专利名称：鹿血活性肽在制备降血压药物及保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹿血活性肽，本发明制备的鹿血活性肽具有降血压活性和增 强免疫力活性，可应用于生物制品技术领域。
背景技术：
鹿血中蛋白质含量占13%以上，是鹿血中的主要成分。蛋白质是由肽 组成的，具有生理作用的肽类化合物称为功能肽或生物活性肽，活性肽具 有抗氧化、降血压、提高免疫力、抗肿瘤、促进矿物质吸收等活性，不同 来源的蛋白质制备具有各种功能的活性肽已成为该领域的研究热点(参考 文南犬1: Hannu Korhonen， Anne Pihlanto; Bioactive peptides: Production and functionality, International Dairy Journal 16(2006)945-960)。具有保健功能 的鹿血中丰富的蛋白质是理想的活性肽原料。
高血压是我国发病率非常高的常见心血管疾病，是引发心、脑、肾和眼 血管等各种并发症并导致中风、促进动脉粥样硬化、冠心病的一个重要危 险因子。高血压早期一般没有不适症状，直至发生临床现象一心脏发病、 脑血管破裂，因此有高血压家族史及轻微症状者的早期保健就至关重要。
发明内容
本发明的目的是以中国传统中药鹿血为原料制备鹿血活性肽，应用于降 血压、增强免疫力的药物或保健品中。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
本发明提供了鹿血活性肽的制备及其在降血压药物及保健品中的应用；
其以鹿血活性肽为活性成份，具有降血压和增强免疫力活性，在医药领域 和功能性食品领域具有良好的应用前景。
所述降血压鹿血活性肽的制备方法，以新鲜的鹿血为原料，鹿血经离心
分离后，取上清血浆蛋白，血浆蛋白中按照l: 1 100 (质量比)的比例加
入丙酮沉淀1 2小时，以1000—10000转/分钟的速度离心10 — 60分钟； 沉淀中加入50mM 500mM NH4HC03缓冲液，其终重量浓度为1。％ 50 %的溶液，加入蛋白质水解酶，酶的加入量为酶蛋白质重量比=1: 10
500，在20 8(TC温度下酶解0.5 24小时，再冷冻干燥得到鹿血活性肽， 活性肽检测具有降血压和增强免疫力活性。
所述离心分离过程为，以新鲜的鹿血为原料，取1 2升鹿血，在4'C、 鹿血经3000 15000转/分钟转速下离心0.1 2小时，上清为鹿血血浆蛋白 用于制备活性肽。
蛋白质水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性 蛋白酶或中性蛋白酶。本发明将鹿血经离心即可得到蛋白质含量、纯度较好的血浆蛋白，省
略了繁琐的分离纯化步骤；血浆蛋白是由肽、免疫蛋白和许多微量元素组
成的具有免疫功能鹿血组分，酶解的方法保留了其本身具有活性的功能。
本发明所制备的鹿血活性肽应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或 与其他药物配合制备成不同的剂型，如散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊 剂、软胶囊剂、栓剂、膏剂、酊剂、冲剂等。
本发明的特点如下
1. 鹿血是我国传统具有保健作用的中药，本发明在传统中药基础上利 用现代生物技术，提高了鹿血的生物功效。
2. 活性肽的生理活性显著。采用本发明制备工艺，首次从鹿血中获得 具有降血压活性和免疫增强活性的肽类物质。
3. 具有良好的应用前景。通过本发明制备的活性肽具有降血压和提高
免疫力的功能，有可能成为保健功能性食品，因此具有良好的应用前景。
图1为本发明实施例1制备的鹿血活性肽对高血压大鼠收縮压的降血 压活性。
图2为本发明实施例1制备的鹿血活性肽对高血压大鼠舒张压的降血
压活性。
图3为本发明实施例1制备的鹿血活性肽对正常血压的SD大鼠收縮压 的影响。
图4为本发明实施例1制备的鹿血活性肽对正常血压的SD大鼠舒张压 的影响。
图5为鹿血活性肽增强免疫力的活性。
具体实施例方式
实施例1
以新鲜鹿血为原料，按照以下工艺制备鹿血活性肽-
取l升新鲜鹿血，在4。C、 3000转/分钟转速下离心1小时，血浆蛋白 中按照l: 1 (质量比)的比例加入冰丙酮沉淀1 ^时，以2000转/分钟的 速度离心10分钟，沉淀中加入50mM NH4HC03缓冲液配成质量浓度为1 %的溶液，加胃蛋白酶，酶的加入量为酶蛋白质=1: 100，在2(TC温度 下水解0.5小时，反应结束后冷冻干燥，得到粉末状鹿血活性肽。
用截留分子量为3000的超滤膜离心过滤本发明实施例1制备的活性 肽，其中分子量分布在3000道尔顿以下占70%，说明通过本工艺可将大分 子量的蛋白质水解为分子量较小的肽类化合物。
鹿血活性肽对高血压大鼠的降血压活性见图1、图2，图3、图4是鹿 血活性肽对血压正常的SD大鼠的血压影响，由图可见鹿血活性肽可显著降 低高血压大鼠的收縮压和舒张压，而对血压正常的SD大鼠的血压没有影 响。小鼠的ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验表明在浓度为10ug/ml
4时，免疫增强活性呈阳性，
活性肽的生理活性检测
1. 降血压活性检测 1.1实验动物
自发性高血压大鼠SHR (上海斯莱克实验动物有限公司)，体重200 220g;正常血压SD大鼠(大连医科大学SPF动物实验中心)，体重200 250g。 1.2测定方法及仪器
血压、心率的测定采用间接测压法—尾脉搏法。尾动脉血压测定仪(上 海奥尔科特生物科技有限公司)。 1.3实验方法
所有大鼠分笼喂养，每笼4只，自由饮水，自由取食。饲喂一周无异常 情况后用于实验。随机分组，每组8只。高血压大鼠分组为空白对照组， 阳性对照组，鹿血活性肽组。降血压药物Captopril作为阳性对照。剂量分别 为Captopril药物2mg/kg，鹿血活性肽10mg/kg。
血压正常的SD大鼠分为两组空白对照组，鹿血活性肽组。鹿血活性 肽按照50mg/kg的剂量。
实验大鼠按照分组剂量灌胃给药，每天给药一次，连续给药4周，每周 测血压和脉搏一次。 1.4数据处理和结果判定
实验组动物血压明显低于对照组，差异具有显著性，且对实验组动物 心率和正常动物的血压及心率无影响，可判定辅助降血压功能动物实验结 果阳性。
2. 增强免疫活性的检测
2.1增强免疫力功能判定NK细胞活性呈阳性，受试样品组的NK细胞活 性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。 2.2实验步骤
LDH基质液的配制
乳酸锂5xlO-2mol/L
硝基氯化四氮唑(INT) 6.6xlO-4mol/L
吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8xlO-4mol/L
氧化型辅酶I (NAD) 1.3xl0-3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.2) 2.2靶细胞的传代(YAC-1细胞)
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用 RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4x105个/mL。 2.3脾细胞悬液的制备(效应细胞)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾 磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hank's液洗2次，每次离心10min (1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起， 加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank's液及 8mLHank，s液，1000rpm， lOmin离心，用lmL含10%小牛血清的RPMI1640 完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95%以上)，用台 酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后用RPMI1640完全培养液调 整细胞浓度为2x107个/mL。 2.4 NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各lOOpL (效靶比50:1)，加入U型96孔培养 板中；靶细胞自然释放孔加耙细胞和培养液各100^iL，耙细胞最大释放孔 加靶细胞和lXNP40或2.5。/。Triton各100|aL;上述各项均设三个复孔，于 37°C 、5 %C02培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min， 每孔吸取上清100(iL置平底96孔培养板中，同时加入乳酸脱氢酶(LDH) 基质液100jiL，反应3min，每孔加入lmol/L的HC1 30pL，在酶标仪490nm 处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照 组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。
反应孔OD—自然释放孔OD
NK细胞活性(％) = -x 100%
最大释放孔OD—自然释放孔OD 2.5数据处理及结果判定
受试组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定结 果为阳性。 3.实验结果
图1 4是鹿血活性肽降血压结果，由图可见鹿血活性肽可明显降低 SHR高血压大鼠的收縮压和舒张压，而对血压正常的SD大鼠的血压没有 影响。图5是鹿血活性肽增强免疫力的活性(P〈0.05)，鹿血活性肽可使NK 细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，说明鹿血活性肽具有增强免疫 力的活性。
实施例2
取l升新鲜鹿血，在4。C、 15000转/分钟转速下离心0.1小时，血浆蛋 白中按照l: 100 (质量比)的比例加入丙酮沉淀2小时，以2000转/分钟 的速度离心10分钟，沉淀中加入50mM NH4HC03缓冲液配成重量浓度为 50%的溶液，加中性蛋白酶，酶的加入量为酶蛋白质=1: 500，在80°C 温度下水解24小时，反应结束后冷冻干燥，得到粉末状鹿血活性肽。
活性肽的活性检测结果与实施例1相同。
权利要求
1.鹿血活性肽在制备降血压药物及保健品中的应用。
2. 按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述鹿血活性肽是通如 下过程制备获得的，其以新鲜的鹿血为原料，鹿血经离心分离后，取上清 血浆蛋白，血浆蛋白中按照l: 1 100质量比的比例加入丙酮沉淀1 2小 时，以IOOO—IOOOO转/分钟的速度离心10_60分钟；沉淀中加入50mM 500mMNH4HCO3缓冲液，其终重量浓度为r^ 50^的溶液，加入蛋白质 水解酶，酶的加入量为，酶蛋白质重量比=1: 10 500，在20 8(TC温 度下酶解0.5 24小时，再冷冻干燥得到鹿血活性肽，活性肽检测具有降血 压和增强免疫力活性。
3. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于蛋白水解酶为胃蛋 白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶。
4. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述离心分离过程 为，以新鲜的鹿血为原料，取1 2升鹿血，在4t:、鹿血经3000 15000 转/分钟转速下离心0.1 2小时，上清为鹿血血浆蛋白用于制备活性肽。
5. 按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述药物以制备的鹿血 活性肽为活性组份，用常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备 成散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、栓剂、膏剂、酊剂或 冲剂。
全文摘要
本发明涉及鹿血活性肽，具体地说是鹿血活性肽在制备降血压药物及保健品中的应用，其以鹿血活性肽为活性成份，具有降血压和增强免疫力活性，可制备成各种口服及外用或注射剂，在医药及保健品领域具有良好的应用前景。
文档编号A61K38/17GK101612386SQ20081001205
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月27日 优先权日2008年6月27日
发明者唐树友, 邹汉法, 艳 靳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所