专利名称：寻常鱼鳞病、特异反应性和其他病症的预防/治疗的制作方法
寻常鱼鳞病、特异反应性和其他病症的预防/治疗发明领域本发明涉及寻常鱼鳞病(IV)、特异反应性和潜在地其他与聚丝蛋白基 因序列中功能失去突变相关的病症的预防/治疗。该预防/治疗基于试剂的 使用，所述试剂能使宿主的翻译系统连读聚丝蛋白基因的突变等位基因中 存在的无义突变。发明背景寻常鱼鳞病(IV; OMIM# 146700)是人类最普遍的角质化遗传病症和最 常见的单基因病症之一。最广泛提及的发生率数字是1/250，该数字基于 对6051名健康的英国学童的调查'。IV与特异反应性体质的关系得到了 充分确定；37-50。/。患有IV的人具有特异反应性体质，具体地特异反应性 皮炎(湿疹)''15，且相反之，大约8%特异反应性皮炎患者具有典型的IV 特征L 16。IV的表型特征包括掌超线性，毛发角化病和最明显见于下腹部、手臂 和腿部的细小鳞屑2。聚丝蛋白(丝聚集蛋白)在角质层形成中十分重要 "。滤泡内表皮颗粒层中的透明角蛋白颗粒主要由400 kDa蛋白聚丝蛋白 原(profilaggrin)组成。在独特的短N末端结构域之后，大部分聚丝蛋白原 分子由324个氨基酸聚丝蛋白序列的10-12个重复序列组成6。随着颗粒 细胞的末端分化，聚丝蛋白原通过蛋白水解裂解为 37kDa聚丝蛋白肽和 含有S100样转结合结构域的N末端结构域。聚丝蛋白迅速聚集为角蛋白 细胞骨架，从而颗粒细胞瓦解为扁平的无核鳞片。该浓縮的细胞骨架在角 质化细胞包膜(CCE)形成过程中通过转谷氨酰胺酶而交联。CCE是皮肤最 外面的屏障层，其不仅防止水分流失，而且还阻止过敏原和传染性病原体 的进入7。因此，聚丝蛋白是促进表皮分化和维持屏障功能的关键蛋白质。免疫印迹研究显示聚丝蛋白在IV患者的皮肤和/或角质形成细胞中缺 乏或明显减少8—，另外，在一些患有IV的个体中证明了减少的聚丝蛋白 mRNA11。隐性小鼠突变体，絮片状尾部具有人类IV的组织学和超 结构标记12，并且获得了与鼠科聚丝蛋白基因座(F丄C^的强烈遗传连锁17' 18。尽管生化分析显示了力，纯合体中的缺陷性聚丝蛋白原操作，但是迄 今尚未鉴定在F丄G基因中的任何基因组突变。本发明人揭示了编码聚丝蛋白的基因中的某些功能失去突变，而且随 继的聚丝蛋白减少/损失与IV和其他病症如特异反应性皮炎(湿疹)、哮喘、 银屑病和/或变态反应的发展相关。该工作是多篇处于印刷中的论文(Smith F. J. D.等，2006; Palmer C. N, A.等，2006)和共同未决的专利申请GB0525492.5的主题。除通过基因治疗应用的潜在治疗外，如果利用为克 服至少一些鉴定的聚丝蛋白突变而设计的小分子药物能治疗IV，则将是理想的。因此，本发明的目的包括提供用于预防和/或治疗IV和其他相关病症 的手段。发明概述本发明部分基于本发明人关于某些试剂容许连读聚丝蛋白基因中功 能失去突变的能力的工作。本发明的第一个方面提供能够连读聚丝蛋白基因中功能失去突变的 试剂用于制备用于治疗IV和/或相关疾病药物的用途。在另一方面，提供了治疗IV和/或其他相关疾病的方法，该方法包括 向受试者施用能够连读聚丝蛋白基因中功能失去突变的试剂。应该意识到本发明能够治疗IV和/或治疗易发展IV的动物受试者，尤 其是人类受试者。另外，由于严重或轻微形式的IV和其他疾病的联系， 该治疗可以用于可能易患有或患有特异反应性皮炎(湿疹)、哮喘、银屑 病或变态反应，如接触型变态反应和食物变态反应(例如，花生变态反应) 的受试者。关于皮肤病症，低水平的聚丝蛋白表达能够导致轻微和/或亚临 床疾病的发展。这样，本发明还可以涉及预防和/或治疗所述轻微和/或亚 临床形式疾病。的确，许多皮肤病症是未确诊的，且这样的治疗被更多地 认为是美容治疗。因此，本发明还延伸到任何这样的美容治疗中。
能够被克服的功能失去突变通常是无义突变。这样的突变典型地是单碱基修饰，所述单碱基修饰导致过早终止密码子的产生(即，TGA， TAG 或TAA)。尽管本发明人已经在聚丝蛋白基因中鉴定了大量导致功能失去 的突变，但是一种突变特别导致符合读框地生成过早终止密码子。该突变 是在F丄G基因的位置1501处的1个碱基取代。该突变是1501OT (从起 始ATG开始编号)，其导致胞苷被胸苷取代，且相应的在位置501处精氨 酸变为终止密码子(R501X)的氨基酸改变。由于该突变发生在第一个聚 丝蛋白重复序列中并且导致终止密码子的产生，所以不产生聚丝蛋白肽的 功能拷贝。尽管，本发明人已经鉴定了聚丝蛋白基因中的其他突变，但是 该突变是迄今为止在欧洲高加索人群中最为常见的，且本发明优选的方面 是克服该突变。受试者可以是任何需要预防性或治疗性处理的受试者，且适宜地，可 以是新生儿或甚至胎儿。然而，受试者可以处于生命的任何阶段，且因此 包括新生儿、儿童和成年人。存在大量已知的能够诱导连读无义突变的试剂。 一类试剂是某些氨基 糖苷类抗生素，包括庆大霉素、巴龙霉素、新霉素和妥布霉素(BidouL.等, 基因治疗(Gene Therapy) 11: 619-627, 2004; Howard MT.,等神经学年 刊(AnnNe醫l) ,55:422-426,2004)。另一类包括负霉素的试剂记述在US2005/0014835中，将其引入作为 参考。最终的突变tRNA能够作为无义突变阻抑制子生成。这些从突变的 tRNA基因中生成，所述突变的tRNA基因导致生成这样的tRNA，所述 tRNA具有改变的反密码子因而它们具有连读由无义突变产生的密码子的 能力。这记述在例如Panchal RG等，人类基因治疗(Human Gene Therapy), 10:2209-2219 (1999)中。除上述经鉴定的试剂外，可能存在其他合适的突变阻抑制子，且本发 明还提供了鉴定阻抑制子的方法。因此，在另一个方面，提供了测试试剂连读无义突变能力的方法，该方面包括下列步骤a) 提供突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体；b) 使测试试剂和所述构建体相接触；和C)检查该测试试剂是否能够影响突变聚丝蛋白基因的连读和报道基 因的表达。任何合适的己鉴定的试剂能够用于治疗iv和/或本文所提及的其他相 关疾病，或实际上任何由无义突变引起的疾病/遗传病症。应该意识到所述构建体应该受到适当的转录控制元件如启动子和终 止子序列的控制。而且，该构建体中存在包含内部无义序列的聚丝蛋白核 酸序列。无需使用完整的聚丝蛋白核酸序列，仅需要一部分。适宜地，聚丝蛋白核酸序列可以是10-1000bp的长度，更优选地15-200bp的长度。典型的突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体包括符合读框地与3'报道 基因序列相连接的5，突变聚丝蛋白核酸序列。照这样，为了实现任何的报 道基因序列表达，必须连读位于5'聚丝蛋白序列中的无义/终止密码子。优选的构建体还包括另外的聚丝蛋白序列5'的阳性对照报道基因。如 应该意识到地，全部序列符合读框地彼此连接。对于这样的构建体，提供 了5'阳性对照报道基因，因此使用者可以确保该构建体适当地发挥功能。 如果没有发生聚丝蛋白基因连读，则只有该阳性报道基因提供可检测到的 信号。然而，如果发生聚丝蛋白序列的连读，该阳性对照报道基因和聚丝 蛋白序列的3'报道基因两者均提供可检测到的信号。备选地，该阳性报道 基因可以在单独启动子的控制下存在于构建体中，或该阳性报道基因可以 由单独的共转染质粒所编码。对于报道基因或阳性对照报道基因的使用而言合适的报道基因是技 术人员所熟知的，且包括例如萤光素酶基因，P半乳糖苷酶基因，荧光基 因诸如绿色荧光蛋白等，氯霉素乙酰转移酶，|3-葡糖醛酸糖苷酶等。此外， 从不同生物体物种能够获得特定基因的不同形式。特别优选的构建体包括作为阳性对照报道基因的海肾萤光素酶基因， 突变聚丝蛋白核酸序列和作为报道基因的萤火虫萤光素酶基因，其受到利 用例如HSV-TK启动子和SV40-多聚A终止子信号的适当地转录控制，如 示意性显示于图l中。然而，可以设想许多其他适合的构建体，且报道基 因可以是当其表达时，仅容许细胞在特定生长培养基中存活的报道基因。通过本领域技术人员熟知的技术可以进行任何具体的报道基因表达
第一轮筛选后，合适地，可以通过测试从患有与无义突变相关疾病的 患者获得的细胞或细胞系上的试剂，而测试任何可能有用的试剂，从而确 定/确证该试剂能够导致连读突变。
应该意识到该方法可以在本领域中已知的基于细胞的或无细胞的系 统中进行。
现在进一步通过实施例并参考附图描述本发明，它们显示
图1显示用于检验聚丝蛋白无义突变连读试剂的构建体。A:通过2bp
的缺失从pRL-TK中的/ -/wc突变的TAA终止密码子，和与F丄G和Z-i:wc 符合读框地插入的J^al位点；B:克隆到pSP-luc+NF的iVcoI位点中的 凡G寡核苷酸盒；C:从突变的ATG密码子用于减少"渗漏的"(leaky) 表达。
图2显示用于克隆进入pSP-luc+的FLG寡核苷酸盒；
图3显示TR3构建体来自染色体6p22.1的人Arg (CGA) tRNA基
因；
图4显示TR4B构建体来自染色体15q26.1的人tRNA-Arg(TCG)基
因；
图5显示预测的TR3和TR4B阻抑制子tRNA的二级结构，其显示了 突变的反密码子环。用粗体显示反密码子环，且标记了容许该环与TGA 密码子配对的G〉A突变。所示碱基是由DNA所预测的，而不说明转录后 修饰；
图6显示聚丝蛋白R501X突变的连续(a)用pRLF-FLG-WT或pRLF-FLG-501X报道基因质粒瞬时转染表皮细胞系293的连读。转染后48小时， 按照制造商的方案溶解细胞并利用Promega双萤光素酶测定系统测定萤 光素酶。
未转染的细胞不提供海肾或萤火虫信号。含有野生型聚丝蛋白序列的 阳性对照构建体pRLF-FLG-WT提供阳性海肾和萤火虫信号。相反地， pRL-FLG-501X构建体提供同等的海肾信号但在缺乏任何连读试剂的情况 下，不提供可检测到的萤火虫信号。这证明pRLF-FLG-501X构建体不是 "渗漏的"，且因此适合于检验或连读试剂。
(b)用含有人聚丝蛋白基因片段的pRLF-FLG-501X共报道基因瞬时
转染293细胞系，所述人聚丝蛋白基因片段携带符合读框地克隆在海肾和
萤火虫萤光素酶之间的R501X突变。
以针对海肾萤光素酶活性进行了标准化的萤火虫萤光素酶活性测量 连读活性。进行了四次重复阅读并进行平均。阻抑制子tRNAs TR3和 TR4BsupTGA容许聚丝蛋白R501X无义突变的连读。庆大霉素以剂量依 赖的形式，容许聚丝蛋白R501X突变的连读。
图7显示庆大霉素在来自寻常鱼鳞病个体(FLG R501X纯合体)的角 质形成细胞中诱导聚丝蛋白的重新表达。
原代角质形成细胞在无血清KGM中生长，并通过从低(0.09mM)向高 钙培养基(1.89mM)中的转移诱导其分层(分化)。利用甲醇/丙酮固定培养 物，并通过间接免疫荧光利用了针对人聚丝蛋白重复序列的Novocastm单 克隆抗体15C10对培养物迸行染色。利用1 mg/ml DAPI (4,6-联脒-2-苯基 吲哚)复染细胞核；(a)正常对照角质形成细胞在分化后表达聚丝蛋白，(b) R501X纯合体角质形成细胞在分化后不表达聚丝蛋白，(c)R501X纯合体 角质形成细胞在600 ^g/ml庆大霉素的存在下(用药物培养96小时)，在 分化后表达聚丝蛋白；和
图8显示庆大霉素处理后来自R501X患者的聚丝蛋白表达。在器官培 养中，用600 ^g/ml庆大霉素培养来自患有明显寻常鱼鳞病的R501X纯合 体患者的皮肤活组织切片物质96小时，恢复聚丝蛋白表达(箭头)。培养 后，活组织切片用福尔马林固定，石蜡包埋，并利用Novocastm抗人聚丝 蛋白重复单克隆抗体15C10,以免疫过氧化物酶检测对其进行免疫组化处
理；A:未处理的活组织切片；B庆大霉素处理
方法和结果
实施例l:用于检验连读试剂的共报道基因构建体
将对应于人聚丝蛋白基因碱基数1480- 1523的寡核苷酸盒，(F丄G; 从ATG起始密码子开始编号编码序列；Genbank登记号NM—002016.1 )， 克隆到唯一的Wco I限制性位点中，该位点在质粒载体pSP-luc+NF (Promega)中跨越萤火虫萤光素酶基因(/:z^c)的ATG密码子。图2中显示 的寡核苷酸盒具有增加的突出端，其对应于iVco I的黏性末端。这些盒对
应于含有密码子501的人F丄G基因区域，即普通的R501X突变位点。形 成了野生型和R501X突变形式。通过DNA测序，鉴定并核实了具有处于 正确方向的插入物的克隆。插入F丄G盒后，通过利用下列引物的位点定 向诱变将ATG密码子，即/-丄1^基因最初的起始密码子，突变为AGG精 氨酸密码子，所述引物是FLmutl 5'AGG CAT TCA GCC AGG GTC ACC GAC GCC 3'禾卩FLmut2 5' GGC GTC GGT GAC CCT GGC TGA ATG CCT 3' (Stratagene快变系统(Stratagene QuikChange system))。这是为了防止 最初起始密码子的可能使用，其可能甚至在含有TGA或其他终止密码子 的F丄G盒的存在下，导致萤火虫萤光素酶的"渗漏"表达。通过DNA测 序证实克隆。将这些克隆命名为pSP-R501和pSP-X501，其分别对应于野 生型和突变形式。
通过缺失2bp (TA)突变质粒载体pRL-TK(Promega)中的海肾萤光素 酶基因(iMw)的TAA终止密码子。这是利用下列引物的位点定向诱变 完成的，所述引物是pRL.M15'TCAAAAATGAACAAATTCTAGAGC GGC C 3'禾卩pRL.M2 5' GGC CGC TCT AGA ATT TGT TCA TTT TTG A 3' (Stratagene快变系统(Stratagene QuikChange system))。对突变的克隆(命 名为pRL-Ml)进行了完全测序。
为了制备完整的共报道基因构建体，从pSP-R501和pSP-X501中切下 含有完整FLG-/-￡wc融合基因的Mze I - ^Z)a I片段。将这些克隆到pRL-Ml
的唯一Z&al位点中，这是可能的，其原因在于iW7el和^)fll具有相容的
黏性末端。通过DNA测序，选择具有正确方向的野生型和R501X突变克 隆。将野生型和R501X突变共报道基因构建体分别命名为pRLF-FLG-WT 和pRLF-FLG-501X (图1)。
实施例2:产生人阻抑制子tRNA基因以用于TGA无义突变
人类基因组包括大量CGA-精氨酸t-RNA基因。这些是非常紧密的基 因，且含有RNA聚合酶III的基因内启动子(LewinB.,在基因VII(Genes VII),牛津大学出版社(Oxford University Press) ,2000,第624-626页)。 在目前人类基因组的集合(HG17; http:〃genome.ucsc.edu)中鉴定出这些基 因中的两种，为方便将其命名为TR3和TR4B，并由正常人对照DNA对 它们进行扩增。TR3位于染色体6p22.1上，且TR4B位于染色体15q26.1 上。具体地，利用引物TR3.F 5' CGA TGC AGA CAA TAT GCA GA 3'和 TR3.R 5' CTA AGC CTA CAA AAC CGA AA 3'，将TR3基因作为668bp的 片段进行扩增，其对应于人类基因组HG17集合中碱基编号 chr6:26,407,555-26，408,284。利用引物TR4B.F 5' GAC TTC TGG GTG GGC TCT CC 3'和TR4B.R 5' CCC TCC CTC TCC ACT TTC CT 3'，将TR4B基 因作为465bp的片段进行扩增。该片段对应于人类基因组HG17集合中碱 基编号chrl5:87,679，164- 87,679,628。利用高保真PCR系统(罗氏(Roche)) 和下列条件((94°C 2分钟)xl; (94°C 30秒，X°C 30秒，72°C 60秒) x35; (72°C 5分钟)xl)进行了PCR。对于TR3，退火温度X:55"C;对 于TR4B， X=58°C。将这些片段克隆到pCR2.1载体(InVitrogen)中，并 对一些克隆进行测序从而获得不含PCR的克隆人为产物的每种构建体的 克隆。图3和4中显示了标有注释的完整构建体序列。图5中显示了对由 此生成的tRNA分子所预测的二级结构。对这些tRNA基因的反密码子环 进行了突变，从而使这些识别TGA终止密码子而非CGA精氨酸密码子， 即从5'TCG3'到5'TCA3'突变基因中的反密码子环。在TR3基因中，这 对应于突变G351A，'从引物TR3.F的第一个碱基开始任意编号(见上)。 在TR4B中，该突变对应于G180A，从引物TR4B.F的第一个碱基开始编 号(见上)。
实施例3: F丄G连读的双萤光素酶测定
通过利用Fugene-6系统(罗氏(Roche))，在96孔板中将共报道基因 构建体pRLF-FLG-WT和pRLF-FLG-501X瞬时转染到293细胞(转化的 人肾上皮细胞系)中，而对它们进行测试。转染后48小时，对细胞使用 双萤光素酶测定系统(Promega)，所述系统检测特异性萤光素酶信号，其对 应于海肾和萤火虫萤光素酶报道基因。对野生型共报道基因， pRLF-FLG-WT，获得了海肾和萤火虫萤光素酶的强信号，如图6a所示。 相反地，对pRLF-FLG-501X构建体，仅获得了海肾信号，显示出存在于 该构建体中F丄G盒内的R501X过早终止密码子突变导致萤火虫萤光素酶 表达的完全丧失(图6a)。
实施例4: FLG无义突变的连读测定
利用具有浓度范围0-2000吗/ml庆大霉素的pRLF-FLG-501X，如上所 述在96孔板中进行了 293细胞的瞬时转染。利用pRLF-FLG-WT平行地 进行了阳性对照转染。如上所述，利用双萤光素酶测定系统(Promega)测量 聚丝蛋白无义突变连读活性。图6b显示庆大霉素以剂量依赖的方式，容 许R501X过早终止密码子突变的连读，该试验中最大连读发生在浓度为 2000吗/ml时。作为使用氨基糖苷进行R501X突变的连读的备选，测试了 人阻抑制子转移RNA (tRNA)种类TR3supTGA和TR4BsupTGA (见实 施例2)。利用Fugene-6瞬时转染系统(罗氏(Roche))，将这些共转染到如 上所述具有pRLF-FLG-501X报道基因质粒的293细胞中。这显示出所测 试的两种阻抑制子tRNA种类均提供强连读信号(图6b)。
实施例5:角质形成细胞培养物中聚丝蛋白表达的再活化
建立了来自患有严重IV个体的原代角质形成细胞培养物，已经显示 出所述个体是对聚丝蛋白R501X突变的纯合体，正如Smith FJD等，自然 遗传学(Nature Genetics ) 2006，印刷中所述。正常原代角质形成细胞不 表达聚丝蛋白到可测量的水平，其原因在于后者是晚分化特异性蛋白。然 而，通过将培养物转移到高钙培养基中，可以诱导这些细胞表达聚丝蛋白， 这导致角质形成细胞的层化和分化，从而引起聚丝蛋白的表达(Smith FJD 等,2006，印刷中)。正常对照角质形成细胞的分化引起聚丝蛋白原在充分 层化的细胞集落中表达(图7)。利用间接免疫荧光，使用了针对人聚丝蛋 白重复肽中表位的单克隆抗体15C10 (Novocastra)对蛋白质进行染色。相 反，来自R501X纯合体患者的充分层化的培养物未能表达聚丝蛋白原(图 7，也见SmithFJD等，2006中，印刷中)。然而，当用600吗/ml庆大霉素 处理来自R501X纯合体患者的分化的培养物时，发现充分层化的细胞集 落在96小时，以与正常对照相当的水平表达聚丝蛋白原(图7)。而且， 聚丝蛋白原以细胞质颗粒的形式存在，与对照角质形成细胞中观察到的那 些相当。因此，庆大霉素能够在培养的细胞中促进R501X聚丝蛋白突变 的连读。 实施例6:器官培养中表皮聚丝蛋白表达的再活化在添加或减去600pg/ml庆大霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中， 在培养物中培养3mm立方体的皮肤活组织切片材料4天，该材料来自患 有明显IV的聚丝蛋白R501X/R501X纯合体患者。培养后，固定并包埋该 活组织切片材料以进行组织学和免疫组化。当用针对人聚丝蛋白重复肽中 表位的单克隆抗体15C10 (Novacastra)染色时，未处理的活组织切片完全是 阴性的(图8)，这与对聚丝蛋白无效突变纯合性相一致(Smith FJD等,自 然遗传学(Nature Genetics)论文，2006，印刷中)。相反，用庆大霉素培养 过的活组织切片材料显示出颗粒细胞层的强烈染色(图8)。由于纯合或混 合杂合聚丝蛋白无效突变，所以缺乏可通过组织学鉴定的透明角质颗粒是 严重IV的标记(SmithFJD等，自然遗传学(Nature Genetics)论文，2006， 印刷中)。显著地，用庆大霉素处理于此观察到的聚丝蛋白染色的恢复引起 透明角质颗粒的重新出现(图8)。此外，在颗粒层中较高的一些细胞中， 其中聚丝蛋白染色特别强烈，观察到其细胞形态变得更加扁平(图8)。因 此，恢复的蛋白质表达表现出促进正确的表皮终止分化，这与聚丝蛋白蛋 白功能的完全恢复相一致。参考文献1. Wells，R.S.和KerrCB,英国医学杂志(BrMedJ.) ，1:947-949(1966).2. Judge, M.R., McLean, W.H.I. & Munro, C.S.角质化病症(Disorders of keratinization).在Rook皮肤医学教科书(i ooA:'s rexAooA o/Dermato/ogy) 中，巻2 (Bums, T., Breathnach, S., Cox, C. & Griffiths, C.编辑)34.54-34.56 (Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publishing)，牛津(Oxford)， 2004).3. Steinert， P.M.， Cantieri, J.S., Teller, D.C.， Lonsdale匿Eccles, J.D. & Dale, B. A.特异性与中间体丝相互作用的阳离子蛋白种类的表征(Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments).国家科学研究院学刊(尸rac Ato"cad5W)78， 4097-4101 (1981). 4. Dale, B.A., Resing, K.A. & Lonsdale-Ecccles, J.D.聚丝蛋白角蛋白丝相 关蛋白 (Filaggrin : a keratin filament associated protein).纽约禾斗学石if究院 年报(Ann. NY Acad. Sci) 455, 330-342 (1985).5. Listwan, P. & Rothnagd, J.A.角蛋白集束蛋白(Keratin bundling proteins). 细胞生物学方法(Me /7oACe〃所o/) 78,817-27(2004).6. Gan, S.Q.， McBride， O.W., Idler, W. W., Markova, N. & Steinert, P.M.人类 聚丝蛋白原基因的构造、结构和多态性(Organization, structure, and polymorphisms of the human profilaggrin gene).生物化学(Biochemistry) 29, 9432-40(1990).7. Candi, E., Schmidt, R. & Mdino， G.角质化包膜皮肤中的细胞死亡模式 (The cornified envelope: a model of cell death in the skin).分子细胞生物学自然综述(Nat Rev Mol Cell Biol) 6,328-40(2005).8. Fleckman， P" Holbrook, K.A.， Dale, B.A. & Sybert, V.P.培养自患有寻常 鱼鳞病受试者的角质形成细胞在表型上是异常的(Keratinocytes cultured from subjects with ichthyosis vulgaris are phenotypically abnormal).皮肤病 学研究杂志(J Invest Dermatol) 88,640-5 (1987).9. Perm Penabad, C.等，聚丝蛋白表达在层状鱼鳞病中的分化模式 (Differential patterns of filaggrin expression in lamellar ichthyosis).英国皮肤病学杂志(Br J Dermatol) 139,958-64(1998).10. Sybert, V.P., Dale, B.A. & Holbrook, K.A.寻常鱼鳞病聚丝蛋白合成中 与缺乏透明角质蛋白颗粒相关的缺陷的鉴定(ichthyosis vulgaris : identification of a defect in synthesis of filaggrin correlated with an absence of keratohyaline granules).皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol) 84,191-4 (簡).11. Nirunsuksiri, W., Zhang, S,H. & Fleckman, P.培养自患有寻常鱼鳞病受 试者的角质形成细胞中聚丝蛋白原mRNA降低的稳定性和双等位基因， 同等表达(Reduced stability and bi- allelic, coequal expression of profilaggrin mRNA in keratinocytes cultured from subjects with ichthyosis vulgaris).皮肤 病学研究杂志(J Invest Dermatol) 110,854-61 (1998).12. Presland,R.B.等，絮状尾部(ft/ft)小鼠中正常聚丝蛋白原和聚丝蛋白的 缺失聚丝蛋白缺陷性皮肤疾病寻常鱼鳞病的动物模型(Loss of normal profilaggrin and filaggrin in flaky tail (ft/ft) mice: an animal model for the filaggrin-deficient skin disease ichthyosis vulgaris).皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol) 115,1072-81 (2000).13. Smith, F.J.D.等，"聚丝蛋白基因中的功能失去突变导致寻常鱼鳞病"("Loss-of-function mutations in the filaggrin gene cause ichthyosis vulgaris")， 自然遗传学(Nature Genetics) ,2006,印刷中.14. Palmer C.N.A.等，"表皮屏障蛋白聚丝蛋白的单倍性不足是哮喘和特 异反应性皮炎的主要诱病因素"("Haploinsufficiency for the epithelial barrier protein filaggrin is a major predisposing factor for asthma and atopic dermatitis"), 已递交.15. Presland, R.B.等，人类聚丝蛋白原的N末端结构域在表皮分化过程中 特异性蛋白水解性分裂的证据(Evidence for specific proteolytic cleavage of the N- terminal domain of human profilaggrin during epidermal differentiation).皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol) 108,170-8 (1997).16. Ishida-Yamamoto, A., Takahashi, H.， Presland, R.B.， Dale, B. A. & Iizuka, H.在正常人类皮肤和兜甲蛋白角皮病中，聚丝蛋白原N末端结构域向具 有片断DNA的角质形成细胞核中的迁移(Translocation of profilaggrin N-terminal domain into keratinocytes nuclei with fragmented DNA in normal human skin and loricrin keratoderma).实验室研究(Lab Invest) 78， 1245-53 (1998).17. Lane, P. W.家鼠连锁群XVI中的两种新突变。絮片状尾部和varitint-waddler-J。 (Two new mutations in linkage group XVI of the house mouse-Flaky tail and varitint-waddler-J. )遗传论杂志(J7/ered) 63, 135-40 (1972).18. Rothnagd, J. A.等，小鼠兜甲蛋白基因的表征聚丝蛋白原和染色体3 上的层状尾部和软皮毛突变基因座的联接(Characterization of the mouse loricrin gene: linkage with profilaggrin and the flaky tail and soft coat mutant loci on chromosome 3).基因组(Genomics) 23,450-6(1994).
权利要求
1. 一种试剂用于制备用于治疗IV和/或相关疾病的药物的用途，所述试剂能够赋予在聚丝蛋白基因中连读功能失去突变的能力。
2. —种预防或治疗IV和/或其他相关疾病的方法，其包括向受试者施 用试剂的步骤，所述试剂能够赋予在聚丝蛋白基因中连读功能失去突变的 能力。
3. 按照权利要求2的方法，其中认为所述方法是美容治疗。
4. 按照以上权利要求中任一项的用途或方法，其中所述功能失去突变 是无义突变。
5. 按照权利要求4的用途或方法，其中所述突变是1501OT(从起始 ATG开始编码)，其导致胞苷被胸苷所取代和相应的在位置501处精氨酸 变为终止密码子(R501X)的氨基酸改变。
6. 按照以上权利要求中任一项方法的用途，其中所述受试者是新生 儿、儿童或成年人。
7. 按照以上权利要求中任一项的用途或方法，其中所述试剂是氨基糖 苷类抗生素。
8. 按照权利要求7的用途或方法，其中所述氨基糖苷是庆大霉素、巴 龙霉素、新霉素或妥布霉素。
9. 按照权利要求l-6中任一项的用途或方法，其中所述试剂是负霉素 或突变tRNA。
10. —种测试试剂连读无义突变能力的方法，其包括下列步骤a) 提供突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体；b) 使测试试剂和所述构建体相接触；和c) 检査所述测试试剂是否能够影响突变聚丝蛋白基因的连读和报道基因的表达。
11. 按照权利要求10的方法，其中所述聚丝蛋白核酸序列长度为 10-1000 bp。
12. 按照权利要求10或11的方法，其中突变聚丝蛋白基因/报道基因 构建体包含与3，报道基因序列符合读框地连接的5'突变聚丝蛋白核酸序 列。
13. 按照权利要求12的方法，其中所述构建体还包括另外的聚丝蛋白 序列5'阳性对照报道基因。
14. 按照权利要求13的方法，其中所述报道基因是萤光素酶基因，(3-半乳糖苷酶基因，荧光基因诸如绿色荧光蛋白等，氯霉素乙酰转移酶，卩-葡糖醛酸糖苷酶等。
15. 按照权利要求14的方法，其中所述构建体示意性地显示于图1中。
全文摘要
本发明涉及预防/治疗寻常鱼鳞病(IV)、特异反应性和潜在地其他与聚丝蛋白基因序列中功能失去突变相关的病症。该预防/治疗基于试剂的使用，该试剂能使宿主翻译系统连读聚丝蛋白基因突变等位基因中存在的无义突变。
文档编号A61K48/00GK101400697SQ200780008788
公开日2009年4月1日 申请日期2007年1月17日 优先权日2006年1月18日
发明者威廉姆·亨利·欧文·麦克莱恩, 弗朗西斯·简·多罗西·史密斯 申请人:敦提大学校董事会