专利名称：：枸杞子和黑木耳在制备抗脂肪肝药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及枸杞子和黑木耳在制备抗脂肪肝药物中的应用。技术背景正常人的肝脏中脂质含量占肝湿重的2%-4%，其中磷脂占50%以上，甘油三酯(TG)占20%，游离脂肪酸(FFA)占20%，胆固醇约占7%，其余为胆固醇酯。当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5%，或组织学上每单位面积有1/3以上肝细胞脂肪变时，称为脂肪肝(张达荣.脂肪肝.上海医药，1995，4(7):56-57)。脂肪肝是指因肝脏本身及肝外原因引起的过量脂肪在肝内持久积聚所致的疾病，其病因主要有酗酒、肥胖、糖尿病、妊娠、肝炎及药物(如皮质激素)或毒物损伤肝脏所致。本病属于中医学"积聚"和"湿阻"范畴。常见症状有肝脏肿大，肝区疼痛或不适，食欲减退，脘腹痞胀，溏便，少数可有轻度黄疽。亦有无明显临床症状者。据统计，脂肪肝的发病率占人口的10%，肥胖和糖尿病患者的50%，嗜酒者的57.5%，且无论是酒精性还是非酒精性脂肪肝，肝纤维化发生率高达25%,约1.5%-8.0%的患者可发展为肝硬化(范建高等.脂肪肝的药物治疗进展.中华肝脏病杂志，1996,4(4):28-29)。当前市场上对脂肪肝治疗的有效药物包括胆碱，蛋氨酸，肌醇，辛伐他汀等，他们虽然对脂肪肝有较好的治疗作用，但长期服用本身对肝脏也是一种负担，而且价格也相当昂贵。非酒精性脂肪肝(NAFL)是一种无过量饮酒史，肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。疾病谱随病程的进展表现不一，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬变4个病理类型。临床流行病学研究表明，NAFL在一般人群占10%-24%,在肥胖者中占57.5%-74%，平均每年有12%NASH的患者发生肝硬变，8%可进展为肝硬变而导致一系列严重并发症，NASH被认为是隐源性肝硬变的常见病因。因此，NASH的防治可望阻止慢性肝病进展，改善脂肪肝的预后(肖文斌等.非酒精性肝炎研究进展.临床肝胆病杂志，2001，17(2):71-73)。现代药理学对中药抗脂肪肝的研究已做了大量的工作，主要包括单味中药和复方研究两方面。单味中药人参，人参粉口服对高胆固醇(CH)饮食大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的升高均有明显降低作用；何首乌，何首乌粉可使高脂动物血中TG、冗分别降低89%和42%，肝TG降低52。/。(叶俊.单味中药抗脂肪肝的研究进展.山东中医杂志，1995，14(7):331-331)。复方研究李传富等对自拟方血脂平(何首乌，蒲黄等药组成)的实验研究表明，该方能有效地降低高脂血症大鼠和家兔的肝胆固醇和甘油三酯的水平(刘燕玲.浅谈脂肪肝的中医药治疗.北京中医药大学学报，1995，18(5):54-55)。脂肪肝作为肝脏疾病的中间病理过程，在病毒性肝炎、药物中毒性肝炎、饮酒过度，以及肥胖症时均可发生。如果在病变的早期及时采取适当的措施，月旨肪肝的病理改变是可逆的。通常认为高食物纤维、高蛋氨酸、高磷脂类和富含维生素A的食物有防治脂肪肝的作用(TakaseS.EnyamaK.TakadaAetal.EffectsofvitaminAoncollagenmetabolismbyculturedratcells.GastroenterolJpn，1992:27(3):354-354)。例如，有资料认为茶叶有降低血脂的作用(裘东联.茶叶与心脑血管疾病.茶报，1992，9(3):41-42)。因此，从药食两用的中药中提取出有效组分，通过口服，观察是否具有降低血脂并起到防治脂肪肝作用，为发掘有效、实用的防治脂肪肝药物进行探索。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供中药枸杞子和黑木耳在制药中的新用途。本发明涉及中药枸杞子和黑木耳在制备抗脂肪肝药物中的用途。本发明涉及的中药枸杞子和黑木耳的上述作用及用途未见有相关的报道。本发明所涉及的枸杞子和黑木耳使用其组合物的颗粒剂。本发明所涉及的枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实；黑木耳为菌类食物Auriculariaauricular-judae。本发明所涉及的枸杞子在夏、秋二季果实呈橙红色时采收，晾至皮皱后，再曝晒至外皮干硬、果肉柔软，除去果梗；或热风低温烘干，除去果梗。本发明所涉及的枸杞子呈类纺锤形，略扁，长6-21ram，直径3-10腿。表面鲜红色或暗红色，顶端有小凸起伏的花柱痕，基部有白色的果梗痕。果皮柔韧，皱縮；果肉肉质，柔润而有粘性，种子多数，类肾形，扁而翘，长1.51.9腿，宽l1.7mm，表面浅黄色或棕黄色。无臭，味甜、微酸。本发明上述枸杞子和黑木耳组合物颗粒剂的制备过程包括如下步骤按照重量比l:1分别称取黑木耳和枸杞子并将其粉碎，加水煎煮3次，第一次加20倍量水煎煮2-4小时，第二次加15倍量水煎煮1-3小时，第三次加10倍量水煎煮1小时，合并煎液；将煎液减压浓縮成稠浸膏，并在7(TC减压干燥，粉碎，过100目筛；而后加入适量10%聚维酮乙醇溶液，混匀制成软材，过12目筛制成软颗粒；将软颗粒在60。C下干燥后再次通过12目筛，整粒，总混，分装，即制得枸杞子和黑木耳颗粒剂(以下称杞耳颗粒剂)。本发明随后的实施例中用脂肪、胆固醇、胆酸钠和丙基硫氧嘧啶配制的脂肪乳给大鼠灌服，制备脂肪肝动物模型，对枸杞子和黑木耳的抗脂肪肝作用进行研究。实验结果揭示，枸杞子和黑木耳具有明显的抗脂肪肝作用，能使肝重/体重指数减小，血清和肝组织胆固醇含量下降、脂肪变性的肝细胞数减少。枸杞子和黑木耳可用于制备防治脂肪肝的制剂。图1为正常组正常肝脏组织在HE染色镜下观察结果图(HE染色X200);图2为模型组肝细胞严重脂肪变性在HE染色镜下观察结果图(HE染色X200);图3为杞耳颗粒剂大剂量组在HE染色镜下观察结果图(HE染色X200);图4为杞耳颗粒剂中剂量组在HE染色镜下观察结果图(HE染色X200);图5为杞耳颗粒剂小剂量组在HE染色镜下观察结果图(HE染色X200);图6为阳性组肝脏组织在HE染色镜下观察结果图(HE染色X200);图7为正常组胶原染色镜下观察结果图(胶原染色X200，汇管区见少量胶原)；图8为模型组胶原染色镜下观察结果图(胶原染色X200，汇管区有胶原向组织沿伸)；图9为杞耳颗粒剂大剂量组胶原染色镜下观察结果图(胶原染色X200，汇管区见少量胶原)；图IO为杞耳颗粒剂中剂量组胶原染色镜下观察结果图(胶原染色X200，汇管区见少量胶原)；图ll为杞耳颗粒剂小剂量组胶原染色镜下观察结果图(胶原染色X200,汇管区见少量胶原)；图12为阳性组胶原染色镜下观察结果图(胶原染色X200，汇管区见少量胶原)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。本发明以下实施例所用的枸杞子和黑木耳均购于河南弘景中药饮片有限公司，均符合中国药典2005年版一部正文各药材项下的有关各项规定。各药材已经过净制、切制、炮制、粉碎等加工处理，投料前，通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合国家药典标准(具体药材鉴定办法参照药典标准执行)。本发明以下实施例所用的杞耳颗粒剂采用如下方法制备而成称取黑木耳lkg、枸杞子lkg，粉碎成粗粉，热水煎煮3次，第一次40L水煎煮3小时，第二次30L水煎煮2小时，第三次20L水煎煮1小时，煎液合并，减压浓縮成稠浸膏，7CTC减压干燥，粉碎过100目筛，得杞耳水提取物，提取得率为25.2%;取杞耳水提物，加入适量10%聚维酮乙醇溶液，混匀制成软材，过12目筛制成软颗粒，在6(TC下干燥，通过12目筛整粒，总混，分装，即得杞耳颗粒剂。本发明以下实施例所用的实验材料包括1、动物SD大鼠96只，雄性，每只重量180-220克，由上海中医药大学动物实验中心提供。2、药品辛伐他汀，江苏联环药业股份有限公司，批号2005901。丙基硫氧嘧啶，Germany,批号503330。脱氧胆酸钠，上海国药化学试剂公司，批号F20031018。胆固醇，上海国药化学试剂公司，批号F20041228。丙二醇，上海国药化学试剂公司，批号T20051207。吐温-80，上海国药化学试剂公司，批号F20050721。自制精炼猪油。3、主要试剂及仪器总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，名典生物科技有限公司，批号20060324。高速分散器，上海金达生化仪器厂，规格XHF-1冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂，规格TGL-16G实施例(抗脂肪肝实验)1.1动物分组按照随机数字表将其分为6组1:正常对照组14只+4只2:模型对照组15只+5只3:辛伐他汀组(阳性对照组)14只4:杞耳颗粒剂组(大剂量)15只5:杞耳颗粒剂组(中剂量)14只6:杞耳颗粒剂组(小剂量):15只正常对照组和模型对照组共多预留9只，目的在于造模4W左右后，先处死观察脂肪肝模型的形成情况，以确定正式造模所需时间。1.2造模试剂的配制参照文献(刘明等一种简便实用的大鼠高脂血症模型.中国药理学画报，1985,20(5):199-199)并据预实验作适当调整按下法制备脂肪乳1:胆固醇1/2瓶(25g/瓶)研末。加25ml丙二醇以及25ml吐温-80搅匀。2:胆酸钠1/4瓶(10g/瓶)，溶解于50ml蒸馏水中。3:丙基硫氧嘧啶1/4瓶(25片)(50mg/片、100片/瓶)研末。加于溶解好的胆酸钠瓶中摇匀。4:精炼猪油37.5g置烧杯于热水中充分融化至透明后，加于处理好的胆固醇中搅匀。5:将溶解在一起的胆酸钠和丙基硫氧嘧啶加于溶解在一起的胆固醇和精炼猪油中搅匀。6:最后将上述乳液定容至250ml。(注在各成份比例及浓度不变条件下，可根据需要配制适当容量的脂肪乳。灌胃器为20号注射器针制成。)1.3造模给药方法均为2ml/100g.d灌胃。1.4给药方法将杞耳颗粒剂分别配制成浓度为O.166g/ml、0.084g/ml、0.042g/ml。将辛伐他汀配制成0.4mg/ml。于每日上午9:00时左右分别灌胃给予不同浓度的杞耳颗粒剂或辛伐他汀药液lml/100g.d，(使杞耳颗粒剂大、中、小剂量组的给药量分别为1.66g/kg、0.84g/kg、0.42g/kg，辛伐他汀的给药量为4mg/kg)对照组给予等容量的生理盐水；每日下午1:00时左右灌胃给予脂肪乳。按常规饲养且正常给食给水，连续给药和造模30天左右。1.5检测指标及方法1.5.1对大鼠一般情况的影响每天观察大鼠食欲，行为，状态。每周称体重一次。连续给药和造模30天左右后先处理数只动物观察脂肪肝是否形成。待脂肪肝形成后同时处死各组大鼠进行下例观察。处死大鼠禁食12h，并测体重。1.5.2血液生化检测大鼠腹主动脉取血，3000rpm离心分离血清，备用，按试剂盒说明书测定TC、TG的含量和ALT、AST活性。1.5.3肝组织匀浆生化检测取肝称重，并将取自同一部位的新鲜肝组织0.5g于冰生理盐水中漂洗后，置盛有4.5ml0.86%冰生理盐水的10ml离心管中，于冰水浴中10秒/次匀浆，制备10%的匀浆液，离心取上清，按试剂盒说明书测定TC、TG的含量和ALT、AST活性。1.5.4肝脏组织形态学检査另取各大鼠同一部位的肝组织浸于10%的福尔马林溶液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色。显微镜下观察肝组织的脂肪变性程度。肝切片用胶原染色，观察纤维化病变程度。1.5.5统计方法计量数据以均数士标准差(x士s)表示。采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，多组间比较用单因素方差分析，两两组间比较用q检验;等级资料以非参数秩和检验(H检验)分析。2、实验结果2.1—般情况实验中，模型组动物皮毛趋黄，蓬乱不顺滑，精神不振，其他各组间动物无明显差异。2.2对肝指数的影响大鼠灌胃4W后，模型组肝指数比正常组明显升高，差别有统计学意义(P〈0.05);杞耳颗粒剂组(大剂量)肝指数比模型组显著降低，差别有统计学意义(P〈0.05)结果见表l。表l.杞耳颗粒剂对脂肪肝大鼠肝指数的影响(X±SD)组别剂量肝指数(g/g)正常对照组NS0.0277±0.0016*模型对照组NS0.0339±0.0036杞耳颗粒大剂量组1.66g/kg0.0304±0.0037'杞耳颗粒中剂量组0.84g/kg0.0330±0.0044杞耳颗粒小剂量组0.42g/kg0.0334±0.0034辛伐他汀组4mg/kg0.0349±0.003i*P^0.05vs模型对照组2.3血液生化检测结果2.3.1对血清TC含量的影响与正常组相比，模型组大鼠血清中TC的含量明显升高，杞耳颗粒剂组(大中剂量)血清中TC的含量均比模型组显著降低，差别有统计学意义(P<0.05)结果见表2。表2杞耳颗粒剂对脂肪肝大鼠血清屮TC含量的影响(X±SD)组别剂量TC(mg/gprot)正常对照组NS1.2171±0.17134模型对照组NS2.4987±0.3614杞耳颗粒大剂量组1.66g/kg2.2133±0.3270*杞耳颗粒中剂量组0.84g/kg2.1407士0.4322'杞耳颗粒小剂量组0.42g/kg2.3333±0.2345辛伐他汀组4mg/kg2.5236±0.4182*PO.05vs模型对照组2.3.2对血清中TG含量的影响表3显示，模型动物血清TG浓度并不升高，受试药对血清中TG的浓度也无作用。结果见表3表3杞耳颗粒剂对脂肪肝大鼠血清中TG含量的影响(X士SD)组别剂量TG正常对照组NS0.88±0.4925模型对照组NS0.2273±0.0872杞耳颗粒大剂量组1.66g/kg0.2267±0.0552杞耳颗粒中剂量组0.84g/kg0.2521±0.1181杞耳颗粒小剂量组0.42g/kg0.496±0.1749辛伐他汀组4mg/kg0.5757±0.19462.4肝组织匀桨生化检測的结果2.4.1对肝组织TC含量的影响与正常组相比，模型组大鼠肝组织中TC含量明显升高，杞耳颗粒剂组(大中小剂量)和阳性组肝组织中TC的含量均比模型组显著降低,差别有统计学意义(PO.05)结果见表4。表4.杞耳颗粒剂对脂肪肝大鼠肝组织中TC含量的影响(X士SD)组别剂量TC(mg/gprot)正常对照组NS模型对照组NS杞耳颗粒大剂量组1.66g/kg杞耳颗粒中剂量组0.84g/kg杞耳颗粒小剂量组0.42g/kg辛伐他汀组4mg/kg*P^).05vs模型对照组2.5肝脏病理学检査的结果2.5.1外观及病理结果正常组，阳性组和杞耳颗粒剂中大部分的大鼠肝脏肉眼观察呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑。模型和杞耳颗粒剂中小部分的大鼠肝脏体积增大，边缘边钝，颜色变黄，可见表面白色斑点，切面油腻感。2.5.2HE染色镜下观察结果大鼠同一部位的肝组织HE染色后正常组大鼠肝小叶完整，肝细胞呈多边形围绕中央静脉呈放射状，偶见肝细胞脂肪变性，未见炎性细胞浸润，肝窦清晰可见，肝束排列整齐，肝小叶汇管区基本结构包括小叶间胆管、小叶间动脉、小叶间静脉清晰可见。模型组大鼠肝细胞弥漫性脂肪变性，肝细胞中度肿胀，呈空泡状和泡沫状，汇管区小叶内有炎细胞浸润，炎症细胞以单核细胞、淋巴细胞为主。部分出现点状坏死、灶状坏死。杞耳颗粒剂组大部分肝细胞趋于正常，仅见少量局灶性轻度肝细胞脂肪变性，小部分可见炎细胞浸润。与正常组相比，模型组u值小于正常组差别有显著统计学意义(P<0.01)。阳性组和杞耳颗粒剂大剂量组u值大于模型组，差别有统计学意义(P<0.05)。杞耳颗粒剂小剂量组u值大于模型组，差别有显著统计学意义(PO.Ol)。杞耳颗粒剂大、中剂量组病理变化减轻，但与模型组比较差异不显著。结果见表5及图l-6所示。1167±1481564±1041364士124'1203±138'1254土201'1093±100表5杞耳颗粒剂抗脂肪肝研究病理数据<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(-)无脂肪变性的肝细胞(±)脂肪变性的肝细胞占肝小叶〈1/5(+)脂肪变性的肝细胞占肝小叶1/5-2/5(++)脂肪变性的肝细胞占肝小叶2/5-3/5(+++)脂肪变性的肝细胞占肝小叶〉3/5根据秩和检验正常对照组vs模型对照组u=4.0395>2.58P<0.01辛伐他汀组vs模型对照组u=1.9975>1.96PO.05杞耳颗粒大剂量组vs模型对照组u=2.0028>l.96P<0.05杞耳颗粒中剂量组vs模型对照组u=1.6426<1.96P>0.05杞耳颗粒小剂量组vs模型对照组u=2.5931>2.58PO.012.5.3胶原染色镜下观察结果如图7-12所示，模型组胶原染色可见明显粗大红色胶原纤维分布于汇管区和中央静脉管壁中，汇管区有少量胶原向组织沿伸，不完全性汇管间纤维间隔主要染为红黄色。正常组可见红色胶原纤维主要分布于汇管区和中央静脉管壁中。与正常组比较，模型组中红色胶原纤维明显多于正常组，杞耳颗粒剂和阳性组可见红色胶原纤维数量明显少于模型组。本发明上述实施例采用的杞耳颗粒剂是用两种中药进行加工提取，其中一种是黑木耳。现有技术中已有黑木耳多糖降胆固醇作用研究报道，方法为给予大鼠高脂饲料1周，建立高脂血症模型，用黑木耳多糖对具高脂血症的大白鼠进行股部肌肉注射l周，剂量为每日15mg/kgd，测定血清中总胆固醇含量。结果注射黑木耳多糖后大鼠的总胆固醇含量比对照组降低了42.2%，作用显著即黑木耳多糖有显著的降低胆固醇作用(蔡小玲等.黑木耳多糖的降胆固醇作用研究.深圳中西医结合杂志，2002，5(3):170-172)。本发明上述实施例采用的杞耳颗粒剂是从两种药食两用的中药提取所得，采用口服给药的途径，实验结果说明临床给予杞耳颗粒剂具有降低肝组织胆固醇含量的作用。一般文献资料认为脂肪肝的形成大部分是由于胆固醇升高所导致，因此本发明实施例的结果提示该受试药对这类因胆固醇长期升高引起的脂肪肝应有一定的防治作用，可将其开发成抗脂肪肝的药物。但杞耳颗粒剂对甘油三酯的升高并无明显的改善作用，所以对临床上甘油三酯升高的病人可能无效。权利要求1.枸杞子和黑木耳在制备抗脂肪肝药物中的应用。2、根据权利要求1所述的用途，其特征是，枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实；黑木耳为菌类食物Auriculariaauricular隱judae。3、根据权利要求1或2所述的用途，其特征是，枸杞子和黑木耳使用其组合物的颗粒剂。4、根据权利要求3所述的用途，其特征是，枸杞子和黑木耳组合物颗粒剂使用剂量为l-30g/天/成人口服，相当于口服枸杞子、黑木耳4-120g。全文摘要本发明属食品、保健品领域，具体涉及中药枸杞子和黑木耳在制备防治脂肪肝药物中的应用。本发明采用枸杞子和黑木耳复方颗粒剂，用脂肪、胆固醇、胆酸钠和丙基硫氧嘧啶配制的脂肪乳给大鼠灌服，制备脂肪肝动物模型，对枸杞子和黑木耳的抗脂肪肝作用进行研究，实验结果揭示，枸杞子和黑木耳具有明显的抗脂肪肝作用，能使肝重/体重指数减小，血清和肝组织胆固醇含量下降、脂肪变性的肝细胞数减少。枸杞子和黑木耳可用于制备防治脂肪肝的药物。文档编号A61K36/815GK101269152SQ20071003818公开日2008年9月24日申请日期2007年3月19日优先权日2007年3月19日发明者茅仁刚,金若敏,陈长勋申请人:上海中医药大学