专利名称：复方丹参滴丸对心脏微循环障碍和心肌损伤的保护作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药产品的新用途，特别涉及复方丹参滴丸在治疗和/或预防心 脏微循环障碍和心肌损伤中的应用。
背景技术：
随着人们生活水平的提高及生活习惯的改变，心血管疾病已经成为威胁人类 健康和生命、影响医疗财政的主要病种。每年全世界因心血管病而死亡的人数大
约有1650万人，其中，中国约300万人，占总死亡人数的45%。
心脏外科体外循环、冠状动脉搭桥术、复杂先天性心脏病就治术、瓣膜置换 术及大血管外科手术等介入疗法的临床应用，某种程度上挽救了心血管患者的生 命，但是，术后缺血再灌注(ischemia / r印erfusion， I/R)损伤则成为阻碍 心脏血管外科手术远期疗效的主要难题。另一方面，心脏骤停后的复苏和心血管 痉挛的环节引发的缺血再灌注损伤也已经影响了救治效果。因此预防和改善心肌
缺血再灌注损伤是提高心血管疾病就治效果、降低其死亡率的重要环节。
心脏冠状血因痉挛、动脉硬化和血栓等因素阻塞时，造成起阻塞下流的缺血 和缺氧。缺血时ATP生成减少，AMP代谢分解产生次黄嘌呤，由于细胞内钙离子增
多，激活蛋白酶，使黄嘌呤脱氢酶不可逆地转变成黄嘌呤氧化酶。当溶栓、血管 扩张剂、或介入治疗后，血流再通(再灌注)提供02时，次黄嘌呤和02及水在黄 嘌呤氧化酶催化下，产生大量负氧阴离子('02—) ， '02—在超氧化物歧化酶(SOD) 的作用下，转化成过氧化氢(HA)，后者在过氧化氢酶(CAT)的作用下转化成 H20， 一部分'(V和HA经过Haber-Weiss反应转化成羟自由基(.OH)。另外， 血管内皮产生的N0与'02—结合成0N00-。 HA、 '0H、 ONOCT等都是毒性很强的过氧 化物，可以引起脂质过氧化、DNA断裂等，导致血管内皮和心肌细胞损伤。I/R 产生的过氧化物，通过降解转录因子抑制蛋白-kb (i-kB)，活化核转录转录因 子(NF-kB)，引起其亚基P65, P50的核转移，特别是P50的核转移可以启动调 亡相关蛋白的合成。血管内皮选折素(E-selectin)和白细胞选折素(L-selectin) 的表达引起白细胞沿血管壁滚动，血管内皮黏附分子ICMA-l和白细胞黏附分子CDllb/CD18的表达引起白细胞与血管壁的黏附。黏附与血管壁上的白细胞一方
面通过NADPH氧化酶进一步产生过氧化物，同时，又可以分泌蛋白酶，加重心脏
血管和心肌细胞的损伤。黏附于血管壁上的白细胞通过血管内皮细胞间隙或损 伤的血管内皮游出于血管外，加重血管周围细胞的损伤。血管内皮细胞和血管基 底膜的损伤，增加了血管通透性，导致血浆白蛋白的外漏，造成血管周围间质的
水肿。P50的核转移还可以诱导肿瘤坏死因子-ct (TNF-a ) 、 IL-6等炎性介质的 合成和释放，这些炎性因子进一步诱导黏附分子的表达和调亡蛋白的启动，加重 心脏微循环障碍和心肌细胞损伤。缺血再灌注引起的心脏微循环障碍和心肌细胞 损伤是复杂的多环节的病理变化过程，氧自由基、钙超载、白细胞与血管内皮细 胞的相互作用、炎性介质、细胞凋亡蛋白调控等均参与此过程，而过氧化物降解 I-kB,活化NF-kB，引起其亚基P65，或P50的核转移，特别是P50的核转移是加 重再灌注后微循环障碍和心肌细胞调亡的主要环节之一。
目前已经有过关于腺苷、降钙素基因相关肽、缓激肽、PGI2 、 NO等对于心 脏I/R损伤的预防和改善作用的研究，但是，由于其仅可以作用于复杂的心脏I/R 损伤过程中的某一个环节或耙点，在改善心脏I/R后心微循环障碍和心肌细胞保 护方面的作用尚不尽人意。
复方丹参滴丸(CP)由丹参、三七、冰片的活性成份组成，在中国、韩国、 俄罗斯和越南等国主要用来治疗心血管疾病。丹参是唇形科鼠尾草植物Salvia miltiorrhiza的干燥根，丹参水溶液的主要成分包括丹参素、原儿茶醛、原儿茶 酸、咖啡酸、丹酚酸A-G和紫草酸。其中，丹参素是其基本结构，参与了丹酚酸 A-G和紫草酸结构的构建。以往研究表明，在灌胃给予丹参总酸后，血清中可以 检测到丹参素和咖啡酸。各种体内和体外研究表明丹参通过改善微循环，扩张冠 状动脉，提高血流量，保护心肌来预防心肌缺血再灌注损伤。其机制主要为丹参 可以抑制心肌细胞内钙离子的活化和超载，清除氧自由基，抑制心肌细胞凋亡和 保护血管内皮细胞等。丹参的水溶性成份可以提高I/R后大鼠的存活率，并且降 低左心室梗死面积，紫草酸B可以减少兔心脏缺血后心肌损伤的程度，丹酚酸A 和丹酚酸B可以保护大脑损伤，复方丹参滴丸可以改善I/R引起的肝脏损伤。丹参 素还可以减少由I/R引起的线粒体膜损伤和脂质过氧化，清除由黄嘌呤和黄嘌呤 氧化酶产生的超氧负离子('02-)，丹酚酸A可以抑制由I/R诱导的脑LPO和清除过氧化氢自由基(OH—),丹酚酸B可以清除l. 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， 抑制LPO并且清除大鼠肝细胞和肝星形细胞中的过氧化物，抑制在PCL2细胞中由 amyloid p印tide A引起的过氧化物的产生，抑制TNF-a诱导的人主动脉平滑肌 细胞过氧化物产生和NADPH氧化酶活性，紫草酸镁B可以清除ON00-。此外，丹参 的水溶性成分还可以抑制TNF-a诱导的NF-icB的核转移，原儿茶醛、丹酚酸B可 以抑制TNF- a诱导的HUVEC的ICAM-1和VCAM-1的表达和ICAM-l与VCAM-l的mRNA的 表达，抑制TNF-a诱导NF-kB和AP-1的DNA结合活性。丹参、丹酚酸B和丹参水 溶液可以抑制由TNF-a引起血管内皮细胞的E-selection的表达，CP剂量依存性 地抑制了TNF-a引起的HUVEC中ICAM-1和VCAM-l的表达，同时抑制血小板产生的 生长因子BB引起的在血管平滑肌细胞内DNA的合成和细胞增殖。丹参还可以抑制 心肌细胞内钙离子的活化和超载，抑制心肌细胞凋亡。
三七是Panax notoginseng的干燥根，三七总阜苷(Panaxnotogiseng Saponins, PNS)为三七中的主要有效组分，主要包括30余种皂苷类成分。临床 上广泛用于心脑血管疾病、肝功能障碍等与微循环障碍相关疾病的治疗。其机制 可能与三七的免疫调节功能，改善微循环障碍，抑制血小板的聚集和粘附因子的 表达，减少白细胞粘附于血管内皮以及提高内皮的功能相关。以PNS为主要成分 的传统中药复方制剂脉流能改善缺血再灌注(I/R)引起的大鼠肠系膜微循环障 碍，包括抑制白细胞粘与细静脉管壁的黏附、细静脉壁过氧化物的产生和血管周 围肥大细胞脱颗粒，PNS还可以改善血管内皮功能。我们以往的体内研究结果证 明在LPS投入之前给予PNS能够抑制白细胞与细静脉的粘附，抑制体内肥大细胞脱 颗粒，体外研究结果证明了PNS可以抑制LPS诱导的粒细胞粘附分子CD18和CDllb 的表达。
复方丹参滴丸中的丹参的主要水溶性成分可以清除过氧化物、抑制血管内皮 细胞黏附分子的表达，PNS可以抑制白细胞黏附分子的表达。CP可以改善缺血再灌 注的肝微循环障碍有改善作用，抑制光化学方法引起的大鼠肠系膜血栓。此外CP 还可以抑制光化学方法引起的大鼠肠系膜血栓。但是，复方丹参滴丸对缺血再灌 注后的心脏微循环障碍是否有改善作用，对心脏细胞中I-KB-a降解和P50的核 转移是否有抑制作用，对心肌细胞超微结构的损伤是否保护作用等尚未见报道。 为此，本实验采用结扎冠状动脉左前降支后再通造成缺血再灌注模型，用连接SIT摄像机和高速摄像机的正立显微镜和激光多普勒血流量仪动态观察缺血再灌 注后大鼠心脏冠状血管细动静脉直径和红细胞流速，FITC标记的白蛋白的血管外 漏出状态以及心脏血流量。同用TTC染色法计数心肌梗死体积，用TUNEL染色法观 察和计数凋亡的心肌细胞，用透射电镜观察心脏血管和心肌细胞的超微结构的变 化，用Western检测心脏组织的I-KB-a， P50, P65的表达，用紫外分光光度仪 检测心脏组织中的MPO,研究复方丹参滴丸对再灌注后心脏微循环障碍和心肌损 伤的保护作用，并探讨其机理。
发明内容
本发明提供复方丹参滴丸对心脏微循环障碍和心肌损伤的保护作用
本发明所述复方丹参滴丸，主要成份是丹参、三七和冰片组成的中药复方制剂。
本发明所述丹酚总酸，复方丹参滴丸可以从市场上买到，也可以根据现有技术制
备，符合药用标准即可。
本发明通过以下实验数据证明本发明的效果
实验一
复方丹参滴丸一次性预给药对缺血再灌注引起的大鼠心脏微循环障碍和心肌损 伤的预防作用
1. 动物和试剂
雄性SD大鼠，体重250士10g，购买于北京大学医学部动物中心，合格证号 SCXK(京)2006—0001。实验动物的管理按卫生部发布的实验动物管理指南执行， 动物饲养在温度为24士rC，湿度为55±5%的条件下，自由饮食、饮水。
2. 手术过程
大鼠用2(^的乌拉坦(1.25g/kg)肌肉注射麻醉，仰卧位固定，颈部去毛，切 开皮肤，分离颈前肌，暴露气管，行气管插管。插管另端连于小动物呼吸机行加 压呼吸(呼吸比1:1，呼吸频率75次/min ，潮气量12 mL/kg)。用热毪维持肛 温在37 - 37.5。C (YSI REF 401, Yellow Spring, Ohio, USA)度之间。胸部去 毛、消毒，沿胸骨左，右缘2 4肋开胸暴露心脏,剪开心包膜，用穿有3-0缝 合线的3/8弯针穿过肺动脉圆锥与左心耳交界稍下(1 2) mm处，结扎缝合线并 在丝线与心肌组间放一根聚乙烯小管,拉紧丝线形成造成缺血，心肌颜色变白为结扎成功的标志。30分种后放松丝线即发生再灌注，缺血区域恢复红色为再灌 注成功的标志，假手术组只穿线不结扎。
3. 药物及分组
复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司提供，批号20040502)，常 温下保存。实验选用的SD大鼠，随机分成5组(n=6)，假手术组(Sham)、缺血 再灌注模型(I/R)组、复方丹参滴丸0.1 g/kg+缺血再灌注组(CPO. l+I/R)、 复方丹参滴丸0.4 g/kg+缺血再灌注组(CPO. l+I/R)、复方丹参滴丸0.8 g/kg+ 缺血再灌注组(CP0.1+I/R)。在实验前90分钟，假手术组和缺血再灌注组分别 灌胃给予生理盐水4 ml/kg，复方丹参滴丸各剂量组分别灌胃给予相应剂量复方 丹参滴丸(0. lg/kg, 0.4g/kg, 0.8g/kg)生理盐水溶液4 ml/kg。
4. 心脏冠状血管细动静脉的血管径和红细胞流速
用连接在正立显微镜(BX51WI, Olympus, J邻anese)的高速摄影机 (ultimate APX mOTRON， FASTCAM , US)，在落射光下，1用0倍物镜，选直 径在30-50 um的细静脉，通过显示屏(20PF5120, PHLIPS， US)观察，并用CD 录像机(DVR-560H， PHLIPS, US)记录。设定高速摄影机的摄影速度为500幅/秒， 记录在缺血前，缺血30分，再灌注30分、再灌注60分时同一视野内细动、静 脉管径和红细胞流动速度。在25幅/秒的速度重放的录像上，用Image-Pro Plus 5.0软件测定细动、静脉管径及红细胞流速。大鼠心脏细动、静脉红细胞流速用 mm/s表示，以缺血再灌注前的细动、静脉红细胞流速为基础值，计算各组心脏 细动、静脉红细胞流速的变化率。大鼠心脏细动、静脉管径用mm表示，分别以 缺血再灌注前的细动、静脉管径为基础值，计算心脏细动、静脉管径的变化率。
5. 心脏冠状血管细静脉血浆白蛋白漏出的测定
另取大鼠(每组^6),在缺血再灌注60分，将FITC标记的血浆白蛋白按 50mg/kg的剂量，经股静脉缓慢推注。用正置荧光显微镜以455 nm激发光，汞 灯作为发射光源(100W)，记录各组再灌注60分钟时细静脉血管内和相邻的血 管外间质的FITC荧光图象。用Image-Pro Plus 5. 0软件测定细静脉血管内和相 邻的血管外间质的FITC荧光强度，用同一视野内细静脉管外间质与血管内FITC 荧光的比表示大鼠心脏细静脉白蛋白渗出的值。用连接计算机的激光多普勒血流灌注成像仪(PeriScan PIM3， PERIMED， Sweden)记录在缺血前，缺血5分、10分、30分以及再灌注5分、10分、30 分、60分时心脏表面血流量。用LDPIwin软件对图像进行测量和评估数据。以 缺血再灌注前的血流量为基础值，计算心脏血流量的变化率。
7. 心肌梗死面积的测定
再灌注60分钟后，取出大鼠心脏(每组^6)，从心尖部开始延平行于房室 间隔的方向切成1 mm厚的5个薄片放入0. 375%的TTC中在37'C下孵育15分钟， 行TTC染色。非梗塞区被染成红色，梗塞区被染成白色，用Digital sight (DS-5M-U1, NIKON, Japan)拍摄图心肌图片，用图像分析软件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)计算出每片心肌的梗死面积与左心室面积 的百分比值，再以五片心脏切片的心肌梗死面积的百分比的平均值来表示总的梗 死面积。
8. 心肌细胞的TUNEL染色
在再灌90min，取大鼠心脏，灌流固定。冰冻切6um的切片，行TUNEL染 色。用激光扫描共聚焦(Radiance2100 Bio-Rad UK)， 63倍物镜(Axiovert200 Carl Zeiss Germany)在心脏缺血再灌注区选择5个视野，用图像分析软件 Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)计数TUNEL阳性细胞数， TUNEL阳性细胞数/视野表示。 9心脏毛细血管和心肌细胞的超微结构
另取部分大鼠(每组n-3)，再灌注90分钟后，在结扎线与心尖中间取大约 2國3的新鲜组织用于电镜观察。组织用3%戊二醛前固定，用1%的锇酸后固定。 样本用梯度丙酮脱水后，用环氧树脂812包埋后制成超溥切片。用醋酸铀和柠檬 酸铅染色用透射电镜(JEM-1230; JEOL Ltd., Tokyo, Japan)观察心脏毛细血 管和心肌细胞超微结构。 10. MPO活性的检测
在再灌注180分后，取部分大鼠缺血再灌注区域的心肌组织100 mg，液氮 速冷，移入-80冰箱。取冰冻的心脏均桨后加入各级反应混合物提取MPO，用紫 外分光光度仪在460 nm处检测，用U/g心脏组织表示。11. 大鼠心肌组织中I-k B-a 、 P50、 P65的免疫印迹分析 在再灌注60分钟后，取缺血部位心肌组织200 mg， -80冰箱中保存。用蛋
白提取试剂盒提出全蛋白和核蛋白(Applygen Technologies Inc.)。取样品加等 体积的2X电泳样品缓冲液混合后，经10%SDS-PAGE电泳后(30 mA 2hour RT.)， 电转膜至PVDF膜(90 mA过夜冰浴)。5%脱脂奶粉封闭1 hour， TBS-Tween漂 洗3次X5 min,剪取目的蛋白区域标记NF-kB p65 (用5% BSA-TBS-Tween 1: 1000稀释;SC-109-G, Santa Cruz)、 NF-kB p50 (用5% BSA-TBS-Tween 1: 1000 稀释；SC-109-G, Santa Cruz) 、 Tubulin (用5%脱脂奶粉1:5000稀释；046k4770' sigma) 、 I-kB-ot (用5% BSA-TBS-Tween 1: 1000稀释；PC 142， Calbiochem Inc., Germany) —抗，4 。C孵育过夜，Tbs-Tween冲洗3次X 5 min，用过氧化物酶标 记的二抗孵育，室温lh, Tbs-Tween冲洗3次X20 min。 ECL显色5 min,暗盒 曝光。X光片上的显色条带进行光密度扫描，用图像分析软件(Image-Pro plus 5.0， Media Cybemetrics Inc, USA)测条带的灰度值。以Sham组的I-k B-a与 Tubulin的灰度值比为基础值，计算各组的I- k B- a与Tubulin的比值与基础值 的比。以Sham组的P65或P50的灰度值为基础值，计算各组的P65或P50的灰 度值与基础值比。
12. 外周血粒细胞表面粘附分子表达的测定 各组大鼠在再灌注60分钟之后，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝(枸櫞
酸钠与血液的体积比为1: 9)，抽血后于10ml离心管中迅速混合，取抗凝全血 50ii 1，加入l^g FITC标记的CDllb、 CD18抗体(BD biosciences Pharmingen， USA)，用溶血素破碎红细胞，经PBS洗涤2次后，用流式细胞仪(FACSCalibur， BD， USA)根据前向角/侧向角分选粒细胞，计数5000个粒细胞，测定FITC标记 的抗CDllb和抗CD18抗体的阳性细胞数和平均荧光强度。
13. 统计方法
统计分析采用SPSS 11. 5数理统计软件包，各组数据用One-Way ANOVA进行 统计，当各组比较具有统计学意义时用S-N-K (方差齐)或Tamhane' s T2 (方 差不齐)进行多重比较分析。数据用3f士 SE表示，当P < 0.05时表示差异具有 统计学意义。结果
1. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后大鼠心脏冠状血管细动静脉管径的影响
图1A表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细动脉管径的连续变化。Sham组大鼠在本观察期间内，大鼠心脏冠 状血管细动脉管径没有显著地变化。1/R组大鼠在缺血再灌注早期，心脏冠状血 管细动脉管径有一过性收縮，CPO.l、 CPO. 4和CTO. 8预给药没有显著地抑制再 灌注早期大鼠心脏冠状血管细动脉的一过性收縮收縮。
图lB表示Sham组、1/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细静脉管径的连续变化。I/R组大鼠心脏细静脉管径在本观察期间内 没有显著地变化，CP各预给药组大鼠心脏细静脉管径也没有显著的变化。
2. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后大鼠心脏冠状血管细动静脉红细胞流速的 影响
图2A表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细动脉红细胞流速的连续变化。Sham组大鼠冠状细动脉红细胞流速 在本观察期间内没有显著地变化。1/R组大鼠冠状血管细动脉红细胞流速在再灌 注开始时显著地降低，再灌注30分钟后恢复。CPO. 1和CPO. 4预给药对大鼠冠 状细动脉红细胞流速没有显著的影响。CPO. 8+I/R组从再灌注30开始，大鼠冠 状血管细动脉红细胞流速显著地高于I/R组。
图2B表示Sham组、1/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细静脉红细胞流速的连续变化。Sham组大鼠冠状细静脉红细胞流速 在本观察期间内没有显著地变化。I/R组大鼠冠状血管细静脉红细胞流速在再灌 注开始时就显著地降低，并持续到本观察结束时。CP 0. 1+I/R组和CPO. 1+I/R 组组大鼠没有显著地抑制再灌注引起的大鼠冠状血管细静脉红细胞流速的降低， 而CPO. 8+I/R组大鼠，从再灌注30分开始，显著地抑制了缺血再灌注引起的红 细胞流速的降低，并持继到再灌注60分。
3. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后大鼠心脏冠状血管细静脉血浆白蛋白渗出 的影响
图3A表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组 大鼠在再灌注60分钟时冠状血管细静脉白蛋白的漏出状态。Sham组大鼠仅可以观察到少量的FITC标记白蛋白的血管外漏出(A-1)。 1/R组大鼠可明显观察 到FITC标记白蛋白的血管外漏出(A-2)。 CPO. 1和CPO. 4的预给药组大鼠心脏 冠状血管细静脉FITC标记白蛋白的血管外漏出没有减少(A-3， A-4)， CPO. 8+I/R 组大鼠的FITC标记白蛋白的血管外漏出明显减少(A-5)。
图3B表示在再灌60分钟时Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏冠状血管细静脉内外FITC荧光强度比的比较。Sham 组大鼠心脏细静脉血管外与血管内FITC标记白蛋白漏出的光密度的比为20. 13 ±2. 52。 I/R组大鼠的比值为41. 44±2. 46，显著高于假手术组。CPO. 1+I/R组 和CPO. 4+I/R组大鼠心脏细静脉血管外与血管内FITC标记白蛋白漏出的光密度 的比值分别为37. 42 ±3. 61、 33. 46 ±3. 32没有显著地抑制白蛋白的漏出。 CPO. 8+I/R组大鼠心脏细静脉血管外与血管内FITC标记白蛋白漏出的光度的比 值为31.23±3.75，显著低于缺血再灌注组。
4. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后大鼠心脏血流量的影响
图4表示的是激光多普勒测获得的Sham组、I/R组、CP0. 1+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏血流量的图像。Sham组大鼠心脏血流量在本过程中没 有明显的变化(A)。 I/R组大鼠在再灌注30 min和60 min时血流量明显降低 (B3， B4)。 CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组大鼠心脏血流量在再灌注30 min和60 min时与I/R相比有所恢复(C， D)。 CPO. 8+I/R组大鼠在再灌注30 min和60 min 时心脏血流量明显恢复(E)。
图5的表示Sham组、1/R组、CPO, 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组 大鼠心脏血流量的连续变化。Sham组大鼠心脏血流量在本观察过程中没有明显 变化。I/R组大鼠心脏血流量在缺血和再灌注期间显著地降低，CPO. 1和CPO. 4 的预给药没有显著地抑制缺血再灌注后的大鼠心脏血流量的降低。CPO. 8+I/R组 从再灌注5分到再灌注30分的期间内，显著地抑制了再灌注引起的大鼠心脏血 流量的降低。
5. 复方丹参滴丸对大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面积的影响
图6表示Shara组、I/魄、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再 灌注60分钟时心脏TTC染色图。Sham组大鼠心脏未见梗死区域(A) ， 1/R组大鼠 心脏可见较大的呈白色染色的梗死区域(B) 。 CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组的心肌梗死区域略有减少(C， D) ， CPO. 8+I/R组心肌梗死区域显著地减少(E)。
图7表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再 灌注60分钟时心脏心肌梗死面积和。1/R组大鼠心肌梗死区面积和为31. 43±4. 07 mm'。 CPO. l+I/R组和CPO. 4+I/R组大鼠心肌梗死面积和分别为26. 63±4. 85、 24. 58 ±5.3 mm3,没有显著地减少心肌梗死面积。CPO. 8+I/R组大鼠心肌梗死面积和 为22.55±1.9 mm3,显著地减少了缺血再灌注引起的心肌梗死面积。
6. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的影响
图8A为Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再灌 注90时心脏TUNEL染色的图象。Sham组大鼠偶见TUNEL阳性的心肌细胞(A-1), 1/R组大鼠心脏可以观察到大量的TUNEL阳性的心肌细胞(A-2) , CPO. l+I/R组、 CPO. 4+I/R组、CP0. 8+I/R组的TUNEL阳性心肌细胞均明显地减少(A-3， A_4， A-5)。
图8B表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠心 脏TUNEL阳性心肌细胞结果。Sham组大鼠TUNEL阳性心肌细胞仅为0.36土0. 11个/ 视野，1/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞为14.7土1.17个/视野，显著多于Sham组。 CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CP0. 8+I/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞数量分别为9. 9 ±0.71、 7. 16±1.431和5. 56±1 (个/视野),均显著地低于I/R组。
7. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后大鼠心脏超微结构的影响
图9A表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠 心脏毛细血管的透射电镜观察结果。Sham组大鼠心脏毛细血管内皮完整，可观察 到少量的小泡，没有观察到血管外周的水肿(A-1)。 1/R组大鼠心脏的毛细血管 内皮细胞肿胀，可观察到血管内皮细胞内的大吞饮泡和血管外周水肿(A-2)。 CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组大鼠心脏的毛细血管内皮细胞肿胀减轻，没有观察到 内皮细胞内的大吞饮泡和血管外周水肿减少(A-3, A-4)。 CP0.8+I/R组大鼠心脏 的毛细血管内皮细胞完好，未见内皮细胞肿胀和血管外周水肿(A-5)。
图9B表示Sham组、I/晚、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠 心肌细胞的投射电镜观察结果。Sham组大鼠心脏心肌细胞纤维排列整齐、均匀， 线粒体紧密排列、形状规则、包膜完整、嵴密密集、规则(B-l)。 1/R大鼠心脏 心肌细胞水肿、肌丝溶解、断裂，线粒体肿胀，多处空泡化(B-2)。 CP浓度依存 地改善了心脏心肌细胞的超微结构，纤维排列较整齐，线粒体肿胀减轻，包膜完整，形态规则(B-3, B-4， B-5)。
8. 复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注后大鼠心肌组织MPO含量的影响
图10显示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠 心脏左心室缺血再灌注区域组织MPO的含量。Sham组MPO的值为O. 18±0.016 U/g 心肌组织，1/R组的MP0值上升为0.63士0.034 U/g心肌组织，CPO. l+I/R组、 CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组的MP0值分别为0. 55±0.027， 0. 54±0.026和0.5 ±0.022 (U/g心肌组织)，浓度依存性的抑制了大鼠心脏左心室缺血再灌注区 域心肌组织内MPO的含量。
9. 复方丹参滴丸对缺血再灌注后大鼠心脏组织中I- k B- a的影响
图11A表示再灌注60分钟时，Sham组、1/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏组织中I-k B-a的免疫印迹分析图象。与Sham组相 比，1/R组大鼠心脏组织I-kB-a条带灰度明显减少，CPO. 8 g/kg的预给药抑制 了缺血再灌注引起的大鼠心脏组织I- k B-a条带灰度的减少。
图11B表示了再灌注60分钟时，Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏组织中全蛋白I-k B-a表达的Weatern blot定量分 析的结果。与Sham组相比，1/R组大鼠心脏组织I-KB-a/Tubulin灰度比明显 减少，CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组I- k B-a/Tubulin灰度比减少没有被显著地 抑制。CP0.8 g/kg的预给药抑制了缺血再灌注引起的大鼠心脏组织I-k B-a/Tubulin灰度比的减少。
10. 复方丹参滴丸对缺血再灌注后大鼠心脏组织P50、 P65的影响
图12A表示再灌注60分钟时，Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏组织中NF- k B亚基P50和P65的免疫印迹分析图象。 与Sham组相比，I/R组在再灌注60分钟时核蛋白P50条带灰度明显增高。 CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组的核蛋白P50条带灰度明显减少。然而，I/R组在 再灌注60分钟时，没有检测到核蛋白P65的条带。CP各剂量组在再灌注60分 钟时也没有检测到核蛋白P65的条带。
图12B显示的Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R 组大鼠大鼠心脏细胞核蛋白P50和P65蛋白含量的Western Blotting分析结果。 与Sham组大鼠相比，1/R组在再灌注60分后，大鼠心脏细胞核蛋蛋白P50的灰度显著增加，提示P50蛋白的核转移增加。CPO. 1 g/kg的预给药没有显著地大 鼠心脏细胞核蛋白P50的灰度显著增加，CPO. 4 g/kg和CPO. 8 g/kg的预给药显 著地抑制了缺血再灌注后大鼠心脏组织内P50蛋白的核转移。但是，与Sham组
大鼠相比，1/R组大鼠心脏细胞核蛋白P65没有显著的变化，CP各预给药组的大
鼠心脏细胞核蛋白P65也没有显著的变化。
11.复方丹参滴丸对心肌缺血再灌注损伤诱发粘附分子的影响
图13A表示各组白细胞粘附因子CDllb的变化，假手术组白细胞粘附分子 CDllb平均荧光强度为31. 11±1.23。缺血再灌注组的白细胞粘附分子CDllb平均 荧光强度上升至41.86士2.87，与假手术组比较且具有统计学意义。复方丹参滴 丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg预投入后白细胞粘附因子CDllb的荧光强度值分别 为40.66土2.87， 42. 7±3.9和35.07±1.35。从结果我们可以看出复方丹参滴丸 预投入后CDllb的表达并无明显影响。
图13B表示各组白细胞粘附因子CD18的变化，假手术组白细胞粘附分子CD18 平均荧光强度为49. 1±3. 59。缺血再灌注组的白细胞粘附分子CD18平均荧光强度 上升至68. 93±4. 21，与假手术组比较且具有统计学意义。复方丹参滴丸0. lg/kg, 0. 4g/kg和0. 8g/kg预投入后白细胞粘附因子CD18的荧光强度值分别为74. 38± 4.83, 73.59±4.93和57.99±3.8。从结果我们可以看出复方丹参滴丸O. 8g/kg 可明显抑制缺血再灌注引起的白细胞表面粘附分子CD18的表达。 小结
1. 复方丹参滴丸0. 8 g/kg —次性预给药可以预防缺血再灌注引起的大鼠心 脏微循环障碍，包括抑制大鼠冠状血管细动脉的收縮，血流速度降低，白蛋白漏 出增加，血流量降低和心肌血流量的降低。
2. 复方丹参滴丸0. 8 g/kg —次性预给药可以减少缺血再灌注引起的大鼠心 肌梗死总面积。
3. 复方丹参滴丸0.4 g/kg 、 0.8 g/kg—次性预给药可以减少缺血再灌注 引起的抑制心肌细胞调亡。
4. 复方丹参滴丸.O. 1 g/kg 、 0.4 g/kg 、 0.8 g/kg —次性预给药均可以 抑制缺血再灌注后心脏组织MPO含量增加。
5. 复方丹参滴丸0. 8 g/kg —次性预给药可以抑制缺血再灌注后外周血粒细胞粘附分子CD18的表达。
6.复方丹参滴丸0. 8 g/kg —次性预给药抑制缺血再灌注后心肌组织细胞浆 内的I- k B-a降解和P50核转移增加。
结论
本研究结果提示复方丹参滴丸0.8g/kg —次性预投入可以改善缺血再灌注 大鼠微循环障碍和心肌损伤。该作用可能与其抑制粒细胞粘附分子CD18的表达， 抑制MPO的活化，I-KB-a降解和P50的核转移，抑制心肌细胞调亡相关。 复方丹参滴丸多次预药对缺血再灌注引起的大鼠心脏微循环障碍和心肌损伤的 防护作用。
实验二复方丹参滴丸多次预药对缺血再灌注引起的大鼠心脏微循环障碍和心肌 损伤的防护作用
实验二中实验方法和材料同实验一相同
1. 动物和试剂
雄性SD大鼠，体重250士10g，购买于北京大学医学部动物中心，合格证号 SCXK(京)2006—0001。实验动物的管理按卫生部发布的实验动物管理指南执行， 动物饲养在温度为24士rC，湿度为55±5%的条件下，自由饮食、饮水。
2. 手术过程
大鼠用2(^的乌拉坦(1.25g/kg)肌肉注射麻醉，仰卧位固定，颈部去毛，切 开皮肤，分离颈前肌，暴露气管，行气管插管。插管另端连于小动物呼吸机行加 压呼吸(呼吸比l : 1 ,呼吸频率75次/min ,潮气量12 mL/kg)。用热毯维持肛 温在37 - 37.5'C (YSI REF 401, Yellow Spring, Ohio, USA)度之间。胸部去 毛、消毒，沿胸骨左，右缘2 4肋开胸暴露心脏，剪开心包膜，用穿有3-0缝 合线的3/8弯针穿过肺动脉圆锥与左心耳交界稍下(1 2) ran处，结扎缝合线并 在丝线与心肌组间放一根聚乙烯小管，拉紧丝线形成造成缺血，心肌颜色变白为 结扎成功的标志。30分种后放松丝线即发生再灌注，缺血区域恢复红色为再灌 注成功的标志，假手术组只穿线不结扎。
3. 药物及分组
复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司提供，批号20040502)，常 温下保存。实验选用的SD大鼠，随机分成5组(n=6)。假手术组(Sham):每日灌胃给予生理盐水4 ml/kg，连续6日。 缺血再灌注模型(I/R)组每日灌胃给予生理盐水4 ml/kg，连续6日。 复方丹参滴丸0. 1 g/kg连续6天给药+缺血再灌注组(CPO. l+I/R):每日灌
胃给予复方丹参滴丸O.l g/kg，连续6日。
复方丹参滴丸0. 4 g/kg连续6天给药+缺血再灌注组(CP0.4+I/R):每曰灌
胃给予复方丹参滴丸0.4 g/kg，连续6日。
复方丹参滴丸0. 8 g/kg连续6天给药+缺血再灌注组(CP0.8+I/R):每日灌
胃给予复方丹参滴丸0. 8g/kg，连续6日。
4. 心脏血流量的测定
用连接计算机的激光多普勒血流灌注成像仪(PeriScanPIM3， PERIMED， Sweden) 记录在缺血前，缺血5分、10分、30分以及再灌注5分、10分、30分、60分 时心脏表面血流量。用LDPIwin软件对图像进行测量和评估数据。以缺血再灌注 前的血流量为基础值，计算心脏血流量的变化率。
5. 心肌梗死面积的测定
再灌注60分钟后，取出大鼠心脏(每组^6)，从心尖部开始延平行于房室 间隔的方向切成1 mm厚的5个薄片放入0. 375%的TTC中在37。C下孵育15分钟， 行TTC染色。非梗塞区被染成红色，梗塞区被染成白色，用Digital sight (DS-5M-U1, NIKON, Japan)拍摄图心肌图片，用图像分析软件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)计算出每片心肌的梗死面积与左心室面积 的百分比值，再以五片心脏切片的心肌梗死面积的百分比的平均值来表示总的梗 死面积。
6. 心肌细胞的TUNEL染色
在再灌90min,取大鼠心脏，灌流固定。冰冻切6um的切片，行TUNEL染 色。用激光扫描共聚焦(Radiance2100 Bio-Rad UK)， 63倍物镜(Axiovert200 Carl Zeiss Germany)在心脏缺血再灌注区选择5个视野，用图像分析软件 Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)计数TUNEL阳性细胞数， TUNEL阳性细胞数/视野表示。
7. 外周血粒细胞粘附分子CDllb/CD18的表达
各组大鼠在再灌注60分钟之后，腹主动脉取血，3.挑枸橼酸钠抗凝(枸橼酸钠与血液的体积比为1: 9)，抽血后于10ml离心管中迅速混合，取抗凝全血 50ul，加入l^g FITC标记的CDllb、 CD18抗体(BD biosciences Pharmingen， USA)，用溶血素破碎红细胞，经PBS洗涤2次后，用流式细胞仪(FACSCalibur， BD， USA)根据前向角/侧向角分选粒细胞，计数5000个粒细胞，测定FITC标记 的抗CDllb和抗CD18抗体的阳性细胞数和平均荧光强度。 8.统计方法
统计分析采用SPSS 11.5数理统计软件包，各组数据用One-Way ANOVA进行 统计，当各组比较具有统计学意义时用S-N-K (方差齐)或Tamhane， s T2 (方 差不齐)进行多重比较分析。数据用？士 SE表示，当P 〈 0.05时表示差异具有 统计学意义。
结果
1. 复方丹参滴丸连续给药对心肌缺血再灌注后大鼠心脏血流量的影响
图14表示的是激光多普勒测得的Sham组、I/R组、CP0. l+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏血流量的图像。Sham组大鼠心脏血流量在本过程中没 有明显的变化。1/R组大鼠在再灌注后血流量明显降低。CP0.1+I/R组大鼠心脏 血流量在再灌注30 min和60 min时与I/R相比有所恢复。CPO. 4+I/R组、 CPO. 8+I/R组大鼠在再灌注后心脏血流量明显恢复。
图15的表示Sham组、1/R组、CPO. 1+I/R、 CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠心脏血流量的连续变化。Sham组大鼠心脏血流量在本观察过程中没有明显变 化。I/R组大鼠心脏血流量在缺血和再灌注期间显著地降低，CPO. lg/kg连续给 药没有显著地抑制缺血再灌注后的大鼠心脏血流量的降低。CPO. 4+I/R组在再灌 注5分和再灌注60分可显著抑制再灌注引起的血流量的降低。CPO. 8+I/R组从 再灌注5分到再灌注60分的期间内，均可显著抑制再灌注引起的血流量的降低。
2. 复方丹参滴丸连续给药对大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面积的影响
图16表示Shara组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠 再灌注60分钟时心脏TTC染色图。Sham组大鼠心脏未见梗死区域，1/R组大鼠心脏 可见较大的呈白色染色的梗死区域。CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组和CP0. 8+I/R组 心肌梗死区域显著地减少。
图17表示Sham组、！/R组、CP0.1+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠再灌注60分钟时心脏心肌梗死面积统计分析结果。1/R组大鼠心肌梗死区面积为 15.55±2.14%。 CP0.1+I/R组、CP0.4+I/R组和CP0.8+I/R组大鼠心肌梗死面积分别 为8.32±1.42%、 7.65±1.66%、 7.56±2.57%，显著地减少了缺血再灌注引起的心 肌梗死的面积。
3. 复方丹参滴丸连续给药对心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的影响
图18为Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4十I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再 灌注90时心脏TUNEL染色的图象。Sham组大鼠偶见TUNEL阳性的心肌细胞，1/R组 大鼠心脏可以观察到大量的TUNEL阳性的心肌细胞，CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、 CPO. 8+I/R组的TUNEL阳性心肌细胞均明显地减少。
图19表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠心 脏TUNEL阳性心肌细胞结果。Sham组大鼠TUNEL阳性心肌细胞仅为0.36士0. 11个/ 视野，1/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞为14.7土1. 17个/视野，显著多于Sham组。 CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CP0. 8+I/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞数量分别为7. 1 ±0.54、 7.23±0.66和6.4±0.44 (个/视野),均显著地低于I/R组。
4. 复方丹参滴丸连续给药对心肌缺血再灌注后外周血粒细胞粘附分子表达的影 响
图20A表示各组外周血粒细胞粘附分子CDllb的变化。假手术组外周血粒细 胞粘附分子CDllb平均荧光强度为31. 11土1.23。缺血再灌注组外周血粒细胞粘附 分子CDllbCDllb平均荧光强度上升至41.86土2.87，显著地高于假手术组。复方 丹参滴丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg预投入后对粒细胞粘附因子CDllb的表达的
增加没有显著的抑制作用。
图20B表示各组白细胞粘附因子CD18的变化，假手术组白细胞粘附分子CD18 平均荧光强度为49. 1±3. 59。缺血再灌注组的白细胞粘附分子CD18平均荧光强度 上升至68.93土4.21，显著地高于假手术组。复方丹参滴丸O. lg/kg, 0.4g/kg和 0.8g/kg预投入后白细胞粘附因子CD18的荧光强度值分别为54. 15±2.09, 57.42 ±2. 16和56.73±2.79，显著地抑制了缺血再灌注引起的白细胞表面粘附分子 CD18的表达。 小结
缺血再灌注后大鼠心脏血流量降低，心脏梗死面积、凋亡的心肌细胞数显著地增加，外周血细胞黏附分子CDllb/CD18表达显著地增多。0. lg/kg、 0.4g/kg 和0.8g/kg用量的复方丹参滴丸多次预给药可以剂量依存地抑制缺血再灌注后 的大鼠心脏血流量的降低，心脏梗死面积和凋亡的心肌细胞数，显著地抑制外周 血粒细胞黏附分子CD18的表达。 结论
复方丹参滴丸多次性预给药可以剂量依存地预防缺血再灌注引起的大鼠心 脏血流量的降低，抑制心肌细胞的损伤。
图1A表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细动脉管径的连续变化。Sham组大鼠在本观察期间内，大鼠心脏冠 状血管细动脉管径没有显著地变化。1/R组大鼠在缺血再灌注早期，心脏冠状血 管细动脉管径有一过性收縮，CPO. 1、 CP0.4和CPO. 8预给药没有显著地抑制再
灌注早期大鼠心脏冠状血管细动脉的一过性收縮收縮。
图IB表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细静脉管径的连续变化。I/R组大鼠心脏细静脉管径在本观察期间内 没有显著地变化，CP各预给药组大鼠心脏细静脉管径也没有显著的变化。
图2A表示Sham组、1/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细动脉红细胞流速的连续变化。Sham组大鼠冠状细动脉红细胞流速 在本观察期间内没有显著地变化。I/R组大鼠冠状血管细动脉红细胞流速在再灌 注开始时显著地降低，再灌注30分钟后恢复。CPO. 1和CPO. 4预给药对大鼠冠 状细动脉红细胞流速没有显著的影响。CPO. 8+I/R组从再灌注30开始，大鼠冠 状血管细动脉红细胞流速显著地高于I/R组。
图2B表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠冠状血管细静脉红细胞流速的连续变化。Sham组大鼠冠状细静脉红细胞流速 在本观察期间内没有显著地变化。I/R组大鼠冠状血管细静脉红细胞流速在再灌 注开始时就显著地降低，并持续到本观察结束时。CP 0. 1+I/R组和CPO. 1+I/R 组组大鼠没有显著地抑制再灌注引起的大鼠冠状血管细静脉红细胞流速的降低， 而CPO. 8+I/R组大鼠，从再灌注30分开始，显著地抑制了缺血再灌注引起的红 细胞流速的降低，并持继到再灌注60分。
图3A表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠在再灌注60分钟时冠状血管细静脉白蛋白的漏出状态。Sham组大鼠仅可
以观察到少量的FITC标记白蛋白的血管外漏出(A-1)。 1/R组大鼠可明显
观察到FITC标记白蛋白的血管外漏出(A-2)。 CPO. 1和CPO. 4的预给药组大鼠
心脏冠状血管细静脉FITC标记白蛋白的血管外漏出没有减少(A-3， A-4)，
CP0.8+I/R组大鼠的FITC标记白蛋白的血管外漏出明显减少(A-5)。
图3B表示在再灌60分钟时Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R
组、CP0.8+I/R组大鼠心脏冠状血管细静脉内外FITC荧光强度比的比较。Sham
组大鼠心脏细静脉血管外与血管内FITC标记白蛋白漏出的光密度的比为20. 13
±2. 52。 I/R组大鼠的比值为41. 44±2. 46，显著高于假手术组。CPO. 1+I/R
组和CPO. 4+I/R组大鼠心脏细静脉血管外与血管内FITC标记白蛋白漏出的光密
度的比值分别为37.42±3.61、 33.46±3.32没有显著地抑制白蛋白的漏出。
CP0.8+I/R组大鼠心脏细静脉血管外与血管内FITC标记白蛋白漏出的光度的比
值为31.23土3.75,显著低于缺血再灌注组。
图4表示的是激光多普勒测获得的Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R
组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏血流量的图像。Sham组大鼠心脏血流量在本过程中没
有明显的变化(A) 。
I/R组大鼠在再灌注30 min和60 min时血流量明显降低
(B3， B4)。 CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组大鼠心脏血流量在再灌注30 min和60
min时与1/R相比有所恢复(C， D)。 CPO. 8+I/R组大鼠在再灌注30 min和60 min
时心脏血流量明显恢复(E)。
图5的表示Sham组、I/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组
大鼠心脏血流量的连续变化。Sham组大鼠心脏血流量在本观察过程中没有明显
变化。1/R组大鼠心脏血流量在缺血和再灌注期间显著地降低，CPO. l和CPO. 4
的预给药没有显著地抑制缺血再灌注后的大鼠心脏血流量的降低。CPO. 8+I/R组
从再灌注5分到再灌注30分的期间内，显著地抑制了再灌注引起的大鼠心脏血
流量的降低。
图6表示Sham组、1/R组、CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠再灌注60分钟时心脏TTC染色图。Sham组大鼠心脏未见梗死区域(A) ， I/R 组大鼠心脏可见较大的呈白色染色的梗死区域(B) 。 CPO. 1+I/R组、CPO. 4+I/R 组的心
肌梗死区域略有减少(C， D) ， CPO. 8+I/R组心肌梗死区域显著地减少(E)。图7表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再 灌注60分钟时心脏心肌梗死面积和。1/R组大鼠心肌梗死区面积和为31. 43±4. 07 國'。CPO. l+I/R组和CPO. 4+I/R组大鼠心肌梗死面积和分别为26. 63±4. 85、 24. 58 ±5.3 mm3，没有显著地减少心肌梗死面积。CPO. 8+I/R组大鼠心肌梗死面积和 为22.55±1.9 ram3，显著地减少了缺血再灌注引起的心肌梗死面积。
图8A为Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再灌 注90时心脏TUNEL染色的图象。Sham组大鼠偶见TUNEL阳性的心肌细胞(A-1), 1/R组大鼠心脏可以观察到大量的TUNEL阳性的心肌细胞(A-2) ， CPO. l+I/R组、 CPO. 4+I/R组、CP0. 8+I/R组的TUNEL阳性心肌细胞均明显地减少(A-3， A-4， A-5)。
图8B表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠心 脏TUNEL阳性心肌细胞结果。Sham组大鼠TUNEL阳性心肌细胞仅为0.36土0. 11个/ 视野，1/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞为14.7土1.17个/视野，显著多于Sham组。 CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CP0. 8+I/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞数量分别为9. 9 ±0.71、 7. 16±1.431和5.56±1 (个/视野)，均显著地低于I/R组。
图9A表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠 心脏毛细血管的透射电镜观察结果。Sham组大鼠心脏毛细血管内皮完整，可观察 到少量的小泡，没有观察到血管外周的水肿(A-1)。 1/R组大鼠心脏的毛细血管 内皮细胞肿胀，可观察到血管内皮细胞内的大吞饮泡和血管外周水肿(A-2)。 CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组大鼠心脏的毛细血管内皮细胞肿胀减轻，没有观察到 内皮细胞内的大吞饮泡和血管外周水肿减少(A-3, A-4)。 CP0.8+I/R组大鼠心脏 的毛细血管内皮细胞完好，未见内皮细胞肿胀和血管外周水肿(A-5)。
图9B表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠 心肌细胞的投射电镜观察结果。Sham组大鼠心脏心肌细胞纤维排列整齐、均匀， 线粒体紧密排列、形状规则、包膜完整、嵴密密集、规则(B-1)。 1/R大鼠心脏 心肌细胞水肿、肌丝溶解、断裂，线粒体肿胀，多处空泡化(B-2)。 CP浓度依存 地改善了心脏心肌细胞的超微结构，纤维排列较整齐，线粒体肿胀减轻，包膜完 整，形态规则(B-3, B-4, B-5)。
图IO显示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠 心脏左心室缺血再灌注区域组织MPO的含量。Sham组MPO的值为O. 18±0.016 U/g心肌组织，1/R组的MPO值上升为0. 63±0.034 U/g心肌组织，CPO. l+I/R组、 CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组的MP0值分别为0. 55±0.027, 0. 54±0.026和0. 5 ±0.022 (U/g心肌组织)，浓度依存性的抑制了大鼠心脏左心室缺血再灌注区 域心肌组织内MPO的含量。
图11A表示再灌注60分钟时，Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏组织中I-k B-a的免疫印迹分析图象。与Sham组相 比，1/R组大鼠心脏组织I-kB-a条带灰度明显减少，CPO. 8 g/kg的预给药抑制 了缺血再灌注引起的大鼠心脏组织I- k B-a条带灰度的减少。
图11B表示了再灌注60分钟时，Sham组、I/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏组织中全蛋白I-k B-a表达的Weatern blot定量分 析的结果。与Sham组相比，I/R组大鼠心脏组织I- k B-a/Tubulin灰度比明显 减少，CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组I- k B-a/Tubulin灰度比减少没有被显著地 抑制。CP0.8 g/kg的预给药抑制了缺血再灌注引起的大鼠心脏组织I-k B-a/Tubulin灰度比的减少。
图12A表示再灌注60分钟时，Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏组织中NF- k B亚基P50和P65的免疫印迹分析图象。 与Sham组相比，I/R组在再灌注60分钟时核蛋白P50条带灰度明显增高。 CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组的核蛋白P50条带灰度明显减少。然而，I/R组在 再灌注60分钟时，没有检测到核蛋白P65的条带。CP各剂量组在再灌注60分 钟时也没有检测到核蛋白P65的条带。
图12B显示的Sham组、I/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R 组大鼠大鼠心脏细胞核蛋白P50和P65蛋白含量的Western Blotting分析结果。 与Sham组大鼠相比，1/R组在再灌注60分后，大鼠心脏细胞核蛋蛋白P50的灰 度显著增加，提示P50蛋白的核转移增加。CPO. 1 g/kg的预给药没有显著地大 鼠心脏细胞核蛋白P50的灰度显著增加，CPO. 4 g/kg和CPO. 8 g/kg的预给药显 著地抑制了缺血再灌注后大鼠心脏组织内P50蛋白的核转移。但是，与Sham组 大鼠相比，1/R组大鼠心脏细胞核蛋白P65没有显著的变化，CP各预给药组的大 鼠心脏细胞核蛋白P65也没有显著的变化。
图13A表示各组白细胞粘附因子CDllb的变化，假手术组白细胞粘附分子CDllb平均荧光强度为3L 11±1.23。缺血再灌注组的白细胞粘附分子CDllb平均 荧光强度上升至41.86土2.87，与假手术组比较且具有统计学意义。复方丹参滴 丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg预投入后白细胞粘附因子CDllb的荧光强度值分别 为40.66土2.87, 42.7±3.9和35.07±1.35。从结果我们可以看出复方丹参滴丸 预投入后CDllb的表达并无明显影响。
图13B表示各组白细胞粘附因子CD18的变化，假手术组白细胞粘附分子CD18 平均荧光强度为49.1±3. 59。缺血再灌注组的白细胞粘附分子CD18平均荧光强度 上升至68. 93±4. 21，与假手术组比较且具有统计学意义。复方丹参滴丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg预投入后白细胞粘附因子CD18的荧光强度值分别为74. 38± 4.83, 73. 59±4.93和57.99±3.8。从结果我们可以看出复方丹参滴丸O. 8g/kg 可明显抑制缺血再灌注引起的白细胞表面粘附分子CD18的表达。
图14表示的是激光多普勒测得的Sham组、I/R组、CP0. l+I/R组、CPO. 4+I/R 组、CPO. 8+I/R组大鼠心脏血流量的图像。Sham组大鼠心脏血流量在本过程中没 有明显的变化。1/R组大鼠在再灌注后血流量明显降低。CPO. l+I/R组大鼠心脏 血流量在再灌注30 min和60 min时与I/R相比有所恢复。CPO. 4+I/R组、 CPO. 8+I/R组大鼠在再灌注后心脏血流量明显恢复。
图15的表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R、 CP0.4+I/R组、CPO. 8+I/R组大 鼠心脏血流量的连续变化。Sham组大鼠心脏血流量在本观察过程中没有明显变 化。I/R组大鼠心脏血流量在缺血和再灌注期间显著地降低，CPO. lg/kg连续给 药没有显著地抑制缺血再灌注后的大鼠心脏血流量的降低。CPO. 4+I/R组在再灌 注5分和再灌注60分可显著抑制再灌注引起的血流量的降低。CPO. 8+I/R组从 再灌注5分到再灌注60分的期间内，均可显著抑制再灌注引起的血流量的降低。
图16表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠 再灌注60分钟时心脏TTC染色图。Sham组大鼠心脏未见梗死区域，1/R组大鼠心脏 可见较大的呈白色染色的梗死区域。CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组和CP0. 8+I/R组 心肌梗死区域显著地减少。
图17表示Sham组、1/R组、CP0.1+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0.8+I/R组大鼠再 灌注60分钟时心脏心肌梗死面积统计分析结果。ITR组大鼠心肌梗死区面积为 15.55±2.14%。 CP0.1+I/R组、CP0.4+I/R组和CP0.8+I/R组大鼠心肌梗死面积分别为8.32±1.42%、 7.65±1.66%、 7.56±2.57%，显著地减少了缺血再灌注引起的心 肌梗死的面积。
图18为Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4十I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠再 灌注90时心脏TUNEL染色的图象。Sham组大鼠偶见TUNEL阳性的心肌细胞，1/R组 大鼠心脏可以观察到大量的TUNEL阳性的心肌细胞，CP0.1+I/R组、CP0.4+I/R组、 CPO. 8+I/R组的TUNEL阳性心肌细胞均明显地减少。
图19表示Sham组、1/R组、CPO. l+I/R组、CPO. 4+I/R组、CPO. 8+I/R组大鼠心 脏TUNEL阳性心肌细胞结果。Sham组大鼠TUNEL阳性心肌细胞仅为0.36土0. 11个/ 视野，1/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞为14.7士1.17个/视野，显著多于Sham组。 CPO. l+I/R组、CP0.4+I/R组、CP0. 8+I/R组大鼠TUNEL阳性心肌细胞数量分别为7. 1 ±0.54、 7.23±0.66和6.4±0.44 (个/视野)，均显著地低于I/R组。
图20A表示各组外周血粒细胞粘附分子CDllb的变化。假手术组外周血粒细 胞粘附分子CD1 lb平均荧光强度为3L 11 ± 1. 23。缺血再灌注组外周血粒细胞粘附 分子CDllbCDllb平均荧光强度上升至41.86土2.87,显著地高于假手术组。复方 丹参滴丸O. lg/kg， 0. 4g/kg和0. 8g/kg预投入后对粒细胞粘附因子CDllb的表达的 增加没有显著的抑制作用。
图20B表示各组白细胞粘附因子CD18的变化，假手术组白细胞粘附分子CD18 平均荧光强度为49. 1±3. 59。缺血再灌注组的白细胞粘附分子CD18平均荧光强度 上升至68.93土4.21，显著地高于假手术组。复方丹参滴丸O. lg/kg， 0.4g/kg和 0. 8g/kg预投入后白细胞粘附因子CD18的荧光强度值分别为54. 15±2. 09， 57. 42 ±2. 16和56. 73±2. 79，显著地抑制了缺血再灌注引起的白细胞表面粘附分子 CD18的表达。
具体实施方式
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以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 实施例1
本发明的滴丸是如下方法制成的丹参提取物4-60重量份，三七提取物2-18 重量份，冰片卜10重量份，按处方量将丹参提取物，三七提取物和冰片细粉混合 均匀待用，丹参提取物4-60重量份，三七提取物2-18重量份，冰片1-10重量份， 按处方量将丹参提取物，三七提取物和冰片细粉混合均匀待用，按处方量，将丹参提取物，三七提取物和冰片粉碎，混合均匀待用；按药粉基质l : 1-2将基质
PEG6000或PEG400熔融后，加入药物混合均匀，60-9(TC保温，以20-70滴/分钟加 入甲基硅油中，收集滴丸即得。本发明制剂工艺先进、质量稳定可控、疗效确切。 实施例2
本发明的复方丹参滴丸的制备工艺步骤为(l)将丹参和三七混合或单独制 成水提液或醇提液；(2)对所述的提取液进行初步澄清处理；(3)进一步对所述的 提取液进行超滤处理；(4)将超滤液浓縮，加入冰片，制成滴丸。
权利要求
1、复方丹参滴丸在制备治疗和/或预防心脏微循环障碍和心肌损伤的药物中的应用。
2、 权利要求i的应用，其特征在于，所述复方丹参滴丸主要成份是丹参、三七 和冰片组成的中药复方制剂。
3、 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是复方丹参滴丸一次性预投入可 以改善缺血再灌注微循环障碍和心肌损伤。
4、 权利要求1的应用，其特征在于，所述应用是复方丹参滴丸多次预药对缺血 再灌注引起的心脏微循环障碍和心肌损伤的防护作用。
5、 权利要求3的应用，其特征在于，所述应用是预防缺血再灌注引起的心脏微 循环障碍，包括抑制冠状血管细动脉的收縮，血流速度降低，白蛋白漏出增 力口，血流量降低和心肌血流量的降低。
6、 权利要求3的应用，其特征在于，所述应用是改善缺血再灌注微循环障碍和 心肌损伤，该作用与其抑制粒细胞粘附分子CD18的表达，抑制MP0的活化， 卜k13-a降解和P50的核转移，抑制心肌细胞调亡相关。
7、 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是复方丹参滴丸多次性预给药可 以剂量依存地预防缺血再灌注引起的心脏血流量的降低，抑制心肌细胞的损 伤。
8、 权利要求4的应用，其特征在于，所述多次预给药是0. lg/kg、 0.4g/kg和 ().8g/kg用量的复方丹参滴丸多次预给药可以剂量依存地抑制缺血再灌注后 心脏血流量的降低。
9、 权利要求4的应用，其特征在于，所述多次预给药是0. lg/kg、 0.4g/kg和 0. 8g/kg用量的复方丹参滴丸多次预给药可以剂量依存地抑制心脏梗死面积 和凋亡的心肌细胞数。
10、 权利要求4的应用，其特征在于，所述多次预给药是0. 1g/kg、 (). 4g/kg 和().8g/kg用量的复方丹参滴丸多次预给药可以剂量依存地抑制外周血粒细 胞黏附分子CD18的表达。
全文摘要
本发明涉及中药产品的新用途，特别涉及复方丹参滴丸在治疗和/或预防心脏微循环障碍和心肌损伤中的应用，本发明的实验表明，复方丹参滴丸一次性预投入可以改善缺血再灌注微循环障碍和心肌损伤，复方丹参滴丸多次预给药对缺血再灌注引起的心脏微循环障碍和心肌损伤的防护作用。
文档编号A61K31/045GK101530467SQ20081005243
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者连 刘, 刘育英, 卫晓红, 凯 孙, 昕 常, 响 李, 李志新, 芳 王, 胡白和, 娜 赵, 赵新荣, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司