专利名称：：一种中药组合物的新应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于医药领域，具体地是涉及一种中药组合物的新/左用。。
背景技术：
：一种中药组合物，其有效成分的原料重量份组成为岗梅308份、山芝麻43份、五指相59份、淡竹叶18份、木蝴蝶1份、布渣叶18份、火炭母46份、金沙藤104份、广金钱草27份、金櫻根106份)该中药组合物通常制备成为凉茶的形式(又称中药组合物或王老吉凉茶)，其主要用于改善湿热上火而产生的头痛、发热症状。其中约占该中药组合物50%的岗梅根(/^^&7^&)为冬青科植物，在我国南方广泛分布，其性味苦寒，主治功用为清热解毒、生津活血，治热病、燥渴、热泻、咳血、喉痛等。临床报道岗梅根还可以防治各种感染和炎症，常作为药茶的原料，也常制成多种单方或复方制剂[3。黄贤华等人报道金櫻根(及OM丄加WgfltoMcte)具有耐缺氧作用，另外，据报道金沙藤(丄少godi-柳y'flpow'c柳)、五指柑(CWhwme血aL.松riSarcofifarc0^^oot))、火炭母(Pofygomwiij/Kwe/weL.)和淡竹叶(丄op/Krf/iCT""加graci7e5ra"gw)均有保肝护肝，治疗肝炎的作用。该中药组合物所涉及的十味中药均为广东民间常用中药，近年来对其研究较为活跃，但是尚未有对于这十味中药配合在一起用f治疗和预防应激和氧化性疾病的研究报道。随着科技的进步和生活节奏的加快,人们为了适应社会的闩益强烈的竞争,需要承受来自不同方面的种种压力,使人们常常处于应激状态，由应激而引起的问题也随之而来。当机体受到应激负荷引起精神紧张和焦虑不安的同时，血中ACTH浓度、皮质激素含量都会相应增多。在这一反应中，也包括儿茶酚胺的分泌量的增加，中枢神经系统的兴奋，心跳加快，血压升高，肝糖原分解的增加及血糖升高等生理反应以适应在应激情况下对能量的需求。可以认为，应激引起机体内环境失衡是一组复杂的临床综合症状，是很难将体内某种串--症状作为治疗或改善对象加以解决。尽管人们可以通过减少工作量，调整生活习惯与精神状态,改善生活环境及适当休息等方法加以改善，但单凭这些心理上的调整可能远远不够。因此需要针对不同人群的各自的特殊症状予以相应的药物治疗,免疫治疗及营养支持疗法等方法来解决。最近的研究表明通过应激，尤其是拘束负荷诱发小鼠氧化应激的方式，可以导致动物的肝损伤以及导致动物的心理压力；而且中医理论认为各种刺激源所引起的气机变化，主要由肝脏来调整。在心理方面对于情绪变化，尤其在调节情志因素引起的各种变化时，肝脏起着决定性的作用。这提示中医学,的肝功能与两医学的神经一内分泌一免疫系统表示的机体内环境稳定状态密切相关。Rosch等人的研究证明，长期的应激负荷不仅严重影响身心健康，而且会导致情绪和行为异常(SfrewMe^/卯7,7U-6)。应激是机体受到应激原负荷时出现的防御反应及适应过程，涉及到神经、内分泌及免疫等多方面生理功能。当然，应激反应直接影响机体的激素分泌、神经和免疫系统的功能，严重时可导致急性器官功能衰竭等生理反应(历ojcf.历Wec/i"o/.历oc/ie肌，20W，47&7-".)。我们的前期工作证明拘束应激降低血糖血脂利用率、影响机体新陈代谢水平，拘束负荷小鼠的血中胰岛素水平及肝糖原合成能力明显低下(Jowrna/o///ra/决Scze"ce，52",。人们知道生理过程需要血糖作为能源去维持脑、心脏和肌肉等的组织功能，因此改善能量的新陈代谢对抗应激反应非常重要的。慢性疲劳综合症(chronicfatiguesyndrom,CFS)，是现代医学新认识的一种疾病，是亚健康状态的一种特殊表现。该病主要症状表现为神疲乏力、失眠多梦、耳鸣健忘、腰酸背痛、头发脱落及须发早白等。其特点是症状持续反复发作，持续时间六个月以上，充分休息也不能解除。长期工作紧张、竞争压力大、情绪不稳定和负性生活事件容易诱发慢性疲劳综合征，它是威胁现代人健康的隐形杀手。
发明内容本发明的需要解决的技术问题是提供一种中药组合物的新J^用。—种中药组合物的应用，其制成有效成分的原料重量份组成为，岗梅308份、山芝麻43份、五指柑59份、淡竹叶18份、木蝴蝶1份、布渣叶18份、火炭母46份、金沙藤104份、广金钱草27份、金樓根106份，所述中药组合物应用是指用于制备提高抗应激效果及治疗或改善因应激负荷引起的免疫低下和/或糖脂代谢低下的药物或健康食品或食品添加剂。所述的中药组合物的应用，还包括在制备改善或和治疗慢性疲劳综合症的药物或健康食品或食品添加剂中的用途。所述的中药组合物的应用，还包括所述凉茶在制备提高应激负荷下的NK细胞杀伤活性、改善因NK细胞活性低下起因的感染症的药物、働泰食品或食品添加剂的用途。本发明中药组合物的应用，可以改善因NK细胞活性低下起因的病原感染而继发感染症，改善应激负荷起因的免疫功能低下和/或糖脂代谢低下还&了以用于制备治疗或改善氧化应激负荷引起的各种临床症状的药物、健康食品、食品添加剂。从实验可以证明口服途径食用，所述中药组合物以有效调节因应激导致的免疫器官萎縮；脾脏细胞数目减少淋巴细胞增殖能力下降；淋巴细胞中T细胞亚群的比例紊乱；增强NK细胞杀伤活性。本发明所述中药组合物是一种安全性高，可通过提高机体免疫系统，从而达到预防、改善和治疗应激、疲劳、感染、免疫低下用于制备可以长期服用的、安全无毒副作用的药物、食品添加剂、健康食品。该中药组合物在投药剂量达到125mg/kg以上时，即显示出有效的改善因应激负荷引起的各种免疫力低下症状。鉴于该中药组合物是以药剂、健康食品或食品添加剂作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择水或含水乙醇为宜。提取时该中药组合物所包含的十味中药与溶剂的比率没有特定限制，但一般与溶剂的比例以1:1S0范围为宜。本发明对提取温度没有特定限制，从室温到溶剂沸点范围都可适用。当然室温、常压及在溶剂沸点范围内提取最为理想。提取时间从10秒到24小时范围都可以。在提取时，根据需要也可以在溶剂中添加碳酸氢钠、抗坏血酸钠盐(sodiumascorbate)等物质。这些提取方法不会影响该中药组合物本来具有-的生物活性。本发明提供的该中药组合物的使用量一般在0.001%至100%重量比，但通常饮料添加浓度一般在0.01^至50^(W/W)范围较为适宜。在这个浓度范围内，该中药组合物适于直接服用，容易被消费者接受。当然，作为添加物的该中药组合物随着加入量的增大，可能会出现苦涩感觉。其解决办法可以根据市场需要及消费者的心理要求改换剂型，例如使用片剂、颗粒剂、胶囊剂等剂型。低浓度该中药组合物溶液可以作为日常饮料提供给消费者。本发明提供的该中药组合物，可以多种口服剂型投放市场，用于预防、改善和治疗应激反应及应激负荷引起的各种临床症状。当然，该中药组合物也可以与常用的赋形剂等医药用载体结合而后制剂化。必要时也可以添加一些防腐剂、抗氧化剂(antioxidants着色剂、甜味剂等制剂添加物。比较适宜的该中药组合物赋形剂，一般考虑有乳糖、白糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤维素等。润滑剂一般应采用硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉等。溶剂通常使用精制水、乙醇、丙二醇等。防腐剂一般采用氯丁醇、苄醇、二羟基乙酸等。抗氧化剂通常以亚硫酸盐、抗坏血酸等比较适宜。本发明提供的该中药组合物，可以其原型、提取物或粉末添加到制品中用于口服。该中药组合物也可.作为食品添加剂与其它饮料原料结合制成一定的饮料制品，如该中药组合物饮料、碳酸饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、豆乳等。该中药组合物还可以考虑制成饼干、巧克力类、糖果类、口香糖类、快餐点心类、果冻点心类、面包、豆腐、酸奶酪等曰常食品。本发明中提供的该中药组合物，也可以原型、水溶液稀释后作为皮肤外用剂使用。当然也可以通过与医药用载体结合制成一定的制剂，如气雾剂、液体制剂、提取物、混悬剂、乳剂、软膏剂、半流体制剂、擦剂、洗剂等剂型提供化妆品、医药品市场的消费。本发明提供该中药组合物作为抗应激、抗疲劳、减轻和预防各种原因引起的各种急性或慢性炎症、各种并发症等临床症状药物及饮料为下述实验所证明。在使用改善拘束负荷动物模型的药理实验中，该中药组合物在投药剂量达到125mg/kg以上时，即显示出有效的改善因应激负荷引起的各种下症状。本发明中该中药组合物的投药量，根据应用者的健康状况、年龄、性别及体重等条件可以调节。成人平均体重如以60Kg计算，该中药组合物日口服量一般可以考虑在lg至10g范围内，分次服用。具体实施例方式本发明可以通过以下实施例证明中药组合物的新用途，但并不仅仅局限于以下实施例。实施例l:中药组合物制备的药物或健康食品配方岗梅308g、山芝麻43g、五指柑59g、淡竹叶18g、木蝴蝶lg、布渣叶18g、火炭母46g、金沙藤104g、广金钱草27g、金樱根106g。制备:十味药，加水煎煮二次,每次1小时,滤过,合并滤液，浓縮至相对密度为1.03(45'C)，以转速为15000rpm超高速离心分离至澄清，取分离液浓縮成稠膏。制备成药物颗粒取稠膏，加适量蔗糖粉，制颗粒，千燥，制成含糖颗粒720g;或取稠膏，加适量淀粉，制颗粒，干燥，制成元蔗糖颗粒72g，即得。制备成健康食品4g上述浸膏，加天然矿泉水100ml，加适量蔗糖配制而成茶饮料；茶浸膏5g,优质白砂糖65g，甲级葡萄糖28g,加水适量制成草珊瑚硬糖10粒。实施例2:促进拘束应激起因的小鼠糖代谢低下的恢复作用实验动物购入7周龄雄性BALB/C小鼠，饲养温度23士2X:，800Lux照明强度照明12h/d(7:00-19:00),饲养一周后用于实验，以下实施例3-7都是用此相同的实验动物。试验样品实施例l所得中药组合物干浸膏500mg溶于蒸馏水10ml，以下实施例都是用此相同的试验样品。应激模型拘束应激组小鼠固定在打有透气孔的50mL圆锥管中进行拘束应激12h,以下实施例都是用此相同的应激模型。试验方法实验将小鼠随机分成正常对照组、拘束对照组、125mg/kg人参皂苷阳性对照组、125及500mg/kg中药组合物浸膏给药组，共五组每组7只。阳性对照组及中药组合物组以0.1ml710g灌胃给药，正常对照组和拘束负荷模型组均灌胃等量水溶液，每天l次连续给药5天，在末次灌胃30分钟后进行拘束应激实验。上述各组实验动物在禁食和拘束结束30分钟后口服葡萄糖2g/kg，分别测定口服葡萄糖20、40、60、80分钟后的血糖浓度。试验结果(表1):组别血糖半数消除时间(分钟)(狄尔洲)正常对照0.08±0.01应激对照57.3±5.0厶厶0.05±0.01△△阳性对照44.9±4.0"0.11±0.01"125mg/kg45.6±4.4"0.11幼.02"500mg/kg47.9i4.5**0.10±0.01"注厶A与IH常对照组比P0.01,"与应aW照组相比户O.Ol实验结论小鼠拘束负荷20小时后血糖浓度半衮期由51.8分钟延迟到57.3分钟，表明拘束负荷降低小鼠对葡萄糖作为能源的利用能力。125及50Qmg/kg中药组合物和人参tS汗给药均促进拘束负荷小鼠的血糖消除速率，改善因应激负荷引起的血糖利用率低下，改机体的能量代谢水平，实旌例3:1S^拘束应激起因的小K血浆酮体水平升髙的恢复作用试验方法实验将小K随机分成正常对照组、拘束对照组、125mg/kg人参皂苷阳性对照组、125及500mg/kg中药组^M漫裔给药组，共五组每组7只。阳性对照组及中药组合物组以0.1mU10gff胃给药，正常对照组和拘束负荷模型组均壤胃等量水溶液，每犬l次连续给药5天，在末次鹰胃30洲后进糊束应激实验.小K在乙瞎麻醉下心脏取血O.SmL于肝崈钠小离心管中.5000转5分钟离心，取血浆，按丙酮酸试剂盒方法測定JliL^丙翻慶含1,试验结果(表2):组别血浆丙酮酸(tw尔/毫升)lE常对照1.13±0.1应激对照1.84±0.3厶么阳性对照1.62±0.2*125mg/kg1.40±0.2**50Qmg/kg1-14±0.1"注与正常对照组相比厶厶尸O.Ol;与应激对照组相比"PO.Ol,*/<0.05)实验结论当葡萄糖摄取不足时，机体会动员储存的脂肪作为能源利用，嗣体是血荣脂肪酸代谢的不完全产物。我们的结果发现拘束负荷小鼠血奖酮体水平明显l:升，表明拘束负荷増加小鼠血浆脂肪酸代谢的不宂全产物.125及50Qmg/kg中药组合物和人多3苷给药组均降低拘束负荷小鼠的翻体水平，改并因拘束负荷起因的能源代谢低下。实旌例4:促进拘束应激起因的小K肝糖原合成低F的恢复作用试验方法实验将小豕瞎机分成正常对照组、拘束对照组、125mg^kg人参皂苷阳性对照组、125及500mg/kg中药组合物浸裔给药组，共五组每组7只，阳性对照组及中药组合物组以O.lmIVlOg灌胃给药，正常对照组和拘束负荷模型组均潘胃等量水溶液，每天1^续给药5天，在末次堠胃30洲后进行拘束应激錢.小鼠在乙鹏麻醉下取出肝脏，按肝糖原试剂盒方法測定肝糖原含量，试验结果(表2):组别肝糖原(毫克/克肝组织)iE常对照31.19±6.0,顺17.7&fc4.0*""^紐16網.0*5紐20.03±3.0*注(与正常对照组相比^<0.05:与应激对照组相比*尸<0.05)实验结论经口给药125啤kg'1及500mpkgf'中药组合物和人参皂苷都显示出可以在—定程度上减轻拘束应激弓l起的小鼠的肝糖原合成能力下降，证明中药组合物能提离葡萄糖IgJEi的利用的同时加强能量的储存，实jt例5:对拘束应激起因的小鼠脾脏脂代谢低下的恢复作用^t&方法实验将小R瞎机分成正常对照组、拘束对照组、12Sm^kg人参t^阳性对照组、125及500mg^kg中药组^W浸贵给药组，共五组每组7只.阳性对照组及中药组合物组以0.1mL/10gtt肖给药，正常对照组和拘束负荷模型组均tt胃等量水溶液，每天l次连续给药5天，在未次灌胃30分钟后进行拘束应激实验，上述各组实验动物在禁食和拘束结束30她后尾静脉注射脂肪乳剂(UniL/IOg,40洲后小鼠乙鹏麻醉心脏取血液，血液样本加2%肝素钠管500(hpin离心5賴取上淸雌，检洒前所有样品存放于-20度.用甘油的甘油-3曙麻酸激,氣化祛(GKPO)经ll^分析仪确定三酸甘油睡含Jt,试验结果(表3):组別血浆甘油三酶(塞彭分升)208.97±17.79393.73±46.62AA199.07*25.35**1邻.52^39.30"130.75i22,22"注与正常对照组相比厶厶尸O.Ol:与应激对照组相比"尸<0.01实验结论:小鼠拘束负荷20小时尾静脉注射脂肪乳剂后TG消除速率明显减慢(户O.Ol)，表明拘束负荷可以彩响质脂能源的利用.125及500mg/kg中药组合物组均能使血浆甘油三酯消除速率明显加快(尸O.Ol),可见中药组^M能加速应激负荷小鼠脂能源的利用。实施例6:对拘朿应舰丙的小鼠肠系膜脂肪lt活性低下的恢复作W试验方法实验将小鼠隨机分成正常对照组、拘束对照组、125mg/kg人参皂苷阳性对照组、125及500nig/kg中药组合物没裔给药组，共五组每组7只.阳性对照组及中药组合物组以0.1mUl6gX胃给药，正常对照组和拘束负荷模型组均權胃等量水溶液，每犬l次连续给药5天，在末次灌胃30^m后进行拘束应激实验，上述各组实验动物在禁食和拘束结束30分钟后尾静脉舰脂助乳剂0.1mL/10g,40賴后小豕乙鹏醉分离肠系鹏组织，每20Dmg脂肪于lmLPBS溶液中剪碎匀浆(KAUbcnte6hni^Gemumy)匀浆，收集匀浆液1200(hFm、41C离心20min，吸取中间的澄滴液，迅速储#^-20^:备用-在BALB-DTNB法自动检澜LPL活性检拥'试验结果'(表4):正常对照应激对照阳性对照125mg/kg500mg/kg组别CD4/CD8正常对照933.43±100加应激对照鄉.35±60.10阳性对照740.11±69.00125mg/kg846.18±80.50500mg^kg752.81±71.20注与正常对照组相比厶厶尸O.Ol:与应激对照组相比"PO.Ol实验结论3葡萄糖摄取不足，机体会动员储存的脂肪来供应能量，肠系膜脂肪,活性会提离，拘束负荷使小鼠肠系鹏肪賺活性下降39.0%(P<0.05〉，表明拘朿负荷使小鼠脂肪动员能力下降.125及5001118^中药组合物给药组使应激负荷小鼠的恢￡^正常水平11实旌例7:对应激小鼠脾脏淋巴细胞内过氧化状态氧化及抗氣化能力的影响实验方法:实施例4所得的血浆样品，1BARS法測定脾脏淋巴细胞内MDA含量及ORAC法劂定脾脏淋巴细胞内抗氣化能力指数水平.TBARS拥定原理为MDA可与琉代巴比妥酸(TBA滩合，形成在532nm处有最大吸收峰性质的红色产物，通过比色法进行測定并计算MDA含量'ORAC測试原理为荧光素钠在48Snm光激发下，^527mn荧光，可以被AAFH释故的过载自由基ft化而使荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素钠竞^l化剂，减暖其荧光消退的速度.实验结果(表5〉组别MDA(纳摩尔/毫升)ORAC(微庫尔Trolox当M/毫升)正常对照29.67±4.026853.97±887.0应鹏照35.12JbS.0AA24281.4±15诉.払厶阳性对照11.29±2.0**33057.36±2423.29"125mg/kg29036.35±2100.19"250mg/kg19.65±3.0"33687.11±2373.8"注与正常对照组相比厶厶尸O.Ol:与应afcCt照组相比"P0.01实敏结论拘束应激升高小豕血浆1^^含*的同时,011>^(:水平，即拘束负荷体内处丁-氣化损伤状态和应激组相比，125mg^kg和50Qmg^kg中药组合物给药组小鼠血浆内的过氧化状态明显得到改蒋，同时ORAC水平明显升髙(尸<0.01),可见中药^_合物能明显缓解应激诱发的体内的氣化应激状态.实旌例8:促进拘束应激起因的小鼠免疫器官指数低f的恢复作用实验动物:购入6周齡雄性CS7BL/6小鼠,饲INg度23^2T:，800Lux照明强度照明12h/d(7:(MM9:00),饲养-周后用于实脸，以F实施例9-13都是用此相同的实验动物.试验样品实施例l所得中药组合物干虔裔50Qmg溶于蒸馏水10ml，以下实施例都是用此相同的试验样品.应激模型拘束应激组小S固定在打有透气孔的50mL圃锥管中进行拘腿激12h，以下实施例都是用此相同的应激模型，试验方法小鼠随机分4组，每组7只，分别为对照组，拘鹏教模型组，给药低剂ft组，实验组缺给药一次，连续tt胃给药5天，正常对照组和应激对照组给予等容量水崈液，除正常对照组外，其余各组给药第二天拘束12小时，拘束恢复—二天后小鼠脱椎处死并取出脾脏和胸腺称霣，试验结果(表8-l〉组别脾脏指数(％)胸腺措数(％)正常对照0.54±0.040.34±0.03模型对照0.41±0.03AA0.19±0.01AA125mg/kg0.44±0.03*0.24^0.02*500mg/kg0.54±0.04"0.2S±0.03*注中药组合物对应激小鼠免疫指数的影响(JF土J，"7)(与iF.常对照组相比厶APO.01;与应^照组相比*7<0.05〉实验结论经口给药125m^kg—1及500mg*kg—'中药组合物显示出可以减轻拘束应激引起的免疫指数减小，证明并用中药组^r可以改兽应激对免疫器官的损伤作用，实施例9:促进拘mjS激起因的小鼠脾脏细胞低F的恢复作用试验方法小R隨机分4组，每组7只，分别为对照组，拘舰激模型组，给药低剂量组，实验组每天给药一次，连续潘胃给药5天，正常对照组和应激对照组给予等容量水溶液。KdE常对照组外，其余各组给药第二天拘束12小时，拘束恢复三天后小R脱椎处死并取出脾脏，用组织研磨粘PBS溶液中分离单细跑，经200目铜两过滤，PBS溶液定容到10mL后细胞计数，试验结果(表^2):组别脾脏总细胞数(x107)正常对照18.&12.0模型对照14.4±1.0厶125mg/kg17.&:1.0*注:中药组合物对应激小鼠脾脏淋巴细胞总数的影响(f土J，/l-7)(与正常对照组相比A^O.05:与jSmXiT照组相比"尸O.Ol，*/<0.05)实验结论经口给药125mgkg,1及500mgkg"中药组合物显示出可以在定程度上减轻拘束应激弓胞的(小鼠)脾脏细胞数减少，证明中药组合物中药组合物可以改并拘束应激起因的脾脏细胞低下作用，说明中药组合物ff改整免皮低卜'作用，从而改接免疫低F易引起疲劳、各种感染症和感染继发症等.实旌例10:对拘束应激起因的小鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例紊乱的恢复作用试验方法小鼠敏机分4组，每组7只，分别为对照组，拘^m激樓型组，给药低剂量组，实验组每天给葯一次，连续籌胃给药5天，iH常对照组和应激对照组给予等容置水港液,除正常对照组外，其余各组给药第二天拘束12小时，拘束恢复三天后小豕脱椎^E并取出脾脏，用组织研磨器在FBS洛液中分离糊胞，经200目铜网过滤，1500ipm离心5min，弃上清液.加入3mLTU^HCl(pH7.65)绶冲溶液低张处理红细胞，静置2min后加PBS液5mL终止红细胞裂解反应，150Qqmi离心5min后弃上糖液，用FBS液换洗两次后，添加10%FCS-RFMI164O培养液讽整细胞,至5xl(AxllsinL人调整脾淋巴细胞浓度为5xl()6ceUsmL—',取流式细胞分析专用管，每管加入细胞息液lOO)iL,每个样本制备两管，进行FITC，PE双色荧光抗体标记，第一管加入2(iLPE标记抗CD3抗体和ljiLFITC标记执CD4抗体第二管加2|iLPE标记抗CD3抗体和3|iLPE标记抗CD8抗体.室温闭光解育20min后加入500)iLPBS,振荡混匀1500qim离心5min后弃上淸液,后用500(iLPBS振荡混匀甩于检拥每5><106个细胞中的CD3+CD4+细lfifllCD3+CD8+细胞百分，并计算CD3+CD4卜细胞M及CD3+CD8+细胞M比值。T细胞是不均-的细胞群体，依据其表面标志及功l^征，又可将其分为不同亚群，CD4+细胞(Th)WCDg"细胞(Ts)两个主要亚群，CD4+细胞具有辅助和诱导功能，CD8+细胞具有免疫抑制作用和细胞毒功能，它们既相互协作，又有各自的功能特点，需要共同完成免,答才发挥免疫调节功能，所以维持T淋巴细胞亚群的稳定对人体免疫功能起了重要的调节作用。试验结果(表10O):<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>汰中药组合物对应激小K脾脏T淋巴细胞亚群比例的影响(5士J，/l-7)(与正常对照组相比厶厶/<0.01:与应激对照组相比**/<0.01〉实验结论拘束应激造成T淋巴细胞亚群比例紊乱的一种免疫异常状态，经口给药12Smgkg"及500mffkg"中药组合W中药组^W显示出可以调节拘束应激引起的脾脏T淋巴细胞亚群亲乱，证明并用中药组^4(j可以改tf拘束应激起因的免疫紊乱作用，从而改并因免疫紊乱引起的疲劳、各种感染症和感染继发症等，实施例11:对拘束应激起因的小豕脾脏NK淋巴细胞数目低下的恢复作用试验方法小鼠随机分4组，每组7只，分別为对照组，拘束应激模型组，给药低剂量组，实验组每天给药一次，连续灌胃给药5天，IH常对照组和应激对照组给f'等容量水溶液,KGE常对照组外，其余各组给药第二天拘束12小时，拘束恢复三天后小鼠脱椎处死并取出脾脏，用组织研磨器在PBS溶液中分离单细胞，经200目铜网过滤，1500ipmmiif'离心5min,弃上淸液,加入3mLTii^HCl(pH7.65)缓冲溶液低张处理红细胞，静置2min后加PBS液5mL终止红细胞裂解反应。150(hpm离心5min后弃l:淸液，用PBS液换洗两次后，添加10WCS-RPMI1640培养液调整细胞浓度至5xl06061131111/1,取流式细胞分析专用管，每管加入细胞悬液lOOpL,加入2jiLPE标记抗CD3抗休和lnLFTTC标记抗NKl.l抗体.室温闭光醉育20min后加入500)iLPBS，振荡混匀1500ipm离心5min后弃上消液，后用500)iLPBS振荡混匀用于'检測每5"06个细胞中的NK(NKl.rCD3")%,并结合淋巴细胞综述计IF脾脏NK细胞数B,服细胞参与机体的抗肿痛、抗感染等生理腿，是机体重要的免疫细胞'因此NK细胞数目的变化与机体兔疫状态密切相关，^fft结果(表114〉组别NK总细胞数(x107〉正常对照1.90±0.1模型对照1.74dbO.07A125mg/kg2.26i0.1*500mg/kg3.31迫2"注中药组^Ml对应激小鼠脾脏NK细胞总数的影响(jf±,w=7)(NK细胞总数-NK细胞百分比x脾脏淋巴细胞总数，和正常对照组相比厶尸<0.05:和应^照组相比**户<0.01，*/<0.05)。实验结论拘束应激造成NK细胞总数减少一种免疾异常状态，经口给药125mg'kg"及500mg'kg.1中药组合物中药组合物显示出可以调节拘束应激引起的脾脏NK细胞数n减少，证明并用屮药组合物可以改善拘束应激起因的免疫棄乱作用，从而改善因免疫紊乱引起的疲劳、各种感染症和感染继发症等。实旌例12:对小鼠自然杀伤性细胞(natunlkiller:NK)的賦活作用实骑方法小鼠随机分4组，毎组7K.分别为对照组，拘束应激模型组，给药低剂,组，实验组每天给药一次，连续港胃给药5天，正常对照组和应激对照组给予等容Jt水溶液.除iE常对照组外，其余各组给药第一-天拘束12小时，拘束恢复二天后小豕脱椎处死并取出脾脏，用组织研磨器在PBS絲中分离单细胞，经200目铜网过滤，1500ipm离心5min,弃h淸液。加入3mLTris~HCl(pH7.65)绶冲溶液低张处理红细胞，静置2min后加PBS液5mL终止红细胞裂解反应.150(hpm离心5min后弃上淸液，用PBS液换洗两次后，添加10%FCS-RPMI1640培养液讽整细胞^至ZxlC^cellsinL-1,实lft3^DiO标记的IELiBI胞被杀伤破损时，染料PI进入细胞标记细胞核，根据效乾细胞大小和DiO染色差异，可在FL1/FS图中区分靶细胞群，进而研究靶细胞死亡情况，算出NK杀伤活性.具体实验为，10%FCS-RPMI1640培养液将脾淋巴细胞思液调至lx106、5x10s、2.5xlW及125x1Wcells.100Ml/1浓度后，以100ML"wdT1分别添加到96孔画底培养板中作为NK杀伤效应细胞.10%FCS-RPMII640培养液调整YAC-1细胞浓度至106mL'，添加EMO(10(iL'lmL1cells),在371C、5WC02条竹下辨齐15min后月培养液洗欲两次，过300目尼龙网，用t述培养液调整细胞浓度至lWceUs100作为NK靶细胞以100iLive!T1添加到效应细胞中(效:祀细胞比分别为100:1，50:1,25:1及12.5:1).YAC-1靶细胞自然死t率为10Vells'100(iL"祀细胞内添加100iL培养液作为对照组,37TC、5WC02培养3小时后，每孔加入500mgl/'PI8|iL,继续孵育一小时后取出，将培养板安于冰上终止杀伤反应，避光保存用f流式细胞仪检溷，细胞仪对每个样本中的1000个乾细胞作NK杀伤活性的检涠分析，NK杀伤活ttfflNK细胞对YAC-1祀细胞的细胞毒性来表示，并通过以下公式计算加扯iaNK珠发祀细胞死t率-ffiffl胞自发死f:率细胞毒性(W-_X100*.100-粑细胞自发死亡率本发明计算出l鹏cytolysis时的NK的杀伤活性LU以细胞毒性为10%时所铕要的效应细胞数目)所需要的脾脏细胞数为单位来定i表示。此外，本发明还if算整个脾脏全部细胞所具有的NK细胞杀伤活性(LU10邻leen)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>模型对照18.1±1.0厶125mg/kg30加.5"250mg/kg46似.4"注中药组賴对应激小R脾脏NK细胞毒活性LU^脾脏的影响(至士J,/^7)(和正常对照组相比厶/<0.05:和应激对照组相比"/<0.01〉实验结论从试验结果表示，和疋常组比较，拘束应激使LU10邻Ieen下降，即拘mjS激使NK细胞活性下降，经口给药125mg'kg-'及SOOmg'kg"中药组合物显示出促进脾细胞恢复的同时,也在一定程度t賦活NK细胞活性，证明并用中药组合物可以改袢由于应激造成的NK细胞活性"F降，具有一定的免疫賦活作用.NK细胞活性下降会引起机体免疫力F降，疲劳和容易感染，故中药组合物町以用改裤疲劳、堉强抗感染症和感染继发^_等的作用.实旌例13:对应激小鼠脾脏淋巴细胞内过ft化状态氧化及抗諷化能力的影响实验方法实施例11所得的脾脏淋巴细胞悬液，PBS溶液调整细胞浓度为2xlO"cells/mL匀菜，9000q皿、4X:离心15min,离心上糖液TBARS法測定脾脏淋巴细胞内MDA含量及ORAC法糖定脾脏淋巴细胞内抗ft化能力Jtft水平.TBARS測定原理为MDA可与硫代巴比妥酸fTBA)缩合，形成在532nm处有肇大吸收峰性质的红色产物，通过比色法进fiiH定并计算MDA含ft,ORAC測试原理为荧光素钠在485nm光激发下，发射527nm荧光，可以被AAPH释放的过諷自由基氣化而使荧光特性消失，当抗载化剂存在时，可与荧光素钠竞争载化剂，减缓其荧光消退的速度.实验结果(表134):<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注与正常对照组相比AAP切.Ol:与应^照组相比**尸<0.01实验结论拘束应激升高小豕脾脏细胞内MDA含量的同时HHKORAC水平，即拘束负荷小鼠脾脏淋巴细胞处于氣化损伤状态和应ft^相比，125mg/kg和50Qm^kg中药组合物给药亂小鼠啤脏细胞内的过諷化状态明显得到改菩.同时细股内ORAr水平吼显歼布(尸<0.01)，可见中药组合物能明显缓解应激诱发免疫细胞内的氣化应激状态.实1K例14:S整拘束应激引起丙ft酸氨基转移瞎(ALT)棄乱作用实验使用广东省医学实验动物中心购入的7周龄雄性C57BL/6小鼠，饲养fflfl[23i2lC,照明时间12h小时/天(7:(XM9:00),饲养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘束应激模型组，阳性药对照组(维生素C2SQmg'kgf')，低剂量中药组合物给药组(250mpkg一1)，拓剂量中葯组^Mf给药组(500mgkg—')，每组7只小鼠，共分5组.iE常对照组和拘束负荷模型组均潘胃同体积蒸馆水，每天l次，第4天拘束模型组和中药组合物给药组以及维生素C给药组小鼠鹰'胃30分钟后进ffffi束应激18小时，正常对照组禁水禁食18小时，所有将小鼠乙鹏麻醉，心脏取血，10000ipm离心10min,用賴氏法tl定血浆ALT活性，结果表明经口给药后证明该中药组合物可以改兽拘束应徵起因的ALT活性升高，使得ALT活性下降到正常水平(表1为改中药组合物对拘束应激小鼠血浆ALT活性的影响，""'表示与空白对照组比较p<0.05)。实施例15:促进拘束应激引起的小鼠血浆和肝组织丙二醛(MDA)异常恢复作用实验使用广东省医学实验动物中心购入的7周龄雄性C57BL/6小鼠，饲养温度23±2°C,照明时间12h小时/天(7:00-19:00),饲养一周后用:P实验。小鼠随机分为空白对照组，拘束应激模型组，阳性药对照组(维生素025011^1^-1)，低剂量中药组合物组(250mgig'1)，高剂量中药组合物组(500mg-kg—')，每组7只小鼠，共分5组。lH常対照組和拘束负荷模型组均灌胃同体积蒸馏水，每天l次，第4天拘束模型组和中药组合物给药组以及维生素C给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照组禁水禁食18小时，所有将小鼠乙醚麻醉，心脏取血，10000rpm离心10min，并于冰上取出月f组织，用TBARS法测定血浆和肝组织MDA含量。结果表示，证明该中药组合物可以改善拘束应激起因的小鼠血浆MDA含量增多(表15-1为该中药组合物对拘束应激小鼠血浆MDA的影响，""'表示与空白对照组比较p<0.05)。表15-1抗应激中药组合物(Ex)对拘束负荷小鼠血浆ALT活性和血浆、肝组织MDA水平的影响组别ALTMDA(ILM/1)LiverPlasma(纳摩尔MDA/毫克(纳摩尔MDA/毫蛋白)升)Normalmice37,25±1.6529.13±2.1026.31±0.73Stresscontrol92.75±1.91*41.63±2.32#36.42±0.72*VitaminC31.02土2.11'18.29±0.23*27.34士0.61'(250mg/kg)39.29±2.56*22.53±1.61*32.67±0.80Ex(250mg/kg)32.69±1.46*19.73±1.47*28.46±0.77*Ex(500mg/kg)实施例16:对拘束应激引起的小鼠肝脏谷胱甘肽(GSH)水平紊乱的改善作用实验使用广东省医学实验动物中心购入的7周龄雄性C57BL/6小鼠，词养温度23i2匸，照明时间12h小时/天(7:00-19:00)，词养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘束应激模^绚，阳性药对照组(维牛素C250mg七g—、低剂量中药组合物组(250mgkg—1)，高剂量屮药组合物组(500mg七g'1)，每组7只小鼠，共分5组。ir.常对照组和拘束负荷模型组均灌胃同体积蒸馏水，每天1次，第4天拘束模型组和中药组合物给药组以及维斗:素C给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照组禁水禁食18小时，正常对照组禁水禁食18小时，所有将小鼠乙醚麻醉，冰上取出肝组织用HPLC法测定肝组织的GSH水平。结果UH明该中药组合物可较好地改善拘束应激引起的肝组织GSH水平紊乱(表2为该中药组合物对拘束应激小鼠小鼠肝组织谷胱甘肽水平的影响，"*"表示与空白对照组比较p<0.05)。实施例17:对拘束应激引起的小鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽S转移酶(GST)活性降低的改善作用实验使用广东省医学实验动物中心购入的7周龄雄性C57BL/6小鼠，伺养温度23±21C，照明时间12h小时/天(7:00-19:00),词养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘束应激模型组，阳性药对照组(维生素C250mgkg")，低剂量中药组合物组(250mgkg"),高剂量中药组合物组(500mg'kg—')，每组7只小鼠，共分5组。正常对照组和拘束负荷模型组均灌胃问体积蒸馏水，每天l次，第4天拘束模型组和中药组合物给药组以及维生素C给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照组禁水禁食18小时，正常对照组禁水禁食18小时，所有将小鼠乙醚麻醉，冰上取出肝组织，比色法测定肝纟n织的GPX和GST活性。结果证明该中药组合物可较好地改善拘束应激引起的肝组织GPX和GST活性降低(表17-2为改屮药组合物对拘束应激小鼠小鼠肝组织GPX和GST活性的影响，""'表示与空A对照组比较p<0.05)。表17-2抗应激中药组合物(Ex)对拘束负荷小鼠肝组织GSH含量及GST、GSH-Px活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例18:对拘束应激引起的小鼠肝一氧化氮(NO)含量增高的改善饲养温度23土21C，照明时间12h小时/天(7:00-19:00),饲养—周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘束应激模型组，阳性药对照组(维生素C250mglg-')，低剂量中药组合物组(250mglg—')，高剂量中药组合物组(500mgig'1),每组7只小鼠，共分5组。正常对照组和拘束负荷模型组均灌胃同体积蒸馏水，每天1次，第4天拘束模型组和中药组合物给药组以及维生素C给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照组禁水禁食18小时，正常对照组禁水禁食18小时，所有将小鼠乙醚麻醉，冰上取出肝组织用Griess化学法测定NO的含量。结果表明该中药组合物可较好地改善拘束应激引起的肝组织NO紊乱(表3为该中药组合物对拘束应激小鼠小鼠肝NO的影响)。实施例19:抗应激中药组合物对拘束应激引起的小鼠肝抗氧化能力指数(ORAC)降低的改善-饲养温度23士2'C，照明时间I2h小时/天(7:00-19:00)，饲养一周后用于实验。小鼠随机分为苧白对照组，拘束应激模型组，阳性药对照组(雄生素C250mg-kg")，低剂量中药组合物组(250mg'kg"),高剂量中药组合物组(500mg'kg'1)，每组7只小鼠，共分5组。正常对照组和拘束负荷模型组均灌胃同体积蒸馏水，每天1次，第4天拘束模型组和中药组合物给药组以及维生素C给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照组禁水禁食18小时，正常对照组禁水禁食18小时，所有将小鼠乙醚麻醉，冰h取出肝组织，参照Davalos等人方法并加以改进测定ORAC的含量。结果表明该中药组合物可较好地恢复拘束应激引起的肝组织ORAC紊乱。(表19-3为改中药组合物对拘束应激小鼠小鼠肝ORAC的影响，"*"表示与空白对照组比较p0.05)。表19-3抗应激中药组合物(E"对拘束负荷小鼠肝组织ORAC指数和NO含量的影响TreatedgroupORACNO(微摩尔/毫升)(微摩尔Trolox当量)Normalmice10-40±0.09*89.41±1.98Stresscontrol4.80±0,06#112.34±0.96#VitaminC11.20±0.10*91.55±2.46**(250mg/kg)15.20tO.12**93.56±2.26**Ex(250mg/kg)16.60±0.18**88.7壯3.39**Ex(500mg/kg)权利要求1、一种中药组合物的应用，其制成有效成分的原料的重量份组成为岗梅308份、山芝麻43份、五指柑59份、淡竹叶18份、木蝴蝶1份、布渣叶18份、火炭母46份、金沙藤104份、广金钱草27份、金樱根106份，其特征是，所述应用是在制备提高抗应激效果及治疗或改善因应激负荷引起的免疫低下和/或糖脂代谢低下的药物或健康食品或食品添加剂中的用途。2、根据权利要求1所述的中药组^的应用，其特征是，所述应用是在制备改糖或和治疗虫应激负荷引起的免疫低下和域糖脂代谢低下而导致的慢性疲劳综合症的药物或健康食品或食品添加剂中的用途，3、根据权利要求l所述的中药组合物的应用，其特征是，所述^f用是在制备治疗或改咎应激负荷f的NK细胞活性低下引起的免疫低下而导致的感染症的药物、健康食品或食品添加剂中的用途'。4、一种中药组合物的应用，其制成有效成分的原料的重量份组成为岗梅308份、山SM43份、五指柑59份、淡竹叶18份、糊蝶1份、布渣叶18份、火炭母46份、金沙藤104份、广^草27份、金楼根106份，其特征是，所述应用是在制备治疗或改普载化应徵负荷引起的免疫低下和/或糖脂代谢低下的药物、使豕食品、食品添加剂的用途，全文摘要本发明公开了一种中药组合物的新应用，中药组合物的制成有效成分的原料的重量份组成为岗梅308份、山芝麻43份、五指柑59份、淡竹叶18份、木蝴蝶1份、布渣叶18份、火炭母46份、金沙藤104份、广金钱草27份、金樱根106份，所述应用是在制备提高抗应激效果及治疗或改善因应激负荷引起的免疫低下和/或糖脂代谢低下的药物或健康食品或食品添加剂中的用途。所述中药组合物以有效调节因应激导致的免疫器官萎缩；脾脏细胞数目减少；淋巴细胞增殖能力下降；淋巴细胞中T细胞亚群的比例紊乱；增强NK细胞杀伤活性。文档编号A61K36/899GK101181539SQ20071003150公开日2008年5月21日申请日期2007年11月20日优先权日2007年11月20日发明者何蓉蓉,姚新生,丽宝,廖广群,曾玉兰,栗原博,郑荣波,黄晓丹申请人:广州王老吉药业股份有限公司