专利名称：：治疗性hbvdna疫苗、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类新型治疗性疫苗的构建、制备及应用。具体的说，本发明涉及治疗性hbvdna疫苗的构建、制备及应用。
背景技术：
：乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染呈全球范围广泛流行。HBV感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，并与肝硬化、肝癌的发病密切相关，是严重危害人类健康的感染性疾病。目前全球约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亚太地区，我国的慢性无症状感染者超过1.2亿，且慢性乙型肝炎预后不良。目前的抗病毒药物主要是核苷类似物和重组干扰素类药物，但效果不十分理想。因此，急需一种更有效的治疗性疫苗，不仅能够预防HBV的感染，而且能够打破慢性乙肝患者的免疫耐受状态，使其产生体液免疫和细胞免疫，清除肝细胞的病毒，使患者痊愈。DNA疫苗是20世纪末开发出来的新型疫苗，1990年Wolff等发现DNA免疫后，标志着新的疫苗革命。DNA疫苗与传统疫苗相比有诸多优点，尤其是其可诱导特异性CTL反应的能力，使它在抗细胞内感染中独具优势。它将编码外源性抗原蛋白的基因表达载体直接导入机体，通过宿主细胞摄取外源DNA，进入核内进行转录，然后在胞质中翻译，翻译产物进一步与MHC-1类分子结合，提呈至细胞表面，被CD8+T细胞识别，产生较强的CTL的细胞免疫。同时，有一部分短肽可进入溶酶体/内体与MHC-II类分子结合，被CD4+T细胞识别，产生CD4+T细胞介导体液免疫应答。CD4+T细胞介导的免疫应答偏向Thl，产生高水平的IFN-y，并刺激产生IgG2同种型抗体。这种HBVDNA疫苗在宿主体内表达的抗原的免疫过程与自然免疫相似，可以提呈天然构象的乙肝表面抗原HBsAg，无抗原表位的改变，并且具有长期记忆免疫反应，不但能用于预防，且可用于治疗。因此，乙肝HBVDNA疫苗已经成为当前研究的热点。1993年Davis等开展了HBV基因免疫的研究，但由于安全性、耐受性及有效性等顾虑而仅限于动物实验。1999年Tacket等率先报道HBVDNA疫苗I期临床试验获得较好的结果，标志着HBVDNA疫苗己从实验研究逐步走向临床应用。2004年法国巴斯德研究所报道的HBVDNA疫苗的I期临床试验取得较好结果，同年，英国和赞比亚的报道临床42例患者耐受性良好。2006年韩国Dong-A药厂的多联疫苗亦取得较好的临床试验结果。虽然DNA疫苗的初步临床试验结果令人鼓舞，但其免疫效果远未达到理想水平，因此如何增强免疫效果己成为DNA疫苗研究的关键，增强的途径有提高细胞转染率，增加抗原表达及提高机体对抗原的免疫反应性等。其中细胞因子表达质粒作为基因佐剂，克服了细胞因子基因工程蛋白的半衰期短、价格昂贵和毒副作用大等缺点，可显著增强DNA疫苗的免疫效果，而且由于其作用短暂，不会导致全身细胞因子水平增高，不会改变机体对不相关抗原的免疫反应，亦不会促进或诱导病理性自身抗体产生，因此安全性良好。基因免疫最常用的途径是经肌肉或皮肤，其他途径如腹腔、口腔、直肠及阴道，基因枪和肌肉注射是公认的DNA免疫有效导入方式。在HBVDNA疫苗的临床实验中，采用基因枪将包被质粒DNA的金颗粒轰击至皮内，能使有效的抗原提呈和识别相结合，但基因枪接种存在诸如免疫应答持续时间短、金颗粒制备繁琐及随温度增加包被的DNA会脱落等缺点。目前构建DNA疫苗通常包括选取表达抗原的目的基因和细菌质粒真核表达载体。在构建临床应用的质粒时，选用pWRG7077类似的载体，关键的启动子和调控元件为HCMV早期启动子/SV40早期启动子、外显子l、内含子A，加牛生长激素polyA尾(BGHpA)，插入抗生素抗性基因，如氨苄青霉素、卡那霉素，也有选择新霉素或潮霉素的抗性基因，还含pUCori的ColEI或pMBl复制起点便于在大肠杆菌复制。为了防止DNA在宿主细胞中复制并整合到染色体中去，载体中不能含有SV40等病毒复制基因，由于人类对青霉素的过敏反应要比卡那霉素频繁，因而用于临床的DNA疫苗载体最好只选择卡那抗性基因，尽管它比氨苄青霉素抗性基因含有的CpG核苷酸序列要少，(CpG核苷酸序列有显著增强免疫作用，有佐剂效果)。经过改构的pVAXl真核表达载体符合以上特点，而且含有增强目的基因表达的KOZAK序列，是美国FDA批准的唯一可用于临床试验的DNA疫苗载体。
发明内容本发明的目的在于提供一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗，包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF。本发明的另一目的在于提供一种HBV双质粒DNA疫苗的制备方法。治疗性HBVDNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S为目的基因的DNA疫苗质粒(简称为pS2.S)和以人IL2和IFN-Y为目的基因的佐剂质粒(简称为pIIF)。一种HBV双质粒DNA疫苗的构建方法疫苗质粒pS2.S构建本发明采用真核表达载体pVAXl，根据载体的要求，设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因的表达。pS2.S的上游引物Pl:5、-GGAAGCT、TAGGATGGGCTGGCTGCAGAGCCTG-3、，下游引物P2:5'-GGGAATT、CTTAAATGTATACCCAAAGACAA-3、，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec，72。C90sec，30cycles，72。C10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为卯0bp，见图l-l所示。回收PCR片段，以HindIII和EcoRI进行双酶切，同时双酶切真核表达载体pVAXl，分别回收酶切片段并进行连接，转化DH5a感受态细菌，筛选Kana抗性的阳性克隆，按试剂盒说明提取质粒并进行酶切测序鉴定，见图2-2所示。佐剂质粒pIIF的构建设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，十4为G，以增强目的基因的表达。pIIF的上游引物P1:5'隱GGAAGCT'TAGGATGGGCTACAGGATGCAACTC-3、，P2:5、-GGGAATT、CTTACTGGGATGCTCT-3、，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/prelL2IFN汀质粒(目的基因人IL2和IFN-y以AGSGGGGS这一韧性连接肽融合而成)为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec，72。C90sec，30cycles，72。C10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为920bp，见图l-2所示。按前述的方法进行双酶切，连接，转化，挑取克隆酶切测序鉴定，见图2-3所示。治疗性hbv;dna疫苗双质粒的体外鉴定采用体外转染非洲绿猴肾细胞(cos-7)，检测到目的蛋白的较高水平表达。按EndofreePlasmidMegaKit说明书分别提取疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF，参照Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectamineTM2000操作说明进行。按常规方法培养COS-7细胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁细胞，重悬于含血清RPMI1640培养液，按3X105细胞/孔转种于6孔培养板中，37°C、5%C02培养，待贴壁细胞生长达90-95%融合度，分别取4pg质粒pS2.S、佐剂pIIF、pcDNA3.1/preS2.S质粒、pcDNA3.1/hlL2IFNY质粒进行转染，同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照。继续培养并于转染后48h收集上清，按"立可读"乙肝表面抗原试剂盒和人IL-2和IFN-Y检测试剂盒定量检测目的基因的表达量。结果显示，对照组的未转染细胞组和空载体转染细胞组均未检测到目的产物，以pVAXl构建的真核表达载体pS2.S、pIIF均能在COS-7细胞进行目的基因的表达，检测HBsAg、hlL2、WFNy的表达量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml，而由pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1/preS2.S质粒和pcDNA3.1/hlL2IFN"/质粒表达的目的蛋白HBsAg、hIL2、hIFNY的表达量分别为26.3、6.3、5.4ng/ml，显然比pVAXl载体构建的质粒的目的蛋白表达量低些，这可能是因为pVAXl载体含有KOZAK序列，该序列能显著增强目的基因的表达。同时收集含目的基因的表达产物的转染上清，浓縮后行常规SDS-PAGE，并按ECL试剂盒操作说明书进行ECLWesternblotting分析，见图3-4、4-3。HBVDNA疫苗质粒pS2.S的表达产物具有较强的HBsAg生物学活性，分子大小约为30Kd，佐剂质粒pIIF表达产物具有较强的IL2生物学活性和IFN-Y，分子大小约为110Kd，推测是融合蛋白hIL2/IFNY形成四聚体的缘故，因为天然IL2常以二聚体或四聚体的形式存在。为了评价佐剂质粒表达的融合蛋白WL2IFNy的生物学活性，采用CombinatorialExtension(CE)软件对融合蛋白hlL2IFNy序列进行模建分析，并和天然的IL2、IFNy进行比对，结果发现以AGSGGGGS这一韧性结构为连接肽的融合hlL2IFNY蛋白，其空间结构能够和天然IL2、IFNy基本吻合，空间模拟其活性部位完全裸露在外，无任何屏蔽结构，见图5，可见融合蛋白WL2IFNY同时具有天然IL2、IFNY的生物学活性，且二者有协同作用，这为质粒pIIF作为HBVDNA疫苗的佐剂而发挥作用奠定坚实结构基础。本发明的目的还在于提供一种疫苗的制备方法。HBVDNA疫苗的制备过程疫苗质粒(pS2.S)和佐剂质粒(pIIF)的制备方法相同，但分开生产，发酵、裂解、纯化方法过程如下发酵采用BIOSTATDL70型发酵罐(德国B.Braun)，以YeastExtract8g/L、Tryptone16g/L、NaCL4g/L、甘油24ml/L、Na2HP04H207.08g/L、KH2P0412H201.58g/L;微量氨基酸适量为基础培养基，以YeastExtract100g/L+Tryptone50g/L+甘油400ml/L+MgS042g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基，按10%接种量，37。C恒温培养，p02控制在35%以下，在线检测菌密度的0D600值，计算质粒含量。发酵10h收菌，菌体量达50-70g/L，质粒含量为50-70mg/g菌。裂解取检测合格的发酵菌30-32g，加临用前配置的P1缓冲液900ml混悬，冰浴10min;加临用前配置的P2缓冲液卯0ml裂解细菌，冰浴4min;加P3缓冲液900ml中和，冰浴10min;离心，4°C，9,000g，15min，上清过G3细菌漏斗，收滤过液；滤过液再过G4细菌漏斗，真空抽滤，收滤过液；滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀，冰浴或放置(4。C)低温冷柜2h，离心，4°C，9，000g，10min，收集沉淀；70%乙醇洗沉淀后用30mlBl溶解得质粒初提液置4'C保存。裂解所用试剂组成如下參Pl:50mMTris，10mMEDTA，pH8.0*P2:200mMNaOH，1%SDS，临用前配制參P3:3.0MKAC，pH5.5參BufferI:10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0纯化质粒初提液经分子筛柱，收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化，最后上阴离子柱，收集质粒峰并用有机溶剂沉淀，用缓冲液溶解质粒DNA。其优选方案如下质粒初提液直接上样Sepharose4FastFlow分子筛柱，始终用BufferI缓冲液，以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等，收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect(PS柱)特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source30Q阴离子柱，以达到有效去除内毒素和浓縮质粒。此柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶解质粒DNA。纯化所用试剂的组成如下*BufferI:10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*BufferII:3M(NH4)2S04，10mMEDTA，1OOmMTris-HCI，pH7.0*BufferIII:2M(NH4)2S04，10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*BufferIV:2M(NH4)2S04，1.4MNaCl10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*BufferV:0.4MNaCl，10mMEDTA，腦mMTris-HCl，pH7.0*BufferVI:0.6MNaCl，10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0*PBS溶液Na2HP04*12H204.86g，NaH2P04'2H200.5g，NaCl9g，定容1000ml质粒DNA纯度可达到95%。本发明治疗性HBVDNA疫苗双质粒能诱导机体产生较高的HBsAg抗体水平和特异性的细胞免疫应答。双质粒疫苗联合在体电脉冲技术(上海交通大学研制，国内首次应用于基因导入)能显著提高大体重动物即家兔和恒河猴的免疫效果，可显著降低HBVTg(转基因)小鼠的HBsAg、HBVDNA、ALT水平，并产生特异性细胞免疫。工具酶与主要试剂真核表达载体pVAXl购自Invitrogen公司(CATALOGNO.V260-20);pcDNA3.1/preS2.S和pcDNA3.1/prelL2IFNy质粒由申请人构建保存，具体构建已在受理号为00107853.4中国发明专利申请文件中公开；限制性内切酶，pfu聚合酶，T4DNA连接酶等均购自NEB公司；DH5a菌株购于上海博彩生物技术公司；引物合成由上海英骏生物公司完成；质粒小量提取试剂盒为上海华舜生物公司产品；EndofreePlasmidMegaKit为QIAGEN公司产品；COS-7细胞株购自上海细胞研究所；Lipofectamine2000转染试剂为Invitrogen公司产品；"立可读"乙肝表面抗原试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司；人白细胞介素(IL-2)和干扰素(IFN-Y)检测试剂盒为晶美生物工程公司；抗人HBsAg单抗、抗人IL-2和IFN-y单抗体均购自BD公司；ELISpot试剂盒购自BD公司。下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。图1是本发明的目的基因的PCR产物1、3分别是目的基因S2.S和融合IIF的PCR产物；2为MarkerDL2000图2双质粒的双酶切图谱1是MarkerDL15000;2.3为双质粒的EcoRI+Hind111的酶切图3质粒pS2.S转染C0S-7细胞表达产物的ECLwesternblot分析1.分子量标准；2.未转染组；3.空载体组；4.pS2.S.图4质粒pIIF转染C0S-7细胞表达产物的ECLwesternblot分析1.未转染组；2.空载体组；3.pIIF;4.分子量标准.图5融合蛋白中IL-2活性部位(橙色)与IFN-Y活性部位(粉色)图6HBVDNA疫苗治疗后血清HBsAg水平降低的HBVTg小鼠个体细胞免疫状态具体实施例方式下面是本发明的实施例，所述的实施例用于描述本发明而不是限制本发明。实施例1治疗性HBVDNA疫苗的构建治疗性HBVDNA疫苗包括以HBV包膜中蛋白preS2+S为目的基因的DNA疫苗质粒(简称为pS2.S)和以人IL2和IFN-Y为目的基因的佐剂质粒(简称为pIIF)。我们采用购自Invitrogen公司的真核表达载体pVAXl，根据载体的要求，设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因的表达。pS2.S的上游引物P1:5'-GGAAGCT'TAGGATGGGCTGGCTGCAGAGCCTG陽3'，下游引物P2:5、-GGGAATT、CTTAAATGTATACCCAAAGACAA-3、，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板，采用pfti高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec,72。C90sec，30cycles，72°C10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为900bp，见图l-l所示。回收PCR片段，以HindIII和EcoRI进行双酶切，同时双酶切真核表达载体pVAXl，分别回收酶切片段并进行连接，转化DH5(x感受态细菌，筛选Kana抗性的阳性克隆，按试剂盒说明提取质粒并进行酶切测序鉴定，见图2-2所示。佐剂质粒pIIF的构建设计上游引物时加上KOZAK系列，即ANNATGG，-3为A，十4为G，以增强目的基因的表达。pIIF的上游引物P1:5、-GGAAGCT'TAGGATGGGCTACAGGATGCAACTC-3、，P2:5'-GGGAATT、CTTACTGGGATGCTCT-3'，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。以pcDNA3.1/prelL2IFN-y质粒(目的基因人IL2和IFN-y以AGSGGGGS这一韧性连接肽融合而成)为模板，采用pfU高保真聚合酶，按95。C5min，94。C50sec，55。C30sec，72。C90sec，30cycles，72。C10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为920bp，见图l-2所示。按前述的方法进行双酶切，连接，转化，挑取克隆酶切测序鉴定，见图2-3所示。实施例2治疗性HBVDNA疫苗双质粒的体外鉴定按EndofreePlasmidMegaKit说明书分别提取疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF，参照Invitrogen公司脂质体转染试剂LipofectamineTM2000操作说明进行。按常规方法培养COS-7细胞株于含10%新生小牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，转染前24h用胰蛋白酶消化贴壁细胞，重悬于含血清RPMI1640培养液，按3乂105细胞/孔转种于6孔培养板中，37°C、5%C02培养，待贴壁细胞生长达90-95%融合度，分别取4pg质粒pS2.S、佐剂pIIF、pcDNA3.1/preS2.S质粒、pcDNA3.1/hlL2IFNy质粒进行转染，同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照。继续培养并于转染后48h收集上清，按"立可读"乙肝表面抗原试剂盒和人IL-2和IFN-Y检测试剂盒定量检测目的基因的表达量，见表1。结果显示，对照组的未转染细胞组和空载体转染细胞组均未检测到目的产物，以pVAXl构建的真核表达载体pS2.S、pIIF均能在COS-7细胞进行目的基因的表达，检测HBsAg、hlL2、hlFNy的表达量分别为45.1、10.03、11.5ng/ml，而由pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1/preS2.S质粒和pcDNA3.1/hlL2IFNY质粒表达的目的蛋白HBsAg、hlL2、hlFNy的表达量分别为26.3、6.3、5.4ng/ml,显然比pVAXl载体构建的质粒的目的蛋白表达量低些，这可能是因为pVAXl载体含有KOZAK序列，该序列能显著增强目的基因的表达。同时收集含目的基因的表达产物的转染上清，浓縮后行常规SDS-PAGE，并按ECL试剂盒操作说明书进行ECLWesternblotting分析，见图3-4、4-3。HBVDNA疫苗质粒pS2.S的表达产物具有较强的HBsAg生物学活性，分子大小约为30Kd，佐剂质粒pIIF表达产物具有较强的IL2生物学活性和IFN-Y，分子大小约为110Kd，推测是融合蛋白hIL2/IFNY形成四聚体的缘故，因为天然IL2常以二聚体或四聚体的形式存在。为了评价佐剂质粒表达的融合蛋白hlL2IFNY的生物学活性，我们采用CombinatorialExtension(CE)软件对融合蛋白WL2IFNy序列进行模建分析，并和天然的IL2、IFNY进行比对，结果发现以AGSGGGGS这一韧性结构为连接肽的融合hlL2IFNY蛋白，其空间结构能够和天然IL2、IFNy基本吻合，空间模拟其活性部位完全裸露在外，无任何屏蔽结构，见图5，可见融合蛋白WL2IFNY可同时具有天然IL2、IFNy的生物学活性，且二者有协同作用，这为质粒pIIF作为HBVDNA疫苗的佐剂而发挥作用奠定坚实结构基石出。表1双质粒转染COS-7细胞检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3治疗性HBVDNA疫苗双质粒的制备HBVDNA疫苗的制备过程疫苗质粒(pS2.S)和佐剂质粒(pIIF)的制备方法相同，但分开生产，发酵、裂解、纯化方法过程如下发酵采用BIOSTATDL70型发酵罐(德国B.Braun)，以YeastExtract8g/L、Tryptone16g/L、NaCL4g/L、甘油24ml/L、Na2HP04H207.08g/L、KH2P0412H201.58g/L;微量氨基酸适量为基础培养基，以YeastExtract100g/L+Tryptone50g/L+甘油400ml/L+MgS042g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基，按10%接种量，37匸恒温培养，p02控制在35%以下，在线检测菌密度的OD600值，计算质粒含量。发酵10h收菌，菌体量达50-70g/L，质粒含量为50-70mg/g菌。裂解取检测合格的发酵菌30-32g加Pl缓冲液(临用前配置)900ml混悬，冰浴10min加P2缓冲液(临用前配置)900ml裂解细菌，冰浴4min加P3缓冲液900ml中和，冰浴10min，i离心，4°C，9,000g，15min上清过G3细菌漏斗，收滤过液I滤过液再过G4细菌漏斗，真空抽滤，收滤过液I滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀，冰浴或放置(4°C)低温冷柜2h离心，4°C，9,000g，10min，收集沉淀70%乙醇洗沉淀后用30mlBl溶解得质粒初提液置4'C保存裂解所用试剂组成如下參Pl:50mMTris，10mMEDTA，pH8.0*P2:200mMNaOH，1%SDS，临用前配制參P3:3.0MKAC，pH5.5參BufferI:10mMEDTA，100mMTris-HCl，pH7.0纯化方案如下质粒初提液直接上样Sepharose4FastFlow分子筛柱，始终用BufferI缓冲液，以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等，收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect(PS柱)特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source30Q阴离子柱，以达到有效去除内毒素和浓縮质粒。此柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶液溶解质粒DNA。纯化所用试剂的组成如下參BufferI:10mMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferII:3M(NH4)2S04，lOmMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferIII:2M(NH4)2S04，lOmMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferIV:2M(NH4)2S04，1.4MNaCl10mMEDTA，lOOmMTris-HCl，pH7.0參BufferV:0.4MNaCl，lOmMEDTA,lOOmMTris-HCl，pH7.0*BufferVI:0.6MNaCl，lOmMEDTA,lOOmMTris-HCl，pH7.0*PBS溶液Na2HP04*12H204.86g，NaH2PO4'2H2O0.5g，NaC19g，定容1000ml质粒DNA纯度可达到95%。实施例4双质粒联合电脉冲技术诱导健康BaLb/c小鼠的体液和细胞免疫实验动物BALB/C小鼠购自广州中医药大学，雌性，4-6周龄，19-21g，属SPF(III)级动物，有合格证书。免疫接种和实验分组腹腔注射戊巴比妥钠先使实验动物处于麻醉状态，在注射部位(小鼠后腿或胫前肌)褪毛，消毒，垂直接种DNA疫苗。或再将电脉冲电极以注射孔为中心垂直插入，电极针插入略深于注射针深度，电场强度200v/cm，放电6次，10秒后拔电极针。健康小鼠60只，每组10只，共分为8组，前4组各5只，后4组各10只(1)pVAXl(100吗/只);(2)pS2.S(100吗/只);(3)pS2.S(50吗/只);(4)pS2.S(10pg/只)；(5)pS2.S+pVAXl(5吗+5吗/只);(6)pS2.S+pIIF(10吗+10吗/只);(7)pS2.S+pIIF(5吗+5吗/只);(8)pS2.S+pIIF(5吗+5吗/只)+EP;分别在接种的0、2、4周采用眼球后静脉丛穿刺法采血，分离血清并于-2(TC保存，待进行一次性抗-HBs的ELISA检须U，并计算抗体出现的阳性小鼠数，四周后，处死小鼠取脾脏分离淋巴细胞进行ELISPOT实验检测。检测方法(1)体液免疫检测，取小鼠血清严格按说明书进行(上海实业科华生物技术限公司)；(2)细胞免疫检测小鼠淋巴细胞制备，①颈椎脱臼法处死小鼠，置盛有75%乙醇的烧杯中，使小鼠体毛完全润湿约3分钟以上，然后切开小鼠腹腔，取出脾脏；②将分离的脾脏放于下置无菌烧杯的200目筛网上(有培养液滴)，用研磨棒(可用玻璃注射器内芯代)轻轻捻碎脾组织，研磨挤压出脾细胞，取5ml无血清1640培养液(IC)缓缓冲下细胞至烧杯中；③将5ml脾细胞悬液缓慢加入装有2.5ml淋巴细胞分离液的14ml离心管中，2,000—2,500r/min离心20min，收集分离淋巴细胞后，用IC离心洗涤细胞2次，每次1500r/min离心6min;④用适量含5%FCS-1640完全培养液重悬分离的脾淋巴细胞，台盼兰染色计数每只小鼠分离淋巴细胞活细胞总数，调整细胞密度至3xl05/ml，37°C5%C02培养箱中培养以供ELISPOT检测。ELISPOT检测严格按BD公司试剂盒使用说明书方法操作。判断标准参照文献并结合本研究验证结果，同时符合以下两条者认定为ELISPOT检测HBsAg特异性Thl细胞阳性①一定细胞密度条件下，ELISPOT检测板中同一样品HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔斑点均数(SFC)的比值应不小于2;②免疫实验组样品淋巴细胞密度为3X10V孔检测时，HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔SFC均数的差值不小于5，作为小鼠特异性细胞免疫的阳性评价标准，HBVDNA疫苗免疫组的细胞免疫应答阳性率应不低于60%。统计学结果处理，组间均数及百分率差异显著性统计分别采用Z检验及查统计简表法。血清-HBs》10mlU被认为是机体保护性有效浓度。结果见表2，pVAXl空载接种正常小鼠后血清抗-HBs浓度均〈10mlU/ml，抗-HBs的小鼠阳性数为0。与之相比，pS2.S高(100pg/只)，中(50pg/只)、低(10pg/只)三组剂量一次性免疫健康小鼠均能在2周诱导抗-HBs产生(M0mlU/ml)。血清抗体水平比较，高剂量组(82.9±30.0)mlU/ml较中剂量组(42.2土25.6)mlU/ml、低剂量组(24.6±7.5)mlU/ml差异分别具显著性(t=2.308，PO.05)及非常显著性(^4.216，PO.01)。这表明疫苗pS2.S质粒能诱导健康小鼠的保护性抗-HBs的产生，且具有剂量相关性。pS2.S+pVAXl空载以5+5pg/只的低剂量免疫组2周后阳性鼠数为1，而采用pIIF作为佐剂免疫质粒且剂量相同情况下，2周后阳性鼠数为3，并产生较高的保护性抗体水平，4周后阳性鼠为50%，而增加剂量达10+10pg/只免疫组2周后阳性鼠为50。/。，4周后抗体阳性鼠为100%，比较此三组的细胞免疫结果，以pS2.S+pIIF按10+10吗/只免疫组的ELISPOT阳性率达80%为最好，组间数据具显著性差异(PO.Ol)，说明pIIF佐剂可增强pS2.S的免疫效果。在前几组的基础上，按pS2.S+pIIF+EP按5+5吗/只的免疫组，2周保护性抗体阳性为80%,4周后检测达100%，细胞免疫ELISPOT阳性率达100%。这充分表明，EP技术能显著提高疫苗pS2.S和佐剂pIIF双质粒的体液和细胞免疫效果，差异具非常显著性。分析其原因是EP技术可瞬间增加细胞膜的通透性，有效介导质粒进入效应细胞表达目的抗原，通过MHC-II或MHC-I类抗原递呈途径诱导T细胞增殖并向Thl亚群分化，提高了IL2/IFNy的分泌水平，有效增强细胞免疫应答。表2佐剂pIIF质粒和EP技术增强疫苗pS2.S的免疫效果免疫原动物数剂量血清抗HBs(2W)血清抗HBs(4W)HBsAg特异性Thl(4W)(n)^g)MlU/ml水平阳性数的阳性率(％)ELISPOT阳性率(％)pVAXl1000pS2.S10082,9±30.05/55042.2±25.63/51024.7±7.52/5pS2.S+pVAXl105+51/101010pS2.S十pIIF105+5115.4±21.93/1050501010+10162.1士42.35/1010080pS2.S+pIIF+EP105+5詣100100实施例5在体电脉冲技术显著提高pS2.S/pIIF在大体重动物的免疫效果实验动物新西兰兔购自广州市出入境检验检疫局动物检验所，具广东省动物监测中心颁发的动物合格证书。灵长类动物食蟹猴及恒河猴，体重3-5kg，年龄2-5岁，由广东省顺德实验动物所提供。健康家兔免疫实验接种部位为兔两小腿内侧腓肠肌，褪毛消毒后，先将DNA注入肌肉，再将3路6点电极中心对准DNA注射孔(DNA注射深度应略比电极针浅)插入肌肉，IO秒后放电拔针即可。电场强度200v/cm，放电6次。按接种pS2.S/pIIF不同剂量及是否采用电脉冲方法接种将动物分为4组，每组5只。各组pS2.S/pIIF剂量分别为A组(5+5)吗/只；B组(25+25)吗/只；C组(50+50)吗/只；D组(1000+1000)pg/只，非在体电脉冲法接种，作对照组。于接种后第IO周各组均增强免疫I次，剂量与方法同初免，并分别于初免后第2、4、13周时采血留样，ELISA法检测血清抗体-HBs水平。健康猴免疫实验接种部位为两腿胫前肌，其他同家兔注射。按不同剂量及是否采用电脉冲方法接种将健康猴分为5组(3只/组)进行实验。A组pS2.S/pIIF剂量为(1000+1000)吗/只；B组(500+500)pg/只；C组(100+100)pg/只；D组(1000+1000)pg/只，非在体电脉冲法接种，作对照组。各组于接种后第4、10周均增强免疫1次，剂量与方法同初免，并分别于初免后第2、4、8、13周时采血留样，ELISA法检测血清抗体-HBs水平。统计学处理，组间均数及百分率差异显著性统计分别采用t检验及査统计简表法。采用电脉冲肌注双质粒DNA疫苗免疫新西兰家兔2周时，在大剂量(50吗)和中剂量(25吗)组联合免疫最早分别有3/5、1/5只血清抗HBs水平阳性，至4周时阳性动物数虽无变化，但两组抗体水平明显升高。较同期对照组(lmg)和小剂量组的差异具显著性(P<0.05)。初免后的13周，在体电脉冲的三个剂量组动物血清均有抗-HBs出现，分别为4、4、5只，而对照组始终为阴性，差异具显著性意义(P<0.05)，但免疫组间差异无显著性。见表3。对于恒河猴的免疫结果与新西兰家兔近乎相同。实验结果表明，在体电脉冲技术对体重相对大的动物新西兰家兔(表3)及恒河猴(表4)的免疫效果都有着质的提高pS2.S联合pIIF免疫接种二种动物在剂量为(1+1)mg的条件下均不能诱导血清抗-HBs的产生，而应用电脉冲技术肌肉给药可促进恒河猴(500pg/只)及新西兰兔(25pg/只)产生良好的免疫反应。说明电穿孔技术可从本质上提高质粒体内转染率，从而降低质粒有效接种剂量。这从技术上解决了文献报道的HBVDNA疫苗对小动物有效而对大动物无效的问题，在疫苗使用方法上为其向临床应用提供实验依据。表3电穿孔法接种DNA疫苗诱导新西兰家兔血清抗-HBs水平结果组免疫原(ng)电场强度动物数另!lpS2.S+pIIFV.cm一1(n)血清抗-HBs水平(MIU/ml)及阳性数2周4周13周(第10周100ng/只增强免疫一次)A5+5200/(0)0/(0)56.3±57.2/(4)25+2520068.5/(1)207.3/(1)231.4±102.8/(4)50+50200126.9±93.1/(3)87.0±115.3/(3)219.0±45.8/(5)D1000+1000/(0)0/(0)/(0)表4电穿孔法接种DNA疫苗诱导恒河猴血清抗-HBs水平结果血清抗-HBs水平(mlu.mr')及阳性例数(下限/上限)组免疫原(ng)电场别pS2.S+pIIF强度V.cm-1动物数(n)2周4周8周(第1次13周(第2次增强后)增强后3周)A1000+10002003陽3.0±-3.0(0)-1.7±-0.9(0)143.6±108.6(3)176.0±89.0(3)B500+5002003.1±-3.1(0)-3.0±-3.1(0)7.2±5.9(2)204.6±62.9(3)C100+100200-2.8±-2.9(0)-2.9±-2.9(0)-0.8±0.1(0)85.3±125.6(3)D1000+10000-2.6±-2.9(0)-2.0±-1.7(0)-1.0±0.6(0)-1.7±0.9(0)实施例6联合电脉冲技术对HBV转基因小鼠(Tg)药效学实验实验动物HBV转基因(Tg)小鼠，由解放军第458医院全军肝病中心转基因动物实验室提供，有广东省实验动物质量合格证书，由HBV全基因(ayw型)随机转染，稳定传至ll代，经剪尾，组织DNA提取，PCR检测HBVDNA呈阳性，再以固相放免及萤光定量PCR法分别定量检测筛选血清HBsAg和HBVDNA阳性鼠备用。HBVTg小鼠60只，随机分3组，每组20只，分别为单质粒pS2.S直接肌注组(剂量为10(Hig/只)、pS2.S+pIIF+EP组(30+30|LigAR)及PBS+EP对照组。接种3次，每次间隔4周，接种期间和末次接种后每4周采血，一次性检测观察血清HBVDNA、HBsAg及ALT水平变化。ELISPOT检测按实施例4方法进行。血清HBVDNA水平检测结果末次免疫后4周，pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组个体血清HBVDNA水平降低1个或以上数量级的有效数及有效率分别为3/20(15%)只、6/20(30%)只及1/20(5%)只，仅pS2.S+pIIF+EP与PBS+EP组比较差异具显著性(p=0.037，x2=4.329)，见表5。血清HBsAg水平检测结果末次免疫后4周，pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组个体血清HBsAg水平降低差值》5ng/ml的有效数及有效率(％)分别为9/20(45%)只、10/20(50%)只及3/20(15%)只，pS2.S及pS2.S+pIIF+EP组均明显较PBS+EP组高，差异具显著性(p=0.018，x2=5.584;p=0.038,x2=4.286)，见表6。血清HBsAg水平降低(差值》5ng/ml)的HBVTg小鼠细胞免疫检测pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及组ELISPOT检测阳性数分别为5/5只，5/5只及2/3只；HBsAg特异性IFNiSFC计数依次为pS2.S+pIIF+EP组(47.5±26.2)最高，pS2.S(19.4±10.3)及PBS组(15.0±14.0)次之。三组中血清HBsAg无降低的HBVTg小鼠特异性IFN-YSFC计数均低于阳性标准。血清ALT水平检测结果比较免疫前后及其过程中三组血清ALT水平检测结果，pS2.S+pIIF+EP组水平较pS2.S及PBS+EP组偏高，第1次免疫后pS2.S+pIIF+EP组水平(39.65±10.96IU/L)较PBS+EP组(22.84±11.66IU/L)差异具显著性(p<0.05，t=2.326)。血清ALT较各组免疫前平均水平升高2倍以上的动物数于pS2.S、pS2.S+pIIF+EP及PBS+EP组分别为1/20只、8/20只及1/20只，其中pS2.S+pIIF+EP组升高例数较多，经简査表法检验较pS2.S组差异具显著性(p<0.05)。pS2.S组1例血清ALT的升高与其血清HBsAg水平降低及ELISPOT结果阳性一致，见表7。以上研究结果表明，治疗性双质粒HBVDNA疫苗能抑制HBVTg小鼠体内HBVDNA的复制，有效降低其血清HBVDNA及HBsAg表达水平。本研究还发现HBVTg小鼠血清ALT水平升高个体与其ELISPOT检测细胞免疫应答阳性以及血清HBVDNA和HBsAg水平降低有一定相关性，HBVDNA疫苗疗效作用机理与其诱导Tg小鼠产生的特异性细胞免疫应答有关，在一定程度上近似临床急性肝炎及动物HBV实验感染病毒自然清除过程。受小鼠外周血淋巴细胞分离量少的限制，我们难以在HBVTg小鼠观察双质粒HBVDNA疫苗诱导机体特异性免疫应答与其血清生化学、组织学及病原学指标的实时动态变化。本发明表明EP接种双质粒HBVDNA疫苗能更有效地诱导产生特异性细胞免疫应答，以提高对HBVTg小鼠体内HBVDNA的复制和血清HBsAg的表达的抑制效果，这为寻找更有效的抗HBV感染基因免疫治疗方法提供了依据。表5HBVDNA疫苗免疫前后比较HBVTg小鼠个体血清HBVDNA水平降低1个或以上数量级的有效数及百分率分组剂量(tig/只)n有效数有效率(％)pS2.S10020315pS2.S+pIIF+EP30+30206(l)30PBS+EP201表6HBVDNA疫苗免疫前后比较HBVTg小鼠个体血清HBsAg水平降低差值25ng/ml的有效数及百分率分组剂量(fig/只)n有效数有效率(％)pS2.S100209(2)45pS2.S+pIIF+EP30+302010(1)50PBS+EP20315表7HBVDNA疫苗免疫前后HBVTg小鼠血清ALT检测结果(IU/L,X±s)分组剂量(ng/只)动物数(n)ALT(IU/L)'免疫前1次免疫后2次免疫后3次免疫后2w3次免疫后4wpS2.S1002036.92±10.9626.翻.0042.02±13.03.45.95±16.8832.67±16.88pS2.S+pIIF+EP30+302034.54±10.5139.65±23.78(')48.35±22.8646.86±33.4636.22±15.94PBS+EP2027.42±11.6622.84±11.4639.60±8.4542.48±19.0029.27±16.7权利要求1、一种HBV双质粒DNA疫苗，其特征是该疫苗含有疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF。2、根据权利要求1所述的HBV双质粒DNA疫苗，其特征是该疫苗的疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF的真核表达载体均为pVAXl。3、权利要求1或2任一所述HBV双质粒DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤采用将目的基因HBV的包膜中蛋白preS2.S基因插入载体pVAXl的启动子pCMV下游，并在目的基因起始处引入-3为A，+4为G的KOZAK序列ANNATGG。4、根据权利要求3所述的HBV双质粒DNA疫苗制备方法，其特征在于，构建pS2.S采用上游引物Ph5、-GGAAGCTTAGGATGGGCTGGCTGCAGAGCCTG-3、，下游弓I物P2:5'-GGGAATT'CTTAAATGTATACCCAAAGACAA-3、，并于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。5、权利要求1和2所述的HBV双质粒DNA疫苗制备方法，其特征在于，构建中采用将融合的人IL2IFNy基因插入载体pVAXl的启动子pCMV下游，并在目的基因起始处引入-3为A，+4为G的KOZAK序列ANNATGG。6、根据权利要求5所述的HBV双质粒DNA疫苗制备方法，其特征在于，构建pIIF采用的上游引物为P1:5-GGAAGCTTAGGATGGGCTACAGGATGCAACTC-3'，P2:5、-GGGAATT、CTTACTGGGATGCTCT-3'，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点。7、根据权利要求5所述的HBV双质粒DNA疫苗制备方法，其特征在于，融合的人IL2IFNy基因中的IL2和IFN-y通过AGSGGGGS连接肽融合而成。8、一种纯化权利要求1所述的HBV双质粒DNA疫苗的方法，其特征在于，质粒初提液经分子筛柱，收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化，最后上阴离子柱，收集质粒峰并用有机溶剂沉淀，用缓冲液溶解质粒DNA。9、根据权利要求8所述的HBV双质粒DNA疫苗的纯化方法，其特征在于质粒初提液直接上样Sepharose4FastFlow分子筛柱，收集洗脱峰上PlasmidSelect特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，最后上Source30Q阴离子柱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶解质粒DNA。10、权利要求1所述的HBV双质粒DNA疫苗在制备预防和治疗乙型肝炎药物方面的应用。11、根据权利要求10所述的HBV双质粒DNA疫苗在制备预防和治疗乙型肝炎药物方面的应用，其特征在于注射时采用在体电脉冲技术。全文摘要本发明涉及一种利用基因重组技术构建的HBV双质粒DNA疫苗、制备方法及应用。该HBV双质粒DNA疫苗包括疫苗质粒pS2.S和其佐剂质粒pIIF，其真核表达载体为pVAX1。质粒体外转染非洲绿猴肾细胞(COS-7)，检测到目的基因的较高水平表达。经裂解、纯化后双质粒按1∶1配伍，联合在体电脉冲技术注射Balb/c小鼠，检测到HBVDNA疫苗能诱导机体产生较高的HBsAg抗体水平和特异性的细胞免疫应答。本发明还涉及该治疗性HBVDNA疫苗在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。文档编号A61P1/00GK101095951SQ20071002911公开日2008年1月2日申请日期2007年7月11日优先权日2007年7月11日发明者杨富强,罗显荣,莫国玉,陈光明,陈阳述,饶桂荣申请人:中国人民解放军第四五八医院