专利名称：一种降低药物依赖性注射液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种戒毒注射液及其制备方法，具体是以从河豚中分离的毒素 和金针菇多糖为主要成分的降低吸毒者对成瘾性药物依赖性的注射液及其制 备方法。
技术背景从河豚中分离出河豚毒素(Tetrodotoxin TTX)制成降低药物依赖性的注 射液，从而达到降低吸毒者对生物碱类成瘾性药品依赖性的目的。河豚毒素属小分子量非蛋白质的神经毒素，河豚毒素药用价值的开发是海 洋生物活性研究中进展最为迅速的领域，也是一个亟待开发的高效益的高技术 产业。河豚毒素是选择性极高的快(Na+)通道阻断剂，能阻止Na+进入细胞， 因而可阻止神经、肌肉产生兴奋活动。TTX使豚鼠心肌细胞膜的零位相最大 上升速率显著降低。零位相斜度变小，甚至Na+通道完全阻断。动作电位的形 状变为类似慢反应电位，动作电位时程縮短，波幅减少。据报道，TTX阻断 轴突传导作用强。经小鼠扭体法及热板法实验表明，镇痛作用极强，作用缓慢 而持久，并且未见成瘾。因此河豚毒素是降低患者对毒品依赖性的理想药物。目前较为有效的分离提取工艺主要包括浸提、浓縮、干燥、柱层析、超滤、 离心等技术，但是由于河豚毒素成分复杂，临床应用对其分离纯化要求高，因 而开发一种提纯率高，有利于工业化大规模生产的河豚毒素分离纯化技术尤为 重要。本发明的目的是提供一种降低药物依赖性的注射液，即从河豚中分离纯化 出纯度高、对酸、碱、温度稳定性好的河豚毒素，将河豚毒素与多糖配合，制 备出无成瘾性的注射药物。本发明涉及的TTX纯化工艺具有成本低、收率高、 操作简单的优点，适合工业大规模应用。 发明内容本发明所述的降低药物依赖性的注射液，是由河豚分离的河豚毒素和金针菇提取的金针菇多糖组成。一种降低药物依赖性的注射液是由以下方法制成的将河豚毒素(TTX)和金针菇多糖按1-2: 1-2比例混合，以无菌水配制， 经过微孔滤膜过滤除菌、冲氮，抽真空，最后封管成针剂。 河豚毒素通过如下的方法提取在高速组织捣碎机中将河豚内脏(卵巢和肝脏)和无水甲醇按重量比l: 2-4混合，加入含5%-15%硫酸的甲醇调节pH为1.0-2.0，室温下搅拌2-4小时， 过滤，用含5%-15%硫酸的甲醇提取残渣，过滤；将滤液与丙酮按体积比1:4-6混合、搅拌，用稀氢氧化铵调节pH到6.0-8.0， 搅拌l-2小时，使悬浊液沉降4-6小时，以2000-3000r/min速度离心10-30分 钟，保留离心上清液；将离心上清液进行氧化铝柱层析，过柱后以蒸馏水冲柱，再以60-8(TC的 蒸馏水洗氧化铝，得到3个含毒组分过柱液、冲柱液和洗氧化铝液；各含毒组分分别以醋酸酸化，调节pH到1.0-3.0，在热水浴上进行真空浓 縮，浓縮至100-3O0ml，出现油状残余物，加入0.1-0.3ml水、l-3ml无水甲醇、 4-12ml无水乙醚，4000-6000r/min离心15-30分钟，以3%-10%醋酸溶解离心 管管底的沉淀，将溶液移入较大的容器，加入氨水，调节pH为7.0-11.0，出 现沉淀，15000-20000r/min离心15-30分钟，所得沉淀用蒸馏水洗5次，无水 甲醇洗2次，并再次溶于0.5ml-1.5ml稀醋酸溶液中，滤出不溶物，加入1.5-4.5ml 无水乙醚，放置过夜，产生结晶的河豚毒素；将结晶的河豚毒素进行冷冻干燥。如上所述的金针菇多糖可以通过如下所述的方法制成将金针燕菌丝体在全自动发酵罐中发酵后进行多糖提取，金针菇菌丝体经 发酵后，样品泡浸在质量分数为90%-99%乙醇中，然后用75%-85%乙醇连续 提取三次，每次22-26小时，将提取过的材料用50-6(TC的酒精清洗，然后放 在铅制器皿中烘干，经葡聚糖凝胶G200层析纯化制成金针菇多糖。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细的描述。 实施例1本实施例是提取河豚毒素的实例。在高速组织捣碎机中将260克的河豚内脏(卵巢和肝脏)和640g、密度 为0.79g/ml的无水甲醇一起混合匀化，加入含10n/。硫酸的甲醇调节pH为1.5， 室温下搅拌3小时，过滤，用325ml含10%硫酸的甲醇提取残渣，过滤；取400 ml滤液与2000 ml丙酮一起搅拌，用稀氢氧化铵调节pH到7.0, 搅拌1.5小时，使悬浊液沉降5小时，以2000r/min速度离心IO分钟，保留离 心上清液；将离心上清液进行氧化铝柱层析，过柱后均以200ml蒸馏水冲柱，再以 200ml、 6(TC的蒸馏水洗氧化铝，得到3个含毒组分过柱液、冲柱液和洗氧 化铝液；各含毒组分分别以醋酸酸化，调节pH到2.0，在热水浴上进行真空浓縮， 浓縮至200ml左右，出现油状残余物，加入0.2ml水、2ml无水甲醇、8ml无 水乙醚，4000r/min离心15分钟，以5%醋酸溶解离心管管底的沉淀，将溶液 移入较大的容器，加入氨水，调节pH为9.0，出现沉淀，15000r/min离心15 分钟，所得沉淀用lml蒸馏水洗5次，lml无水甲醇洗2次，并再次溶于lml 稀醋酸溶液中，滤出不溶物，加入3ml无水乙醚，放置过夜，产生结晶的河豚 毒素；将结晶的河豚毒素进行冷冻干燥。 实施例2本实施例是提取河豚毒素的实例。在高速组织捣碎机中将300克的河豚内脏(卵巢和肝脏)和600g、密度 为0.79g/ml的无水甲醇一起混合匀化，加入含5。/。硫酸的甲醇调节pH为1.0， 室温下搅拌2小时，过滤，用3501111含5%硫酸的甲醇提取残渣，过滤；取400 ml滤液与1600 ml丙酮一起搅拌，用稀氢氧化铵调节pH到6.0，搅拌1.5小时，使悬浊液沉降5小时以上，以2500r/min速度离心20分钟，保 留离心上清液；将离心上清液进行氧化铝柱层析，过柱后均以200ml蒸馏水冲柱，再以 200ml、 60'C的蒸馏水洗氧化铝，得到3个含毒组分过柱液、冲柱液和洗氧 化铝液；各含毒组分分别以醋酸酸化，调节pH到l.O，在热水浴上进行真空浓縮， 浓縮至100ml左右，出现油状残余物，加入0.1ml水、lml无水甲醇、4ml无 水乙醚，5000r/min离心20分钟，以3%醋酸溶解离心管管底的沉淀，将溶液 移入较大的容器，加入氨水，调节pH为7.0，出现沉淀，18000r/min离心20 分钟，所得沉淀用lml蒸馏水洗5次，lml无水甲醇洗2次，并再次溶于0.5ml 稀醋酸溶液中，滤出不溶物，加入1.5ml无水乙醚，放置过夜，产生结晶的河 豚毒素；将结晶的河豚毒素进行冷冻干燥。 实施例3本实施例是提取河豚毒素的实例。在高速组织捣碎机中将300克的河豚内脏(卵巢和肝脏)和1200g、密度 为0.79g/ml的无水甲醇一起混合匀化，加入含15%硫酸的甲醇调节pH为2.0， 室温下搅拌4小时，过滤，用500ml含15^硫酸的甲醇提取残渣，过滤；取500 ml滤液与3000 ml丙酮一起搅拌，用稀氢氧化铵调节pH到8.0， 搅拌2小时，使悬浊液沉降6小时，以3000r/min速度离心30分钟，保留离 心上清液；将离心上清液进行氧化铝柱层析，过柱后均以500ml蒸馏水冲柱，再以 500ml、 6(TC的蒸馏水洗氧化铝，得到3个含毒组分过柱液、冲柱液和洗氧 化铝液；各含毒组分分别以醋酸酸化，调节pH到3.0，在热水浴上进行真空浓縮， 浓縮至300ml左右，出现油状残余物，加入0.3ml水、3ml无水甲醇、12ml 无水乙醚，6000r/min离心30分钟，以10%醋酸溶解离心管管底的沉淀，将溶液移入较大的容器，加入氨水，调节pH为ll.O，出现沉淀，20000r/min离心 30分钟，所得沉淀用3ml蒸馏水洗5次，3ml无水甲醇洗2次，并再次溶于 1.5ml稀醋酸溶液中，滤出不溶物，加入4.5ml无水乙醚，放置过夜，产生结 晶的河豚毒素；将结晶的河豚毒素进行冷冻干燥。实施例4本实施例是提取河豚毒素另一实例。在高速组织捣碎机中将260克的河豚内脏(卵巢和肝脏)和640g、密度 为0.79g/ml的无水甲醇一起混合匀化，用含10%硫酸的甲醇调节pH为2.0， 室温下搅拌2小时，过滤，用325ml含l(P/。硫酸的甲醇提取残渣，过滤；取滤液450ml，滤液先进行热水真空浓縮，浓縮得约200ml，再与1000ml 丙酮一起搅拌，用稀氢氧化铵调节pH到7.0，搅拌1小时，使悬浊液沉降4 小时以上，以3000r/min速度离心IO分钟，保留离心上清液；将离心上清液进行氧化铝柱层析，过柱后均以200ml蒸馏水冲柱，再以 200ml、 60'C的蒸馏水洗氧化铝，得到3个含毒组分过柱液、冲柱液和洗氧 化铝液； '各含毒组分分别以醋酸酸化，调节pH到3.0，在热水浴上进行真空浓縮， 浓縮至200ml左右，出现油状残余物，加入0.2ml水、2ml无水甲醇、8ml无 水乙醚，4000r/min离心15分钟，以5%醋酸溶解离心管管底的沉淀，将溶液 移入较大的容器，加入氨水，调节pH为ll.O，出现沉淀，15000r/min离心15 分钟，所得沉淀用lml水洗5次，lml无水甲醇洗2次，并再次溶于lml稀醋 酸溶液中，滤出不溶物，加入3ml无水乙醚，放置过夜，产生结晶的河豚毒素。TTX结晶进行冷冻并称量。由于热水洗氧化铝液之结晶仍遗留大量有机 溶剂的气味，不符合冷冻干燥的安全标准，故未能进行干燥。实施例4是在实施例1的基础上加以改进，进行浓縮，从而减少了丙酮的 使用量，节约成本，亦节约了过柱时间。实施例5本实施例为提取金针菇多糖的实例。将金针菇菌丝体在全自动发酵罐中发酵后进行多糖提取，金针恭菌丝体经发酵后，样品泡浸在质量分数为95%乙醇中，然后用80%乙醇连续提取三次， 每次24小时，将提取过的材料用5(TC的酒精清洗，然后放在铅制器皿中烘干， 经葡聚糖凝胶G200层析纯化制成金针菇多糖。 实施例6将金针菇菌丝体在全自动发酵罐中发酵后进行多糖提取，金针菇菌丝体经 发酵后，样品泡浸在质量分数为90%乙醇中，然后用75%乙醇连续提取三次， 每次22小时，将提取过的材料用60'C的酒精清洗，然后放在铅制器皿中烘干， 经葡聚糖凝胶G200层析纯化制成金针菇多糖。实施例7将金针菇菌丝体在全自动发酵罐中发酵后进行多糖提取，金针燕菌丝体经 发酵后，样品泡浸在质量分数为99%乙醇中，然后用85%乙醇连续提取三次， 每次26小时，将提取过的材料用55"C的酒精清洗，然后放在铅制器皿中烘干， 经葡聚糖凝胶G200层析纯化制成金针菇多糖。实施例8本实施例为制备本发明注射液的实例。河豚毒素TTX和金针菇多糖经过纯化后，纯度可达96-98%,按重量比1: 1的比例混合，以无菌水配制，经过微孔滤膜过滤、除菌、冲氮、抽真空，最 后封管即制成本发明的针剂。用于降低药物依赖性，其效果达到80%以上，无 成瘾性和毒副作用。实施例9本实施例为制备本发明注射液的实例。河豚毒素TTX和金针菇多糖经过纯化后，纯度可达96-98%，按重量比1: 2的比例混合，以无菌水配制，经过微孔滤膜过滤、除菌、冲氮、抽真空，最 后封管即制成本发明的针剂。用于降低药物依赖性，其效果达到80%以上，无 成瘾性和毒副作用。实施例10本实施例为制备本发明注射液的实例。河豚毒素TTX和金针菇多糖经过纯化后，纯度可达96-98%，按重量比2: 1的比例混合，以无菌水配制，经过微孔滤膜过滤、除菌、冲氮、抽真空，最 后封管即制成本发明的针剂。用于降低药物依赖性，其效果达到80%以上，无 成瘾性和毒副作用。实施例11本实施例是本发明注射液的应用实例。本注射液经广东省汕头、清远、湛江、顺德、湖南省怀化等地戒毒所临床 试用，效果很好。经过一个疗程，使用注射液20支后，吸毒者反映体能恢 复85%，体重增加6.5kg，调整了生物钟，恢复了正常作息时间，看见老友在 场吸毒可以拥有坚强意志，不再参与吸毒，80%以上患者降低了对药物的依赖 性。本药物经广东省科技厅和广东省卫生厅检验，认为该药物安全、有效、创 新。实施例12本实施例为本发明提取的河豚毒素的生物检测实例设置3个对照组，每个对照组选择3只体重在18-22克的小鼠，对每个对 照组的小鼠注射实施例1提取的河豚毒素，注射量分别为0.27pg/只、0.4pg/ 只、0.67pg/只，小鼠的死亡时间如下0.27—只0.4pg/只0.67pg/只体重(g)死亡时间 (s)体重(g)死亡时间 (s)体重(g)死亡时间 (s)19.579620.159521.242121.482118.853420.839720.978319.756821.6420重18-22克的小鼠注射微量本发明提取的河豚毒素后在14分钟内全部死 亡，说明本发明提取的TTX纯度高。10
权利要求
1、一种降低药物依赖性注射液，其特征是该注射液由从河豚中分离的河豚毒素和金针菇多糖按重量比1-2∶1-2组成。
2、 权利要求1所述的降低药物依赖性注射液的制备方法，其特征在于将 河豚毒素和金针菇多糖按1-2: 1-2比例混合，以无菌水配制，经过微孔滤膜过滤除菌、冲氮，抽真空，最后封管成针剂。
3、 权利要求2所述的方法，其特征在于所述河豚毒素通过如下步骤分离 制得(1) 在高速组织捣碎机中将河豚内脏和无水甲醇按重量比1: 2-4混合， 加入含5Q/。-15n/。硫酸的甲醇调节pH为1.0-2.0，室温下搅拌2-4小时，过滤， 用含5%-15%硫酸的甲醇提取残渣，过滤；将滤液与丙酮按体积比1:4-6混合、搅拌，用稀氢氧化铵调节pH到6.0-8.0， 搅拌l-2小时，使悬浊液沉降4-6小时，以2000-3000r/min速度离心10-30分 钟，保留离心上清液；(2) 将离心上清液进行氧化铝柱层析，过柱后以蒸馏水冲柱，再以60-80 'C的蒸馏水洗氧化铝，得到3个含毒组分过柱液、冲柱液和洗氧化铝液；(3) 各含毒组分分别以醋酸酸化，调节pH到1.0-3.0，在热水浴上进行 真空浓縮，浓縮至100-300ml，出现油状残余物，加入0.1-0.3ml水、l-3ml无 水甲醇、4-12ml无水乙醚，4000-6000r/min离心15-30分钟，以3%-10%醋酸 溶解离心管管底的沉淀，将溶液移入较大的容器，加入氨水，调节pH为 7.0-11.0，出现沉淀，15000-20000r/min离心15-30分钟，所得沉淀用蒸馏水洗 5次，无水甲醇洗2次，并再次溶于0.5ml-1.5ml稀醋酸溶液中，滤出不溶物， 加入1.5-4.5ml无水乙醚，放置过夜，产生结晶的河豚毒素；(4) 将结晶的河豚毒素进行冷冻干燥。
4、 权利要求3所述的方法，其特征在于河豚内脏包括卵巢和肝脏。
5、 权利要求2所述的方法，其特征在于所述金针菇多糖通过如下方法制 成将金针菇菌丝体在全自动发酵罐中发酵后进行多糖提取，金针燕菌丝体经发酵后，样品泡浸在质量分数为90%-99%乙醇中，然后用75%-85%乙醇连续 提取三次，每次22-26小时，将提取过的材料用50-6(TC的酒精清洗，然后放 在铅制器皿中烘干，经葡聚糖凝胶G200层析纯化制成金针菇多糖。
全文摘要
一种降低药物依赖性的注射液是由河豚分离的河豚毒素(Tetrodotoxin TTX)和金针菇多糖组成，TTX和多糖按比例混合后，以无菌水配制。经过微孔滤膜过滤除菌、冲氮、抽真空、最后封管成针剂。本药剂能够降低80％以上的吸毒者对生物碱类成瘾性药物的依赖性并修复免疫损伤机能和性功能，是一种良好的戒毒药剂。
文档编号A61K31/529GK101322718SQ20081002982
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月29日 优先权日2008年7月29日
发明者林德球, 斌 钟, 陈豪贵 申请人:林德球