专利名称：毒隐翅虫提取液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毒隐翅虫提取液及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：
毒隐翅虫是隐翅虫科中的一个属，已知种类超过250种，产自除南极洲以 外的世界各地，中国已报道的毒隐翅虫有21种。毒隐翅虫主要生活在潮湿的 农田、菜地、杂草丛中，是山沟、农田常见的小型昆虫。我国常见的毒隐翅虫 有青翅败形隐翅虫(又称梭形毒隐翅虫、黄足蚁形隐翅虫)，黑足蚁形隐翅虫， 多毛隐翅虫，巾形毒隐翅虫，小红毒隐翅虫，蚁态毒隐翅虫，西藏毒隐翅虫等 7种，其中以青翅蚁形隐翅虫分布最广，遍及各省及台湾等地区。毒隐翅虫的卵、幼虫、蛹和成虫(除翅以外的各部分)都有毒素存在，成 虫的毒素主要来源于血淋巴，雌、雄虫体内都含有毒素。毒隐翅虫的毒素是虫 体用来抵御外来侵袭的化学物质。毒隐翅虫的毒液化学成分复杂，含有醛类、 醌类、萜类等，有报道其毒素主要为3种，分别是毒隐翅虫素、拟毒隐翅虫素 和毒隐翅虫酮。其中，毒隐翅虫素的含量最高，分子量为503.65,溶于有机溶 剂乙醇、乙醚、氯仿及苯，不溶于水，结晶的毒隐翅虫素在112匸熔化，弱酸 性，水中煮沸lh不被破坏。我国毒隐翅虫的资源较多，但对毒隐翅虫毒素的 提取工艺及其药效研究尚无完整的研究报道。糖尿病皮肤溃疡，是导致糖尿病患者致残致死的严重慢性并发症之一。糖 尿病皮肤溃疡主要在足部，是一种较顽固的慢性溃疡，若向深部发展，则最后 截肢。全球近2亿糖尿病患者中，有15%以上发生足溃疡或坏疽。糖尿病皮肤 溃疡患者的截肢是非糖尿病患者的15倍，每年的非创伤性截肢中约50%是糖 尿病患者，而后者85%以上是因足部皮肤溃疡恶化、深部感染或邻疽所致。糖 尿病皮肤溃疡的治疗，除了对症治疗(包括限制活动，减少体重负荷，抬高患 肢，以利于下肢血液回流，严格控制血糖，积极纠正酮症酸中毒等影响皮肤溃 疡愈合的各种不良因素)夕卜，传统的常用扩张血管药物如前列腺素El、西洛他唑、654-2以及活血化瘀中药如灯盏花素、参脉等药物治疗，临床上还有高 压氧治疗、血管再造术、细胞因子基因治疗、营养神经治疗、真空封闭、拟人 皮肤活性物、自体皮瓣移植等方法，但目前尚无有效治疗方法。虽然毒隐翅虫 毒素治疗慢性、坏死性皮肤溃疡有零星报道，但运用毒隐翅虫毒素提取液治疗 糖尿病皮肤顽固性溃疡的研究尚为鲜见。HL-60人白血病细胞株的凋亡为减缓人急性白血病进展的机制之一， BEL-7402人肝癌细胞株的凋亡为减缓人肝癌进展的机制之一。显然，抑制 HL-60人白血病细胞株和BEL-7402人肝癌细胞株生长的药物，对治疗某些类 型的人白血病和人肝癌具有积极的意义。毛囊是一个独立的器官，在机体一生中不断经历生长期、退行期、.休止期 的周期性循环。来自外胚层的毛囊上皮成分和来自中胚层的毛囊真皮成分相互 作用，通过自分泌、旁分泌及内分泌在毛囊及其毛囊周围合成和代谢大量的生 长因子、细胞因子、激素和神经肽等完成复杂而有序的毛发生长周期。若有能 减少退行期、延缓休止期、激发生长期的药物，其应用前景不言而喻。发明内容本发明的目的是公开一种毒隐翅虫提取液和及其制备方法和其在药物中 的应用，以填补现有技术的空白。 本发明的技术方案如下本发明所述的毒隐翅虫提取液包括乙醇溶剂和毒隐翅虫毒素，其中毒隐翅 虫毒素的总含量不低于30%。所述毒隐翅虫毒素为毒隐翅虫素、拟毒隐翅虫素和毒隐翅虫酮的混合物。 本发明所述的毒隐翅虫提取液的制备方法包括如下顺序步骤1) 在加热架上安装平底烧瓶，内加75% ~95%乙醇平底烧瓶的3/5容积；2) 按索氏提取器的长度与内径大小，用滤纸做成套桶；3) 操作者带乳胶手套，将釆集的活毒隐翅虫称重，然后在研钵中将毒隐翅 虫捣碎，立即置于上述滤纸套桶内；4) 将套桶装入索氏提取器，自上而下安装索氏提取装置，开启冷凝水，加 热回流；5) 保持回流2~4小时；6) 自然冷却到室温，浓缩定容为毒隐翅虫体重的4-6倍。本发明制备的毒隐翅虫提取液，可应用于制备促进糖尿病皮肤溃疡愈合的药物、制备抑制HL-60人白血病细胞株生长的药物、制备抑制BEL-7402人肝 癌细胞株生长的药物及制备促进毛发生长的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明是如何实现的做进一步详细、清楚、完整地 说明，所列实施例仅对本发明予以进一步的说明，并不因此而限制本发明。 实施例l1) 在加热架上安装平底烧瓶，内加95%乙醇至平底烧瓶的3/5容积；2) 按索氏提取器的长度与内径大小，用滤纸做成套桶；3) 操作者带乳胶手套，将釆集的活毒隐翅虫称重，然后在研钵中将毒隐翅 虫捣碎，立即置于上述滤纸套桶内；4) 将套桶装入索氏提取器，自上而下安装索氏提取装置，开启冷凝水，加 热到回流；5) 保持回流3小时；6) 自然冷却到室温，浓缩定容为毒隐翅虫称重的5倍。 检测所制备的毒隐翅虫提取液的组成含量，检测方法如下APBOOO质谱仪(美国应用生物系统公司)，HPLC高效液相色谱仪(曰本 Shimadzu公司)等仪器，甲醇、甲酸铵为HPLC级，以50%甲醇稀释50-100 倍，记录时间为60min，离子化方式为ESI,扫描范围为50-900m/z。测定结果样品含有毒隐翅虫素(pederin)、拟毒隐翅虫素(Pseudopederin) 和毒隐翅虫酮(pederon)的化合物，总含量为70%。实施例21) 在加热架上安装平底烧瓶，内加75%乙醇至平底烧瓶的3/5容积；2) 按索氏提取器的长度与内径大小，用滤纸做成套桶；3) 操作者带乳胶手套，将釆集的活毒隐翅虫称重，然后在研钵中将毒隐翅 虫捣碎，立即置于上述滤纸套桶内；4) 将套桶装入索氏提取器，自上而下安装索氏提取装置，开启冷凝水，加 热到回流；5) 保持回流3小时；6) 自然冷却到室温，浓缩定容为毒隐翅虫称重的5倍。检测所制备的毒隐翅虫提取液的组成含量，检测方法如下 API3000质谱仪(美国应用生物系统公司)，HPLC高效液相色谱仪(日本 Shimadzu公司)等仪器，甲醇、甲酸铵为HPLC级，以50%甲醇稀释50-100 倍，记录时间为60min,离子化方式为ESI,扫描范围为50-900m/z。测定结果样品含有毒隐翅虫素(pederin)、拟毒隐翅虫素(Pseudopederin) 和毒隐翅虫酮(pederon)的化合物，总含量为30%。实施例31) 在加热架上安装平底烧瓶，内加85%乙醇至平底烧瓶的3/5容积；2) 按索氏提取器的长度与内径大小，用滤纸做成套桶；3) 操作者带乳胶手套，将釆集的活毒隐翅虫称重，然后在研钵中将毒隐翅 虫捣碎，立即置于上述滤纸套桶内；4) 将套桶装入索氏提取器，自上而下安装索氏提取装置，开启冷凝水，加 热到回流；5) 保持回流3小时；6) 自然冷却到室温，浓缩定容为毒隐翅虫称重的5倍。 检测所制备的毒隐翅虫提取液的组成含量，检测方法如下API3000质谱仪(美囯应用生物系统公司)，HPLC高效液相色谱仪(日本 Shimadzu公司)等仪器，甲醇、甲酸铵为HPLC级，以50%甲醇稀释50-100 倍，记录时间为60min，离子化方式为ESI,扫描范围为50-900m/z。测定结果样品含有毒隐翅虫素(pederin)、拟毒隐翅虫素(Pseudopederin) 和毒隐翅虫酮(pederon)的化合物，总含量为5()0/。。实施例4本实施例为本发明所述的毒隐翅虫提取液在促进糖尿病皮肤溃疡愈合中 的药效实验将32只清洁级雄性昆明小白鼠，体重18.12 土2.41g,随机分为4组低剂 量组12只，高剂量组12只，空白组(无任何处理)4只，空白对照组(注射 等量生理盐水，脊部开创，滴涂生理盐水)4只。尾静脉注射3%四氧嘧啶 100mg^g, 72小时后，自远端尾静脉釆血，血糖测定仪检测血糖，若血糖浓 度>10.0 mmol/L即为造模成功。再72小时后，腹腔注射3%戊巴比妥钠 25mg/kg,背部剃毛，常规消毒，在脊背中央用剪刀制成面积为l平方厘米的 圆形创面，单笼喂养，定量饮水与喂食。术后3天，低剂量组和高剂量组开始用药，用滴管在创面分别滴低剂量浓度或高剂量浓度的毒隐翅虫提取液0.5ml, l次/3天。在术后第9天、第15天、 第21天、第27天(于滴涂药物前)记录创口面积、渗出、色泽、结痂情况， 然后分别处死低剂量组3只，高剂量组3只，空白对照组l只。取创面组织置 3.7%多聚甲醛溶液中，包埋，切片，组织学观察炎症细胞浸润、上皮化发生、 真皮结构、胶原纤维致密度、血管分布等情况。实验结果表明四氧嘧啶糖尿病小白鼠造模，在背部皮肤溃疡创口涂布含 有毒隐翅虫毒素提取液后，创口渗出、收口时间短于对照组(空白对照组完全 收口愈合为28.25 ±0.62天，而低剂量组为26.25 ±0.71天，高剂量组为22.75 ±0.43天)，创口干燥、色泽由鲜红变暗红早于对照组；用药组创面炎症细胞 浸润较对照组略少，胶原纤维网状排列、疏松，血管分布均匀，而对照组真皮 结构厚、胶原纤维紊乱、致密度高。可见，本发明所述的毒隐翅虫提取液可应 用于制备促进糖尿病皮肤溃疡愈合的药物。实施例5本实施例为本发明所述的毒隐翅虫提取液在促进HL-60人白血病细胞株 生长中的药效实验-.釆用常规的四氮唑盐(MTT)还原法，作用时间72小时。实验结果表明 在低浓度和高浓度时，本发明所述的毒隐翅虫提取液对HL-60人白血病细胞株 生长的抑制率均达到90%以上，可应用于制备促进HL-60人白血病细胞株生长 的药物。实施例6本实施例为本发明所述的毒隐翅虫提取液在抑制BEL-7402人肝癌细胞株 生长中的药效实验釆用常规的磺酰罗丹明B (SRB)蛋白染色法，作用时间72小时。实验结 果表明在低浓度和高浓度时，本发明所述的毒隐翅虫提取液对BEL-7402人 肝癌细胞株生长的抑制率均达到卯％以上，可应用于制备抑制BEL-7402人肝 癌细胞株生长的药物。本实施例为本发明所述的毒隐翅虫提取液在促进毛发生长中的药效实验 1)用滴管汲取毒隐翅虫提取液0.5ml,滴在昆明小白鼠鼻部上方(红色黏膜) 处，隔3天再滴一次，4天后，可见小白鼠鼻部上方(红色黏膜)处长出密密的短绒毛。2)用滴管汲取毒隐翅虫提取液lml，滴在昆明小白鼠右前肢上方皮肤上， 隔3天再滴一次，3天后，可见局部毛长于周围约2mm。可见，本发明所述的毒隐翅虫提取液可应用于制备促进毛发生长的药物。
权利要求
1.一种毒隐翅虫提取液，其特征在于所述提取液包括乙醇溶剂和毒隐翅虫毒素，其中毒隐翅虫毒素的总含量不低于30％。
2. 根据权利要求l所述的毒隐翅虫提取液，其特征在于所述毒隐翅虫毒 素为毒隐翅虫素、拟毒隐翅虫素和毒隐翅虫酮的混合物。
3. —种权利要求l所述的毒隐翅虫提取液的制备方法，其特征在于所述 制备方法包括如下顺序步骤1) 在加热架上安装平底烧瓶，内加75% ~95%乙醇至平底烧瓶的3/5容积；2) 按索氏提取器的长度与内径大小，用滤纸做成套桶；3) 操作者带乳胶手套，将釆集的活毒隐翅虫称重，然后在研钵中将毒隐翅 虫捣碎，立即置于上述滤纸套桶内；4) 将套桶装入索氏提取器，自上而下安装索氏提取装置，开启冷凝水，加 热回流；5) 保持回流2 4小时；6) 自然冷却到室温，浓缩定容为毒隐翅虫体重的4 6倍。
4. 一种权利要求1所述的毒隐翅虫提取液的应用，其特征在于所述毒隐 翅虫提取液在制备促进糖尿病皮肤溃疡愈合药物中的应用。
5. —种权利要求1所述的毒隐翅虫提取液的应用，其特征在于所述毒隐 翅虫提取液在制备抑制HL-60人白血病细胞株生长药物中的应用。
6. —种权利要求1所述的毒隐翅虫提取液的应用，其特征在于所述毒隐 翅虫提取液在制备抑制BEL-7402人肝癌细胞株生长药物中的应用。
7. —种权利要求1所述的毒隐翅虫提取液的应用，其特征在于所述毒隐 翅虫提取液在制备促进毛发生长药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种毒隐翅虫提取液，其包括乙醇溶剂和毒隐翅虫毒素，其中毒隐翅虫毒素的总含量不低于30％。本发明所述的毒隐翅虫提取液通过在乙醇中回流提取制备而成，其可应用于制备促进糖尿病皮肤溃疡愈合的药物、制备抑制HL-60人白血病细胞株生长的药物、制备抑制BEL-7402人肝癌细胞株生长的药物及制备促进毛发生长的药物。
文档编号A61K35/64GK101234128SQ20081003439
公开日2008年8月6日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者平 万, 李利珍, 胡佳耀, 赵梅君 申请人:上海师范大学