新的高异黄酮类化合物及其用途的制作方法

专利名称：新的高异黄酮类化合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的高异黄酮类化合物及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术：
玉竹为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)植物玉竹(尸o(ygo""&wo&W訓(Mill.)Druce)干燥根茎，为常用中药。最早以葳蕤之名始载于《神农本草经》，列为上品。
玉竹味甘性平，微寒，无毒，归肺、胃经，能养阴润肺，益胃生津，用于燥热、伤阴、热伤和胃阴之症，有提高免疫力、强心、降血糖、降血脂等功效。主要含有多糖、皂苷、甾醇、黄酮类等成分。
高异黄酮类化合物(homoisoflavonoids)是黄酮化合物中特殊的一类，母体结
构比异黄酮多一个碳原子。这类化合物在植物中较少见，主要分布于百合科沿阶草属Ophiopogon、绵枣儿属Scilla、波罗兰属Eucomis和蓝壶花属Muscari等植物中。在豆科云实属植物金凤花Ga^a/^w'a/w/c/z^T/waN苏木C. rap/ ""、鹰叶剌C. 6owfece//a等植物中也有少量发现。

发明内容
发明人从玉竹中分离得到三个新结构的高异黄酮类化合物I、 II、 III，并具有很高的抗肿瘤活性。
具体地，本发明涉及
(1)下式化合物及其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药
<formula>formula see original document page 3</formula>其中，K^为-OCH3或-CH3， R2为H或-CH3， R3为H或-OH， R4为-OH或醫OCH3。
(2)下式(1)、 (II)或(III)的化合物及其可药用盐、溶剂化物、立
体异构体或前药<image>image see original document page 4</image>
(3) —种药物组合物，其含有项(1)或(2)的任一化合物作为活性成份和可药用载体。
(4) 项(1)或(2)任一化合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
(5) 根据项(4)的用途，其中所述的肿瘤为白血病、结肠癌、肺癌、肉瘤或肝癌。
本发明利用上述化合物I、 II、 III及其溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药作为活性成分，单独或组合使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的用于肿瘤治疗的药物。
本发明涉及的具有上述用途的化合物不仅是化合物本身，适当时也可以是其药学上可接受的盐(酸或碱加成盐)或其溶剂化物(例如水合物、醇合物等)、立体异构体、互变异构体及前药，下文中为简便起见，都简称为本发明的化合物。
上述药学可接受的加成盐包括化合物能够形成的治疗活性的非毒性酸和碱加成盐形式。碱性的化合物通过用适当的酸处理碱的形式可转化成它们的药学可接受的酸加成盐。酸的例子包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、
硫酸、磷酸；有机酸，诸如乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、乙醇酸、马来酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸、苯甲酸、抗坏血酸等。碱加成盐形式的例子是钠、钾、钙盐，以及与药学可接受的胺形成的盐，所述的胺是诸如氨、烷基胺、苯胺和氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸。
在治疗肿瘤中，用本发明的化合物，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物。如注射剂，散剂，丸剂，胶囊剂，片剂，微囊剂，软胶囊剂，膜剂，栓剂，膏剂，酊剂，冲剂，气雾剂等各种制剂。
给药方式以及有效剂量的选择将尤其根据所治疗的疾病而异。给^方式和剂量的选择在本领域技术人员的能力范围内。
本发明化合物的单位剂型通常将含有0.1至99重量％活性物质，更通常为5至75重量％活性物质。举例来说，单位剂型可以含有lmg至lg化合物，更通常为10mg至500mg，例如在50mg与400mg之间，剂量通常为100mg至200mg。
每个剂量单位或每次口服给药优选地含有1至250mg(关于肠胃外给药，优选地含有0.1至25mg)的项1化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的化合物将按照有效提供所需治疗效果的量给药。提供所需治疗效果所必要的浓度将尤其根据疾病的明确性质、患者的年龄、体重和疾病的严重性而异。
给药剂量优选地将对患者是无毒的，不过在某些情况下所治疗疾病的严重性可能迫使给以导致一些毒性迹象的量的化合物。
通常，本发明化合物的给药量将在0.01mg/kg至100mg/kg体重的范围内，
更优选为0.1mg/kg至10mg/kg体重，特别是lmg/kg至5mg/kg体重。
药学上可接受的本发明化合物正常地将按照每日剂量方案对受治疗者给药。关于成年患者，例如可以是项l化合物或其药学上可接受的盐的口服剂
量在lmg与500mg之间，优选在lmg与250mg之间，或者静脉内、皮下或肌内剂量在O.lmg与100mg之间，优选在0.1mg与25mg之间，按照游离化合物计算，化合物每天分1至4次给药。因而，关于体重70kg的普通人，本发明化合物的典型每日剂量将在70mg至700mg的范围内。这样一种剂量例如可以每日分二至四次给药。
不过，给药剂量的大小和给药的频率最终将由治疗该患者的医师来决定和判断。
本发明的药理实验结果表明，本发明的化合物具有显著抑制人白血病细胞K562，人肺癌细胞A549，人结肠癌HCT-15等肿瘤细胞生长的活性，促进肿瘤细胞凋亡，提示可以用于肿瘤治疗。体内实验研究结果进一步证实了本发明化合物的抗肿瘤活性。


图1为化合物I的'H-NMR图谱
图2为化合物I的13C-NMR图谱
图3为化合物I的ESI-MS图谱
图4为化合物I的HMBC图谱
图5为化合物I的HMQC图谱
图6为化合物I的H-HCOSY图谱
图7为化合物II的1H-NMR图谱
图8为化合物II的13C-NMR图谱
图9为化合物II的ESI-MS图谱
图10为化合物II的HMBC图谱图11为化合物II的HMQC图谱图12为化合物II的H-HCOSY图谱图13为化合物III的"H-NMR图谱图14为化合物III的13C-NMR图谱图15为化合物III的ESI-MS图谱图16为化合物III的HMBC图谱图17为化合物III的HMQC图谱图18为化合物I、 II、 III的分离流程图
化合物I为淡黄色针状结晶(甲醇-水)，分子量346，分子式为C18H1807。!H-NMR(CD30D， 500MHz)& 6.82 (1H， d， J =8.5Hz， H-6')， 6,20(1H， d, J =2.5Hz，H曙3')， 6.17 (lH，dd， J=2.5, 8.5Hz,H-5')， 4.22 (1H， dd, J =4.0， 11.4Hz， H-2)， 4.10
(1H， dd， J =7.0， 11.4Hz， H-2)， 3.66 (3H， s, 6-OCH3)， 3.08 (1H， dd, J =5.0, 13.5Hz，H-9)， 2.88 (IH， m,H-3)， 2.52 (1H， dd， J =10.0， 13.5Hz， H-9)， l.卯(3H， s，8-CH3)。碳谱数据见表1。该化合物结构为[5， 7-dihydroxy-6methoxyl-8-methyl-3-(2'， 4'—dihydrox—ybenzyl)chroman-4國onG]。
化合物II为淡黄色针状结晶(甲醇-水)，分子量316，分子式为C17H1606。!H-NMR(CD30D， 500MHz)& 6.80(1H， d, J =8.5Hz， H-6')， 6.24(1H, d， J =2.5Hz，H-3')， 6.17 (lH，dd，J=2.5, 8.5Hz，H-5')， 4.14 (1H， dd， J =4.0， 11.4Hz， H-2)， 4.01
UH，dd， J=7.0， 11.4Hz，H-2)， 3.08 (1H, dd, J =5.0, 13.5Hz， H-9)， 2.88 (IH，m,H-3)， 2.52 (1H, dd, J =10,0, 13.5Hz， H-9)， 1.87 ( 3H， s, 6-CH3)。碳谱数据见表1。该化合物结构为[5， 7-dihydroxy-6-methyl-3-(2'， 4'-dihydroxybenzyl)-chrom-an-4-one]。
化合物III为淡黄色针状结晶(甲醇-水)，分子量344，分子式为C19H2()06。'H-NMR (CD3OD， 500MHz) & 7.08 (2H， d, J =8.5Hz， H-2'，6')， 6.79 (2H，d，J=8.0Hz，H-3',5') ，4.20 (1H, dd， J =4.5， 11.5Hz, H-2)， 4.03 (1H, dd, J =7.5， 11.5Hz,H-2)， 3.69 GH,s, 6-OCH3)， 3.07 (1H， dd， J =4.5， 14.0Hz， H-9)， 2.75 (lH，m，H-3)， 2.52 (lH，dd， J =10.5， 14.0Hz， H-9)， 1.90 (3H, s， 8-CH3)。碳谱数据见表1 。该合物结构为[5, 7-dihydroxy-6醫methoxyl-8-methyl画3-(4'-methoxybenzyl)
chroman-4-one]。
表1化合物I-III的碳谱数据13C-NMR (CD30D， 125MHz)
PositionCompound ICompound IICompound III
270.970.670.3
346.646,548.0
4200.4200.2199.4
4a102.4102.6102.3
158.9165.9159.0
6129.0105.1129.0
7158.5162.8158.6
8105.194.8105.2
83153.1162.3152.9
928.828.333.0
116.8116.9131.3
2,157.6157.5131,1
3,103.5103.5115.0
4,158.3158.3159.9
5,107.5107.4115.0
6,132.6132.6131.1
61.5-61.5
6-￡H3-6.9-
8-￡H37.2—7.2
4'- 0￡H3--55.6
8表2化合物I-III的HMBC数据
HCompound ICompound IICompound III
2-HC隱9,C-3， C-4,C-8aC-9,C-3，C-4 , C-8aC-9， C陽3,C-4 , C-8a
6-OCH3C國6-C-6
6-CH3-C陽5 :,C-7 ,C-8 ， C-6-
8-CH3C-8， C-7,C-4a， C-6 C-8a-C-8, C-7,C-5， C國6 C-8a
8-H-C-7，C隱8 ， C隱6， C-4-
3'-HC-l'， C-5', C-4'C-l',C-5', C-4'-
5'-Hc-r， c-3'c-i'，C-3', C-4'-
6'-HC-4', C-9C-4'，C-3'一
2', 6'國H--C-3'， C隱4', C-5'
3'， 5'-H--C誦2'， C-4', C-6'
具体实施例方式
下述实施例及实验例用于证实本发明化合物的制备工艺及用途，不应理解成对本发明的限制。除非特别说明，本发明中所有百分比均为体积百分比。
中药玉竹(中国药典)石家庄乐仁堂药店waters996型高效液相色谱仪
HPLC制备色谱柱(VenusilXBPC-18， lOpm ， 10mmx250mm)INVOA500型核磁共振波谱仪Volian公司，TMS为内标ZMD Micromass型质谱仪英国Micromass公司柱层析硅胶青岛海洋化工厂Sephadex LH-20 :安玛西亚公司
薄层层析用硅胶板及色谱纯乙腈默克公司
C02恒温细胞培养箱美国SHELLAN公司PMI1640培养液GIBCO公司MTT: Sigma公司人白血病细胞K562:美国菌种保藏中心人肺癌细胞A549:美国菌种保藏中心
人结肠癌细胞HCT-15:美国菌种保藏中心
Victor 2 1420多标计数仪美国PE公司实施例l:化合物的制备
玉竹药材50Kg粉碎后，用95%乙醇(乙醇/水，以下同)回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓縮得浸膏4.2Kg，浸膏用4倍体积甲醇溶解，过滤，残渣弃去，甲醇溶解部分用等体积石油醚萃取2次，得到石油醚层部分和甲醇层部分。对甲醇层部分进一步分离纯化，得到化合物I、 II、 III。具体的分离流程见附图18。实施例2 MTT法体外抑瘤实验
实验材料K562， A549， HCT-15
采用常规MTT法。收集处于对数生长期的上述各肿瘤细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，然后用10%的RPM1640培养液调整细胞浓度为1.0xl05/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100nl，分别加入不同浓度的化合物l-3，阴性对照药为磷酸盐缓冲液，阳性对照药为顺铂。每组均设3个复孔。置于37'C， 5%C02培养箱中培养72h，于培养结束前4h，各培养孔加入10ulMTT (5mg/ml)，培养结束后，吸去培养上清，每孔加入10%的SDS 100ul，震荡10min，使结晶物充分溶解，放置过夜，最后用酶标仪于490nm波长处测定各孔OD值，进行细胞增殖分析，统计数据并进行/检验。
实验结果显示，化合物I-III对K562、 A549和HCT-15细胞生长有明显的抑制作用。化合物I-III对肿瘤细胞的IC5。值见下表
表l化合物I-III对肿瘤细胞的IC5c值(ICso: ug/ml)
化合物K562A549HCT-15
I12.532.719.1
II10.029.815.6
III13.235.321.4
顺铂2.485.022.37实施例3 S180肉瘤小鼠体内抑瘤实验
实验材料:小鼠S180，河北医科大学。清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，购自河北省实验动物中心。顺铂，山东省德州制药厂生产。
实验方法采用昆明种小鼠皮下接种S-180肉瘤模型。瘤种体外培养至对数生长期，记数，调节细胞数为6xl(^个/ml，接种于小鼠右前肢腋下，每只0.21111，随机分成5组，每组动物10只，同时记录每组小鼠体重。设生理盐水组和顺铂阳性对照组，三个化合物设5.0mg/Kg剂量组，于接种后次日连续腹腔注射给药8天，第9天脱颈椎处死动物，记录小鼠体重，解剖取出瘤块，称重，根据下式计算抑瘤率。
生理盐水组平均瘤重一给药组平均瘤重
抑瘤率(％) = - X100%
生理盐水组平均瘤重
实验结果本发明化合物对S180小鼠肉瘤的生长具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为35.9%， 40.3%， 34.2%，而对小鼠体重无明显影响(见表2)。
表2化合物l-3对昆明种S180肉瘤小鼠的抑瘤率
组别齐U量(mg/kg)用药前体重(g)用药后体重(g)激
生理盐水—19.9±1.221.0±0.7—
顺钼2.020.7±1.417.9±0.650.4
化合物I5.021.7±0.722.3±1.635.9
化合物II5.020.8±1.321.8±1.040.3
化合物III5.021.3±1.020.7±1.434.2
实施例4肝癌小鼠体内抑瘤实验
实验材料BALb/c纯系小鼠，雄性8-12周龄，体重20-22g，购自河北医科大学实验动物中心。H-22肝癌小鼠，购自河北医科大学实验动物中心。顺铂，山东省德州制药厂生产。
实验方法无菌抽取荷H-22肝癌小鼠第7天腹水，用生理盐水稀释10倍，于受试小鼠右前肢腋窝皮下注射0.21111。随机分成5组，每组动物10只，同时记录每组小鼠体重。设生理盐水组和顺铂阳性对照组，化合物l、 2、 3给药剂量均为5.0mg/Kg，于接种后次日连续腹腔注射给药8天，第9天脱颈椎处死动物，记录小鼠式计算抑瘤率。
生理盐水组平均瘤重 一 给药组平均瘤重
抑瘤率(％) = - xioo%
生理盐水组平均瘤重
实验结果化合物I、 II、 m对H-22肝癌小鼠的肿瘤生长具有一定的抑制作用，在5.0mg/kg的剂量时抑瘤率分别达到41.2。/。、 46.9%和37.8%，而对小鼠的体重无明显影响，见表3。
表3本发明化合物对H-22肝癌小鼠(BALb/c小鼠)的抑瘤率
组别剂量(mg/kg)用药前体重(g)用药后体重(g)抑瘤率(％)
生理盐水—20.7±1.221.9±1.3—
顺钼2.021.7±1.717.2±1.680.4
化合物15.020.7±1.421.3±0.941.2
化合物25.021.9±0.722.1±1.246.9
化合物35.020.9±0.922.0±1.537.8
权利要求
1.下式化合物及其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药其中，R1为-OCH3或-CH3，R2为H或-CH3，R3为H或-OH，R4为-OH或-OCH3。
2.下式(1)、 (II)或(III)的化合物及其可药用盐、溶剂化物、立体异构 体或前药CH3,0、 HO、H3CO'OH O,0\ HO、OHCH3O(II);,OCH3H3CO,OH O(III),
3. —种药物组合物，其含有权利要求1或2的任一化合物作为活性成份和可药 用载体。
4. 权利要求1或2的任一化合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
5. 根据权利要求4的用途，所述的肿瘤为白血病、肺癌、结肠癌、肉瘤或肝癌。
全文摘要
本发明提供了一类如下式所述的高异黄酮类化合物，其中，R¹为-OCH₃或-CH₃，R²为H或-CH₃，R³为H或-OH，R⁴为-OH或-OCH₃，以及含有上述化合物或其可药用盐的药物组合物。本发明的化合物对于肿瘤，特别是白血病、结肠癌、肺癌、肉瘤或肝癌具有明显的抑制作用。
文档编号A61K36/88GK101591315SQ20081005518
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者任风芝, 华 张, 张艳哲, 张艳立, 张雪霞, 朱京童, 李丽红, 宁 王, 范玉玲, 贺建功, 郑智慧, 陈书红, 高月麒 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司