专利名称：复合胶原止血材料的制备方法
技术领域：
本发明是将胶原进行修饰，及修饰后胶原再与中草药制成复合材料，縮 短复合材料的止血时间，适用医用生物材料领域的止血材料范畴。
技术背景出血给外科手术和人类生活带来的诸多风险和危害，寻求理想有效的止 血剂一直是国内外研究的热点。继阿富汗、伊拉克战争及反恐怖主义在世界范围内展开之后，美国军方研制出快速止血剂，(止血时间为30s)，目前国 内外止血剂的优劣以止血时间为评价标准，这对止血材料的性能又提出更高 的要求。随着医学技术水平的不断提高，止血材料和方法有了很大发展。近 年来，国内外已开发出许多止血剂，常用的有明胶海绵，纤维蛋白胶，氧化 纤维素，凝血酶等，与传统的止血材料和方法如纱布、结扎等相比，止血效果明显好，但速度还不是很快，且它们还分别存在一定的缺点或副作用明 胶可能增加伤口的感染率，尤其是污染的伤口，且其附粘力差较易脱落，如 用于内脏止血需缝合固定，此外由于其止血作用须依赖机体的凝血因子参与， 故在伴有凝血机制障碍时，其止血效果往往不理想；纤维蛋白胶是血液制品， 有传播血源性传染病如肝炎或AIDS的危险，且在使用中不宜直接注入血管 内，以防血栓形成或产生过敏反应，此外对动脉、较大静脉出血的止血作用 不佳；氧化纤维素的酸性可能引起神经纤维变性，且它有很强的吸水性，若 受潮后将影响其止血作用；凝血酶虽能明显促进血小板的戮附、聚集，但价 格较昂贵；而另外一种有效的止血剂一胶原止血剂则不存在上述缺陷，且与 上述诸者相比，其止血时间短，效果好，副作用小且较经济，是一种理想的 止血剂。发明内容目前国内普遍使用的医用胶原其平均止血时间为90s左右，与国外止血剂 (美国军方止血剂止血时间为30s)的止血时间相比尚存在很大差距，因此国内 快速止血剂的研究又成为热点课题。胶原蛋白存在状态的多样性及其止血效果研究的复杂性，胶原的止血性 能仍然是主要课题。目前国内使用的胶原止血材料基本未经过修饰，此外， 由于胶原的止血依赖于正常的凝血机制，故对于接受抗凝治疗或有凝血功能 障碍的患者而言其止血效果往往不理想。鉴于此，本发明在胶原提取的基础 上，拟采用低温化学修饰并将修饰后胶原与其它止血药物进行复合的方法来 增强和改善胶原的止血性能。本发明提供了步骤l)胶原棉网的制备将牛二层皮制成灰皮，加入质量百分浓度为2-4。/。的浸灰剂Ca(OH)2，以 及10倍于灰皮质量的水进行浸灰，室温反应24-48h后，充分水洗；再用质量百 分浓度为4-8。/。的脱灰剂NH4Cl或(NH4)2S04，以及5倍于灰皮的水进行脱灰，室温反应4-10h后，充分水洗；破碎；用质量百分浓度为3。；的胃蛋白酶进行酶水解48-72h;离心，转速为10000-20000rpm;用NaOH调节pH值至7，采用质量 百分浓度为4。/。的NaCl进行盐析，室温静置24h以上；二次离心，转速为 10000-20000rpm;用0.5mol/L的醋酸，进行酸溶解，10°C以下冷冻干燥制成胶 原棉网；步骤2)胶原修饰配制溶液配制质量百分比浓度为2 4%的甲醛，乙醛和戊二醛溶液之一， 用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值为7 9，同时配制pH二8的磷酸钠或者磷酸 氢钠缓冲液；修饰将胶原棉网浸泡于上述配制的醛溶液中，反应温度范围为25~35°C， 浸泡时间为48 96h;漂洗用磷酸盐溶液冲洗；置于乙醇溶液中以灭除细菌； l(TC以下冷冻干燥得到修饰胶原膜；步骤3)胶原复合材料制备配置质量百分比浓度为2~4%能将血浆中可溶纤维蛋白催化成不溶纤维蛋 白的中草药溶液，调节pH5 7，将修饰后的胶原膜浸渍在药物溶液中，反应温 度为23 3,(TC，浸泡时间为6 24h，置于冷冻干燥机中1(TC以下冷冻，干燥， 得到复合胶原止血材料。止血性能提高说明胶原具有促进血小板凝血和血浆结块的作用，与其它常用止血剂相比，止血率高，效果好，副作用小且较经济，是一种非常理想的止血材料；但目 前我国使用的胶原基本未经过修饰，与国外修饰过的相比止血时间过长，因 此本发明有必要对天然胶原进行化学修饰，并与中草药复合，以提高胶原复 合材料止血性能。胶原的修饰胶原同其它蛋白质一样，也是由氨基酸排列组成，而氨基酸属于两性电 解质，即在同一分子中，既含有碱性的氨基(-NH2)，又含有酸性的羧基(扁COOH)。胶原的活性氨基可与醛中的羰基发生反应,0 卩 Rr'—C —h + H;jN—ch-COOH :^=^ R'—f — m —COOH + H2()H可以看出，修饰剂醛对胶原侧链上疏水的活性氨基起到了一定程度的去 除作用，而亲水的活性羧基数量未发生变化，相对的数目却有所增加，这使 得胶原的亲水性能得到增强，从而提高了胶原复合材料止血性能。修饰后胶原与中草药复合植物中草药兼具有止血和改善凝血机制的功效，且该药经济廉价，无毒 无副作用。其止血机理为诱致血小板聚集及其成分的释放，包括腺核苷酸 和钙的释放，将血浆中可溶的纤维蛋白原转变为不溶的纤维蛋白块，从而达 到局部止血的作用。胶原膜在植物中草药溶液中充分浸渍时，由于分子间的 作用力与扩散、渗透作用使得药物分子进入到胶原三螺旋结构的空隙中，故 在止血过程中会产生协同强化的效果，从而进一步增强了胶原的止血性能。本发明的效益本发明从皮革副产物中提取高纯度胶原，在此基础上对 其止血性能进行应用基础研究，采用胶原提取~~^化学修饰""^与植物中 草药复合的工艺路线有自主地开发复合胶原止血剂。蛋白质修饰技术现已应 用于提高胶原蛋白生物材料的机能和止血性能。对胶原进行定量可控的化学修饰，研制出新一代止血材料。在提高生物医用材料科技含量的基础上，扩 大了我国医用生物材料市场份额，为我国人民的生活健康质量提供保证。
图l醛类修饰胶原的红外图谱 图2复合胶原的红外图谱 图3胶原复合材料示意图其中，表示胶原分子； 一表示胶原棉网结构；O表示草药分子具体实施方式
对胶原侧链氨基修饰而言，醛是较为适用且效果非常好的修饰剂。本发 明分别选用甲醛、乙二醛、戊二醛为修饰剂，对胶原的氨基进行修饰，修饰 后的胶原再与中草药复合制成止血材料，此复合止血材料止血时间大大縮短。 冷冻干燥的温度均为1(TC以下。例l:戊二醛修饰胶原中草药复合步骤l)胶原棉网的制备将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为2%的浸灰剂Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室温反应24h后，充分水洗，再用质量百分浓度 为4。/。的脱灰剂NH4Cl，水50ml，进行脱灰，室温反应6h;充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度3l的胃蛋白酶水解48h，离心，转速为10000rpm;用NaOH调 节pH值至7，采用质量百分浓度为4y。的NaCl盐析，静置24h; 二次离心，转速 为10000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，冷冻干燥制成胶原棉网。 步骤2)胶原修饰配制质量百分比浓度为2M的戊二醛溶液，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH 值为7，将胶原棉网浸泡于上述戊二醛溶液中，反应温度为25。C，浸泡48h;同时配制pH二8的磷酸钠缓冲液漂洗；置于乙醇溶液中以灭除细菌；然后冷冻干燥，得到修饰胶原棉网。戊二醛属于双醛，是两羰基之间有三个C原子相连，其化学分子式为H H^\ 」 这三个碳原子产生了邻近基团效应，使得羰基具有很大活性，基 本上相当于两个单醛同时在发挥作用，戊二醛主要与胶原中的赖氨酸和羟赖氨酸发生反应，但由于戊二醛分子在在pl^7时的扩散、渗透好，故与胶原分 子的接触和反应较为充分、完全；而另一方面，与醛基反应的氨基等活性基 团在碱性条件下能发生较好的解离，有利于与戊二醛进行反应，达到去除氨 基的效果。如图1所示，胶原膜在3386cm"附近有一个强而宽的吸收峰，该峰对应 于胶原蛋白中酰胺键中N—H键的伸縮振动特征吸收峰；在1700 1300cm—1 间分别出现三个吸收峰，它们是蛋白质中的酰胺I带1656cm—1， C二O键伸縮 振动峰、酰胺II带1542cm—1， N—H弯曲和C一N伸縮振动的混频峰及酰胺 III带1387 cm—1， C一N键伸縮振动峰，这些是蛋白质的IR中最特征的吸收峰。对比胶原膜和戊二醛修饰胶原膜，可以看出经过醛修饰后，在3386cm" 位置的峰向短波方向移动，这主要与胶原蛋白中NH键及H键有关。当醛插 入胶原三股螺旋内部后，在一定程度上破坏了螺旋之间的氢键，但同时酰胺 带中的〔:=0和所生成的水分子又形成了更多的氢键，因此峰向短波方向移 动；此外，修饰后胶原中的三个酰胺带减弱了，这表明醛的渗入使胶原中酰 胺键的振动受到了遏制，即修饰反应发生在酰胺键的位置；但这三个峰依然 存在，说明经过戊二醛修饰后的胶原均未发生变性。此时戊二醛对胶原的修 饰效果最佳，修饰原的止血性能最佳。修饰率80%。步骤3)胶原复合材料制备配置质量百分比浓度为2%的中草药(北京中药厂XB030020109 ，成分 为C44.9%、 H6.4%、 N0.8%、以及微量的无机元素P、 Ca等)溶液，调节pH至 5，将修饰后的胶原膜浸渍在药物溶液中，反应温度为23"C，浸泡6h，冷冻干 燥，得到胶原复合材料。由图2可以看出，胶原经过与药物复合之后，其N—H伸縮振动峰及三 个酰胺带的峰在复合胶原的图谱中均对应出现，而N—H峰向长波方向发生 了移动，表明该复合过程在一定程度上破坏了胶原螺旋之间的氢键，导致其 分子间作用力发生了变化，草药分子进入了修饰胶原棉网中如图3所示，并 于胶原的分子形成物理结合，故在止血过程中会产生胶原及草药的协同强化 效果，从而进一步增强了胶原的止血性能。胶原复合材料的止血时间为51S。例2:戊二醛修饰胶原中草药复合 步骤l)胶原棉网的制备将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为3%的浸灰剂Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室温反应36h后，充分水洗，再用质量百分浓度 为6。/。的脱灰剂NH4Cl，水50ml，进行脱灰，室温反应6h;充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度3。；的胃蛋白酶水解60h，离心，转速为15000rpm;用NaOH调 节pH值至7，采用质量百分浓度为4。/。的NaCl盐析，静置24h; 二次离心，转速 为15000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，冷冻干燥制成胶原棉网。步骤2)胶原修饰配制质量百分比浓度为2。/。的戊二醛溶液，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH 值为7，将胶原棉网浸泡于上述戊二醛溶液中，反应温度为25。C，浸泡96h; 同时配制pH二8的磷酸氢钠缓冲液漂洗；置于乙醇溶液中以灭除细菌；然后 冷冻干燥，得到修饰胶原棉网，修饰率为85%。步骤3)胶原复合材料制备配置质量百分比浓度为2。/。的中草药溶液，调节pH至5，将修饰后的胶原 膜浸渍在药物溶液中，反应温度为28'C，浸泡12h，冷冻干燥，得到胶原复合 材料。由图2可以看出，胶原经过与药物复合时间加长之后，其N—H伸縮振 动峰及三个酰胺带的峰在复合胶原的图谱中均对应出现，而N—H峰向长波 方向发生了移动比例1移动明显，复合过程在破坏了胶原螺旋之间的氢键， 导致其分子间作用力发生了变化，草药分子进入了修饰胶原棉网中如图3所 示，并于胶原的分子形成物理结合更完全，从而进一步增强了胶原的止血性 能。胶原复合材料的止血时间为45S。例3:乙二醛修饰胶原中草药复合 步骤l)胶原棉网的制备将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为3%的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室温反应48h后，充分水洗，再用质量百分浓度 为8。/。的脱灰齐l」(NH4)2S04，水50ml，进行脱灰，室温反应10h;充分水洗；绞碎;用质量百分浓度3^。的胃蛋白酶水解72h，离心，转速为20000rpm;用NaOH调 节pH值至7，采用质量百分浓度为4M的NaCl盐析，静置24h; 二次离心，转速 为20000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，冷冻干燥制成胶原棉网。 步骤2)胶原修饰配制质量百分比浓度为3%的乙二醛溶液，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH 值为8，将胶原棉网浸泡于上述戊二醛溶液中，反应温度为32。C，浸泡96h;同时配制pH二8的磷酸钠缓冲液漂洗；置于乙醇溶液中以灭除细菌；然后冷冻干燥，得到修饰胶原棉网。乙二醛与戊二醛不同，它也属于双醛，且为最简单的双醛，分子式为C2H202，化学分子式为h"h即少了3个C。乙二醛主要与精氨酸的胍基NH(H2N一I一NH一)发生反应，但产物不是很稳定；此外有关研究表明在胍基反应中，精氨酸的去除率约为83%，而赖氨酸的损失在20%以上，表明胍基 反应专一性不强，因此乙二醛还能与少量赖氨酸中的s—氨基发生反应。当乙 二醛浓度为3%时，达到去除氨基的效果。如图1所示，胶原膜在3386cm"附近有一个强而宽的吸收峰，该峰对应 于胶原蛋白中酰胺键中N—H键的伸縮振动特征吸收峰；在1700 1300cm—1 间分别出现三个吸收峰，它们是蛋白质中的酰胺I带1656cm"， C:O键伸縮 振动峰、酰胺II带1542cm—1， N—H弯曲和C一N伸縮振动的混频峰及酰胺 III带1387 cm"， C一N键伸縮振动峰，这些是蛋白质的IR中最特征的吸收峰。 可以看出经过醛修饰后，在3386cm"位置的峰向短波方向移动，这主要与 胶原蛋白中NH键及H键有关。当醛插入胶原三股螺旋内部后，在一定程度 上破坏了螺旋之间的氢键，但同时酰胺带中的C二O和所生成的水分子又形成 了更多的氢键，因此峰向短波方向移动；此外，修饰后胶原中的三个酰胺带 减弱了，这表明酸的渗入使胶原中酰胺键的振动受到了遏制，即修饰反应发 生在酰胺键的位置；但这三个峰依然存在，说明经过乙二醛修饰后的胶原均 未发生变性。此时乙二醛与戊二醛对比强度较弱，修饰率为75%。步骤3)胶原复合材料制备配置质量百分比浓度为3%的中草药溶液，调节pH至6，将修饰后的胶原 膜浸渍在药物溶液中，反应温度为3(TC，浸泡9h，冷冻干燥，得到胶原复合 材料。由图2可以看出，胶原经过与药物复合之后，其N — H伸縮振动峰及三个酰胺带的峰在复合胶原的图谱中均对应出现，而N—H峰向长波方向发生了移动，表明该复合过程在一定程度上破坏了胶原螺旋之间的氢键，导致其分子间作用力发生了变化，草药分子进入了修饰胶原棉网中如图3所示，并于胶原的分子形成物理结合，故在止血过程中会产生胶原及草药的协同强化效果，从而进一步增强了胶原的止血性能。胶原复合材料的止血时间为57S。例4:甲醛修饰胶原中草药复合 步骤l)胶原棉网的制备将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为4%的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室温反应48h后，充分水洗，再用质量百分浓度 为8。/。的脱灰剂(NH4)2S04，水50ml，进行脱灰，室温反应10h;充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度3。；的胃蛋白酶水解72h，离心，转速为20000rpm;用NaOH调 节pH值至7，采用质量百分浓度为4。/。的NaCl盐析，静置24h; 二次离心，转速 为20000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，冷冻干燥制成胶原棉网。步骤2)胶原修饰配制质量百分比浓度为4%的甲醛溶液，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH 值为9，将胶原棉网浸泡于甲醛溶液中，反应温度为35。C，浸泡96h;同时配制pH二8的磷酸钠缓冲液漂洗；置于乙醇溶液中灭菌处理；然后冷冻干燥，得到修饰胶原棉网。.甲醛是最h简单的单醛，其分子较小，只含有一个羰基，分子式为HCHO，化学分子式为h〉^。甲醛分子较小，在更多情况下会先与胶原蛋白中赖氨 酸的s—氨基发生反应生成亚胺中间体，然后再跟酪氨酸反应形成分子间交联[52，从而形成稳定、坚固的网格结构。有助于增强胶原吸水性能。如图1所示，胶原膜在3386cm'1附近有一个强而宽的吸收峰，该峰对应于胶原蛋白中酰胺 键中N—H键的伸缩振动特征吸收峰；在170(M300cm"间分别出现三个吸收 峰，它们是蛋白质中的酰胺I带1656crn'1， C-O键伸縮振动峰、酰胺II带 1542cm'1， N—H弯曲和C一N伸縮振动的混频峰及酰胺III带1387 cm: C 一N键伸縮振动峰，这些是蛋白质的IR中最特征的吸收峰。可以看出经过 醛修饰后，在3386cm"位置的峰向短波方向移动，这主要与胶原蛋白中NH键及H键有关此时甲醛与乙二醛对比移动较小。当醛插入胶原三股螺旋内部 后，在一定程度上破坏了螺旋之间的氢键，但同时酰胺带中的C二O和所生成 的水分子又形成了更多的氢键，因此峰向短波方向移动；此外，修饰后胶原 中的三个酰胺带减弱了，这表明醛的渗入使胶原中酰胺键的振动受到了遏制， 即修饰反应发生在酰胺键的位置；但这三个峰依然存在，说明经过甲醛修饰 后的胶原均未发生变性。此时甲醛与乙二醛对比强度较弱，修饰率为70%。步骤3)胶原复合材料制备配置质量百分比浓度为4%的中草药溶液，调节pH至7，将修饰后的胶原 膜浸渍在药物溶液中，反应温度为3(TC，浸泡24h，冷冻干燥，得到胶原复合 材料。由图2可以看出，胶原经过与药物复合之后，其N—H伸縮振动峰及三 个酰胺带的峰在复合胶原的图谱中均对应出现，而N—H峰向长波方向发生 了移动，表明该复合过程在一定程度上破坏了胶原螺旋之间的氢键，导致其 分子间作用力发生了变化，草药分子进入了修饰胶原棉网中如图3所示，并 于胶原的分子形成物理结合，故在止血过程中会产生胶原及草药的协同强化 效果，从而进一步增强了胶原的止血性能。胶原复合材料的止血时间为60S。
权利要求
1、一种复合胶原止血材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1)胶原棉网的制备将牛二层皮制成灰皮，加入质量百分浓度为2-4％的浸灰剂Ca(OH)2，以及10倍于灰皮质量的水进行浸灰，室温反应24-48h后，充分水洗；再用质量百分浓度为4-8％的脱灰剂NH4Cl或(NH4)2SO4，以及5倍于灰皮的水进行脱灰，室温反应4-10h后，充分水洗；破碎；用质量百分浓度为3‰的胃蛋白酶进行酶水解48-72h；离心，转速为10000-20000rpm；用NaOH调节pH值至7，采用质量百分浓度为4％的NaCl进行盐析，室温静置24h以上；二次离心，转速为10000-20000rpm；用0.5mol/L的醋酸，进行酸溶解，10℃以下冷冻干燥制成胶原棉网；步骤2)胶原修饰配制溶液配制质量百分比浓度为2～4％的甲醛，乙醛和戊二醛溶液之一，用盐酸和氢氧化钠调节溶液pH值为7～9，同时配制pH＝8的磷酸钠或者磷酸氢钠缓冲液；修饰将胶原棉网浸泡于上述配制的醛溶液中，反应温度范围为25～35℃，浸泡时间为48～96h；漂洗用磷酸盐溶液冲洗；置于乙醇溶液中以灭除细菌；10℃以下冷冻干燥得到修饰胶原膜；步骤3)胶原复合材料制备配置质量百分比浓度为2～4％能将血浆中可溶纤维蛋白催化成不溶纤维蛋白的中草药溶液，调节pH5～7，将修饰后的胶原膜浸渍在药物溶液中，反应温度为23～30℃，浸泡时间为6～24h，置于冷冻干燥机中10℃以下冷冻，干燥，得到复合胶原止血材料。
全文摘要
复合胶原止血材料的制备方法属于医用生物材料领域。止血时间成为止血材料优劣评价的标准，提高胶原材料止血性能仍然是主要研发重点。本发明首先用醛类对可溶性胶原进行化学修饰，制成修饰胶原棉网。由于改善了胶原的亲水性，因此提高了其止血性能。另外，选择了能将血浆中可溶纤维蛋白催化成不溶纤维蛋白的中草药，配制成溶液；将修饰胶原的棉网在药物溶液中充分浸渍。由于修饰胶原和草药的分子键作用与扩散、渗透，使药物分子进入到胶原三螺旋结构中，成为复合胶原止血材料。这种材料在正、异常凝血情况下均在修饰基础上得到了明显的提高和改善，其止血时间为45S-60S，超过目前国内医用胶原止血材料及日本同类医用胶原止血材料。
文档编号A61L15/16GK101224311SQ20081005738
公开日2008年7月23日 申请日期2008年2月1日 优先权日2008年2月1日
发明者刘晶冰, 张文熊, 欣 李, 長南康正 申请人:北京工业大学