核苷酸分子septin1sr2及其在制备治疗白血病药物中的应用的制作方法

专利名称：：核苷酸分子septin1sr2及其在制备治疗白血病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术：
：白血病是一种造血系统的恶性肿瘤。表现为正常血细胞生成减少，周围血白细胞发生质和量的异常，白细胞及其幼稚细胞(即白血病细胞)在骨髓或其它造血组织中进行性、失控制的异常增生，浸润并损害各种组织，产生不同症状。根据白血病的病程及细胞形态学可将白血病分为(1)急性白血病病情发展迅速，骨髓及周围血中主要是异常原始和幼稚细胞。其自然病程多在6个月以内。急性白血病又分A、急性淋巴细胞白血病(急淋)；B、急性非淋巴细胞白血病(急非淋)。包括急性粒细胞白血病(急粒)、急性单核细胞白血病(急单)。(2)慢性白血病病程较长，骨髓及血中主要是较成熟的异常细胞，其次为幼稚细胞。自然病程多在一年以上。慢性白血病主要包括慢性粒细胞白血病(慢粒)；慢性淋巴细胞白血病(慢淋)；多毛细胞白血病；幼淋巴细胞白血病。(3)特殊类型白血病如低增生性白血病、绿色瘤或粒细胞肉瘤、嗜酸粒细胞白血病、嗜碱粒细胞白血病等。白血病是一种常见的恶性肿瘤，我国己将其列入重点防治的十大恶性肿瘤之一。白血病占恶性肿瘤总发病数的5%左右，发病以儿童和青年居多，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中占第六位(男性)和第八位(女性)，在儿童及35岁以下的人群中则占第一位。人类白血病的确切病因至今未明。有关研究表明，病毒可能是主要的因素，此外尚有遗传因素、放射、化学毒物和药物等因素。某些染色体的异常与白血病的发生也有直接关系，染色体的断裂和易位可使癌基因激活或位置发生移动，染色体内基因结构的改变可直接引起细胞发生突变。免疫功能的降低，也有助于白血病的发生。40年代以前，白血病被认为是"不治之症"。诊断后除了输血等支持疗法外，一般无其它特殊治疗。进入70年代，在综合支持疗法的基础上，采取联合化疗、免疫治疗、细胞生长因子与造血干细胞移植、中医治疗等有计划地科学综合疗法，使患者缓解率明显提高。然而，由于目前白血病的治疗大多需要进行骨髓移植，这就阻碍了进一步提高治愈率或者缓解率。首先，找到可以配型的骨髓机率就不高；其次，在骨髓移植手术期间，由于成熟免疫细胞被一率杀灭，患者的免疫力极其低下，需要住在无菌室进行治疗，给患者带来了非常大的痛苦；再次，骨髓移植手术耗费巨大人力、物力，给患者及其家属都带来了很大的负担和压力。
发明内容本发明的目的是提供一种用于制备治疗白血病药物的核苷酸分子。本发明的另一个目的是提供上述核苷酸分子的应用。本发明提供了一种分离出的核苷酸分子，它的序列包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5，-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。本发明中称为SEPTIN1SR2。在本发明中，术语"核苷酸分子SEPTIN1SR2"指具有抑制SEPTIN1蛋白活性并且含有与5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3'、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'序列高度同源的核苷酸序列。该术语还包括与5，-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3，的同源性至少70%，较佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。该术语还包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-15个，较佳地1-10个，更佳地l-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为IO个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'(3'端)加入若干dT(脱氧胸苷)后形成的序列。在本发明中，可在SEPTIN1SR2后(3'端)连接dTdT，从而形成5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3，。在本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以包括GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。在本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3，。在本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3'或者5'陽GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。在本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以是GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。在本发明中，SEPTIN1SR2的序列可以是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3'禾口5，-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3'。本发明还提供了一种载体，它含有上述的核酸分子，即SEPTIN1SR2。在本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将含有本发明SEPTIN1SR2核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载体。本发明还提供了上述载体转化的宿主细胞。在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS7、NIT、293细胞等。另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子SEPTIN1SR2的制备方法，即按5，-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。本发明的核苷酸分子SEPTIN1SR2可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核苷酸分子SEPTIN1SR2序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。本发明还提供了上述的核苷酸分子SEPTIN1SR2在制备治疗白血病药物中的应用。本发明的SEPTIN1SR2可以作为Septinl蛋白的抑制剂，可以抑制淋巴细胞的增殖。Septinl表达组织谱分析表明，在胰腺、肾、骨胳肌、肝、肺、胎盘、脑、心脏、外周血白细胞、大肠、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、胸腺和脾脏等16种组织中，Septinl只在外周血、胸腺和脾脏的淋巴细胞中大量表达，这说明Septinl蛋白主要在淋巴细胞中发挥功能，而不会对其它组织或者细胞起作用。细胞结果显示，Septinl可被磷酸化，而在206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A时，Septinl就不能被磷酸化。在淋巴系统来源细胞中表达本发明的Septinl、SeptinlS206A突变体(即在Septinl蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A)和SeptinlS206E突变体(即在Septinl蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为E)，结果显示，以表达正常Septinl的细胞为对照，SeptinlS206A突变体会使细胞不进入G2期，即细胞不能分裂；SeptinlS206E突变体使G2期细胞大大增加，即促进细胞分裂。这说明Septinl可调控细胞分裂，尤其是206位的丝氨酸残基。这也说明，如果将Septinl蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A、抑制Septinl蛋白活性或者使Septinl蛋白失活，就可以使细胞停止分裂增殖。这说明了206位丝氨酸残基是Septinl被磷酸化的关键。因而，可以将Septinl蛋白作为药靶，筛选Septinl蛋白的抑制剂和失活剂。一旦筛选到了Septinl蛋白的抑制剂或者失活剂，施用于细胞，就可以使细胞停止分裂。另一方面，一旦筛选到了Septinl蛋白的增强剂，施用于细胞，就可以使细胞加速分裂生长。有丝分裂是细胞周期过程中很重要的一个阶段。大多数的肿瘤其发生原因是有丝分裂所致的基因组的不稳定性，基因组的不稳定又来源于染色体的不稳定，染色体的不稳定是癌症的特征性标志。染色体的分离、中心粒的复制和分离发生异常，会导致每个细胞染色体数目的异常，既非整倍体，增加杂合性缺失的机会，抑癌基因的缺失或原癌基因的数目增加都会使细胞生命代谢和信号传导发生紊乱，增加癌变的机会。肿瘤与正常细胞的区别就是无限制增生，即有丝分裂失去正常调控。综上所述，Septinl可调控细胞分裂，尤其是淋巴细胞的细胞分裂。Septinl的突变体可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。由此，本发明的SeptinlSR2可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。流式细胞仪结果表明，本发明的SeptinlSR2可以使淋巴细胞不进入G2期，即细胞不能分裂；将其施用于淋巴细胞白血病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞，例如中性粒细胞，单核细胞等等，的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、縮短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。将其转入了内源表达septinl的人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat中，48小时后western印迹法检测了内源septinl的表达水平，结果如图7所示，在所取细胞量相同的条件下(P-actin蛋白表达水平大致相同)，转入干扰siRNA的细胞中内源表达septinl的水平明显下降(下降水平>50%)。为了验证SEPTIN1SR2的功能，本发明首先检测了干扰septinl后，Jurkat细胞在不同浓度的PHA刺激下的增殖能力，结果如图8所示，与转入对照siRNA(序列如下正义链5'-AGAAGAGGGGAUCCACAUGtt-3'或者反义链5'-CAUGUGGAUCCCCUCUUCUtt-3')的Jurkat细胞相比，干扰了septinl后的Jurkat细胞对PHA刺激的敏感性明显下降，对比lpg/ml的PHA刺激与O.l^g/ml的PHA刺激下Jurkat细胞的增殖水平，对照组升高约200%，而干扰组只升高了约25%。随后本发明又检测了在lpg/ml的PHA刺激下，60小时内干扰septinl的Juricat细胞的增殖水平。结果如图9所示，对照组在60小时后增殖了161%，而千扰组只增殖了44%。本发明的核苷酸分子SEPTIN1SR2及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。以本发明的核苷酸分子SEPTIN1SR2，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子SEPTIN1SR可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的SEPTIN1还可与其他治疗剂一起使用。当本发明的核苷酸分子SEPTIN1SR2被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明中，所述的治疗白血病药物是由含有效治疗量的核苷酸分子SEPTIN1SR2和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至10微克/千克体重。本发明中，所述药物是针剂、粉剂或者片剂。白血病是一种造血系统的恶性肿瘤。目前可以通过骨髓移楦进行治疗，给患者及其家属都带来了很大的负担和压力。本发明的核苷酸序列包括5，-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5，-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。该核苷酸可以使淋巴细胞停止分裂，因此将其与药学上的载体或者赋形剂组成的药剂组合物，可以作为新的治疗白血病药剂，为缓解和治疗淋巴细胞白血病提供了一种新的途径和手段。图1为Septinl的组织表达谱图。其中，1为心脏、2为脑、3为胎盘、4为肺、5为肝、6为骨胳肌、7为肾、8为胰腺、9为脾脏、IO为胸腺、11为前列腺、12为睾丸、13为卵巢、14为小肠、15为大肠、16为外周血白细胞。图2为septinl蛋白在17种人类细胞系中的表达情况图。图3为septinl蛋白与CK2互作IB-免疫印迹杂交试验的结果。图4为septinl蛋白在Jurkat细胞株的定位结果。图5为septinl蛋白被CK2体内磷酸化的结果。图6为septinl蛋白被CK2体外磷酸化的结果。图7为septinl蛋白在Jurkat细胞株内被SEPTIN1SR抑制的结果。图8为SEPTIN1SR抑制Jurkat细胞株分裂受PHA浓度影响的结果。图9为在相同PHA浓度条件下SEPTIN1SR抑制Jurkat细胞株分裂的结果。图10为空载体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数。为图11-13的空白对照，由流式细胞仪分析而得。图11为野生型septinl蛋白转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数。为图12-13的对照，由流式细胞仪分析而得。图12为septinl蛋白S206A突变体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。可见，与图10和11相比，G2期细胞几乎没有。图13为septinl蛋白S206A突变体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。可见，与图10和11相比，G2期细胞明显增加。图14为Jurkat细胞株中转入对照siRNA的的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。此图为图15的对照。图15为Jurkat细胞株中转入有效siRNA的的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，如Sambrook等人的《分子克隆》实验室手册(NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或者按照生产商建议的条件进行操作。实施例1Septinl的组织中的表达情况1.1Northern探针制备用ClontechMultipleTissuenorthen膜检测成人组织中septinl基因的分布情况，所用探针为克隆到的septinl全长开放阅读框(即NCBI登陆号NM—052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。1)用septinl基因的特异的引物从构建好并已经测序的质粒中扩增得到PCR产物。PCR产物用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化后，用GeneQuantII型紫外分光光度计测定纯化后DNA的浓度。2)DNA模板经100'C热变性2min后，用随机引物标记试剂盒以随机引物标记法掺入Y-32PdCTP。标记反应结束后，加入EDTA至终浓度20mmol/L中止反应，10(TC热变性5min，置于冰上。3)将探针用MicroSpinG-25纯化柱纯化。纯化前后分别取样lp稀释IOO倍，取3pl稀释液点样在WhatmanDE81滤纸上，用Monitor900型放射性检测仪测定其放射强度(cps)。将纯化后的放射性强度除以纯化前的放射性强度记为掺入率，掺入率大于30%则认为探针制备合格。1.2Northen杂交1)将杂交膜用2XSSC液润湿后将膜带RNA的一面朝上放入杂交管中，每10cm2膜面积加入lml甲酰胺预杂交液，预杂交液含50%甲酰胺，5XSSPE，10XDenhardt试剂，2%SDS，1000mg/L小牛胸腺DNA。42'C预杂交2-4小时。2)预杂交结束后，将纯化后的标记探针加入剩余的预杂交液中。42。C杂交48小时。3)杂交反应结束后，将杂交液弃去，加入杂交洗脱液l(2XSSC,0.05%SDS)室温洗涤3次，每次30min，其间不停晃动膜。然后加入杂交洗脱液2(0.1XSSC，0.1%SDS)，50'C洗涤2次，每次30min。用Monitor900型放射性检测仪测定整张膜上的放射强度。如果背景的放射强度过高，可以适当的提高洗膜温度，再次洗涤。4)将洗涤完毕的膜放入保鲜袋中封口，进行放射自显影.结果显示，在胰腺、肾、骨胳肌、肝、肺、胎盘、脑、心脏、外周血白细胞、大肠、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、胸腺和脾脏等16种组织中，Septoil的mRNA仅在外周血、胸腺、脾脏等组织中有表达，而且在胸腺中表达量最高。详见图l。实施例2western-blot分析septinl蛋白在17种人类细胞系中的表达情况1、17种人类细胞系的培养所选17种细胞均来自中国科学院细胞库，其组织来源及培养条件如下名称种属组织来源培养条件HEK293T人类胚胎肾90%DMEM高糖完全培养基，10%胎牛血清，37°C，5%C02HELA人类子宫颈同HEK293TU20S人类肌肉90。/。5A培养基，10%胎牛血清，37°C,5%C02PANC人类胰腺同HEK293TSMMC7721人类肝脏同HEK293TMCF7人类乳腺同HEK293TH1299人类肺90%RPMI1640培养基，10%胎牛血清，37°C，5%C02<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.Western印迹检测septinl蛋白的表达水平(1)分别收获17种细胞各约106个，加入50(^1细胞裂解液，振荡混匀后4°C孵育30min。12000rpm/min离心15分钟，取上清。(2)分别取每种上清l(Hil进行SDS-PAGE电泳。(3)用BIORAD转移系统，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维素薄膜上，冰浴中转移2hr，电压为100V。置于丽春红染色液中510min，水洗去染料，标记蛋白标准分子量条带。(4)封闭将膜放置于30ml封闭缓冲液中，室温下置于摇床震荡lhr。(5)—抗反应按推荐的稀释比加入septinl特异性抗体(购于SANTACRUZ公司)，将膜浸于稀释好的一抗中，室温下摇床孵育2hr;用洗涤缓冲液洗膜4次，每次10min;(6)二抗反应按l:l，OOOO的稀释比加入HRP耦联的抗羊抗体，将膜浸于稀释好的二抗中，室温下摇床孵育lhr;用洗涤缓冲液洗膜4次，每次10min。(7)ECL发光反应把膜用三倍稀释或不稀释的ECL发光试剂显影曝光。结果显示，Septinl主要在T细胞(Jurkat，ATCC;6T-CEM，购自中国科学院生命科学学院)和B细胞(EB-3，ATCC)中表达。实施例3Septinl在Jurkat细胞中的定位本发明中，首先将全长septinl的cDNA构建入Ds-Red-Cl荧光表达载体。将所得的RFP—septinl重组子转染入Jurkat细胞中，培养48小时，经过固定处理后，激光共聚焦显微镜下观察。具体步骤如下(1)收取悬浮培养的Jurkat细胞，充分打散后滴加在涂有多聚赖氨酸的载波片上，静置5min后置于4X的多聚甲醛中室温固定10min(分钟)。(2)PBS洗三遍，于0.2%TritonX-100中室温打孔15min。(3)PBS洗三遍，于含有10%马血清、1%BSA的TBS中室温封闭1hr(小时)。(4)TTBS洗一遍，在盖玻片上滴加入用抗体稀释液按比例稀释的一抗(抗septinl抗体，1:20)，37°C孵育2hr。(5)TTBS洗三遍，在盖玻片上滴加入用抗体稀释液按比例稀释的二抗(Rhodamine-抗羊，1:100)，37°C孵育lhr。(6)TTBS洗三遍，于lng/nlDAPI溶液中37°C染色20min。(7)TTBS洗三遍，封片，上荧光显微镜观察。结果显示，发现septinl呈细胞质分布(如图4)，且其分布具有一定的极性，另外，其分布随细胞周期的变化有所不同，在细胞分裂的全过程中，septml极有可能在纺锤体两极的中心粒周围分布，在中期以后，septinl还会在两细胞分裂沟处聚集。实施例4pull-down检测septinl蛋白与CK2激酶的互作1、将瞬时转染有PCMV-Myc-CK2a的细胞裂解液(细胞数5X106)与50pl50。/。的谷胱甘肽琼脂糖珠和20ng的GST在摇床上4。C孵育2h.2、4°C,2000rpm离心2分钟。3、将上清转移到新的离心管中，分为两等份，各加入50pl谷胱甘肽琼脂糖珠，其中一管加入10pg的GST蛋白，另一管加入10吗的GST-septinl融合蛋白，4°C摇床孵育2小时。4、2000rpm离心2分钟，上清取到新的离心管中，4°C保存，以备后用。5、用lml冰浴的裂解缓冲液(20mMTris-clpH8.0，500mMNaCl，lmMEDTA，l%NP-40)洗珠子，2000rpm离心1分钟，弃上清，再重复洗3次。6、用20nl20mM的还原谷胱甘肽(在50mM的Tris-ClpH8.0的缓冲液中)从珠子上洗脱GST融合蛋白和与它结合的蛋白。2000rpm离心2分钟。7、洗脱的蛋白加入等体积的2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸4分钟。8、WesternBlotting检测。结果显示，如图3所示，Septinl与CK2能相互作用。实施例5CK2激酶在体外、体内磷酸化septinl1、体外磷酸化(1)取His-CK2a激酶0.2ug,底物蛋白5ug(GST-septinl，GST-septin1-206A),加入lXKinasebuffer(cellsignal公司)，反应体系中另含有200nMr-32p-ATPlnl(5(xCi棒(2)在30r让反应物作用30分钟，然后加5ial5XSDS上样缓冲液终止反应。(3)取20|^1反应产物经12%SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，胶染色、脱色。(4)真空干燥仪上干胶60。C2小时，冷却后，压上X-光片，-801:曝光。(5)显影2、体内磷酸化(1)将PCMV-HA-CK2a分别与PCMV-myc-septin1、PCMV-myc-septinl(206A)共转染人H1299细胞系(2)37°C培养48hr后收获细胞并裂解。(3)向每500nl细胞裂解液中加入3planti-myc—抗(sigma)，25piProteinGPlus/ProteinAAgarose(sigma公司)，置于4°C摇床缓慢震荡1小时。(4)2000rpm离心l分钟后用lXPBS洗涤Agarose三次(5)向Agarose中加入2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸4分钟。取上清20pl进行SDS-PAGE电泳(6)用磷酸化蛋白染色试剂盒(invitrogen)染色结果显示，在体外和体内，Septinl均可被CK2激酶磷酸化。体外磷酸化详见图5，体内磷酸化详见图6。实施例6检测septinl的磷酸化突变体对Jurkat细胞生长及周期的影响1、分别将PCMV-myc，PCMV-myc-septinl，PCMV-myc-septinl(S206A),PCMV-myc-septinl(S206E)质粒转染Jurkat细胞2、37°C培养60hr后流式细胞仪检测个细胞的周期结果显示，如图10-13所示，septinl(S-A)突变体(即将septinl蛋白第206位丝氨酸突变为丙氨酸(alanine，Ala，A))导致细胞凋亡增加，G2/M期细胞明显减少，而septinl(S-E，即将septinl蛋白第206位丝氨酸突变为谷氨酸(glutamicacid,Glu，E))突变体则不能诱导细胞凋亡，但引起细胞G2/M期增高。这提示，septinl可以维持细胞分裂的正常进行，septinl206位丝氨酸突变时，细胞不能正常分裂。实施例7细胞中RNA干扰septinl的表达1、将合成的siRNA溶于去RNAase的ddH20中，制成50mM的工作母液2、取5pl脂质体(GIBCO公司脂质体Lipfectmine2000)与250plOPTI—MEM培养基混合均匀，静置5min3、取25plsiRNA工作母液与250nlOPTI—MEM培养基混合均匀4、将2与3溶液混合均匀，室温静置20min5、将lX10e的悬浮细胞离心收集并用lXPBS洗涤一次，用400plOPTI—MEM培养基重悬后与4所得溶液混合，加入6孔板一孔6、37°C培养5hr后更换完全培养基7、继续培养48-60hr后收获细胞，取出一半细胞进行western-blot检测septinl的表达情况，同时另一半细胞用于流式细胞检测。结果显示，在lpg/ml的PHA刺激下，60小时内干扰septinl的Jurkat细胞的增殖水平。结果显示，干扰组与对照组相比，在60小时后细胞增殖数大大减少。这同时也提示，septinl是淋巴系统来源的细胞增殖所必需的。权利要求1.一种分离出的核酸分子，其特征在于，它的序列包括5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3’、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5’-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3’。2.—种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括GGAAGAGGAGATCCACATC禾卩GATGTGGATCTCCTCTCC。3.—种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT陽3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3，。4.一种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3'、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。5.—种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是GGAAGAGGAGATCCACATC禾卩GATGTGGATCTCCTCTCC。6.—种如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3，和5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3'。7.—种如权利要求1所述的核苷酸分子的制备方法，其特征在于，按权利要求1所述的核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团或者脱氧核糖核酸基团依次脱水縮合。8.如权利要求1所述的核苷酸分子在制备治疗白血病药物中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征是所述的药物是由含有效治疗量的权利要求1所述的核苷酸分子和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。10.如权利要求8所述的应用，其特征是，所述药物是针剂、粉剂或者片剂。全文摘要本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备治疗白血病药物中的应用。白血病是一种造血系统的恶性肿瘤。目前可以通过骨髓移植进行治疗，给患者及其家属都带来了很大的负担和压力。本发明的核苷酸序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。该核苷酸可以使淋巴细胞停止分裂，因此将其与药学上的载体或者赋形剂组成的药剂组合物，可以作为新的治疗白血病药剂，为缓解和治疗淋巴细胞白血病提供了一种新的途径和手段。文档编号A61K31/7088GK101240274SQ20071003718公开日2008年8月13日申请日期2007年2月6日优先权日2007年2月6日发明者丁向明,龙余,余文博,唐丽莎申请人:复旦大学