专利名称：一种泰来藻提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种泰来藻(r力aJasw'a力e历pn'c力i力提取物，另外还涉及这种提取物的制备 方法以及其在制备抗病毒药物，生物农药和海洋防污剂中的应用。
背景技术：
泰来藻(也称泰莱草)属于水鳖科泰来藻属，是我国南海水域的海草床中的优势种，但 目前其经济价值还未被开发出来。
发明内容
本发明的目的在于从泰来藻中提取出具有医药价值的化合物，从而实现泰来藻的经济价值。
我们通过有机溶剂提取，常压柱层析分离技术等，从泰来藻中分离得到一种主成分为黄 酮苷化合物的提取物，这种化合物具有抗病毒，昆虫拒食活性和抗海洋污损生物幼虫附着的 作用，因而可以应用于制备抗病毒药物，生物农药和海洋绿色防污剂，从而实现了本发明的 目的。
本发明的泰来藻提取物，其特征是含有黄酮苷化合物并由以下的步骤制备得到
(1) 将泰来藻用有机溶剂在室温下浸泡，收集提取液，浓縮得粗提取物；
(2) 将上述粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯、正丁醇分别依次萃取，收集水层并 浓縮；
(3) 将上述浓縮的水层进行大孔树脂常压柱层析，以水-甲醇溶剂体系或水-乙醇溶剂体 系为洗脱液，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，收集用甲醇或乙醇洗脱的组分，浓縮 得到粗组分；
(4) 将上述粗组分用甲醇冲洗，收集冲洗后不溶于甲醇，并且在紫光灯波长254rnn下有 强紫外吸收的组分，得到泰来藻提取物。
步骤(l)所述的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶剂或乙醇-水混合溶剂等，所 述的浸泡可以是3次，每次5天，所述的浓缩可以采用常规的方法如减压浓縮。
步骤(2)所述的萃取可以是各3 4次，所述的浓縮可以采用常规的方法如减压浓縮。 步骤(3)所述的浓縮可以采用常规的方法如减压浓縮。
本发明泰来藻提取物为黄色无定形粉末，在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收，其核磁 共振氢谱['H NMR (500 MHz, DMS0)]显示如下数据:SH 7.50-7.82 ppm (多个芳香环氢)， 6.10-6.80 ppm (多个芳香环氢)，4. 71~5. 17 ppm (多个糖端基氢)，3. 20~3. 82 ppm (多个糖
次甲基和亚甲基氢)，其'H NMR谱与从泰来草中分离到的黄酮苷化合物luteolin 3，-0画methyl-7隱glucuronide相似(见参考文献Stochmal A， Placente S， Pizza C， et al. J Agric Food Chem， 2001, 49:753-758.)，只是多了一些信号峰，结合黄酮类化合物是泰来 藻的主要特征性化学成分这一研究事实，故推测该提取物的主要化学成分是黄酮苷类化合物。 本发明泰来藻提取物的制备方法及其优化条件同上述。
实验证明本发明的泰来藻提取物具有很强的抗单纯疱疹病毒HSV-I病毒活性，其IC50 值约为6. 25 u g/mL，还具有体外抗CVB3病毒活性，在浓度为100 y g/mL时能够抑制一半以 上CVB3病毒的病变，另外本发明的化合物有较好的昆虫拒食性活性，在浓度为500yg/mL时 对斜纹夜蛾2龄幼虫的拒食率为93%，在浓度为100 u g/mL时对斜纹夜蛾SL细胞的细胞致死 率为91%，此外，本发明的化合物还具有很强的抑制多室草苔虫幼虫附着的活性(E"为0. 005 U g/mL)。
本发明的泰来藻提取物可以用于制备抗病毒药物，可以用作生物农药和海洋防污剂。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 实施例1:
以风干干重4 Kg的泰来藻(77 a7a"j'a力ey^n'c力j'i)为原料，切碎后用乙醇有机溶剂约 35 L室温浸泡3次，每次5天，将提取液减压浓縮得粗提取物。将粗提取物(70 g)悬溶于 水(1 L)，用氯仿(600 mL)和正丁醇(500 mL)依次萃取各3次，收集水层并减压浓縮， 将浓縮后的水层23g进行大孔树脂(D101大孔吸附树脂)常压柱(常压玻璃柱，直径9cm, 长1.8 m)层析，以水-甲醇溶剂系统为洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱， 收集用甲醇洗脱的组分，减压浓縮得到粗组分。将粗组分在用甲醇冲洗，收集冲洗后不能溶 解于甲醇，并且在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收的组分，得到本发明泰来藻提取物。该 提取物的核磁共振氢谱['H醒R (500 MHz， DMS0)]显示如下数据5H 7.50-7.82卯m (多个 芳香环氢)，6. 10~6. 80 ppm (多个芳香环氢)，4. 71~5. 17 ppm (多个糖端基氢)，3. 20~3. 82 ppm (多个糖次甲基和亚甲基氢)，其'H丽R谱与从泰来藻中分离到的黄酮苷化合物luteolin 3'-0-methyl-7-glucuronide相似，只是多了一些信号峰，结合黄酮类化合物是泰来藻的主要特 征性化学成分这一研究事实，故推测该提取物的主要化学成分是黄酮苷类化合物。
实施例2:
收集对数生长期vero细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为1. 0X 105 / 100叱，置于 5%， C02培养箱培养。次日将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的实施例1的泰来藻提取物 的溶液50化，立即加入HSV-I病毒使用液50叱，同时设正常细胞对照，病毒对照，37°C， 5 %0)2培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE)，每天观察细胞长势，以-、+、 ++、 +++、 ++++
表示细胞病变情况。结果显示，本发明的化合物对vero细胞的最大无毒浓度为25ug/ml，其 抑制单纯疱疹病毒I型病变的ICs。值为6. 25ug/mL。 实施例3:
收集对数生长期H印G2细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为L0X10Vl0(mL，置 于5%， C02培养箱培养。次日将微孔中生长液吸出，每孔加入稀释好的实施例1的泰来草提取 物的溶液50叱，立即加入CVB3病毒使用液5(HiL，同时设正常细胞对照，病毒对照，37°C， 5 %0)2培养箱培养。观测细胞病变效应(CPE)，每天观察细胞长势，以-、+、 ++、 +++、 ++++ 表示细胞病变情况。结果显示，本发明的化合物对hela细胞毒性的最大无毒浓度为200u g/mL，在浓度为100" g/mL时能够抑制一半以上病毒的病变。
实施例4:
将实施例1的产物配成500 Ug/mL丙酮溶液(难溶物加了几滴二甲亚砜)，并以浓度为 10ug/mL的印楝素作为对照。将木薯叶($=1.5 cm)分别浸泡实验液和对照液1秒，晾干 后放入培养皿中，每皿3片，接入2头斜纹夜蛾2龄幼虫。每样品处理设5个重复。处理48 小时后调查取食叶面积，并更换新鲜甘蓝叶饲喂，记录处理后6天内试虫的死亡情况。结果 显示，本发明的化合物在浓度为500u g/mL时对斜纹夜蛾2龄幼虫的拒食率为93%。 实施例5:
以斜纹夜蛾SL细胞为对象，用MTT法对实施例1的产物进行了细胞毒力试验。实施例1 的产物的浓度均为100ug/mL (即100 ppm)，溶剂为DMSO。结果显示，本发明的化合物在 浓度为100" g/mL时对斜纹夜蛾SL细胞的细胞致死率为91%。
实施例6:
将实施例1得到的泰来藻提取物作为测试样品溶解于二甲亚砜(DMSO)，然后加入经高压 灭菌器过滤(0.22 pm )的海水(FSW)配成不同的浓度(0.05 Pg/ mL, 0.2 Pg/ mL， 1 Pg/ mL, 10 Pg/ mL and 50化/ mL)。在聚苯乙烯24孔径板的每个孔板中加入20个游动的幼虫 和lmL配制好的测试样品，每个样品做4个平行孔，用加有DMSO的FSW海水作为阴性对照 物。将配有测试样品的24孔径板放于28。 C的培养箱中放置l小时后，观察实验结果。通 过显微镜计算1)已附着在板壁上的幼虫个数，2)没有附着在板壁上的幼虫个数，3)己死 了的幼虫个数。计算已附着在板壁上的幼虫个数占实验用的总幼虫个数的百分比，再通过EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1. 5软件计算其抑制幼虫附着的半数有效抑制浓度EC50。 结果显示，本发明的化合物对多室草苔虫幼虫附着的半数有效抑制浓度ECs。为0.005 yg/mL。
权利要求
1.一种泰来藻提取物，其特征是含有黄酮苷化合物并由以下的步骤制备得到(1)将泰来藻(Thalassia hemprichii)用有机溶剂在室温下浸泡，收集提取液，浓缩得粗提取物；(2)将上述粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯、正丁醇分别依次萃取，收集水层并浓缩；(3)将上述浓缩的水层进行大孔树脂常压柱层析，以水-甲醇溶剂体系或水-乙醇溶剂体系为洗脱液，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，收集用甲醇或乙醇洗脱的组分，浓缩得到粗组分；(4)将上述粗组分用甲醇冲洗，收集冲洗后不溶于甲醇，并且在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收的组分，得到泰来藻提取物。
2. 根据权利要求1所述的一种泰来藻提取物，其特征是步骤(l)所述的有机溶剂是甲醇、 乙醇、甲醇-水混合溶剂或乙醇-水混合溶剂，所述的浸泡是3次，每次5天，所述的浓縮是 减压浓縮，步骤(2)所述的萃取是各3 4次，所述的浓縮是减压浓縮，步骤(3)所述的浓縮是 减压浓縮。
3. —种泰来藻提取物的制备方法，其特征包括以下的步骤(1) 将泰来藻用有机溶剂在室温下浸泡，收集提取液，浓縮得粗提取物；(2) 将上述粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯、正丁醇分别依次萃取，收集水层并 浓縮；(3) 将上述浓縮的水层进行大孔树脂常压柱层析，以水-甲醇溶剂体系或水-乙醇溶剂体 系为洗脱液，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，收集用甲醇或乙醇洗脱的组分，浓縮 得到粗组分；(4) 将上述粗组分用甲醇冲洗，收集冲洗后不溶于甲醇，并且在紫光灯波长254mn下有 强紫外吸收的组分，得到产物。
4. 根据权利要求3所述的一种泰来藻提取物的制备方法，其特征步骤(l)所述的有机溶 剂是甲醇、乙醇、甲醇-水溶剂或乙醇-水混合溶剂，所述的浸泡是3次，每次5天，所述的 浓縮是减压浓缩，步骤(2)所述的萃取是各3 4次，所述的浓縮是减压浓縮，步骤(3)所述的 浓縮是减压浓缩。
5. 权利要求1所述的泰来藻提取物在制备抗病毒药物中的应用。
6. 权利要求l所述的泰来藻提取物作为生物农药的应用。
7. 权利要求1所述的泰来藻提取物作为海洋防污剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种泰来藻提取物及其制备方法和应用，其特征是通过将泰来藻用有机溶剂浸泡，得到的粗提取物用氯仿或乙酸乙酯、正丁醇分别依次萃取，收集水层进行大孔树脂常压柱层析，以水-甲醇溶剂体系或水-乙醇溶剂体系为洗脱液，收集用甲醇或乙醇洗脱的组分，再用甲醇冲洗，收集冲洗后不溶于甲醇，并且在紫光灯波长254nm下有强紫外吸收的组分，得到产物。本发明的泰来藻提取物具有很强的抗单纯疱疹病毒HSV-I病毒活性，体外抗CVB3病毒活性，昆虫拒食性活性，和很强的抑制多室草苔虫幼虫附着的活性，因此可用于制备抗病毒药物，生物农药和海洋绿色防污剂。
文档编号A61P31/22GK101336940SQ20081003016
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月14日 优先权日2008年8月14日
发明者漆淑华 申请人:中国科学院南海海洋研究所