专利名称：一种艾叶多糖及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从中药艾叶中提取的多糖及其用途，尤其涉及一种艾叶多糖及其在制备治疗或预防癌症药物或保健品中的应用。
背景技术：
艾叶(Folium Artemisia Argyi)为我国传统中药，其功用主要为散寒止痛，温经止血(《中国药典》，2005，化学工业出版社120)。化学成分主要含有挥发油、腺嘌呤、胆碱、鞣质、黄酮、甾醇、萜类、多糖、微量元素及其他有机成分等(《中华本草》，1999，上海科技出版社1864)。
有人用野艾注射液及野艾片治疗消化道肿瘤及乳腺癌(《抗癌中草药制剂》，1981，人民卫生出版社144)，但是由于有效成分未确定，所以临床疗效不稳定。
近年来，有人发现艾叶的水提物具有抑制某些肿瘤细胞增生的作用(PhytotherapyResearch，2005，19，649)，中国专利CN1962698(《艾叶多糖提取物的用途》)发现艾叶总多糖提取物不仅对体内肿瘤有明显的抑制作用，并且还具有免疫调节作用，但是对抗癌活性成分的化学结构还缺少深入研究。因此，急需弄清楚艾叶抗癌的活性成分，以便研制出有效成分清楚，作用机理明确、疗效稳定的新型防癌抗癌类药物或保健品，以满足人们的日常消费和临床用药需求。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种艾叶多糖及其制备方法和应用。
本发明所说的艾叶多糖是从艾叶中提取获得的，其结构通式(1) 其中，Glup代表葡萄糖，Xylp代表木糖，Arap代表阿拉伯糖，Manp代表甘露糖，1，2，6代表取代基的位置，x＝1～2，y＝2～3，z＝4～5。
由式(1)可见，其化学结构以β-(1→2)-连接-D-葡萄糖为主链，且有4/5～7/6的葡萄糖的C6位有β-D-木糖、β-D-阿拉伯糖、β-D-甘露糖末端分枝，分子量为6,200Da～7,800Da，推荐的平均分子量为7,000Da左右；优选的，木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的组成，摩尔比为1∶1.0～2.0∶2.0～3.0∶5.0～7.0。
本发明的艾叶多糖的制备方法，包括如下步骤将艾叶总多糖经凝胶柱色谱纯化，脱盐，干燥，最终获得艾叶多糖AYP01。
所说的艾叶总多糖的制备方法，可参见申请人在先的中国专利，公开号为CN1962698，本发明不再赘述；推荐的制备方法，包括如下步骤(1)将艾叶总多糖加水，溶解，多糖与水的重量比为总多糖∶水＝1∶0.5～5，溶液的pH值为5.0～8.0；(2)然后上于已预处理好的DEAE葡聚糖凝胶色谱柱上，以去离子水洗脱，收集水洗脱液，浓缩，干燥，得到一种多糖AYP01，纯度可达到90％以上；所说的DEAE葡聚糖凝胶所采用的凝胶为DEAE-sepharose、DEAE-sepharose F.F.、DEAE 01-纤维素或DEAE 02-纤维素，推荐使用DEAE 02-纤维素，均可采用商业化产品，如华震科技有限公司的产品；(3)将粗多糖AYP01再经凝胶柱色谱作进一步纯化，用浓度为0～0.5％的NaCl盐溶液洗脱，收集糖峰，脱盐，干燥，得到艾叶多糖纯品，代号为AYP01，纯度可达99％；凝胶柱色谱所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose、Bio-Gel P型、Superdex、GEL 01、GEL 02。推荐凝胶用GEL 01，用0.1M NaCl洗脱，均可采用商业化产品，如华震科技有限公司的产品；动物体外试验证明，本发明的艾叶多糖AYP01，易溶于水，无毒副作用，适用于口服和注射，对小鼠移植性Heps瘤、Eac瘤和Lewis瘤均有显著的抑制作用，并具有增加T淋巴细胞数量、调节T细胞亚群的平衡、协调免疫调节因子(IL-2、IFN-r等)之间的平衡，促进巨噬细胞分泌TNF-α，从而增加机体全身免疫防癌抗癌能力的功效；另一方面，AYP01也可清除羟基自由基。因此，本发明的艾叶多糖，可用于增强机体免疫、抗氧化和治疗癌症，可用于制备增强机体免疫药物或保健品、抗氧化药物或保健品和治疗癌症药物或保健品；
本发明的艾叶多糖，可以组合物的形式施加于需要治疗的患者。
所说的组合物，包括治疗有效量的所说的艾叶多糖和医药学上可接受的载体，所说的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂，如淀粉、蔗糖等，粘合剂，如纤维素衍生物明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，润滑剂，如滑石粉等，制剂中，艾叶多糖的重量含量为0.1～99.9％，优选的含量为0.5～90％。
本发明的艾叶多糖与上述载体构成的组合物，可以通过口服、静脉注射或皮下注射的形式施加于需要这种治疗的患者。
用于口服时，可以将其制备成为常规的片剂、粉剂或口服液；用于注射时，可以将其采用本领域常规的方法，制备成为注射液或粉针剂；本发明优选粉针剂，所说的粉针剂的组分按重量百分比为艾叶多糖艾叶多糖85～100％，骨架支持剂0-15％，冻干前水溶液的pH为6.8～7.2的pH调节剂。
所说的骨架支持剂选自甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、右旋糖酐、多元醇肌醇、白蛋白、明胶、葡聚糖或聚乙二醇的一种以上；一般的剂量为1～300mg每公斤体重每天，具体可根据患者的年龄、病情等进行变化。
本发明的艾叶多糖的各种制剂，可以采用药学领域常规的方法进行制备；由此可见，本发明所获得的艾叶多糖，作用机理明确、疗效稳定，能够满足人们的日常消费和临床用药需求。
图1是艾叶多糖AYP01的红外光谱图。
图2是艾叶多糖AYP01的GC-MS图谱中的总离子流图。
图3是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。
图4是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。
图5是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。
图6是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。
图7是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。
具体实施例方式
实施例1
取艾叶总多糖10.0g，加50ml水使充分溶解，上于已经平衡好的离子交换色谱柱DEAE-02-纤维素，依次用水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，用硫酸-苯酚法跟踪检测多糖成分，合并相同色谱峰组分，洗脱液50℃下减压浓缩为10mL后，上于GEL 01柱，依次用水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，硫酸-蒽醌法跟踪检测多糖成分，合并相同色谱峰组分，冷冻干燥，获得平均分子量为6,800Da左右的艾叶多糖组分AYP01共4.9g。
采用HPLC法测定艾叶多糖AYP01的纯度，色谱柱为DEAE-sepharose，流动相为水至0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，检测器为示差检测器。测定的各参数见表1。
表1艾叶多糖AYP01高效液相色谱图中各色谱峰参数表
归一化法测得艾叶多糖AYP01的纯度为99.69％。
艾叶多糖AYP01的1HNMR-核磁共振图谱中σ(ppm)＜5.0，说明各糖基连接均为β-D-型吡喃糖基。其13CNMR-核磁共振图谱中，σ1(ppm)102.7，83.1，77.9，69.6，76.0，61.5为β-D-型吡喃葡萄糖基；σ2(ppm)95.7，76.1，75.7，74.6，72.8，63.7为β-D-型吡喃甘露糖基；σ3(ppm)105.1，74.0，76.0，72.4，65.6为β-D-型吡喃木糖基；σ4(ppm)103.3，76.3，77.9，83.1，64.3为β-D-型吡喃阿拉伯糖基。
图1是艾叶多糖AYP01的红外光谱图。红外光谱图中920cm-1处的吸收说明各糖基均为β-D-型吡喃糖基。
图2是艾叶多糖AYP01的GC-MS图谱中的总离子流图。其中表明有五个碎片，各碎片的质谱图分别见图3、4、5、6、7，其摩尔比为1.0～2.0∶1∶2.0～3.0∶5.0～7.0。
图3是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。表明有[Arap]1→碎片。
图4是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。表明有[Xylp]1→碎片。
图5是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。表明有[Manp]1→碎片。
图6是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。表明有→2[Glup]1→碎片。
图7是艾叶多糖AYP01碎片的MS图谱。表明有→2，6[Glup]1→碎片。
实施例2取艾叶总多糖AYTP 10.0g，加50ml水使充分溶解，上于已经平衡好的离子交换色谱柱DEAE-sepharose F.F.，依次用水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，用硫酸-苯酚法跟踪检测多糖成分，合并相同色谱峰组分，洗脱液50℃下减压浓缩为20mL，上于Sephadex G-25柱，依次用水、0.1mol/L NaCl溶液洗脱，硫酸-蒽醌法跟踪检测多糖成分，合并相同色谱峰组分，冷冻干燥，获得平均分子量为6,800Da左右的艾叶多糖组分AYP01共5.1g。
对实施例1或实施例2所制得的艾叶多糖AYP01进行有关抗肿瘤药效学、免疫作用、抗氧化作用及毒理学研究，具体如下实施例3MTT法测定艾叶多糖AYP01对HL60细胞的抑制作用离心处于对数生长期的HL60细胞(中国科学院上海生命科学院细胞研究所)，稀释成细胞悬液，接种在96孔培养板上，每孔100μl。细胞接种后，加入不同浓度的药物(含空白对照)100μl。每组浓度设3个复孔，于5％的CO2，37℃下培养一定时间。加药24小时后，在每孔中加入MTT工作液10μl，终浓度为10％，即500μg/ml，于细胞培养条件下孵育4h。取出培养板，1000转离心5分钟，小心吸去上清液，加入100μl的DMSO，放置培养箱内孵育5-10分钟，在酶标仪上选择检测所需波长，放入细胞培养板测量其光密度值(OD值)，测定波长为492nm，校正波长为630nm。测定值代入下式计算肿瘤抑制率(％)，结果见表2。根据样品的量效曲线计算IC50值。
表2艾叶多糖AYP01对HL60细胞的抑制作用的实验结果
结果见表2，计算艾叶多糖AYP01对HL60细胞抑制作用的IC50值为212.30μg/ml，体外实验表明AYP01对肿瘤细胞有一定的抑制作用，并且有一定的量效关系。
实施例4
按实施例1所述的制备方法制得的艾叶多糖AYP01灌胃对小鼠移植性Lewis肿瘤的抑制作用将处于生长旺盛期的Lewis肿瘤制成细胞悬液，接种到小鼠(C57小鼠，上海西普尔-必凯试验动物有限公司，6-8周，体重20±2g，性别雌雄各半。每组10只)的右侧腋部皮下，约5×106细胞/只；接种24小时后分组，静脉给药。给药方案为治疗组按不同剂量组灌胃，连续10天。停药后饲养8天，处死动物，称瘤重，计算各组平均瘤重，按下面公式计算肿瘤生长抑制率。结果见表3。
表3艾叶多糖AYP01对Lewis肿瘤抑制作用的实验结果
*平均值±SD由表3可知与空白对照组相比，艾叶多糖AYP01各剂量组均有显著抑制小鼠移植性Lewis肿瘤生长的作用。
实施例5按实施例1所述的提取方法制得的艾叶多糖AYP01静脉注射对小鼠移植性肿瘤Heps的抑制作用取ICR小白鼠(18-22g，雌雄各半；由中国科学院上海试验动物中心提供)40只，按移植性肿瘤研究法接种Heps实体型，接种24小时后称鼠重，随机分为4组，每组10只，雌雄各半，空白对照组与环磷酰胺组分别为阴、阳对照组。艾叶多糖AYP01组设高、低二个剂量组(100、50mg/kg)。接种24小时后静脉注射给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，计算各组平均瘤重，得到肿瘤抑制率。结果见表4。
表4艾叶多糖AYP01对Heps肿瘤抑制作用的实验结果
由表4可知与空白对照组相比，艾叶多糖AYP01各剂量组、环磷酰胺组均有显著抑制Heps肿瘤生长的作用。
实施例6按实施例1所述的提取方法制得的艾叶多糖AYP01静脉注射对小鼠移植性肿瘤Eac的抑制作用取ICR小白鼠(18-22g，雌雄各半；由中国科学院上海试验动物中心提供)40只，按移植性肿瘤研究法接种Eac实体型；接种24小时后称鼠重，随机分为4组空白对照组(生理盐水)、艾叶多糖AYP01100mg/kg、50mg/kg、环磷酰胺30mg/kg，每组10只，雌雄各半；接种24小时后尾静脉注射给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，对所得数据进行统计学处理，计算抑瘤率，结果见表5。
表5艾叶多糖AYP01对Eac肿瘤抑制作用的实验结果
由表5可知与空白对照组相比，艾叶多糖AYP01各剂量组均可显著抑制小鼠移植瘤Eac的生长，阳性药环磷酰胺对移植瘤的抑制作用更加明显。
实施例7艾叶多糖AYP01的小鼠淋巴细胞毒性试验将制备好的脾细胞(源自纯系昆明小白鼠7周龄，20±2g，由中国药科大学实验动物中心提供)悬液加入96孔细胞培养板(costar)，100μl/孔。加入样品，100μl/孔，每份样品的每一浓度(终浓度分别为100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)复3孔；同时，设立仅加RPMI-1640完全培养基(GBICO)的阴性对照。将加好样品的细胞板置5％CO2细胞培养箱中，37℃培养44h。取出细胞板，加MTT(sigma)，20μl/孔，继续培养4h。取出细胞板，3000rpm离心5min，弃尽上清液；加DMSO，100μl/孔，37℃振荡裂解细胞10min；用酶联免疫检测仪(Thermo)测定OD492值。结果见表6。
表6艾叶多糖AYP01对小鼠淋巴细胞毒性的试验结果
实验结果表6，艾叶多糖AYP01能显著促进脾淋巴细胞转化增殖，其作用有剂量依赖性，无明显细胞毒性。
实施例8艾叶多糖AYP01对ConA诱导淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的影响将制备好的脾细胞与腹腔巨噬细胞(源自纯系昆明小白鼠7周龄，20±2g，由中国药科大学实验动物中心提供)悬液加入96孔细胞培养板(costar)，100μl/孔。然后分别加入ConA(sigma)和样品，50μl/孔，其中ConA终浓度为5μg/mL，每份样品的每一浓度(终浓度分别为100、10和1μg/mL)复3孔；同时设立空白对照和阴性对照，空白对照仅加ConA，阴性对照仅加RPMI-1640完全培养基(GBICO)。将加好样品的细胞板置5％CO2细胞培养箱中，37℃培养48h。吸出和合并相同加样孔的培养液，3000rpm离心5min，弃沉淀，上清液于-20℃保存。按ELISA试剂盒(进口分装)说明进行检测。结果见表7。
表7艾叶多糖AYP01对ConA诱导淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的实验结果
实验结果表7，艾叶多糖AYP01能显著促进淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2，促进巨噬细胞分泌TNF-α，其作用有剂量依赖性。
实施例9艾叶多糖AYP01清除·OH能力的测定取待测样品一定量于测量杯中(以双蒸水做空白对照)，依次加入50μL1mmol/LCuSO4溶液，20μL1mmol/L抗坏血酸溶液，50μL1mmol/L邻菲啰啉溶液，780μL0.05mol/L硼砂溶液(pH9.18)，最后注入50μL0.15mol/L H2O2溶液启动发光(BPCL微弱发光测量仪，中国科学院生物物理研究所)，记录100s内发光强度，取60～70S积分的发光强度(CL)用于计算。一定浓度范围内发光强度与自由基数量呈量效关系，故可用发光强度(CL)表示自由基的产生量。清除自由基的物质可以降低发光强度(CL)，所以用发光抑制率来表示物质清除自由基的能力。发光抑制率按以下公式计算。测得的结果见表8。
表8艾叶多糖AYP01对·OH的清除作用实验结果
实验结果表8，艾叶多糖AYP01对·OH具有一定的清除作用，表现出明显的量效关系。
实施例10艾叶多糖AYP01的急性毒性实验急性毒性实验设六个剂量组，每剂量组10只小鼠(18-22g，雌雄各半；由中国科学院上海试验动物中心提供)，药物剂量递减，分别为4687.5、3750、3000、2400、1920、1536mg/kg，尾静脉注射，给药体积0.4ml/只，一次注射后，在24小时后多次观察，连续观察7天。记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布，死亡动物及时进行尸检，并记录病变情况。结果见表9。结果用Bliss统计方法计算LD50值。
表9艾叶多糖AYP01的急性毒性实验结果
由表9可知小鼠静脉注射给药后中毒症状为茸毛卷卧，步履蹒跚，活动减少，嗜睡，呼吸减慢。死亡动物解剖，各脏器未见明显异常，计算LD50为2914.74mg/kg，LD50的95％置信区间为3236.68～2624.82mg/kg，表明艾叶多糖AYP01作为肌肉注射或静脉注射给药具有一定的安全性。
实验结果见表2～9。艾叶多糖AYP01不仅对肿瘤细胞有直接的抑杀作用，而且还可通过增加T淋巴细胞数量、调节T细胞亚群的平衡、协调免疫调节因子(IL-2、IFN-r等)之间的平衡，促进巨噬细胞分泌TNF-α，清除·OH自由基，从而增加机体全身免疫防癌抗癌能力，急性毒性实验表明艾叶多糖AYP01毒性较小，安全范围大。
以实施例2所述的制备方法得到的艾叶多糖AYP01重复实施例3～9的实验可得相同的结论，在此不再赘述。
实施例11制备含艾叶多糖AYP01的药物组合物(a)片剂艾叶多糖AYP01 100g聚乙烯吡咯烷酮 20g硅酸 10g淀粉 60g硬脂酸镁 10g乳糖 50g滑石粉 50g按1000个片剂(配方如上)的用量，称取艾叶多糖AYP01、乳糖、淀粉分别研细过80目筛后，混匀，再与聚乙烯吡咯烷酮、硅酸混匀，加入淀粉混合，以水润湿，用16-18目筛制成颗粒，于60℃干燥，整粒，加滑石粉混匀，压制成片即得。
(b)注射液艾叶多糖AYP01100g氯化钠 5g注射用水 加至10L按上述配方，称取艾叶多糖AYP01和氯化钠，配制成溶液后灌装于10ml注射液瓶中，共1,000瓶，灭菌后包装。供注射用。
(c)胶囊艾叶多糖AYP01200g聚乙烯吡咯烷酮 10g淀粉 100g乳糖 10g按1000个胶囊的用量，称取以上各辅料分别研细过筛后混合均匀，然后用等量递加法加入艾叶多糖AYP01，充分研磨，使其分散均匀，再过80目筛，然后灌制成胶囊。
实施例12～16(d)粉针剂实施例艾叶多糖AYP01药用辅料 药用辅料用量pH调节剂1285g 甘氨酸 15g NaOH5g13100g -0g NaOH0g1490g 甘露醇 10g NaOH2g1585g 葡聚糖/聚乙二醇 7g/8g NaOH0g1695g 乳糖 5g NaOH1g制备方法(1)按1,000瓶计，称取艾叶多糖原料溶于10L注射用水中，再加入4g针用活性炭搅拌10分钟后，用0.45μm微孔滤膜过滤，取样送检，待细菌内毒素检验合格并冷却后备用；(2)称取药用辅料，加入注射用水溶解，加入步骤(1)所得溶液，继续加入灭菌注射用水至全体积的4/5，用pH调节剂调节pH至7后定容至相应体积，药液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用无菌、无热原的容器收集，灌装，转移至冷冻干燥机，冻干。
权利要求
1.一种艾叶多糖，其结构如通式(1) 其中，Glup代表葡萄糖，Xylp代表木糖，Arap代表阿拉伯糖，Manp代表甘露糖，1，2，6代表取代基的位置，x＝1～2，y＝2～3，z＝4～5。
2.根据权利要求1所述的艾叶多糖，其特征在于，分子量为6,200Da～7,800Da。
3.根据权利要求1所述的艾叶多糖，其特征在于，分子量为7,000Da。
4.根据权利要求1所述的艾叶多糖，其特征在于，木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的组成，摩尔比为1∶1.0～2.0∶2.0～3.0∶5.0～7.0。
5.制备权利要求1～4任一项所述的艾叶多糖的方法，包括如下步骤将艾叶总多糖经凝胶柱色谱纯化，脱盐，干燥，最终获得艾叶多糖。
6.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1～4任一项所述的艾叶多糖和医药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，剂型为片剂、粉剂、口服液或注射液。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，剂型为粉针剂，所说的粉针剂的组分按重量百分比为艾叶多糖85-100％，骨架支持剂0-15％，冻干前水溶液的pH为6.8～7.2的pH调节剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所说的骨架支持剂选自甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、右旋糖酐、多元醇肌醇、白蛋白、明胶、葡聚糖或聚乙二醇中的一种或一种以上。
10.权利要求1～4任一项所述的艾叶多糖在制备增强机体免疫药物或保健品、抗氧化药物或保健品或治疗癌症药物或保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种艾叶多糖及其用途。该化合物具有明显的肿瘤抑制作用，能用于增强机体的免疫功能，并有很强的抗氧化作用，可用于肿瘤病人放化疗的辅助治疗，也适合年老体弱及久病体虚者服用。其疗效可靠，成本低廉，无毒副作用。结构如通式(1)。
文档编号A61K36/282GK101067004SQ20071004174
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月7日 优先权日2007年6月7日
发明者蓝闽波, 何正有, 郁荣华, 袁慧慧, 郭晶, 张艳红, 赵红莉, 王越, 刘建文 申请人:华东理工大学