及抗脂多糖因子基因片段的筛选；e) 用基因特异性引物GSF1: GACGCAGGAGGATGCTAAC和GSF2:TGATGGCAGATGAAGGACAC 进行3'和5'RACE克隆到中华绒鳌蟹抗脂多糖因子cDNA全长序列；f) 中华绒鳌蟹抗脂多糖因子的体外重组表达及其活性分析。具体操作如下1 )中华绒鳌蟹总RNA的提取及mRNA的纯化:将中华绒鳌蟹注射50pl OD6Q()=0.4的鳗弧菌暂养12小时后，利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取 中华绒鳌蟹血淋巴中总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化 试剂盒纯化mRNA。2) 中华绒鳌蟹cDNA文库构建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit 和ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)进行cDNA的合成，分别按照试 剂盒的说明进行双链cDNA末端补平、￡CORI接头连接、五coRI末端磷酸 化、I内切酶酶切，后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于lOObp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司 Uni-ZAP XR vector载体金接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从Uni-ZAP XR Vector上体外切割pBluescript成为 质粒文库。3) 中华絨鳌蟹cDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克 隆，使用载体通用引物T3 ( AATTAACCCTCACTAAAGGG )在 MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi， *.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(气s叫)和质量文件(气s叫.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除 低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据 中选取连续碱基质量大于Q13 (准确率大于95%)且长度大于lOObp的序 列作为EST数据，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》6(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。4) 中华绒鳌蟹EST序列的同源性分析及抗脂多糖因子基因片段的筛选 将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons, 分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分 析，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著， 浙江大学出版社，2005年)。根据相似性分析结果寻找出与抗脂多糖因子 基因同源的EST序列。5) 中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因cDNA全长序列的克隆根据与抗脂 多糖因子基因同源的EST序列设计基因特异性引物GSF1 : GACGCAGGAGGATGCTAAC和GSF2: TGATGGCAGATGAAGGACAC， 分别利用载体通用引物T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) 、 T7(GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3，和5'末端的扩增，PCR产物 用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯 片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物 工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社， 2002年)的方法转化大肠杆菌XLl-blue，挑选阳性克隆提取质粒，用载体 弓i物 M13-47 ( CGCCAGGGTT TTCCCAGTCACGAC ) 、 RV陽M (GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)进行PCR检测，确认插入片段 大小后进行序列测定，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。 3'RACE扩增所用体系以及反应条件 25^11反应体系2.5^1 10 xPCR buffer1.0(ilMgCl2 (2.5 mM)2.0 pi dNTP (2.5 mM)1 引物GSFl(10pmol4d)1 pl引物T7(10pmol4U)16.3 jil of PCR-grade water0.2 |il (1 U) Taq polymerase (Promega)1 iilcDNA文谏模板。反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列 循环94"C变性25秒，57'C退火30秒，72"C延伸60秒，共进行35个循 环，最后72"C延伸10分钟。5'RACE扩增所用体系以及反应条件 25^1反应体系2.5 pi 10 x PCR buffer C12 (2.5 mM)2.0nldNB>(2.5mM)1 pi引物GSF2(10pmol/nl)1 ^引物T3(10pmo1/[！1)16.3 (jl of PCR-grade water0.2 fol (1 U) Taq polymerase (Promega)1 plcDNA模板。反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列 循环94-C变性30秒，59T:退火30秒,72'C延伸50秒，共进行34个循 环，最后72。C延伸10分钟。PCR筛选阳性克隆的反应条件 25^1反应体系2.5 pl 10 x PCR buffer1.0plMgCl2 (2.5 mM)2.0pldNTP(2.5 mM)1 pi引物Ml3-47 (10 pmol/)al)1 pi引物RV-M(10pmolV)16.3 pi of PCR-grade water0.2(1 U) Taq polymerase (Promega)1 ^菌液模板。反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列 循环94"C变性25秒，6(TC退火30秒，72"C延伸60秒，共进行30个循 环，最后72"C延伸10分钟。 一将3'RACE和5'RACE的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检 测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收 和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分 子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌 XLl-blue，挑选阳性克隆提取质粒，送上海鼎安生物科技有限公司测序，测 得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。6)中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的体外重组表达通过PCR技术， 禾U用 Rl ( GAATTCGGCTGGCTGGACCGGATTATT ) 和 R2 (GCGGCCGCTCAGGCATTCAGCAAAGGGTTAG)扩增编码抗脂多糖因 子成熟肽的基因片断，反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJResearch)中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后 进入下列循环94'C变性25秒，65 °C退火30秒，72。C延伸60秒，共进 行30个循环，最后72C延伸10分钟。按照《分子克隆第三版》的方法将 其克隆到pET32a表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，测序确认 表达框的正确性。接种阳性克隆到含有1%葡萄糖的SOB液体培养基中， 37。C振荡培养至OD6(W0.4-0.6，加入lmM的IPTG诱导过夜，离心保存菌体 沉淀。菌体以lmg/mL鸡蛋清溶菌酶处理30min后超声破碎200W，超声60次，每次2秒，间隔14秒。离心收集上清和沉淀，沉淀以8M的尿素溶 解后，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱纯化重组产物，纯化产物 经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、lmM EDTA、 50mM Tris-HCl、 50mMNaCl、 10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素溶液透析复 性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到5M、 4M、 3M、 2M、 1M，最后一 次透析至无尿素的透析液时不添加甘油。复性后的重组产物采用经典的杀 菌活性检测方法(Wang D., Liu C., Liu J., He Z.， Zhang W.， Wu X. 2001. The native gene of anti-LPS factor from 7bc/^/ /ews加Vfewto加cloning, expression and its bacteriostatic activity in vz'組Protein Pept Lett. 8, 273-280)，以藤黄微 球菌、鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F作为受试菌株检验表达产物的杀菌活性。 表达产物与指数生长期的供试菌株共孵育1 hr后，将适度稀释的样品涂步 于SOB固体平板，发现藤黄微球菌没有生长，表明重组产物对于该菌株的 杀菌活性为100%;而对于革兰氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀 菌活性分别是80%和26.42%。实施例2中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物可作为动物饲料添加剂、食 品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。S柳皿E LISTING 《H0>中W科学院海洋研究所 2G》中华绒紫蟹抗脂多糖W了'埃W及K编码级D邻应用 <则> 2<370> Patent In version 3,1<220><221> CDS<222> (21). .(383)<223><纖1g幼ttcgtca腿ccacc稱t atg gca egc ctg teg etg ttc ctt etc gtt gtg 53 Met Ala if g Leu S枕Leu怖e Leu Leu Val i 5 10get gtt柳gtg ttt act cca aac att cca卿tgt gaa get ggc tgg 101 Ala Val Ala %i Phe Thr Pro Asn lie Pro Gin Cys Glu Ala Gly Trp 15 幼 25ctg gac egg att att ggt aca gca gtt gat tct gtt get g幼ttc gga i鄉 Leu Asp Arg lie lie Gly Thr Ala Val Asp Ser Val Ala Glu Phe Gly 30 35 40aee act aat ata gtg gac c幼ate tgc aac acc cgt gtg atg cec acc 19 Thr Tte Asii lie Vai Asp Gin lie Cys Asn Hir Arg Val Met Pro Hir 45 50 55ata卿aag ttt gaa ctg t加tte鄉鹏鄉gtg tgg tgc cca ggc 245 lie Lys Lys Phe Glu Leu Tyr Phe Arg Gly Arg Yal Trp C^s Pro Gly 節 肪 70 75tgg aca aca ate c鄉鹏gag tct ctg act cgc age鄉acc鄉gtg 293 T， Thr Thr lie Gin Gly Ser Leu Thr Arg Ser Arg Tte" Arg Val 柳 肪 卯gtg aac aaa get gtg g幼g枉c ttc gcc agg aag get gtc gel gca ggc 341 Vai Asn Lys Ala Val Glu Asp Phe Ala Arg Lys Ala Val Ala Ala Gly 站 100 105etc aig aeg cag gag gat get aac cct ttg ctg aat gee t辟 383 Leu Mel Th^ Wn Glu Asp Ala Asn Pro Leu L抑Asn Ala 110 US l加tcatggagca g辟cgecaca cctct鹏gc acatggctat cctgacccat gtg，ccltca 443mgcralca ctc助cc化t ccctcag卿acattgt, gcaggatttc* tt朋ccttu 鄉ft卿 "'tg腿ra:ttgt8 ctstatt卿gtatatc卿cegccctra ccectlc卿 563t抑歐川a gtsgttcagc" scsccT'gatg 8ttttgttaa抑gactacct ttuctacatr 鄉a!ra,gfwgt aaaag朋gtl g"tggccag tactttgttg at"cataat朋mi卿ata 鄉rffu鹏f""副朋鹏则 7001700 DNA中华绒鹳蟹(Briocheir sinensis)!20P盯 ，屮,级科躯(Eriork、ir sineiisi s》> > > 。2222> > 二 > <formula>formula see original document page 11</formula>
权利要求
1. 一种中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，其特征在于具有序列表SEQID No1中碱基序列。
2. —种权利要求l所述中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因编码蛋白，其特 征在于具有序列表SEQIDNo:2中氨基酸序列。
3. —种权利要求2所述中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的应用，其特征 在于中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物可作为动物词料添加 剂、食品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。
全文摘要
本发明涉及分子生物学中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因克隆及体外重组表达技术，中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No1中碱基序列。本发明利用构建的中华绒鳌蟹cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对中华绒鳌蟹抗脂多糖因子进行了研究，首次从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有较强杀菌活性的重组蛋白。
文档编号A61K38/17GK101245344SQ20071001373
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月17日 优先权日2007年2月17日
发明者宋林生, 李成华, 赵建民, 邱丽梅 申请人:中国科学院海洋研究所