专利名称：：其它新形式的干扰rna分子的制作方法其它新形式的干扰RNA分子本申请是国际申请号PCT/EP2003/008666，国际申请日为2003年8月5日，中国申请号为03818867.8，中国申请日为2005年2月5日，发明名称为"其它新形式的干扰RNA分子"的分案申请。本发明涉及含有双链结构的核糖核酸，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，还涉及该核糖核酸的应用、分别含有该核糖核酸的细胞和生物、含有该核糖核酸的组合物、含有该核糖核酸的药物组合物和抑制目标基因表达的方法。
背景技术：
：RNA-介导的千扰(RNAi)是转录后的基因沉默机制，它由在序列上与沉默基因同源的双链RNA(dsRNA)启动(Fire(1999),TrendsGenet15,358-63,TuscW,等(1999),GenesDev13,3191-7，Waterhouse,等(2001),Nature411，834-42，Elbashir，等(2001),Nature411,494-8,综述参见Sharp(2001),GenesDev15,485-90,Barstead(2001),CurrOpinChemBiol5,63-6)。RNAi已经广泛地用于检测许多生物中的基因功能，包括植物(Baulcombe(1999)，CurrOpinPlantBiol2，109-13)、线虫(Montgomery，等(1998)，ProcNatlAcadSciUSA95，15502-7)、果蝇属(Kennerdell,等(1998)，Cell95,1017-26,Kennerdell,等(2000),NatBiotechnol18,896-8)。在线虫Ce/egara中，已经有三分之一的基因组通过RNAi进行了功能分析(Kim(2001),CurrBiol11，R85-7，Maeda，等(2001)，CurrBiol11,171-6)。直到最近，哺乳动物细胞的RNAi还未普遍应用，除了早期的小鼠发育(Wianny，等(2000)，NatCellBiol2,70-5)。通常由长dsRNA得知，用21nt的双链体转染哺乳动物细胞会干扰基因表达，且不会诱导不依赖于序列的干扰素驱动的抗病毒应答，这一发现在分化的哺乳动物细胞中具有新的潜在用途(Elbashir等(2001)，Nature411，494-8)。有趣的是，这些小的干扰'RNAs(siRNA)类似于长dsRNA的加工产物，提示在分化的哺乳动物细胞中潜在的旁路机制。Dicer复合物是RNA酶III家族的成员，已经鉴别出它是启动dsRNA加工所必需的(Bemstein,等(2001),Nature409,363-6,Billy，等(2001),ProcNatlAcadSciUSA98,14428-33)。在以前使用未修饰的核糖寡核苷酸时遇到的问题之一是在细胞或甚至在含血清培养基中的快速降解(Wickstrom(1986)，JBiochemBiophysMethods13,97-102，Cazenave,等(1987),NucleicAcidsRes15，10507-21)。转染siRNA诱导的各种降低(knockdown)是否会维持足够长的时间来实现表型的改变依赖于特定基因的功能和使用的分析系统。本发明解决的基本问题是提供了合成的在生物化学环境例如活细胞中稳定切有活性的干扰RNA分子。在本发明的第一方面，通过含有双链结构的核糖核酸解决了问题，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，并且其中所述的双链结构是平端的。在本发明的第二方面，通过含有双链结构的核糖核酸解决了问题，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，并且其中所述的第一序列和/或第二序列的长度为18或19个核苷酸。在根据本发明的第一方面的核糖核酸的一个实施方案中，第一序列和/或第二序列的长度为18或19个核苷酸。在根据本发明的第一方面的核糖核酸的另一个实施方案中，双链结构的双链两端都是平端的。在根据本发明的第一方面的核糖核酸的一个备选实施方案中，双链结构是平端的，双链结构由第一链的5'-端和第二链的3'-端定义。在根据本发明的第一和第二方面的核糖核酸的另外一个备选实施方案中，双链结构是平端的，双链结构由第一链的3'-端和第二链的5'-端定义。在本发明的第三方面，通过含有双链结构的核糖核酸解决了问题，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，并且其中双链中的至少一个在5'-端具有至少一个核苷酸的突出端。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个实施方案中，突出端由至少一个核苷酸组成，所述核苷酸选游离核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的组。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个更优选的实施方案中，核苷酸具有一个修饰，所述的修饰优选地选自包含反向无碱基的核苷酸和在2'-位具有NH2-修饰的核苷酸的组。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，至少一条链具有由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的3'-端的至少一个核苷酸的突出端。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的另外一个优选实施方案中，第一序列和/或第二序列的长度为18或19个核苷酸。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个实施方案中，双链结构的长度为17—21个核苷酸，优选18—19个核苷酸。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个实施方案中，5'-端的突出端是在第二链上。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，第一链也包含突出端，优选地在5'-端。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个实施方案中，第一链的3'-端含有突出端。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个备选实施方案中，5'-端的突出端是在第一链上。在它的一个优选实施方案中，第二链也包含突出端，优选地在5'-端。在根据本发明的第三方面的核糖核酸的一个实施方案中，第一链的3'-端含有突出端。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个实施方案中，核糖核酸中的至少一个核苷酸在2'-位有修饰，该修饰优选地选自包含氨基、氟、甲氧基、烷氧基和垸基的组。在本发明的第四方面，通过含有双链结构的核糖核酸解决了问题，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，其中，所述的第一链和/或所述的第二链含有多个在2'-位具有修饰的修饰的核苷酸基团，其中在链中的每个修饰的核苷酸基团在一侧或两侧与核苷酸连接基团连接，形成核苷酸的连接基团的连接核苷酸是未修饰的核苷酸，或者是具有修饰的核苷酸，所述修饰不同于修饰核苷酸的修饰。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个实施方案中，所述的核糖核酸是根据本发明的第一、第二或第三方面的核糖核酸。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，所述的第一链和/或所述的第二链含有多个修饰的核苷酸。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，所述的第一链含有所述多个修饰的核苷酸基团。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，所述的第二链含有所述多个修饰的核苷酸基团。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，修饰的核苷酸基团和/或核苷酸连接基团包含许多核苷酸，其中的数目选自包含1个核苷酸一IO个核苷酸的组。关于这里指定的任何范围，应当理解，每一个范围都公开了用于定义该范围的各数值之间的任何整数，包括所述的定义该范围的两个数值。在本申请中，所述的组因此包含1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸和IO个核苷酸。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，所述的第一链的修饰的核苷酸模式与所述的第二链的修饰的核苷酸模式相同。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，所述的第一链的模式与所述的第二链的模式匹配(align)。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个备选实施方案中，所述的第一链的模式替换为一个或多个与第二链的模式相关的核苷酸。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个实施方案中，所述的修饰选自包含氨基、氟、甲氧基、垸氧基和烷基的组。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，双链结构是平端的。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，双链结构的两端都是平端的。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，双链结构在第一链的5'-端和第二链的3'-端定义的双链结构端是平端的。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，双链结构在第一链的3'-端和第二链的5'-端定义的双链结构端是平端的。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，双链中的至少一个在5'-端具有至少一个核苷酸的突出端。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，突出端由至少一个脱氧核糖棒苷酸组成。在根据本发明的第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，所述链中的至少一个在3'-端具有至少一个核苷酸的突出端。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个实施方案中，双链结构的长度为约17—21个碱基，更优选18或19个碱基。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，所述的第一链的长度和/或所述的第二链的长度相互独立地选自包含约15—约23个碱基、17—21个碱基和18或19个碱基的范围的组。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，所述的第一链和目标核酸的互补性是准确的。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个实施方案中，第一链和目标核酸形成的双链体包含至少15个核苷酸，其中在形成所述的双链结构的所述第一链和目标核酸之间有一个错配或两个错配。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个实施方案中，第一链和第二链每个都包含至少一个修饰的核苷酸基团和至少一个核苷酸连接基团，其中每一个修饰的核苷酸基团包含至少一个核苷酸，每一个核苷酸连接基团包含至少一个核苷酸，且第一链中的每一个修饰的核苷酸基团与第二链中的核苷酸连接基团相匹配，其中第一链的多数5'端核苷酸是修饰的核苷酸基团的核苷酸，第二链的多数3'端核苷酸是核苷酸连接基团的核苷酸。在根据第四方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，每一个修饰的核苷酸基团由单个核苷酸组成，和/或每一个核苷酸连接基团由单个核苷酸组成。在根据第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，在第一链上形成核苷酸连接基团的核苷酸是未修饰的核苷酸，它相对于形成修饰核苷酸基团的核苷酸位于3'方向，和其中在第二链上形成修饰的核苷酸基团的核苷酸是修饰的核苷酸，它相对于形成核苷酸连接基团的核苷酸位于5'方向。在根据第四方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，第一链包含8_12个、优选9一11个修饰的核苷酸基团，其中第二链包含7—11个、优选8—10个修饰的核苷酸基团。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，目标基因选自包含结构基因、持家基因、转录因子、游动因子、细胞周期因子、细胞周期抑制剂、酶、生长因子、细胞因子和肿瘤抑制剂的组。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，第一链和第二链通过环结构连接。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个优选实施方案中，环结构由非核酸聚合物组成。在它的一个优选实施方案中，非核酸聚合物是聚乙二醇。在它的一个备选实施方案中，环结构由核酸组成。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的一个实施方案中，第一链的5'-末端连接到第二链的3'-末端。在根据本发明的任何方面的核糖核酸的另外一个实施方案中，第一链的3'-末端连接到第二链的5'-末端。在本发明的第五方面，通过使用根据本发明的任何方面的核糖核酸解决了问题，用于目标验证(targetvalidation)。在本发明的第六方面，通过使用根据本发明的任何方面的核糖核酸解决了问题，用于生产药物。在根据本发明的第六方面的应用的一个优选实施方案中，药物是用于治疗选自包含恶性胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和白血病、糖尿病、肥胖症、心血管病和代谢病的疾病或病症。在第七方面，通过含有根据本发明的任何方面的核糖核酸的细胞、优选敲倒细胞(knockdowncell)解决了问题。在第八方面，通过含有根据本发明的任何方面的核糖核酸的生物、优选敲倒生物(knockdownorganism)解决了问题。在第九方面，通过含有根据本发明的任何方面的核糖核酸的组合物解决了问题。在第十方面，通过含有根据本发明的任何方面的核糖核酸和可药用载体的药物组合物解决了问题。在第十一方面，通过抑制细胞中目标基因或其衍生物的表达的方法解决了问题，该方法包括将根据本发明的任何方面的核糖核酸以足以抑制目标基因表达的量导入细胞中，其中目标基因是根据本发明的任何方面的核糖核酸的目标基因。本发明是基于一个惊人的发现，即可以设计小的干扰RNA，使其在生物系统例如生化实验或细胞环境常见的反应条件下具有高度的特异性、活性和稳定性。在现有技术例如Tuschl等(国际专利申请WO01〃5164)中描述的各种干扰RNA的长度为21—23个核苷酸，并且在双链RNA的3'端有修饰。本发明的发明人已经意外地发现，干扰RNA(包括小的干扰RNA(siRNA)，在下文中通常称作RNAi)的稳定性问题实际上是因为核酸内切酶f不是以前认为的核酸外切酶的攻击。在这一发现的基础上，本发明的发明人已经提出了用于本应用的几种策略。，这样，本发明涉及新形式的干扰RNA。RNAi由包含双链结构的核糖核酸组成。所述的双链结构由第一链和第二链形成。所述的第一链含有连续核苷酸的序列(在这里也称作连续核苷酸的第一序列)，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补。所述的第二链也含有连续核苷酸的序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同。该核糖核酸的最基本的结构示意性地显示在图1中。所述的第一链和所述的第二链优选地相互杂交，形成双链结构。典型地通过WatsonCrick碱基配对进行杂交。但是，创造的核糖核酸在其长度方面没有必要限于所述的双链结构。还可以向每条链和/或形成RNAi的任何链的每一末端添加其它的核苷酸。根据第一序列和第二序列的特定序列，杂交或碱基配对不是一定要完整的或准确的，这意味着第一和第二序列由于错配而没有100%配对。双链体中还可以由一个或几个错配。所述的错配对RNAi活性没有影响，如果位于优选地15、16或17个配对核苷酸的序列之外。如果放置错配以产生仅15或更少的连续的配对核苷酸，与17配对核苷酸双链体相比，RNAi分子通常在下调对于给定的靶目标的mRNA中显示降低的活性。第一链的连续核苷酸的第一序列基本上与目标核酸互补，更优选地与目标核酸的一部分互补。这里使用的"互补"优选地指第一链的核苷酸序列与目标核酸序列或其部分的核酸序列杂交。典型地，根据干扰核糖核酸的作用模式，目标核酸序列或目标核酸是单链RNA，更优选mRNA。这种杂交最可能通过WatsonCrick碱基配对来完成，但是不一定限于此。所述的第一链和更具体地所述第一链的连续核苷酸的第一序列与目标核酸序列互补的范围可以高达100%，也可以低至80%,优选80-100%，更优选85-100%，最优选90-100%。最佳互补性好像是95_100%。该意义上的互补性指前述的核苷酸范围，例如取决于特定范围的80%-100%的核苷酸准确地进行WatsonCrick碱基配对。本发明的一个方面表明，所述的第一核苷酸序列和目标RNA之间的互补性必须是18—19个核苷酸，即使有两个序列特异性突出端的短至17个核苷酸的序列也没有介导RNAi的功能。因此，假设长为19个核苷酸或碱基对的双链体，17个核苷酸或核苷酸碱基对的最小互补性是可以接受的，以允许2个核苷酸的错配。如果双链体由20个核苷酸或碱基对组成，17个核苷酸或核苷酸碱基对的互补性是可以接受的，并且是功能上有活性的。这同样适用于共有17个互补核苷酸或碱基对的21个核苷酸或碱基对的双链体。基本上，双链体(即双链结构)长度所需要的互补性的范围也可以基于复合物的融解温度，所述的复合物由这里描述的双链结构形成，或由第一链的第一序列和目标核酸的复合物形成。应当理解，本发明的所有核糖核酸都适用于产生或参与RNA介导的干扰，例如国际专利申请W099/32619、WO00/44895禾nWO01/75164中所述的。根据本发明的第一种策略可以设计出的干扰核糖核酸分子应该有序列的18或19个核苷酸的最佳长度，它与目标核酸互补。本发明的范围还包括，所述18或19个核苷酸的最佳长度是使用的RNAi中的双链结构的长度。该长度要求与现有技术(例如国际专利申请W001/75164)中的技术教导明显不同。根据本发明和现有技术的描述，关于具有所述长度特征(即18或19个核苷酸的长度)的干扰核糖核酸可以想到的任何其它设计都在本发明的范围内。根据本发明的第二种策略可以设计出的干扰核糖核酸分子应该在第一链上有游离的5'羟基，这里也称作游离的5'OH-基。游离的5'OH-基指存在形成第一链的大多数末端核苷酸，这样也是未修饰的，特别是没有末端修饰。典型地，还分别存在未修饰的第二链的末端5'-羟基。在一个更优选的实施方案中，第一链和第一序列的3'-末端分别是未修饰的，例如存在游离的OH-基，这里也称作游离的3'OH-基，其中5'末端核苷酸的设计是前述的实施方案中的任何一个的内容。优选地，第二链和第二序列的3'-端也存在这种游离的OH-基。在根据本发明的前述的核糖核酸分子的其它实施方案中，分别地，第一链和第一序列的3'-末端和/或第二链和第二序列的3'-末端可以在3'-末端存在末端修饰。这里使用的术语游离5'OH-基和3'OH-基还表明，聚核苷酸的5'端和3'端的相应大多数末端核苷酸分别存在OH-基。这样的OH-基可以出自核苷酸的糖部分，更优选的出自5'OH-基的5'位和3'OH-基的3'位，或者出自连接到各末端核苷酸的糖部分上的磷酸基。磷酸基原则上可以连接到核苷酸的糖部分上的任何OH-基。优选地，磷酸基连接到存在游离5'OH-基时糖部分上的5'OH-基和/或存在游离3'OH-基时糖部分上的3'OH-基，它们在这里也称作游离5'或3'OH-基。如这里公开的设计RNAi的任何策略或RNAi的任何实施方案所使用的，术语"末端修饰"指添加到第一和/或第二链的大多数5'或3'核苷酸上的化学实体。这类末端修饰的实例包括但不限于反向的(脱氧)无碱基(abasic)、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、甲氧基、咪唑基、羧基、硫代(thioate)、d—d。低级烷基、取代的低级烷基、垸芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-、或N-烷基；O-，S-或N-烯基；SOCH3;S02CH3;ON02;N02，N3;杂环烷基(heterozycloalkyl);杂环垸芳基(heterozycloalkaryl);氨基烷基氨基;聚垸基氨基或取代的甲硅垸基，如在欧洲专利EP0586520Bl或EP0618925Bl中公开的那些。这里使用的烷基或任何包括"烷基"的术语指含有1一12个、优选l一6个和更多、优选1一2个碳原子的任何碳原子链。其它的末端修饰是生物素基团。这样的生物素基团可以优选地连接到第一链和/或第二链的大多数5'或大多数3'核苷酸或二者。在一个更优选的实施方案中，生物素基团是偶连到聚肽或蛋白上。本发明的范围也包括，聚肽或蛋白通过任何其它前述的末端修饰连接。聚肽或蛋白可以赋予发明的核酸分子其它特征。其中，聚肽或蛋白可以作为其它分子的配体。如果所述的其它分子是受体，则可以通过结合配体来激活该受体的功能和活性。受体可以显示出内化活性，这有利于结合到发明的核酸分子上的配体的有效转染。要结合到发明的核酸分子上的配体的实例是VEGF，且相应的受体是VEGF受体。具有不同种类的末端修饰的本发明的RNAi的各种可能的实施方案如表1所示。表l根据本发明的干扰核糖核酸的各种实施方案<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>游离OH游离OH6.)5'-端3'-端游离OH末端修饰末，修饰游离OH7,)5'-端3'-端游离OH游离OH末端修饰末端修饰8.)5'-端3'-端游离OH末端修饰末端修饰末端修饰如此处所公开的的各种末端修饰优选地位于核糖核酸的核苷酸的核糖部分。更具体地，末端修饰可以连接到或替换核糖部分的任何OH-基，包括但不限于2'OH、3'OH和5'OH位，假设这样修饰的核苷酸是末端核苷酸。反向无碱基是不含有核碱基部分的核糖核苷酸或核糖核苷酸。这种化合物是(特别是)Sternberger等(2002)，Antisense.Nucl.Ac.DrugDev.inpress所述的。前述的任何末端修饰都可以与表1所述的RNAi的各种实施方案一起使用。与此相关地应该指出，带有失活(优选地通过带有末端修饰，更优选地在5'端)的有义链的这里所述的任何RNAi形式或实施方案是特别有益的。其原因是与这里所述的核糖核酸的第二链相对应的有义链的失活，它可能反过来干扰细胞中的无关的单链RNA。这样，更特异性地影响细胞的转录物组(transcriptome)的表达和更具体的翻译模式。该影响也称作偏离目标的影响。参考表l，作为实施方案7和8进行说明的那些实施方案在上述意义上是特别有益的，因为修饰导致了目标非特异性的部分RNAi(它是第二链)的失活，这样减少了第二链与单链RNA在细胞系统或类似系统中的任何非特异性相互作用，这时本发明的RNAi将用于分别降低(knockdown)特异性的核糖核酸和蛋白。本发明的第三个策略是提供了包含双链结构的核糖核酸，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，其中所述的双链结构是平端的。如在本说明书中使用的，术语"双链结构"也称作双链体。因此，这样的RNAi设计是明显不同的，例如与Tuschl等在公开了3'-突出端的国际专利申请WO01/75164中所述的不同。这里使用的"突出端"指这样的双链结构，其中一条链的至少一个末端比形成该双链结构的另一条链的相应末端长，它在这里也称作反链(counterstrand)。优选地，第一序列即为第一链，第二序列即为第二链。分别考虑到各核糖核酸的第一链或第二链或二者的平端RNAi的有效性和末端修饰的优点，优选组合两种设计原则。换句话说，带有表l所述的任何末端修饰方案的平端RNAi都在本发明的范围内。本发明的第四个策略是在核糖核酸的5'-端具有突出端。更具体地，这样的突出端原则上可以在根据本发明的核糖核酸的第一链或第二链或二者中。所述的突出端的长度可以短至一个核苷酸，也可以长至2—8个核苷酸，优选2、4、6或8核苷酸。5'突出端可以位于根据本发明的核糖核酸的第一链和/或第二链也在本发朋的范围内。形成突出端的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其延长物。突出端优选地含有至少一个脱氧核糖核苷酸，其中所述的一个脱氧核糖核苷酸优选地是大多数的5'-端的一个。本发明也包括，发明的核糖核酸的各反链的3'-端没有突出端，更优选地没有脱氧核糖核苷酸突出端。再者，发明的任何核糖核酸都可以包含表1中列出的末端修饰方案和/或这里列出的末端修饰。设计本发明的干扰核糖核酸的第五种策略是，在根据本发明的至少一条链上，更具体地，在核糖核酸的连续核苷酸的一个序列上形成特定的修饰的核苷酸的模式。所述的核苷酸的修饰类型可以与在这里公开的设计干扰RNA的其它策略中讨论的相同，更具体地，'这里所述的对于末端修饰或作为末端修饰的修饰类型例如在至少一个形成根据本发明的核糖核苷酸的核苷酸的核糖部分上的反向无碱基、甲氧基或氨基等。应当指出，所述的核苷酸的修饰可以是这里所述的任何形式的修饰，更具体地，这里所述的末端修饰的修饰类型具有一个特征，即所谓的末端修饰不一定在末端核苷酸上。更合适的修饰是在非末端核苷酸上。在该条件下，修饰优选地在修饰的(或要修饰的)核苷酸的核糖部分上，更优选地在核糖部分的2'位。本发明还包括，根据该策略设计的任何核糖核酸还可以具有这里所述的任何其它设计策略赋予根据本发明的核糖核酸的特征。因此，具有修饰的核苷酸模式的干扰核糖核酸可以有末端修饰，末端修饰方案可以是平端的，或可以有5'突出端，或这些元素或特征中的两个或多个的任何组合。除了上面所述的可以作为末端修饰或修饰模式存在的修饰外，这里的核糖核酸骨架还可以通过在核苷酸之间形成不同连接来修饰。这样的不同连接是在(特别是在)欧洲专利EP0586520Bl和欧洲专利EP0618925Bl中记载。此处特别感兴趣的是核糖核酸骨架的内部修饰，已经表现它能赋予核糖寡核苷酸较高的核酸酶耐受性。在一个优选实施方案中，修饰的核苷酸的修饰是核苷酸的核糖部分上的2'-0H-基的甲氧基化。在一个优选实施方案中，两条链(更具体地，第一序列和第二序列)都有这种分别形成所述链和序列的核苷酸的修饰类型。但是，本发明还包括，第一链和第一序列(或第二链和第二序列)分别有这种特殊的核苷酸修饰模式。这里使用的术语核苷酸修饰基团或核苷酸连接基团可以包含或代表少至一个核苷酸，即一个或多个核苷酸。考虑到连续核苷酸的序列，可以将形成序列的核苷酸的修饰模式设计成单核苷酸或核苷酸基团表现出这种修饰，所述单核苷酸或核苷酸基团彼此通过标准磷酸二酯键或至少部分地通过硫代磷酸键共价地连接。当这种核苷酸或这里也称作"修饰的核苷酸基团"的核苷酸基团没有形成所述序列的5'-端或3'-端时，核苷酸或核苷酸基团继续(followon)不含有前面的核苷酸或核苷酸基团的修饰的核苷酸的两端。但是应当指出，这种核苷酸或核苷酸基团可以有不同的修饰。这种核苷酸或核苷酸基团在这里也称作核苷酸连接基团。分别地，修饰的核苷酸和修饰的核苷酸基团的序列，和未修饰的或不同地修饰的核苷酸或未修饰的或不同地修饰的核苷酸基团的序列，可以重复一次或几次。优选地，该序列重复不止一次。为了清楚起见，下面更详细地讨论模式，它一般称作修饰的核苷酸基团或未修饰的核苷酸基团，其中每一个所述的基团实际上都可以包含少至一个核苷酸。这里使用的"未修饰的核苷酸"分别指在形成各核苷酸或核苷酸基团的核苷酸上没有任何前述的修饰，或具有与修饰的核苷酸和核苷酸基团的修饰所不同的修饰。本发明还包括未修饰的核苷酸的修饰，其中这样的未修饰的核苷酸实际上是以与修饰的核苷酸的修饰不同的方式修饰，可以与形成所述的未修饰的核苷酸的各种核苷酸或各种核苷酸连接基团相同甚至不同。修饰的和未修饰的核苷酸的模式可以是这样的，该链或序列的5'-端核苷酸以核苷酸的修饰的基团或核苷酸的未修饰的基团起始。但是，在一个备选实施方案中，5'-端核苷酸可以是由核苷酸的未修饰的基团形成。这种模式可以在干扰RNA的第一序列或第二序列或二者上实现。必须指出，siRNA双链体的目标互补链上的5'磷酸酯是siRNA功能所必需的，这表明细胞通过游离5'OH(它可以被磷酸化)检查siRNA的真实性，并仅允许这样的真实的siRNA指导目标RNA的破坏(Nykanen,等(2001)，Cell107，309-21)。优选地，第一序列显示出核苷酸的修饰的和未修饰的基团的一种模式，即核苷酸的修饰的核苷酸基团和连接基团的模式，而第二序列未显示出这种模式。在这样的范围内，即第一序列实际上在RNA干扰现象下的目标特异性降解过程中是更重要的，所以为了特异性的原因，'可以化学修饰第二序列，因为它在介导RNA干扰中不起作用，这可以是有用的。但是，本发明也包括第一序列和第二序列都有这种模式。优选地，第一序列和第二序列的修饰模式和非修饰模式是相同的。在一个优选实施方案中，形成第二序列且与第一序列的核苷酸的修饰基团对应的核苷酸基团也是被修饰的，而形成第二序列或第二序列的核苷酸的未修饰基团与形成第一序列或第一序列的核苷酸的未修饰的基团对应。这种可能性在图2A中示意性地说明。另外一个备选方案是，第一序列和第一链各自的修饰模式相对于第二序列和第二链各自的修饰模式存在相转移。优选地，该转移是，第一链核苷酸的修饰的基团与第二链核苷酸的未修饰的基团对应，反之亦然。这种可能性在图2B中示意性地说明。本方面还包括，修饰模式的相转移是不完全但重叠的，如图2C所示。在一个优选实施方案中，链和序列各自末端的第二核苷酸是未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸的起始基团。优选地，该未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸基团分别位于第一链和第二链的5'-端，更优选地第一链的5'-端。在另外一个优选实施方案中，未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸基团分别位于第一链和第一序列的5'-端。在一个优选实施方案中，模式由交替的单个的修饰的和未修饰的核苷酸组成。在本发明的该方面的另外一个优选实施方案中，干扰核糖核酸主题包含两链，其中2'-0-甲基修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸，优选地非2'-0-甲基修饰的核苷酸，以交替的方式整合在两链上，这意味着每一个第二核苷酸分别是2'-0-甲基修饰的和未修饰的核苷酸。这意味着第一链上的一个2'-0-甲基修饰的核苷酸后面是未修饰的核苷酸，它后面又依次是2'-0-甲基修饰的核苷酸，等等。2'-0-甲基修饰和未修饰的相同序列也在第二链上，其中优选地存在相转移，这样第一链碱基上的2'-0-甲基修饰的核苷酸与第二链上的未修饰的核苷酸配对，反之亦然。在短干扰核糖核酸(即短碱基配对的双链核糖核酸)的情况下，这种特殊的排列(即两条链上的2'-0-甲基修饰的和未修饰的核苷酸的碱基配对)是特别优选的，因为假设，虽然本发明的发明人希望不受下述理论的限制，即在两个碱基配对的2'-0-甲基修饰的核苷酸之间存在某^^斥力，这会使双链体、优选短双链体不稳定。关于特殊排列，这是优选的，如果反义链起始于在5'端的2'-0-甲基修饰的核苷酸，而因此第二个核苷酸是未修饰的，第三、第五、第七个等核苷酸因此又是2'-0-甲基修饰的，而第二、第四、第六、第八个等核苷酸则是未修饰的核苷酸。另外，希望不受任何理论的限制，似乎不包含任何修饰的反义链的5'末端的第二个、任选的第四、第六、第八个和/或相似位是特别重要的，而大多数5'末端核苷酸，即反义链的第一个5'末端核苷酸可以在任何奇数位存在这样的修饰，例如反义链的第一个、任选的第三、第五和相似位可以被修饰。在其它实施方案中，修饰的和非修饰的核苷酸各自的修饰和不修饰可以是这里所述的任何一个。虽然不限于此，发明的核糖核酸的双链结构，也称作双链体，分别是由第一链和第二链、或连续核苷酸的第一和第二序列形成。第一和第二序列各自的长度典型地是约15—约23个碱基，优选地17—21个碱基，更优选地18或19个碱基。在这方面应当指出的是，低于30个核苷酸、优选地低于21个核苷酸的长度不会使基本上能够显示出RNA干扰和干扰素反应的任何生物系统产生干扰素反应。其原因是观察到，当长度超煤30个碱基对的双链RNA结合并激活蛋白激酶PKR和2',5'-寡腺苷酸合成酶时，特定的细胞正在经历深刻的生理学改变。激活的PKR通过elF2a磷酸化阻止翻译，激活的2',5'-AS造成mRNA降解。在目标评价和动物模型中不希望发生这些作用，因为它们负面地影响表型的目标特异性降低。根本设计本发明的干扰核糖核酸的第六个策略，核糖核酸包含双链结构，所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，第一链的一个末端和第二链的一个末端通过环结构连接。在一个实施方案中，环结构由非核酸聚合物组成。这种非核酸聚合物可以是聚乙二醇或类似聚合物。非核酸聚合物原则上可以选自包含聚合物的组，所述聚合物不含有聚核苷酸且能使要连接的两条链可以实际上相互杂交。为了允许这样的杂交，连接两个相互杂交的序列的分子或分子部分必须具有某种分子结构或分子柔性，以允许分子的弯曲，从而使两个序列能紧密接触并形成允许杂交的三维定向。这样的分子或部分真正地作为铰链。原则上，满足该要求的任何分子都可以用于本发明。除了聚乙二醇外，还可以使用基于氨基酸的分子。这样的基于氨基酸的分子可以是同源聚合物或异源聚合物。有用的实例是由7个甘氨酸残基组成的同源聚合物，它允许生成要求的铰链，以如需要使两个序列近距离杂交。基于甘氨酸的铰链记载在，例如GuanK.L.和DixonJ.E.(1991)，AnalBiochem.192，262中。在另外一个实施方案中，铰链可以通过本领域已知的冠醚形成。在一个备选实施方案中，环由核酸组成。如这里使用的，如在Elayadi和Corey(2001)CurrOpinInvestigDrugs.2(4):558-61.综述；Orum和Wengel(2001)CurrOpinMolTher.3(3):239-43中记载的LNA和PNA被认为是核酸，也可以用作成环的聚合物。基础地，第一链的5'-末端可以连接到第二链的3'-末端。作为备选方案，第一链的3'-端可以连接到第二链的5'-末端。形成所述环结构的核苷酸序列通常被认为不是关键的。但是，由于空间原因，形成该环的核苷酸序列的长度好像是关键的。因此，最小4个核苷酸的长度好像适合形成需要的环结构。原则上，不限制形成铰链或要杂交的两个序列之间的连接的核苷酸的最大数目。但是，聚核苷寧越长，二级结构和三级结构更容易形成，从而影响，求的序列定向。优选地，形成铰链的核苷酸的最大数目是约12个核苷酸。本发明的内容包括，上述的任何设计都可以组合第六个策略，即以能通过环结构或类似结构产生后折叠(环)的方式共价地连接两条链。发明人已经意外地发现，如果环是位于反义链的3'端，即根据本发明的核糖核酸的第一链，这类RNAi的活性比在反义链的5'端的环位置更高。因此，与反义链和有义链(即第一链和第二链)分别有关的特殊环排列是至关重要的，因而这与现有技术所表述的理解(即认为与定向无关)相反。但是，根据这里所述的实验结果，这好像是错误的。现有技术所表述的理解是基于一个假设，即在加工任何RNAi的过程中产生非环连接的RNAi。但是，如果这是正确的，就不能解释清楚地观察到的具有反义链的3'端环的那些结构的增加的活性。迄今为止，在这种小的干扰RNAi的5'—3'方向的优选排列是第二链-环-第一链。相应的结构可以整合到合适的载体系统中。优选地，该载体包含用于表达RNAi的启动子。相应的启动子优选地是poim，启动子更优选地是Good等(1997)GeneTher,4,45-54中所述的U6、Hl、7SK启动子。由于干扰RNA概念的普遍应用和编码核苷酸(例如mRNA)的降低或敲除，通过使用根据本发明的任何核糖核酸分子，在其表达过程中可以修饰产生这样的RNA的任何基因。由于该基础的和普遍的应用机制，可以实现任何基于此的应用，其暗示基因的降低或敲除。优选的应用是发明的核糖核酸在目标认证中的应用。这里使用的"目标认证"是指一种方法，它包括采取步骤证明DNA、RNA或蛋白分子是直接地参与生物学过程，优选以参与疾病或非标准病症为原因的过程，和因此是开发新的治疗化合物的合适目标。序列的同源性研究已经成功地将基因归类到目标家族中。需要以有效的方式完成艰巨的任务，即解密这些目标中的哪一些是疾病中的重要因素，哪一些应当用于后续的药物开发。因此，基因表达的降低应当减少约50—100%(优选90%)以观察到对表型的显著影响。在其它依赖于基因的情况下，小至20%的降低可能足以产生表型。通过对比含有功能性RNAi分子的细胞与含有非功能性RNAi分子的细胞来定义表型。这能确保显著的读出，即使在仅仅部分地抑制蛋白功能的条件下。mRNA减少的程度与表型改变的范围通常没有线性关系。必须承认，对于一些蛋白而言，减少约20%的蛋白就足以产生表型的改变，而分别对于其它基因和mRNA，少至5—10%的剩余蛋白就足以维持观察到的表型。根据本发明的核糖核酸分子的其它的应用是，其在生产药物中的应用或其作为药物的应用。这样的药物可以用于治疗和/或预防疾病或病症，例如任意类型的癌症，其中的基因和其产物己经与该疾病的发生、起因或进程相关联。另外，这样的药物可以用于治疗疾病，其中基因产物的存在或过表达造成病理表型。在一个优选实施方案中，疾病的特征在于功能增加，并且可以通过应用或施用相应的生物活性的RNAi来补偿。可以使用包含这里所述的核糖核酸的药物治疗疾病或病症，它们可以选自包含癌症、心脏病、代谢病、皮肤病、炎症疾病、免疫系统疾病和自身免疫疾病的组。各种形式的癌症包括但不限于实体瘤和造血系统瘤，例如恶性胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和白血病。代谢病包括但不限于肥胖症和糖尿病。皮肤病包括但不限于银屑病。在另外一方面，根据本发明的核糖核酸分子可以用作诊断剂，优选用于与上述疾病和病症有关的指定的那些疾病。这样的诊断可以基于这一发现，即将根据本发明的核糖核酸分子应用到样品(它优选地含有细胞)上，会发生样品表达模式的改变。优选地，该样品含有来自受试者的细胞，所述受试者假设可能表现出待治疗的所述疾病或病症或其倾向。根据本发明的核酸的其它应用是它们在筛选药学上有活性的化合物和/或先导化合物优化中的应用。进行后者是为了例如监视或检测备选药物(例如小分子)的效果，并将所述备选药物产生的效果与通过施用特异性RNAi观察到的效果作对比，所述的RNAi的设计基础是这里公开的原理。在这样操作的过程中，具有偏离目标效果的备选药物可以从筛选过程中删除，而那些产生相似的或等同的表型的备选药物则被认为是高度地相关的先导化合物，或可能甚至是药学上有活性的化合物自身。在该方法中，高度特异性的RNAi分子作为黄金标准，据此检测备选药物。另一方面，本发明涉及一种细胞，优选降低的细胞，它含有这里公开的核糖核酸。这样的细胞优选地是在组织或甚至器官中分离或含有的细胞，所述的组织或器官又优选地在生物中不含有。但是，该细胞也可yl在生物中含有。该细胞优选地是参与要用本发明的核糖核酸治疗的疾病或病症的细胞。为了说明功能上的关系和检测下游目标，这种降低的细胞可以用于产生基于如mRNA或蛋白的表达模式。另一方面，本发明涉及含有这里公开的核糖核酸的生物。优选地，该生物是脊椎生物；更优选地，该脊椎生物是哺乳动物。这里使用的"哺乳动物"特别是但不限于猿、狗、猫、山羊、绵羊、猪、豚鼠、兔子、小鼠、大鼠和人。另一方面，本发明涉及含有根据本发明的核糖核酸的组合物。优选地，该组合物包含阴性对照和阳性对照，它们与有效的核糖核酸或其分离物相组合。该组合物还可以包含溶剂，优选缓冲剂。另一方面，本发明涉及含有根据本发明的核糖核酸和可药用载体的药物组合物。可药用载体是本领域技术人员已知的，特别包括稀释剂、缓冲剂等。药物组合物还可以包含药学上有活性的化合物。要使用根据本发明的核糖核酸分子治疗的疾病或病症优选地是现在已经在治疗所述疾病或病症方面使用的那些。由于根据本发明的核糖核酸分子的不同作用模式和根据现有技术用于治疗所述疾病和病症的药物，可以发生协同作用。现在参考附图和实施例进一步解释本发明，从中可以看出本发明的其它的特征、实施方案和优点。图1显示了定义这里使用的术语的示意图。两条链中上面的一条为第一链和目标核酸(例如mRNA)的反义链。第二链是其序列基本上与目标核酸对应，并从而形成有义链。第一链和第二链形成双链结构，典型地通过WatsonCrick碱基配对。图2说明了本发明的带有修饰的或未修饰的核苷酸基团模式(它们在这里也被称作修饰模式)的核糖核酸分子的一些实施方案。核苷酸的修饰的基团在这里也被称作修饰的核苷酸的基团。如此处使用，在这里称作核苷酸的连接基团的未修饰的核苷酸或核苷酸的未修饰的基团还可以具有一个或多个这里所述的修饰，但是它们不同于形成修饰的核苷酸基团的核苷酸的修饰。在图2A中，修饰的和未修饰的核苷酸基团(即第一序列和第二序列上的修饰的核苷酸基团和核苷酸的连接基团)位于序列的相应部分，并这样相互匹配(第一链上的修饰的核苷酸基团与第二链上的修饰的核苷酸基团匹配，第一链上的核苷酸连接基团与第二链上的核苷酸连接基团匹配)；而在图2B中，第一链上实现的模式也在第二链上实现，但是存在的相转移使第一序列的修饰的核苷酸基团与第二序列的未修饰的核苷酸基团进行碱基配对，反之亦然，结果。第一链上的修饰的核苷酸基团与第二链上的核苷酸连接基团相匹配。在图2C中实现了排列修饰的和未修饰的核苷酸基团的另外一种可能性。本发明也包括，第一序列的模式独立于第二序列的模式，通过碱基配对定义的双链结构中的两个模式根据相对位置部分地相互重叠。在另外一个实施方案中，该重叠的范围可以分别根据序列和链的长度而变化。图3显示了使用具有不同末端保护基团的RNAi分子的降低实验的结果。更具体地，图3A表明，各种形式的末端保护的RNAi分子对PTENmRNA的降低是有作用的。图3B显示了在实验中使用的不同RNAi分子的序列，实验结果如图3A所示。图3C显示了用修饰的RNAi分子处理后PTEN蛋白与PTEN特异性的反义构建体相比的免疫印迹分析。图4表明RNAi分子的3'突出端对RNA干扰是不重要的。更具体地，图4A显示了不同RNAi分子的剂量反应曲线，图4B显示了在实验中使用的RNAi分子的序列，实验结果如图4A所示。图5表明RNAi分子的双链体长度必须是至少18—19个核苷酸。更具体地，图5B显示了在实验中使用的PTEN特异性的RNAi分子的序列，实验结果如图5A所示的剂量反应曲线。图6表明在长度为19个核苷酸的RNAi分子中的四个末端错配的核苷酸对介导Aktl降低仍然有作用。更具体地，图6B显示了在实验中使用的RNAi分子的序列，实验结果如图6A所示。图7显示了对双链体长度要求和对siRNA中的突变的耐受的进一步结果。更具体地，图7A显示了使用的各种构建体(左区)和相对于在介导量的siRNA分子中使用的pllOa的表达对HeLa细胞中的AktlmRNA表达的抑制的各自影响(右区)。在错配的siRNA分子中的核苷酸改变以箭头标明3'脱氧核苷酸，如果有则以大写字母标明。图7B显示了各种PTEN特异性的siRNA(左区)，不同量的siRNA对HeLA细胞中的PTENmRNA表达的抑制表示为PTEN/pllOa比(中区)，图7C的Western印迹分析说明了分别48和96小时后使用PTEN特异性的siRNA(30nM)和各错配siRNA对PTEN蛋白表达的抑制，使用plOOa作装载对照。图8显示了经2'-0-甲基化赋予RNAi分子的在血清中稳定性的研究结果，并表明末端修饰对RNAi的稳定性没有有益作用。更具体地，图8A显示了与胎牛血清孵育的图8B所示的各种RNAi分子的凝胶电泳结果。图9表明氨基末端修饰会导致活性的减少。图9B显示了在实验中使用的特殊RNAi分子，实验结果如图9A所示，表达为PTEN/pllOa表达水平比。图9C显示了可以从图9A所示的结果推导出的设计原则。如在图9C中使用的，术语"有作用的"指在实施例所述的特殊分析系统中是功能上有活性的，"无作用的"指在所述的系统中是功能上无活性的。图10表明2'-0-烷基(甲基)修饰能稳定RNAi分子，但是也会降低它们的活性。更具体地，图10C显示了在实验中使用的RNAi分子的序列，实验结果如图10A所示的剂量反应曲线。图10B显示了与胎牛血清孵育2小时的图10C所示的各种RNAi分子的凝胶电泳结果。图11显示了用2'-0-甲基修饰阻断的RNAi分子的功效实验结果。图IIA用剂量反应曲线图示地说明了所述实验的结果，图IIC显示了在所述实验中使用的特殊RNAi分子的序列。图11B显示了与胎牛血清孵育2小时的图llC所示的各种RNAi分子的凝胶电泳结果。图12表明交替的2'-0-甲基修饰使修饰的RNAi分子比未修饰的形式有活性。更具体地，图12B显示了在该实验中使用的RNAi分子的序列，实验结果如图12A所示。图12C显示了所述的RNAi分子在血清中孵育2小时后的稳定性。图12D显示了将不同RNAi分子应用到HeLa细胞时PTEN蛋白的免疫印迹。从中可以看出，交替修饰的RNAi分子被稳定化后能耐受核酸内切酶的降解，在介导PTEN蛋白的降低中也有活性。图13显示了Western印迹分析以检测PTEN蛋白降低的时间进程的结果。使用阳离子类脂，以2'-0-甲基修饰的相对未修饰的RNAi分子连续转染细胞72小时。48和120小时后制备蛋白裂解物并通过免疫印迹和分析。在96小时和120小时的时间点，在没有RNAi分子的条件下将细胞分离、重新涂平板并孵育另外的24和48小时。一图14显示了说明持续使用交替修饰的RNAi分子相对未修饰的RNAi分子PTEN蛋白降低的Western印迹。转染只进行了5小时，加入无转染试剂的新培养基。在用所述的RNAi分子转染后的72小时和96小时，通过免疫印迹分析裂解物。图15表明带有不同的2'-0-甲基核糖核苷酸修饰的siRNA分子显示出增高的在血清中的稳定性，并且介导HeLa细胞中的蛋白降低。更具体地，图15A表明了使用的各种siRNA分子构建体(左区)，其中2'-0-甲基核糖核苷酸修饰标有下划线，并在序列中以粗体标示。对在用标示量的修饰的siRNA分子转染的HeLa细胞中的PTENmRNA表达的抑制表示为PTEN/pllOa比，并标示在右区。图15B的左区显示了使用的各种siRNA构建体，右区显示了在血清中孵育后的修饰的和未修饰的siRNA分子的PAA凝胶电泳；含有2'-0-甲基核糖核苷酸的各种构建体以下划线标示并以粗体打印。图15C显示了说明使用分别图15A和15B所示的各种siRNA构建体(30nM)对PTEN蛋白表达的抑制的基于SDS-PAGE的免疫印迹。另外，pll0a用作装载对照。最后，图15D是说明48和128小时后施用不同的2'-0-甲基核糖核苷酸修饰的siRNA分子(30nM)的延长的蛋白降低(即PTEN蛋白表达的抑制)的免疫印迹。如图15C所示，pll0a用作装载对照。图16表明，带有对Aktl和pllO卩mRNA特异性的不同2'-0-甲基核糖核苷酸修饰的siRNA分子显示出增高的在血清中的稳定性，并且介导HeLa细胞中的蛋白降低。更具体地，图16A的左区标示使用的各种构建体，其中2'-0-甲基核糖核苷酸标有下划线并以粗体打印。标示的siRNA分子在血清中孵育后的完整性显示在右区。图16B显示了用标示的siRNA(30mM)转染细胞后的Aktl、Akt2和Akt磷酸化和p110用作装载对照的免疫印迹。图16C显示了标有下划线并以粗体打印具有2'-0-甲基修饰的各种pll0f3特异siRNA构建体(左区)，和所述的siRNA构建体抑制下游激酶Aktl的磷酸化的免疫分析结果(右区)。pll0a已经用作装载对昭。/"、o图17的剂量反应曲线显示了具有发夹结构的各种RNAi分子的功效，而图17B显示了所述RNAi分子的结构，其结果如图17A所示。含有不同环的合成siRNA在减少p110(3、Aktl和Akt2表达中起作用。(14A)在siRNA转染的HeLa细胞中pllOpmRNA表达的抑制。在标示的siRNA转染后24小时，平行地分析样品中的pllOPmRNA表达水平。示意性地显示了转染的双分子siRNA(具有3'TT突出端的21mer，分子IAB)或具有环结构的单分子siRNA。注意到在3A、4A相对于3B、4B中相对于反义序列的环(HIV衍生的pA-环；(A)u-环)的位置是相反的。2ABsiRNA分子在21mer双链体中含有6个错配，并和未处理的样品一起作为阴性对照。制备RNA后对其进行实时RT-PCR(Taqman)分析。显示了相对于作为内部参考的pllOamRNA水平的p110(3mRNA水平。每一个条代表三次转染(土标准偏差)。在生长培养基中以标示浓度的siRNA在50%汇合(2500细胞/96孔)时转染HeLa细胞。图18的剂量反应曲线显示了具有分子间环结构和分子内环结构的各种RNAi分子的功效。(18A)在siRNA转染的HeLa细胞中的AktlmRNA表达的抑制。在标示的siRNA转染后24小时，平行地分析样品中的Aktl和Akt2mRNA表达水平。示意性地显示了不同环(A-环；GAGA-环和聚乙二醇(PEG)-连接物)和它们的推定二级结构。siRNA分子9A对Akt2是特异性的，并作为阴性对照。注意到IOA和10B不含有自身互补序列，并组合转染。显示了相对于作为内部对照的pll0|3mRNA水平的AktlmRNA水平。(18B)在标示的siRNA分子转染的HeLa细胞中的Akt2mRNA表达的抑制。显示了相对于pll0卩mRNA水平的Akt2mRNA水平。Aktl特异分子7A在这里作为阴性对照。图18C显示了Akt蛋白的Western印迹分析，它说明了含有不同环的合成siRNA在特异性地降低Aktl和Akt2表达中的作用。通过免疫印迹分析了Aktl和Akt2蛋白表达的抑制。标示的发夹siRNA(20nM)转染后48小时收集细胞。通过SDS-PAGE分离细胞提取物，并通过使用抗-p110抗体、抗Aktl/2的免疫印迹进行分析。用特异于磷酸化形式Aktl的抗体得到了类似结果。左边标明了pllOa(PI3-激酶的另外一个催化亚基，它用作装载对照)、Aktl、Akt2和磷酸化的Akt(P、Akt)的位置。图19显示了NH2修饰(这里也称作氨基修饰)，它可以存在于3'-OH末端核苷酸或5'末端核苷酸。氨基通过垸基连接到磷酸基上，后者又连接到糖部分的OH基团，所述的烷基包含l一8个(优选6个)碳原子的烷基链，其中连续磷酸基的第2个碳原子具有与其相连的CH20H基团。作为备选，连接物可以由醚形成，其中该醚有两种醇组成，其中的一种醇是氨基醇，另外一种是二醇，该二醇的一个醇基参与形成醚基，另外一个是位于任一个碳原子上的OH基，优选地在相对于磷酸基的第2个碳原子上。实施例l:合成的双链体RNAi分子的剂量反应在该实施例中研究了NH2末端保护基团对双链体RNAi分子活性的影响。合成的siRNA购自Biospring(Frankfort,Germany)。将核糖-寡核苷酸重新悬浮于无核糖核酸酶的TE中至终浓度为50pM。关于双分子siRNA分子的情况，组合等份试样(100nM)至终浓度为50pM。为了形成分子内双链体，将siRNA在退火缓冲液(25mMNaCl;5mMMgCl2)中、在5(TC孵育2分钟，冷至室温。根据生产商的说明，通过使用各种阳离子脂质侈!j如01igofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,CO)或FuGene6(Roche)，在96孑L或10cm平板中进行转染(30%—50°/。汇合)。通过将预制的5倍浓缩的退火RNAi和无血清培养基中的脂质的复合物加给完全培养基中的细胞来转染RNAi分子。在转染前，在转染96孔形式前15—18小时，将2500HeLa细胞分布到每个孔中。分布在96孔中的细胞的总转染体积是100^，在10cm平板中的细胞的总转染体积是10ml。根据细胞密度，最终的脂质浓度为0.8—1.2吗/ml;在每个实验中都说明了RNAi浓度。允许在37t:形成复合物30分钟。将复合物加给细胞，产生最终lx浓度的脂质和RNAi。根据在转染后进行的分析，使用标准细胞裂解缓冲液裂解细胞以提取蛋白(Klippd，A.，Escobedo，J.A.，Hirano，M.和Williams,L.T.(1994).MolCellBio114，2675-2685)，或根据RNA分离试剂盒(Invitek，Berlin,德国)用变性缓冲液分离RNA，转染后24—48小时进行RNA分析，转染后48—72小时通过Western印迹迸行蛋白分析。通过Taqman分析检测相对量的RNA水平转染后24小时，使用InvisorbRNAHTS96试剂盒(InVitekGmbH，Berlin)分离并纯化96孔中的转染的细胞的RNA。使用300nMPTEN5'弓|物CACCGCCAAATTTAACTGCAGA、300nMPTEN3'弓|物AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT和100nMPTENTaqman探针Fam-TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA-Tamra,并结合40nM(3-肌动蛋白5'引物GTTTGAGACCTTCAACACCCCA、40nMp-肌动蛋白3'引物GACCAGAGGCATACAGGGACA和100nM卩-肌动蛋白Taqman探针Vic-CCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG-Tamra，通过实时RT-PCR(Taqman)分析检测PTENmRNA表达的抑制。Akt引物和探针按照Sternberger等(Stemberger，a.a,O.)的方法检测，并根据生产商的说明书(AppUedBiosystem;useofAmpliconSet)使用。还可以使用软件程序PrimerExpress(AppliedBiosystem)设计所述的引物和探针。在50pl中进行反应，根据生产商的说明书在ABIPRISM7700序列检测器(AppliedBiosystems)上进行分析，条件如下在48。C进行30分钟，在95。C进行10分钟，随后进行40个下述条件的循环在95。C进行i5秒和在6(TC进行1分钟。通过HeLa细胞的实时RT-PCR分析显示RNA降低，所述的HeLa细胞由21nt长的未修饰的和在1.0pg/ml的脂质载体浓度用NH2或反转的无碱基基团在5'-端修饰的siRNA双链体分子转染。细胞密度为2000细胞/孔。3'-端的修饰是RNA突出端、带有氨基基团的RNA突出端或DNA突出端。细胞提取物的制备和免疫印迹。用冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞2次，在含有20mMTris(pH7.5)、137mMNaCl、15%(体积/体积)甘油、1%(体积/体积)NonidetP-40(NP-40)、2mM苯基甲基磺酰氟、10mg抑酶肽/ml、20mM亮抑蛋白酶肽、2mM苄脒、1mM钒酸钠、25mMP-甘油磷酸酯、50mMNaF和10mMNaPPi的裂解缓冲液中于4'C裂解。通过以14,000xg离心5分钟清除裂解产物，通过Western印迹分析含有等量蛋白的等分试样细胞提取物的蛋白表达通过SDS-PAGE分离样品，转移到硝酸纤维素滤膜上(Schleicher&SchueU)。滤膜在含5%(重量/体积)奶粉的TBST缓冲液(10mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，0.05%(体积/体积)Tween20，0.5%(重量/体积)叠氮化钠)中封闭。将各抗体以合适的稀释度加入TBST。在TBST中用抗-小鼠-或抗-兔-缀合的辣根过氧化物酶(TransductionLaboratories)检测结合的抗体，洗涤，使用SuperSignalWestDura(Pierce)或ECL(Amersham)化学发光基质(c.f.Stemberger等(2002),Antisense.Nucl.Ac.DrugDev.inpress)显影。抗体。鼠单克隆抗-pllO抗体U3A和鼠单克隆抗-p85抗体N7B已经有记载(Klippd等，1994，aaO)。通过细胞信号技术得到兔多克隆抗-Akt和抗-磷酸基Akt(S473)抗体。鼠单克隆抗-PTEN抗体来自SantaCruzBiotechnology。PTEN53特异性的反义分子(即geneBloc)记载于Sternberg等[Sternberger，上文]，它具有下述序列(ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga)，其中小写的核苷酸是核糖核苷酸，而大写的核苷酸则是脱氧核糖核苷酸。该反义分子也与无TT的RNAiIA相同。结果显示在图3A中，各RNAi分子在图3B中，它们指向PTEN的mRNA。小写的核苷酸代表核糖核苷酸，而大写的核苷酸则代表脱氧核糖核苷酸。术语"NH2"表示核糖核苷酸的3'-位被氨基基团修饰。在这里公开的本实施例和其它实施例中使用的RNAi分子也称作小的干扰RNA分子siRNA。应当指出，在这里包含的任何图中，上链是反义链或第一链，而下链则是干扰RNA分子的有义链或第二链。从图3A中可以看出，当修饰位于反义链的3'端时，核酸末端OH基团的氨基末端修饰(例如氨基修饰)和反转的无碱基修饰与未修饰的末端一样有效(参见图8A;8B)。因此，当位于3'OH时，特别是当3'OH位于突出的核苷酸时，能够在无活性损失的情况下耐受使稳定或具有其它有益性能(输送)的化学修饰。关于图3C所示的实验，使用的条件与上面描述的类似。RNAi的第一链和第二链由NH2基团在核糖部分的3'-位修饰或由反转的无碱基在该位修饰。第一个构建体设计成siRNA-NH2(3A3B)，第二个设计成siRNA-iB(4A4B)。两个分子的序列如图3B所示。术语"3A3B"表示干扰核糖核酸由作为反义链的链3A和作为有义链的链3B组成。为了对比的原因，生成了指定为GB53(Steinberger等，上文)的反义寡核苷酸，它也指向PTENmRNA。该后一实验的特殊性如下。从图3C可以看出，图3B所示的末端保护的RNAi分子在产生PTEN蛋白的降低方面是有作用的。从该实施例可以看出，两个末端保护的基团使RNAi分子在降低PTEN蛋白中具有活性。该抑制与反义构建体的抑制一样有效，但是使用浓度更低，该优点明显超过已有的非常有效的反义技术。实施例2:体内RNAi双链体活性对突出端的要求实验方法与关于实施例1的描述相同，只是不同地设计了靶向PTENmRNA的干扰RNAi分子。结果如图4A的剂量反应曲线所示，图4B显示了用于产生图4A所示的数据的干扰RNAi分子的特殊序列和修饰。命名是这样的，如RNAi18是由作为反义链的链18A和作为有义链的链18B组成。对比了平端分子在降低HeLa细胞中的PTENmRNA方面的活性与具有3'-突出端(RNAi18)和5'-突出端(RNAi30和RNAi31)的分子的活性。平端分子(RNAi28)和具有5'-突出端的分子的活性可以比得上具有3'-突出端的分子的活性。这表明3'-突出端对于RNAi不是基本的。实施例3:对于体内RNAi活性干扰RNA分子双链体长度的要求实验方法与关于实施例1的描述相同，只是干扰RNA分子指向Aktl的mRNA。显示RNAi分子特异性的阴性对照还是pllOmRNA。实验结果如图5A所示，使用的干扰RNAi分子的细节如图5B所示。用图7A的左区所示的其它的siRNA构建体进行了类似实验，其中的箭头标出了错配，脱氧核糖核苷酸用大写字母表示。用标示量的siRNA分子转染的HeLa细胞中的AktlmRNA的表达抑制如图7A的右区所示。来自用不同的RNAi分子转染的HeLa细胞的AktRNA的Taqman分析表明，siRNA分子的双链双链体的长度必须超过17个碱基对才能显示出活性，而有17个碱基对长或更短的双链体的分子则没有作用，即使添加了序列特异性的突出端。成功地实验了的最短的RNAi分子的长度是18一19个核苷酸或碱基对。应当指出，称作RNAi51的干扰RNA分子51A/51B的设计对应于国际专利申请WO01/75164中所述的。RNAi分子55A/55B包含17个核苷酸的序列，且在降解AktlmRNA方面具有明显降低的活性。从图7A中可以看出，19nt长的双链体在降低不依赖于3'突出端的性质(脱氧-或核糖核苷酸)的AktlmRNA水平中高度有效(对比分子1AB、2AB、3AB、4AB)。17个核苷酸长的siRNA(分子5AB)显著地减少了沉默活性，这确证了上述的理解，即有活性的siRNA双链体应该是至少18nt或更长。不受任何理论的约束，该结果可以从机制上由两种不同的要求来解释。首先，siRNA的反义链和目标mRNA之间的最小18nt的碱基配对可以是必须的，或者其次，整合进RNA诱导的沉默复合物(RISC)需要最小长度的siRNA双链体。为了说明该问题，合成了相对于野生型序列有1和2个末端突变(CG和UA反转)的19nt长的siRNA双链体分子(分子6AB和7AB)。两个分子，即使具有与目标mRNA配对的仅15nt碱基的序列的分子，在诱导AktlmRNA水平中是有作用的。因此可以i得出结论，好像是双链体长度本身(但不是反义'siRNA与目标mRNA之间的碱基配对)决定了有作用的siRNA的最小长度b这表明，双链螺旋的长度是整合进RISC复合物的重要决定齿素。在siRNA双链体的末端导入的错配对RNA干扰的影响较小。在得到的实验结果下，因此，实现最佳的RNAi介导的干扰的最小要求是18或,19个核苷酸的双链体长度，这独立于其它的通常可用于RNAi分子的RNAi分子设计，例如平端或5'-突出端或这里所述的任何其它形式。但是必须承认，RNAi分子的特殊设计可以赋予所述的分子其它优点，例如分别是增加的效率和增加的稳定性。实施例4:对于体内RNAi的目标-反义同源性的要求实验设置与实施例1描述的相似，其中RNAi是对AkU特异性的。另外，设计了PTEN特异性的干扰RNA分子，并用作阴性对照。结果如图6A和图6B所示。使用图7B所示的其它siRNA分子进行了基本上相同的实验，结果分别如图7B(右区)和图7C所示。己经建立了有作用的siRNA分子的最小双链体长度为18个或超过18个核苷酸后，我们已经提出了一个问题在目标mRNA和siRNA之间有多少配对的核苷酸是沉默活性所必须的。在Akt1的例子中，如AktlRNA的Taqman分析所示，与目标RNA准确配对的19一15个核苷酸序列足以介导RNAi活性。PTEN特异性的RNAi分子不能减少Aktl的RNA量，这证实了该方案的特异性。在链任一端或两端的一个或两个核苷酸错配是有作用的，这表明目标mRNA和RNAi之间的15nt的同源序列足以形成基因沉默。从这些数据可以得出结论，通过非特异性的结合到无关目标上，能随机发生非特异性的基因沉默。这基于一个理解，考虑到脊椎动物的基因组或转录物组的复杂性和大小，即有1517个配对碱基对的序列对单个基因无特异性且随机发生。除了上述的实验之外，随后还分析了错配的位置。为此目的，使用了指向PTENmRNA的19nt长的平端siRNA。在一个siRNA链中的序列改变由另外一链中的互补性改变予以补偿，以防止破坏双链体的形成。从图7B和C分别可以看出，在分子中心仅有一个点突变的siRNA严重损害其利用mRNA和蛋白表达水平的能力。该结果表明，RNA机器对双链体中心的目标mRNA和siRNA之间的准确的和不准确的碱基配对是高度辨别的。这种对目标和siRNA之间的准确互补性的极端依赖已经用来解释果蝇系统中的RNAi干扰。但是，还没有与哺乳动物系统(例如HeLa)关联起来。基于这一观察，本发明通过两个方案减少了siRNA的这种偏离目标的问题。首先，通过将siRNA分子的分子长度减少至最小要求(18-19nt)，由此减少偏离目标的同源性机会。其次，通过使有义链失活来防止不想要的由有义链和无关目标RNA的意外互补性造成的RNA沉默(还参见实施例6)。实施例5:修饰的RNAi分子在血清中的稳定性将寡核苷酸在人血清中孵育15分钟和2小时，与未处理的对照装载到10%聚丙烯酰胺凝胶上。结果如图8A所示。使用的各种RNAi分子更详细的显示和记录在图8B中。'从该实施例可以看出，所有的核苷酸都用2'-0-甲基基团修饰的RNA分子的RNAi双链体(RNAi分子79A79B和28A28B)在血清中具有更高的稳定性。它也表明，平端双链体比带有突出端的双链体分子更稳定。从该结论可以得出，末端保护(例如iB或氨基)不能增加在血清中的稳定性。另外，还可以得出结论，与提交本申请之前的现有技术中的理解相反，核酸内切酶(而不是核酸外切酶)在RNAi分子的保护中更重要。鉴于此，除了在本申请中公开的发明的RNAi分子的各种修饰或设计外，其它的或另外的核苷酸修饰可以是使用RNAi分子的完全的或部分的硫代磷酸酯骨架，以抑制核酸内切酶的功能。完全的硫代磷酸酯骨架是指任何核苷酸带有硫代磷酸酯基团，而部分的硫代磷酸酯骨架是指并非形成RNAi分子的所有核苷酸都带有硫代磷酸酯修饰。该修饰适用于增加RNAi分子的寿命，这与RNAi分子的其它设计无关。在这方面，部分地或完全地用硫代磷酸酯骨架修饰的RNAi用于本发明，它们可以通过结合这里公开的干扰RNA分子不同设计策略或现有技术中的任何已知设计来实现。实施例6:在5'和3'端的NH2末端保护基团对有义链的灭活实验设置与关于实施例1的描述相似，目标核酸序列是PTENmRNA。HeLa细胞的浓度为2,000细胞/L。用不同修饰的RNAi分子转染后，通过Taqman实验分析PTEN的RNA。使用的不同干扰RNA分子如图9B所示，而实验结果如图9A所示。从图8A中的各种RNAi分子的剂量反应曲线可以看出，当有义链(即第二链)的两端被氨基基团修饰时，RNAi分子是有作用的。特别有效的是RNAi分子20A26B、18A26B和28A26B。RNAi分子26A26B表现出最低活性，它对应于在双链体的所有4个末端上的末端修饰(Tuschl是18AB)。但是，当反义链(即第一链)仅在3'端上修饰、在5'端保留游离OH基团时(RNAi构建体22A26B;20A26B)，也可以实现RNAi活性。当反义链在5'和3'端两端都有氨基基团修饰时(26A26B)，则无活性。这就得出结论，反义链的任何一端(更具体地，反义链的5'端)应当无修饰。另外，值得一提的是，NH2末端修饰可,以用于在5'和3'端使有义链失活，从而减少其它有作用的有义链介导的偏离目标作用，它会明显增加RNAi分子的特异性，这对于目标验证和RNAi分子的任何其它医学应用都是有益的。从该实验中得出的其它概括性结果如图9C所示。因此，功能上有活性的RNAi是在反义链上无氨基修饰或只在反义链的3'端有氨基修饰的那些，而在反义链的两端都有氨基修饰的则是无作用的，即不能导致目标mRNA的降低。实施例7:RNAi分子的2'-0-甲基修饰对核酸内切酶保护的影响在用指向PTENmRNA的RNAi双链体分子转染的HeLa细胞上，使用实时RT-PCR分析，再次显示了如图10A所示的RNA降低。实验方法基本上与关于实施例1的描述相同。研究的RNAi分子的结构如图IOC所示，它们的剂量反应如图IOA所示。以粗体打印的核苷酸具有2'-0-甲基修饰。图10A中显示的各种RNAi分子的剂量反应曲线说明，内部2'-0-烷基基团降低RNAi活性。优选地，这样的2'-0-烷基基团是2'-0-甲基或2'-0-乙基基团。但是，含有未修饰的核苷酸的分子与2'-0-烷基修饰相组合则显示出显著活性。如图10A所示，当反义链都被2'-0-甲基基团修饰且有义链无修饰时(例如RNAi分子79A28B)则无活性。从图10B所示的稳定性实验(例如将各种RNAi分子在血清中孵育)的结果可以看出，2'-0-垸基修饰使RNAi分子稳定化、抗降解。但是，该明显的有益效果被通常会导致减少的降低活性的2'-0-烷基修饰的作用抵消到至少某种程度。因此，RNAi分子的设计必须平衡活性的稳定性，这使意识到本申请公开的各种设计原则变得重要。实施例8:阻止内部2'-0-甲基修饰对RNAi分子在血清中的稳定性的影响该研究的实验方案实际上与实施例l所述的相同。另外，在用不同剂量的RNAi分子转染的密度为2000细胞/孔的HeLa细胞上，通过实时RT-PCR分析PTENRNA。将RNAi分子在血清中孵育2小时，在10%聚丙烯酰胺凝胶上分析。该研究的结果如图IIA至IIC所示，其中图11A显示了图llC所示的各种RNAi分子的剂量反应，图11B显示了使用一些图11C所示的RNAi分子的稳定性实验的结果。应当承认，在图nc中以粗体书.写的核苷酸带有修饰，在本申请中它是在核苷酸的核糖部分的2'-0-甲基修饰。未修饰的RNAi分子有剂量依赖性抑制。这也表明，核心9个核苷酸的2'-0-甲基修饰使RNAi在血清中稳定，并且使双链体在介导导致PTENmRNA降解的干扰现象中有活性。有义链的总修饰使RNAi分子在血清中稳定并且具有一定的活性。交替地阻止带有2'-0-甲基修饰的5个核苷酸使RNAi分子在血清中稳定，并且具有对PTENRNA的活性，这可以通过将RNAi双链体在血清中孵育2小时并将样品上样到10%聚丙烯酰胺凝胶证实。从图11B可以看出，包含链80A和80B的双链体在血清中孵育2小时后被明显降解。由链82A和82B组成的双链体证实了该结果，即包含反义链的第一链的5'-端不应该在5'-端核苷酸被修饰(将82A82B与反向的81A81B对比)。这也被得到的另一结果所证实，它具有由链86A和86B组成、在血清中有活性且稳定的双链体。值得注意的是，在反义链的5'末端有未修饰的阻断的分子更有活性，而5'端OH基团优选地不是衍生的。使用核苷酸的2'0-甲基修饰的不同修饰模式进行了其它实验。其结果如图12A至12C所示，并在这里的实施例9中进一步讨论。实施例9:交替的内部2'-0-垸基修饰对RNAi分子的血清稳定性的影响进行这类研究的实验设置分别与实施例1和实施例8所述的研究中使用的相同，目标核酸还是PTENmRNA。用图12B所示的不同RNAi分子转染HeLa细胞，在PTENRNA上以剂量依赖性方式使用实时RT-PCR证实RNA降低(图12A)。各种RNAi分子在血清中于37。C孵育15分钟和2小时后的稳定性如图12C所示，对p110和PTEN作为各种RNAi分子的目标蛋白的Western印迹如图12D所示，实验的RNAi分子与图12C和图12D所述的两个实验中的相同。图12A和图12C说明，用2'-0-甲基基团修饰的核苷酸与未修饰的核苷酸相交替使RNAi分子在血清中稳定，并且仍然能使它们具有干扰目标mRNA的活性。这表明，将RNAi双链体分子在血清中孵育15分钟和2小时会降解未修饰的双链体和其中10个大多数5'-位核苷酸是未修^的双链体。在图12B所示的RNAi分子中，实现了修饰的和未修饰的核苷酸的各种模式。RNAi分子94Al/94Bl包含一种结构，其中修饰的核苷酸是由未修饰的核苷酸连接到位于第一链5'端的未修饰的核苷酸。由链94A2和94B2组成的RNAi分子是另外一个实施例，其中第一链和第二链的修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸位于相对位点。与此相反，由链94A1和94B2组成的RNAi分子具有相同的修饰的和未修饰的核苷酸模式。但是存在相转移，这样修饰的核苷酸与未修饰的核苷酸形成碱基配对。由链94A1和94Bl、链94A2和94B2组成的两个RNAi分子相互不同，这样，第一种情况是第一链从未修饰的核苷酸开始，而对应的第二链上的第一个核苷酸(即在第二链的3'端的核苷酸)从未修饰的核苷酸开始，其排列与由94A2和94B2组成的RNAi分子的排列相对。另夕卜，图12B所示的交替地修饰的RNAi分子在介导PTEN蛋白降低中是有作用的，如图12D所示，但是只有在当第二个5'和第二个3'端核苷酸是未修饰的时(见94A294B1和94A294B2)。综合这些数据可以看出，最稳定的和最有活性的RNAi分子确实具有交替的2'烷基修饰的和未修饰的核苷酸残基。应当指出，当与未修饰的siRNA分子(它们在血清中稳定，这有利于增加的或更容易的处理)对比时，这些分子确实显示出非常相似的mRNA减少。实施例10:内部修饰的RNAi分子介导的功能性蛋白降低实验方案与实施例1所述的相似。用图12B所示的交替地修饰的RNAi分子转染后，在不同的时间点(48、72、96和120小时)收集HeLa细胞，进行Western印迹，为了实验原因，值得注意的是，已经将在第96小时时间点的细胞分开，用总数的一半重新涂平板。将共计40nM的各种RNAi分子应用到细胞上。用实施例1所述的阳离子脂质连续转染细胞72小时；然后在没有转染剂的存在的条件下重新涂平板。通过使用各种阳离子脂质例如Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388、L8(Atugen，Berlin),在96孔或10cm平板中进行转染(30%—50%汇合)，通过将预制的5倍浓縮的RNAi和无血清培养基中的脂质的复合物加给完全培养基中的细胞来转染RNAi。分布在96孔中的细胞的总转染体积是100^，在10cm平板中的细胞的总转染体积是10ml。根据细胞密度，最终的脂质浓度为0.8—1.2pg/ml;在每个实验中都说明了RNAi浓度。Western印迹分析的结果如图13所示。从该图可以看出，94A2B1和94A2B2版本的修饰的RNAi分子比未修饰的分子产生更持久的PTEN蛋白降低。该实验证实了从图12中可以看出的用94A1B1和94A1B2版本的分子无蛋白降低。当细胞不是被连续地转染时，未修饰的分子(80AB)在支持持久的蛋白降低中没有作用。实施例ll:含有交替的2'-0-甲基修饰的RNAi分子的持续的PTEN蛋白降低实验方案与实施例10所述的相似，只是通过将转染培养基替换为新培养基在5小时后终止转染。该方案进行了少许改变，这样对于每一个RNAi分子而言，使用实施例1所述的1吗RNAi/ml阳离子脂质储液实现了40nM浓度。转染后5小时，撤掉培养基，加入新鲜的EMEM。72小时后，将细胞分成2半，一半细胞进行裂解，另外一半新涂平板，24小时后(转染后96小时)裂解。使用3种不同的RNAi分子(80AB，94Al/B2，94A2/B1)进行的Western印迹分析结果如图14所示。使用未处理的细胞作为阳性对照。图14显示了分别72小时和96小时后PTEN的表达。考虑到各种RNAi分子的结构特殊性，从图14可以看出，与未修饰的RNAi分子(例如80AB)和RNAi分子94A1B2相比，94A2B1类的交替分子的蛋白降低的是持续的，即使在分开细胞和将细胞重新涂平板后96小时。使用图15A(左区)所述的siRNA构建体进行了其它实验。从表示为在实验系统中使用的各种浓度siRNA构建体下PTEN/pllOamRNA降解比可以看出，具有一条或两条由2'-0-甲基残基组成的链的siRNA分子不能诱导哺乳动物系统中的RNA干扰(图15A，分子V2、V5、V6)。但是，当仅有部分链被修饰时，活性降低是较不明显的。有趣地，具有未修^5的反义链(除非另有说明，它在本说明书中是指上链)和完全修饰的有义链的分子具有比反转版(图5A，分子V5和V6)明显更高的活性。该结果表明，siRNA的反义链似乎更关键，且对修饰敏感。诱导PTENmRNA的最有效的分子只具有修饰的序列，其5'端未修饰，或在两条链的交替位置被修饰(图15A，分子VIO、V12)。为了实验对核酸酶的抗性，将不同的siRNA版在血清中孵育，随后进行PAA凝胶电泳。结果如图15B所示(右区，各序列如图15B的左区所.示)。前面已经表明，具有未修饰的核糖核苷酸的平端siRNA分子会被迅速降解，而用2'-0-甲基核苷酸完全取代则会介导对血清来源的核酸酶的抗性(图15B，将分子AB与V1对比)。与未修饰的siRNA相比，具有部分的2'-0-甲基修饰的siRNA分子也显示出提高的稳定性。特别地，在两条链上有交替修饰的分子的不稳定性明显改善(图15B，分子V13、V14、V15和V12)。更重要地，这些分子中的三个转染进HeLa细胞会导致明显的PTEN蛋白表达的下调，如图15C(长度6、9和10)所示。在该RNA干扰活性实验中，观察到意外优选的分子，它在所有的从反义链的大多数5'端核苷酸起始的第二个核苷酸被修饰(分子V15、V12)。含有从反义链的5'端第二个核苷酸起始的修饰的分子更加稳定，但是在基因沉默中具有明显降低的活性(分子V13、V14)。该结果预示着参与的酶和siRNA双链体中的精确核苷酸之间的高度特异性的相互作用。综合，\里所述的数据表明，在siRNA双链体的特别地选定的位(置的'2'-0-甲ife、布能增加核酸酶抗性，且不会必然地彻底消除RNAi。'.尽管合成的siRNA的提高的稳考性基本上暗示了体内用途，'还是分析了特殊修饰是否也会导致细胞培养系统的大范围的蛋白降低。据此，使用不同类型的PTEN特异性的siRNA瞬时转染HeLa细胞6小时。然后洗去脂质siRNA复合物，48和120小时后分析PTEN蛋白降低。由于未转染的细胞在该时间段的快速生长导致了非常短暂的降低，虽然没有连续转染siRNA的降低实验是复杂的，本发明的发明人能够证明，通过所述的2'-0-甲基修饰稳定过的siRNA分子能延长PTEN蛋白降低。在转染后48小时，未修饰的siRNA(AB)表现出PTEN蛋白水平的最大降低，但是，在转染后120小时，利用交替的2'-0-甲基修饰稳定过的siRNA减少的PTEN蛋白表达是优越的(图15D，将带2与4、6和7作对比)。从该结果可以看出，优选地，交替修饰的起始核苷酸位置好像是重要的。为了更详细地检测该优选，合成了两个其它的siRNA系列，一个对激酶Aktl是特异性的，另外一个对pllOp是特异性的，pllOp是PI(3-)激酶的两个催化亚基之一。该特殊构建体如图16A所示。从中可以看出，只使用了有19个核苷酸长的siRNA双链体，在每隔一个核苷酸上没有任何修饰或者有2'-0-甲基修饰。以Aktl为目标，使用平端的，未修饰的siRNA观察到有效的蛋白降低和磷酸基-Akt水平的明显降低(图16A，右区)。在不同种类的每个一个核苷酸上有修饰的分子中，只有一个能有效地介导RNAi(图16A，分子V5)。该siRNA分子含有反义链，它在大多数5'和3'端核苷酸有修饰。有义链在大多数末端位以未修饰的核苷酸起始，在产生的结构中，两条链的修饰的和未修饰的核糖核苷酸彼此面对。如预期的，该分子也受到对抗血清来源的核酸酶的保护，如图16B所示(分子V5)。有趣地，在使用的特殊实验中，非常相似的从反义链的第二个核苷酸开始有修饰的19个核苷酸长的siRNA分子(V4)显示不出RNA干扰活性。在该实验中，V6类也无活性，V6中反义链的修饰的核苷酸对着有义链的修饰的核苷酸。相同系列的19个核苷酸长的对pll0p特异性的siRNA分子证实了该结果，如图16C所示。另外，类似地修饰的siRNA分子(V5)最有活性，如通过减少Akt磷酸化所表明的，它指示着由于pll0(3水平的降低导致的P(1)-3激酶活性的降低。分子V6活性的降低可以通过双链体稳定性的降低来解释，因此相同的结构在使用21mersiRNA的PTEN降低实验中都是有活性的。虽然已知在彼此相对的两链上的2'-0-甲基修饰会降低核酸双链体的稳定性，siRNA分子V4和V5的活性间的差异(图16B和C)不可能是由于双链体稳定性的差异所致，因为修饰的和未修饰核苷酸的碱基对数目是相同的。这种活性差异可能是由于参与降解目标mRNA的相互作用的蛋白的特异性要求。从这些实验还可以看出，反义链的大多数末端核苷酸在2'-OH-基有修饰会明显减少沉默活性。实施例12:不同的环结构在介导RNA千扰中是有作用的为了验证RNAi分子(优选地，有自身互补结构的合成的RNAi分子)是否会象标准双链siRNA分子一样有效地抑制基因表达，用p110(3特异性的合成的siRNA转染HeLa细胞。通过使用各种阳离子脂质例如Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies),在96孑L或10cm平丰及中进行转染(30%—50%汇合)。通过将预制的5倍浓縮的GB和无血清培养基中的脂质的复合物加给完全培养基中的细胞来转染GeneBlocs。分布在96孔中的细胞的总转染体积是100^，在10cm平板中的细胞的总转染体积是10ml。根据细胞密度，最终的脂质浓度为0.8-1.2吗/ml;在每个实验中都说明了RNAi浓度。剂量依赖性的滴定表明，标准双分子双链21mer和对应的单分子分子达到的mRNA降低效率没有明显差异，如通过实时PCR(Taqman)所分析的(图17A)。平行地实验了两个不同的环结构(A)u环和fflV衍生的pA-环，得到了类似结果。对比反义序列和环结构的相关位置后发现，用位于3'至环的反义序列改进了降低效率(图17B;对比构建体3A、3B和4A、4B)。实施例13:对分子内发夹环和分子间"泡"的功效的研究实验了不同环结构对mRNA的抑制和蛋白表达的影响。在这些实验中，选择Aktl和Akt2作为目标。实验方法与实施例12所述的类似。显然地，图18A和图18B所示的AktlmRNA的减少、图18C所示的Aktl蛋白水平的减少完全独立于实验的环结构(对比分子5A、6A、7A、8A)(实验的RNAi分子的结构都列在条形图下面)。即使含有相当非生理性结构(例如聚乙二醇连接物(PEG))作为环的分子也有效地降低了Aktl表达，这表明环的大小和核苷酸序列都不是关键的(图18A;分子8A)。对Akt2(9A)特异性的合成的siRNA分子用作特异性对照，且对Aktl水平无作用，如图15A所示。但是，该分子有效地沉默了Akt2表达(图18B;图18C)。在生理的杂交条件下，带有环结构的自身互补的RNA分子有可能退火为单分子结构或双分子结构中的双链(图18B，环或泡结构)。为了解释这一问题siRNA分子是否通过适应分子内环或分子间"泡"(示意性地显示在图18B中)来发挥它们的作用，转染了两种不能向它们自身折回的分子。这些构建体在相同的分子中含有Aktl-和Akt2-特异性的序列(图18B，构建体10A、10B)，并且设计成不能形成双分子双链体("泡")。意外地，当两条链退火后转染时，该分子有效地介导了Aktl和Akt2mRNA降低以及蛋白降低。尚不清楚环和泡结构是否确实地是RNA加工酶(例如D^r)的底物。Paddison和coworkers的最近的研究表明，含有siRNA的发夹比双链siRNA更依赖于活性。但是，这些使用PEG连接物分子的证实RNA干扰活性的数据表明连接物序列可能是无关的。在说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地或以其任何组合方式成为用于实现各种形式本发明的材料。序列乾<120><130><17D><210><212><213><223><220><221><223>阿图根股份公司其它新形式的干扰RNA分子A19014PCT174Patentlnversion3.]23人工序列misc—feature1A(—图3B〉<221><222><223><220><221><222><223>misc(22)'feature二(23)<400>1cuccuumiguuucugcuaacgtt23<210><211><212><213>223人工序列<220><223>EHAl<220>■<221><223>miscIBfeature-图3B)<:22D><221><222><223>miscU〉,Rid(21)<220><221><222><223>raise—featuire(22):，(23〉Dm<400>2cguuagcagasacaaaaggagtt23<210><211><212><213>23人工序列<220><223>ENAi<220><221><223>ndsc_feature3A厂图3B)<220><221><222><223>misc(1).-feature_(21)<220:<221><222=><223:>misc(22,DNAfeature二(23)<220><221><222><223>ni工sc(23).feature-.(23)HH2-修饰的<400>3cuccuuuuguuucugcuaacgtt23<210><211><212><213>423人工#歹.11<220><223>RNAi<220><221><223>nusc3B(■feature-图3B)<220><221><222><223>masc(1)..feature「(21)<220><22l>misc一feature<222>(22):-(23)<223>DNA<220><221><222><223>misc—fsature(23》.(23)NH2-修饰的<400>4cguuagcagaaa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isc_￡eaturePTKMiV4(图15A》.<220:><221><222><223>misc一featuxe(7).:(15)2'-0甲基核糖核苷酸<400>130cguuagcagsascaaaaggag■21<210><211><212><213>13121孤A人工序列<220><223>RWAi<220><221><223>misc_featurePTEK^V5(图15A)<400>131cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213>13221人工序列<220><223>RNAi<220><221><223>misc一featurePTBNiV5(图15A)<220><221><222><223:>raisc一feature(1).:(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>132<210>133<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<2.20><221>misc一feature<223>PTEn5v6(图15a)<220><221>misc一feature<222:(1)-:(21)<223>2'-O甲基核糖核苷酸<400>133cuccuuuuguuucugcuaacg21<210>134<211>21<212>RNA<213>人工序列<220><223><220><221>misc一feature<223>PTEnSV6(图15A)<400>134cguuagcagasacaasaggag21<210>135<211>21《212>RNA《213>人工序列<2'20><223>RNAi<220><221>misc一feature<223>PTEB^V7(图15A,B)<220><221>misc_feature<222>(1)<223>2'-0甲基核糖核苷酸<400>135cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><213>13621RNA人工序列<220><223>RNAi<220>s221><223>misc一featurePTEuiV7(图15A,B)<220><221><222><223>misc_feature(1)2'-0甲基核糖核苷酸<400>135cguusgcagaaacasaaggsg21<210><211><212><213>13721RNA人工序列<220><223>RNM<220><221><223》misc一featurePTEN^V8(图15A,B)<220><221><222><223>misc一feature(ll):.(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>137cuccuuuuguuucrugcuaacg21<210>138<211>21<212>RMA<213>人工序列<220><223>ENAi<220:<221:<223:misc一feature15A,B)<220:><221><222〉<223>misc—fe3ture(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>138cguusgcagasscassaggag21<210><211><212><213>13921人工序列<220><223>KNAi<220><221><223>m丄sc一featurePTEn5V3(图15a)<220><221><222><223>misc一feature(8).:(13)2'-0甲基核糖核苷酸<400:>133cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213><220><223>14021人工序列RHAi<220><221><223>ndsc一featurePTEHiVS(图15A)<220:<221><222><223>misc_feature(1).:(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400:>140cguuagcagaaacaaasggag21<210><211><212><213>14121RNA人工序列<220:<223:RJ3Ai<220;><221><;223>tnisc一featurePTEn5V10(图15A,B)<220:><221;><222:miscfeature(S).:UO)2'-O甲基核糖核苷酸<220><221><222><223>misc一feature(16):.(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400>141cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><213>14221人工序列<220><223>ENAi<220><221><223>misc一featurePTENiV10(图15A,B}<220><221><222><223>misc_feature'(7).:(12)2'-0甲基核糖核苷酸<220><221><222:><223>misc一feature(17):.(21)2'-0甲基核糖核苷酸<400;142cgruuagcagaaacaaaaggag21<210><211><212:><213><220><223>14321RNA人工序列RNAi<221><223>misc—featurePTENiiVI1(图ISA)<220><221><222><223>misc一feature(7).:(15)2'-O甲基核糖核苷酸<400>143cuceuimuguuucugcuaacg21<210><211><212><213>14421RNA人工序列<220><223:>RHAi<220><221><223>misc一featurePTEn5VI1(图15A)<220><221><222><223>misc一featurePTENBVll(图15)<400>144cguuagcagaaacaaaaggag21<210;<211><212:><213>1452JLRNA人工序列<220><223>RKAi<220><221><223>misc一featureFTEN^V12(图15A,B)<220><221:>misc一feature<223>在位fl,3,5,7,S,11,13,15,17,1S和21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400;>145cuccummguuucugcuaacg21<210><211><213>14521RMA人工序列<220><223>RKAi<220><221:><223>roisc_featurePTENiV12(图15A,B)<220:><221;><223>raise—feature在位i"l,3,5,7,3,11,13,15,17,13禾B21的核苷酸是2'-0甲基哮糖核苷酸<40O:>14621<210><211><212><213>14721ENA人工序列<220><223>RNAi<220><221><223>misc—featurePTEmSV13(图15b)<220><221><:223>raise—feature在位i"2,'4,S,8,10,12,14,1S,18禾口20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>147cuccuuuuguuucugcuaacg21<210:<211><212><213>14B21RI9A人工序列<220><223:<220><221><223>misc一featuire3PTEKi"V13(图15B)<220><221><223>misc一feature在位置2,4,6,8,10,12',14,1S,18禾口20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>14821<210>-213>14921人工序列<220><223>EMAi<220><221;><223>misc一fs3turcPTEN"ZV14(图15B)<220><221><223>misc一feature在位f2,4,6,8,10-12,14,1G,1S禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷—酸<400>149cuccuuuuguuucugcuaacg21<211><212><213>ISO21人工序列<220<223>RNAi<220><221><223>misc—featurePTENiV14(图15B)<220><221>misc一feature在位il,3,5,7,3,11,13,15,17,1S禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>150cgvmagcagasacaaaaggsig21<210><212><213>15121RKA人工序列:220>:223>RNAi<220><221><223:>misc_featurePTEN5V15(Fig.15B)<220><221><223>misc一feature在位M"l,3,5,7,3,11,13,15,17,13禾口21的核苷酸是2'-O甲基核糖核苷酸<400>151cuccuuuuguuucugcuaacg21<210><211><212><213>15221RNA人工序列<220><223>RNAi<220:<221><223>misc_featurePTENiV15(图15B)<220:<221><223=misc—feature在位M"2,4,6,8,10,12,14,1S,13禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>15221<210><211><212><213》15321人工序列<220><223>RNAi<220:><221><223>misc一featureAfctlSVI(图ISA)<220><221><222><223>misc一festure(1).:(19)RNA<220><221;<222>misc(20).feature二(21)<400>153ucuugauguacuccccucgtt21<211><213>15421DNA人工序列<220><223>RKAi<220><221><223>misc一festureAktlSVI(图ISA)<220><221><222><223>misc_feature(1).:US)<220><221><222:><223>misc一featurs(20):,(21)<400>154cgaggggaguacaucaagatt21<211><212><213>15513人工序列<223><220:<221><223>tnisc一featureAktli;V2(图ISA)<4O0>155ucuugauguacuccccucg13<210><211><212><213>15S19人工序列<220:<223:西Ai<220><221><223;>misc一featureAktl5V2(图ISA)<400>156cgaggggaguacaucaaga—13<210><211>，212><213>15719人工序列<220><223>RNA1<220><221><223;misc_featureAktlKV3(图ISA)<220:><221><223>misc_feature在1立置2,4,6,8,10,12,14,16,18禾Q20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:>157ucuugaugu3cuccccucgIS<210;><211><212><213>15813RNA人工序列<220:><223>RNAi<220><221><223>misc一fsatursAktliV3(图16A)<220><221><223>misc一fssiturs在位f2,4,6,8,10,12,14,16,18禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:158cgaggggsguacauc站gaIS<210><211;><212><213><220><223>159RMA人工序列RNAi《221>misc一featureAKtlSV4(图16A)<220:><221><=223>misc一fssturs在位置2,4,6,8,10,12,14,16,18禾卩20的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>15Sucuugaugru3cuccccucg1S<210><211:><212><213>ISO孤A人工序列<220><223>KNAi<220><221><223>ndsc—featureAkt:iiiV4(图16A)<220><221><223>misc—feature'在位置l,3,5,7,S,11,13,15,17,13禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>ISOcgaggggaguacaucaaga19<210><211><212><213>1S119ENA人工序列<220><223>RNAi<:220><221><223>misc_featureAktlJV5(图16A)<220><221>misc一feature<223>在位i"l,3,5,7,S,11,13的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>161ucuugauguacuccccucg<210>162<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<220>.<221>misc一feature《223>Aktl5V5(图16A)<220><221>raise—feature<223:>在位i"2,4,6,8,10,12,14的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<:400;>162cgaggggaguacaucaaga<210>163<211>19<212>ENA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>mi5C一feature<223>Aktl^VS(图ISA)<220><221>miscfeature<223>在位置l,3,5,7,3,11,13,15的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>163ucuugsuguscuccccucg<210>164<211:13<212>RNA<213>人工序列<220:<223:RNAi<220:<221-<223-misc_featureAJctaSV6(图ISA)<220><221><223>misc一feature在位置l,3,5,7,S,13,15,17,19禾口21的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>1S4cgaggggsguscaucssgs13<210》<211><212:><213><220><223>1S5ENA人工序列<220><221:><223>mlsc一featurePlloSV2(图16C)<400:>165站uuccagugguucauucc13<210><211><212><213>16S13SKA人工序列<220><223>RNAi<220><221:><=223>raisc_featurePlloSV2(互补序列，图1SC)<400;>16SggaaugaaccacoiggaauuIS<210:>167<211>1S<212>RHA<213:人工序列<220:<223:<220=><221>misc_feature<223:>PlloSV3(图16C)<220:<221>misc一feature<223>在位i2,4,S,8,10,12,14,1S禾口18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>167aauuccagugguucauucc19<2工0:>158<:211>13<212>RNA<213>人工序列-<220><223>RNAi<220><221>misc一feature<223>Pllo￡V3(互补序歹lj,图16C)<220><221>raisc_feature<223>在4立i2,4,S,B,10,12,14,1S禾口18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:>168ggaaugaaccacuggaauu19<210>16S<211;13<212>RMA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>misc一feature-<223>PlloSV4.(图16C)<220><221>misc一feature<223>在位i"2,4,S,8,10,12,14,16禾口18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>169aauuccagugguucauucc19<210><211:><212><213><220><223>170人工序列<220><221><223>misc一featurePllo￡V4(互补序列，图1SC)<220><221><223>misc_feature在位i"l,3,5,7,3,11,13,15,18禾口的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸2.1<400>170ggaaugaaccacuggaauu19<210><211><212><213>17113孤A人工序列<220:><223>RMAi<220><221>《223>misc一featureP110SV5(图工SC)《220:><221:>《223>misc_feature在位fl,3,5,7,S,11,13,15,17禾卩13的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸400>171aauuccagugguucauucc<210:><211:>《212>'<:213:17213人工序列<220s><223>RKAi《221><223>misc_featureP110SV5(互补序列，图is。<220><221;>miscfeature<223>在位置2,4,S,8,10,12,14,1S禾卩18的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>172ggaaugaaccacuggaauu13<210>173<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>RNAi<220><221>misc—feature<223:>PlloSVS(图1SC)<220><221>misc_feature'<223>在l立置l,3,S,7,3,11,13,15,17禾Q19的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400>173aauuccagugguucauucc13<210>174<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>RKAi<220><221>misc一feature<223>VS(互补序歹lj,图16C〉<220;><221><223>在位置l,3,5,7,9,11,13,15,17禾口13的核苷酸是2'-0甲基核糖核苷酸<400:>174ggaaugaaccscuggssuu权利要求1.一种包含长度为18-30个碱基对的双链结构的核糖核酸在制备药物中的应用，其中所述双链结构包含第一链和第二链，所述第一链由连续核苷酸的第一序列组成，所述第一序列与目标核酸80-100％互补，所述第二链由连续核苷酸的第二序列组成，所述第二序列与目标核酸相同，其特征在于，所述第一序列和所述第二序列包含由多个在2′-位具有修饰的修饰的核苷酸组所组成的模式，其中在序列中，每个修饰的核苷酸组在一侧或两侧与核苷酸连接组连接，其中在第一序列和第二序列两者中，修饰的核苷酸组与核苷酸的连接组交替，其中形成核苷酸的连接组的核苷酸是未修饰的核苷酸，或者是具有与修饰的核苷酸的修饰不同的修饰的核苷酸，其中所述第一序列在5’端和3’端均不具有氨基修饰，并且所述第一序列在其5’端起始为修饰的核苷酸组，其中所述修饰选自氨基，氟，甲氧基，烷氧基和烷基中的一种。2.根据权利要求1的应用，其中的药物用于治疗疾病或病症，所述疾病或病症选自包含恶性胶质瘤，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，肝癌，结肠癌，胰腺癌和白血病，糖尿病，肥胖症，心血管病和代谢病的组。3.—种药物组合物，其含有根据权利要求1所定义的核糖核酸和可药用载体。全文摘要本发明涉及含有双链结构的核糖核酸，其中所述的双链结构含有第一链和第二链，所述的第一链含有连续核苷酸的第一序列，所述的第一序列至少部分地与目标核酸互补，所述的第二链含有连续核苷酸的第二序列，所述的第二序列至少部分地与目标核酸相同，并且其中所述的双链结构是平端的。文档编号A61K38/00GK101301309SQ200810097059公开日2008年11月12日申请日期2003年8月5日优先权日2002年8月5日发明者克劳斯·吉泽,安克·克利佩尔-吉泽,约尔格·考夫曼申请人:阿图根股份公司