专利名称：：生产和纯化甲型肝炎灭活疫苗的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产和纯化曱型肝炎疫苗的方法，属于医药生物制品领域。
背景技术：
：曱型肝i^l:由曱型肝炎病毒(HAV)引起的一种以肝脏损害为主要特征的高发病率的急性传染病。我国是世界上曱肝流行最严重的国家，在已知的所有病毒性肝炎中，曱肝的发病率具首位。而接种甲肝疫苗是预防曱肝流行最有效的方法。我国在90年代初研制成功曱肝减毒活疫苗，10年后又成功研制了曱型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)，这两种疫苗的研制成功与广泛使用，为降低我国曱型肝炎的发病率，控制曱型肝炎的爆发流行，起到了极其重要的作用。现有曱型肝炎疫苗的细月驢质均为人二倍体细胞，而且均采用单层细胞瓶培养，细胞密度低、繁殖效率不高是其共同缺点，而制备曱肝疫苗需要大量的病毒抗原，这是曱肝疫苗生产成本高、产量难已扩大的根本原因。
发明内容本发明的目的是提供一种能提高细胞密度、提高病毒产量、P争低生产成本的生产纯化曱型肝炎疫苗的方法。实现上述目的的技术方案是一种生产纯化曱型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于其工艺步骤为1)从工作细胞库中复苏Vero细胞，进行细胞的传代扩增，将Vero细胞接种于2-5层2~5升的盛放培养液的转瓶中，进行高密度培养，培养液为含2-10%新生小牛血清的199培养MMEM培养基，调PH至7.2~7.4;2)取工作种子毒种接种于Vera细胞，经吸附后于33°C~37。C培养至病毒增殖高峰期，其间换培养液3~5次；3)将经过Vero细胞培养的含HAV病毒的细胞消化后"t^，通过离心后弃上清，加磷酸盐緩沖液悬浮制成曱肝病毒原液；4)曱肝病毒原液经过破碎后，加入氯仿，振摇离心取上层水相，然后再加入磷酸盐緩沖液，重复抽提35次，制成粗制曱肝病毒液；5)粗制曱肝病毒液经超滤浓缩后，再经疏水柱、凝胶柱两步纯化，最后过滤除菌，收集过滤液为纯化曱肝病毒液；6)将纯化曱肝病毒液进行灭活；7)灭活后的甲肝病毒液经过佐剂吸附后，制成曱肝半成品，分装得曱型肝炎灭活疫苗。进一步，第5)步中釆用超滤膜进行超滤浓缩，该超滤膜的膜孔的孑L径为五万十万分子量。采用上述技术方案后，本发明采用2~5层2~5升转瓶^姿照已筛选的培养^4f进行细胞培养，细胞密度iiJiJ0.8~1.2x107个/ml,,与原有的工艺相比细胞密度提高了3~5倍，大幅度降低了生产成本，提高了产品质量，并可以实现批量生产。附图为;^发明的工艺流4I图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。如图所示，一种生产和纯化曱型肝炎灭活疫苗的方法，工艺步骤为自液氮容器中取出工作库中的Vero细胞(细胞为国家药品管理当局批准的ATCC系Vero细月&朱)，接种到细胞瓶中，加入培养液于37。C培养(培养液为含8%新生小牛血清的199培养基，调PH值至7.2~7.4)，长成单层后用胰酶——EDTA消化，加入上述培养液，以1:3分种，每3天传1次，直至获得一定批量。将Vero细胞用胰酶——EDTA消化以1:50比例接种曱肝JS-4毒抹，37°C吸附40分钟，接种于3层转瓶中，加培养液。置35。C恒温室进行高密度培养。期间换4次维持液，到期后收毒，用胰酶消化细胞再加磷酸盐緩沖液悬浮收集于离心杯中，离心后弃上清，用磷酸盐緩沖液悬浮细胞(细胞密度为lxl07个/ml，)，即为病毒原液，置-2(TC冻存。取出病毒原液化冻后用超声破^ff义破碎细胞至破碎率95%以上，加入等体积氯仿，经氯仿抽提5次，3000rpm离心30分钟jR^Ui层7K相，然后再加入等量磷酸盐緩冲液，重复抽提35次，制成粗制曱肝病毒液，粗制曱肝病毒液先采用十万分子量的超滤膜进行超滤浓缩后，再经疏7K柱、^0交柱2步纯化，最后用0.22jum滤膜除菌过滤，收集过滤液。将纯化样品在无菌条件下加入终浓度为1:4000的福尔马林，置37。C恒温室，灭活12天后加入NaHS03中和。灭活后的曱肝病毒液检定合格后，根据病毒抗原滴度水平可作适度稀释，加入氢氧化铝配制半成品，将制备好的半成品按成人剂量为l.lml/瓶，儿童剂量为0.6ml/瓶分装于无菌的西林瓶中制成成品疫苗。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1、一种生产和纯化甲型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于其工艺步骤为1)从工作细胞库中复苏Vero细胞，进行细胞的传代扩增，将Vero细胞接种于2～5层2～5升的盛放培养液的转瓶中，进行高密度培养，培养液为含2-10％新生小牛血清的199培养基或MEM培养基，调PH值至7.2～7.4；2)取工作种子毒种接种于Vero细胞，经吸附后于33℃～37℃培养至病毒增殖高峰期，其间换培养液3～5次；3)将经过Vero细胞培养的含HAV病毒的细胞消化后收获，通过离心后弃上清，加磷酸盐缓冲液悬浮制成甲肝病毒原液；4)甲肝病毒原液经过破碎后，加入氯仿，振摇离心取上层水相，然后再加入磷酸盐缓冲液，重复抽提3～5次，制成粗制甲肝病毒液；5)粗制甲肝病毒液经超滤浓缩后，再经疏水柱、凝胶柱两步纯化，最后过滤除菌，收集过滤液为纯化甲肝病毒液；6)将纯化甲肝病毒液进行灭活；7)灭活后的甲肝病毒液经过佐剂吸附后，制成甲肝半成品，分装得甲型肝炎灭活疫苗。2、根据权利要求1所述的生产和純化曱型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于所述第5)步中采用超滤膜进行超滤浓缩，该超滤膜的膜孔的孑L径为五万~10万分子量。3、根据权利要求1所述的生产和纯化曱型肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于所述第7)步中采用的佐剂为氢氧化铝。全文摘要一种生产和纯化甲型肝炎灭活疫苗的方法，其工艺步骤为从工作细胞库中复苏Vero细胞，将Vero细胞接种于2～5层2～5升的盛放培养液的转瓶中，进行高密度培养，取工作种子毒种接种于Vero细胞，经吸附后培养至病毒增殖高峰期；将经过Vero细胞培养的含HAV病毒的细胞消化后收获，通过离心后弃上清，加磷酸盐缓冲液悬浮制成甲肝病毒原液；甲肝病毒原液经过破碎后，加入氯仿，掁摇离心取上层水相，然后再加入磷酸盐缓冲液，制成粗制甲肝病毒液，经超滤浓缩后，再经疏水柱、凝胶柱两步纯化，最后过滤除菌，收集过滤液为纯化甲肝病毒液，进行灭活，然后经过佐剂吸附后，制成甲肝半成品，分装得甲型肝炎灭活疫苗。本发明能提高细胞密度、提高病毒产量、降低生产成本，并可实现批量生产。文档编号A61K39/29GK101306199SQ20071002242公开日2008年11月19日申请日期2007年5月18日优先权日2007年5月18日发明者张玉慧,曹雨露,峰许,赵永强,金晓中申请人:江苏延申生物科技股份有限公司