专利名称：：双启动子二价防龋DNA疫苗pCN-SSISG的制备的制作方法
技术领域：
：本发明利用分子生物学知识和基因工程技术构建了一种新型的防龋DNA疫苗质粒pCN-SSISG，用于人类龋病防治，属于生物疫苗
技术领域：
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背景技术：
：龋病的病因学现已明确龋病是一种细菌感染性疾病，而变形链球菌是主要致龋菌，其致龋作用依赖于细菌在牙面的黏附、聚集和菌斑的形成；而这一致病过程主要依靠变形链球菌两个毒力因子来完成，即变形链球菌表面蛋白Pac和葡糖基转移酶GTF;二者发挥作用的功能结构域现已明确，分别为Pac的唾液结合区(SBR)和GTF的葡聚糖结合区(GBR)，实验表明对上述区域的有效封闭可阻止细菌在牙面的聚集和菌斑的形成，有效防止龋病的发生。免疫接种在预防感染性疾病方面曾取得辉煌的成绩，但传统的疫苗如早期的灭活死疫苗和减毒活疫苗，和后来的亚单位疫苗、合成肽疫苗等，都存在着诸多缺点和弊端，如灭活不全或毒力回升的问题，无法通过体外培养方式获得足够量抗原的问题，病原体有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性的问题等；以及有些疫苗的生产很困难且不方便，保存期短，特别在发展中国家限制了它的使用，制备成本高，纯化困难，周期长，需加入适量的佐剂来增强免疫效果等都是传统疫苗所存在的缺点和不足。随着分子生物学、分子免疫学和基因工程技术的发展，基因工程疫苗越来越受到人们的关注。它克服了以往传统疫苗的缺点，具有不可比拟的优越性和广阔的发展前景。根据口腔部位的免疫特点，结合当今免疫学的最新成就，本发明构建了二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG。与迄今已知的疫苗比较，pCN-SSISG作为DNA防龋疫苗的优势主要表现为两个方面一、目前所用的基因免疫载体大都是真核表达质粒，不能在原核细胞中表达抗原。而本发明的防龋疫苗质粒pCN-SSISG含有双启动子，即人巨细胞病毒CMV/IE真核启动子和大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子(nirB)。它既可以在真核细胞又可以在原核细胞中表达抗原蛋白。且NirB是一种厌氧诱导启动子，在厌氧环境下可被激活启动抗原基因表达。它不需化学诱导剂的诱导，与宿主菌有很好的兼容性，特别适合于以胞内寄生菌作为载体工具的体内接种。当沙门氏菌携带质粒pCN-SSISG进入宿主肠道后，受厌氧环境的调节启动外源基因的表达，使外源基因从一进入机体就开始进行表达，并且一直持续到侵入宿主体内。双启动子使外源基因不但能从细菌中表达，而且使质粒在进入到宿主细胞之后继续进行表达，这样就延长了外源基因在体内的表达时间，提高了抗原蛋白的表达量，同时又可以通过不同的途径激发机体的免疫反应，从而提高了疫苗的免疫活性，增强了免疫效果。二、pCN-SSISG是一个二价疫苗，针对变形链球菌两个重要毒力因子的功能结构域，表达两种不同的抗原蛋白，这样就产生针对同一细菌的两种不同抗体，其免疫效果不仅优于单一疫苗，且比两种疫苗联合免疫更加安全、方便、有效。
发明内容本发明针对上述不足，提供了二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG的构建，以及用质粒pCN-SSISG制备防龋疫苗。本发明的技术方案如下一种二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG，具有SEQ.2所示的序列。一种二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG的构建方法，利用分子克隆技术在载体pCMVnir中插入抗原基因S服和抗原基因GBR，两者通过IRES连接，以防止二者融合表达；并且在每个抗原基因的5'端融合一段信号肽基因，以提高抗原蛋白的分泌效率。以上所述的载体pCMVnii"为双链闭环DNA分子，是一种基因克隆和表达的载体，长度为5.1Kb，含有两种启动子，一种是真核细胞启动子HCMV/IE启动子，另一种为大肠杆菌硝酸盐还原酶基因的启动子NirB,分别在真核细胞和原核细胞中启动外源基因的表达，pCMVnir载体含有多克隆位点，用以插入外源基因，同时带有氨节抗性基因作为筛选标志。以上所述的抗原基因SBR是变形链球菌表面蛋白的功能结构域一唾液结合区的编码基因。以质粒pcDNA3.l-SBR为模板通过PCR扩增获得，扩增产物大小为1192bp，pcDNA3.l-SBR质粒由山东大学口腔医学院姜广水、杨小青等构建(北京口腔医学2002年第IO巻第3期《通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBRDNA疫苗》姜广水，刘贤锡，杨小青等(CONSTRUCTIONOFANTI-SBRDNAVACCINEFLANKEDWITHIMMUNOSTIMULATORYSEQUENCECpGMOTIFTHROUGHT_ACLONINGjiangg咖gshui,Liuxi獄i,yangxia。qing，yangPishan,BIANJifeng，LIJing,GENGZhao)。以上所述的抗原基因GBR是变形链球菌葡糖基转移酶GTF的葡聚糖结合区的编码基因，以质粒pSG52为模板通过PCR扩增可以获得，扩增产物大小为1152bp，pSG52购于上海博亚生物公司。以上所述IRES是内部核糖体进入位点，它连接抗原基因SBR和GBR，可使两者连锁转录，但在翻译的时候分别翻译。这样就避免了两者融合表达所造成的免疫原性的改变。以上所述信号肽序列是一段69bp的编码组织型纤溶酶原(tPA)信号肽的双链DNA片段，由上海Sangon生物工程技术服务有限公司产售。除此以外，构建过程中还用到以下材料(1)质粒和菌株pTriEx-4质粒购于上海Sangon生物工程技术服务有限公司；质粒pCN-SSIE的构建(参见本申请人提出的另一申请，申请号200810158564.2);克隆载体pMD18-TVector购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.，Ltd.);菌株有大肠杆菌DH5a，购于上海Sangon生物工程技术服务有限公司。(2)试剂:DNA凝胶回收试剂盒由德国QIAGEN公司生产、质粒小提试剂盒MiniBESTPlasmidPurificationKit购自大连TaKaRa生物工程有限公司;PCR试剂盒TaKaRaTaq、限制性内切酶EcoRI，BamHI,HindIII，Xhol和T4DNALigase均购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd.)。一种二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG的构建方法，具体步骤如下1.PCR扩增GBR片段以质粒pSG52为模板，设计引物用PCR的方法从pSG52中扩增得到GBR片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是HindIII位点，下游添加的是Xhol位点。引物设计如下上游引物5'-CGAAGCTTGAAGGTGATAAATGGTATT-3'5'端含有HindIII酶切位点AAGCTT4下游引物5，-CTCGAGTTAGTTAATCCGAACTCGTTCT_3，5'端含有XhoI酶切位点CTCGAG最后获得两端带有酶切位点的编码抗原GBR的基因片段，该GBR基因片段经DM凝胶回收试剂盒回收后，与克隆载体pMD18-T相连接，获得质粒pMD18-T-GBR。2.在pTriEx-4载体中插入GBR片段将步骤1扩增获得的质粒pMD18-T-GBR和载体pTriEx-4进行HindIII和XhoI双酶切，获得目的基因片段GBR和pTriEx-4载体大片段，将两者在连接体系中进行连接，获得pTriEx-4-GBR。3.在pTriEx-4-GBR中插入tPA信号肽序列选择适合GBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除EcoRI、HindiII酶切位点的双粘末端；上游5'aattatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccagg3'下游5'agctcctggctgggcgaaacgaagactgctccacacagcagcagcacacagcagagccctctcttcat3'将步骤2获得的质粒pTriEx-4-GBR经EcoRI、HindIII双酶切后的大片段与上述合成的双链信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pTriEx-4-SG。4.质粒pCN-SSIE中插入目的基因SGBR将步骤3获得的质粒pTriEx-4-SG与pCN-SSIE质粒(具有序列表中的SEQ.1所示的序歹ij，构建方法实施例1中说明)分别用限制性内切酶Xhol和BamHI进行双酶切，回收目的基因片段SG服和pCN-SSIE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SSISG。以上构建过程的各步骤，都要经大肠杆菌DH5a的转化、筛选扩增和酶切鉴定，这对于本领域的技术人员是熟知的。最后质粒pCN-SSISG的测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。DNA序列测定结果确定重组质粒pCN-SSISG的开放阅读框架正确，插入的信号肽序列与预期设计的完全一致。载体pCMVnir中插入的所构建的抗原基因SSISG的DNA序列如序列表中的SEQ.2所示的序列。质粒pCN-SSISG用于制备防龋疫苗，步骤如下用质粒pCN-SSISG转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆，37"通气增菌培养14小时，通气量20m7h，将培养的菌液4'C4000rpm离心IO分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件下离心IO分钟，将沉淀经冷冻真空干燥等生产工艺制得冻干疫苗。本发明的pCN-SSISG防龋疫苗可以是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量不少于10亿。粉剂使用前须用冷开水稀释。不用时储存于2-8'C，有效期10个月。下面用对比实验，说明用pCN-SSISG所制备防龋疫苗的作用和效果。7.首先检测口服疫苗在小鼠体内诱导的粘膜免疫反应将68周龄的BALB/c小鼠(SPF级)随机分为两组即实验组和对照组，每组5只。实验组用转化了质粒pCN-SSISG的减毒沙门氏菌(即防龋疫苗)，经灌胃的方法免疫小鼠；对照组用转化了空载体pCMVnir的减毒沙门氏菌(即阴性对照)，同样方法灌胃。免疫4周后取唾液标本。应用ELISA间接法检测样本中的特异抗体水平将实验组和对照组唾液样本分别稀释为1:102、1:103、1:104、1:105、1:106，用酶标仪测定各稀释度样本的OD楊值(表l)，经统计学分析当样本稀释到102、103、104倍时，尸值都<'0.001，稀释至105倍时7仍小于0.005;稀释至ljlO"咅时P大于0.05。计算实验组与对照组的比值(P/N);稀释到10"咅时P/N最小值为6.364，大于3;当稀释至Ul()S倍时P/N最小值为0.263，小于3，故可认为制备的唾液特异抗体滴度达到105。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>么口服疫苗对动物口腔内致龋变形链球菌的粘附、聚集及龋病发生、发展的抑制作用选取出生后25天断奶的Wistar雄性大鼠20只，体重85.391.6克，平均88.5克，购于山东大学动物实验中心。将大鼠随机分为2组即实验组和对照组，每组10只；实验组用转化了质粒pCN-SSISG的减毒沙门氏菌(即防龋疫苗)，经灌胃的方法免疫小鼠，对照组用转化了空载体pCMVnir的减毒沙门氏菌(即阴性对照)，同样方法灌胃；同时喂以普通饲料10天，然后取前、后牙牙面菌斑厌氧培养进行变形链球菌计数以观察幼鼠口腔内变形链球菌的定居情况，于3639天鼠龄期间给予含有广谱抗生素的致龋饲料2000#(6%全麦粉，56%蔗糖，28%精炼奶粉，3%蔬菜粉，1%脱水全肝粉，4%酵母，2%食用盐)，其中广谱抗生素(氯霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素)用量为lg/kg，饮水中也加入抗生素。抗生素应用结束后，用相同方法取菌斑计数，观察幼鼠口腔中抗生素的灭菌情况。然后改为喂以致龋饲料2000"和普通饮水，并分别于第40天、5556天和7072天鼠龄期间给幼鼠口腔内接种变形链球菌Ingbritt(100ul菌液/次，2次/天)，之后继续喂养60天，于鼠龄132天时，记录体重，对菌落计数以观察2组大鼠口腔内变形链球菌数量的差异。第133天鼠龄时，常规处死大鼠，依据Keyes法评价鼠牙患龋情况。结果如下(l)实验前后体重增加值见表3。2组大鼠实验前后体重增加值无统计学差异(尸〉0.05)。表3各实验组Wistar大鼠实验前后体重(m/g，x士s)组别n鼠龄25天鼠龄132天增加值阴性对照组1088.5±1.8203.5±2.0115.0±3.0防龋疫苗组1087.7±1.9202.8±1.7115.2±2.3(2)菌斑变形链球菌计数实验107天后，(16.4土2.8)X102CFU/ml，少于阴性对照组[(13.5±3.8)X104CFU/ml](尸〈O.OD。(3)鼠牙患龋情况见图1。Keyes法计分结果显示，防龋疫苗实验组颊舌面、殆面窝沟E级龋损和3^ffi窝沟Ds级龋损均低于对照组(尸<0.01)。本发明的技术特点和优良效果如下本发明根据口腔粘膜免疫的特点，利用双启动子表达载体构建了适于粘膜免疫的二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG。本发明构建的是一个可以表达变形链球菌表面蛋白唾液结合区段SBR和变形链球菌葡糖基转移酶GTF的葡聚糖结合区段GBR的双启动子防龋DNA疫苗质粒pCN-SSISG。用于制备和生产防龋DNA疫苗，该疫苗质粒pCN-SSISG含有双启动子即人巨细胞病毒CMV/IE真核启动子和NirB原核启动子，NirB不同于其他原核启动子如T7、T5、Lac、Tac等，它是受氧压调节的原核启动子，不需要诱导剂的化学诱导，特别适合于体内使用。以减毒沙门氏菌作为载体，在肠道厌氧的环境和宿主细胞中，NirB启动子被激活，大量转录下游基因，这样NirB启动子使外源基因从一进入机体就开始表达抗原蛋白，并且一直持续到侵入宿主体内，这样就保证了外源基因在体内的充分表达，同时双启动子保证pCN-SSISG质粒在被释放入宿主细胞后可继续表达抗原蛋白，这样既延长了外源基因在体内的表达时间，提高了抗原蛋白的表达量，同时又可以通过不同的途径激发机体的免疫反应，从而提高了疫苗的免疫原性，增强了免疫效果。并且二价质粒可同时表达两种不同的抗原蛋白，这样就产生针对同一细菌的两种不同抗体，从而大大增强了免疫效果。同时以减毒沙门氏菌作为质粒pCN-SSISG的载体，通过肠道粘膜途径，可获得口腔部位良好的粘膜免疫效果。免疫方法简便、有效、经济、持续时间长，并且可多次免疫、副作用小。图1是用pCN-SSISG所制备的防龋疫苗免疫Wistar大鼠的防龋效果；依据Keyes法评价鼠牙患龋情况Keyes法计分显示，防龋疫苗实验组颊舌面、殆面窝沟E级龋损和殆面窝沟Ds级龋损均低于对照组(P<0.01)。具体实施例方式实施例l:pCN-SSIE质粒的构建，步骤如下1.以质粒pEGFP-Nl为模板，用PCR的方法扩增目的基因片段EGFP，并在上游添加Sail酶切位点，下游添加Notl酶切位点。以质粒pcDNA3.1-SBR为模板，用PCR的方法扩增目的基因片段SBR，上游添加NcoI酶切位点，下游添加EcoRI酶切位点。将以上所获得的两种基因片段分别连于克隆载体pMD18-T，获得质粒pMD18-T-EGFP和pMD18-T-SBR进行扩增。2.将步骤1扩增获得的质粒pMD18-T-EGFP和质粒pIRES进行SalI和NotI双酶切,接体系中进行连接，获得pIRES-EGFP。3.将载体pCMVnir和步骤2得到的pIRES-EGFP分别用限制性内切酶EcoRI和Notl进行双酶切。利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中的pCMVnir载体大片段和pIRES-EGFP中的IRES-EGFP小片段进行连接，获得质粒pCN-IE。4.将步骤3获得的质粒pCN-IE和步骤1中获得的pMD18-T-SBR，分别用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切，回收目的基因片段SBR和pCN-IE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SIE。5.选择适合SBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除NcoI酶切位点的双粘末端上游5'端为5'-CATG，下游5'端为5'-CATG。将步骤4获得的pCN-SIE经Ncol酶切与上述合成的信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pCN-SSIE。以上构建过程的各步骤，都要经大肠杆菌DH5a的转化、筛选扩增和酶切鉴定；最后构建的质粒pCN-SSIE由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，具有序列表中的SEQ.l所示的序列。实施例2:质粒pCN-SSISG的构建，步骤如下1.以质粒pSG52为模板，用PCR的方法扩增目的基因片段GBR，并在上游添加Hindm酶切位点，下游添加XhoI酶切位点；与克隆载体pMD18-T相连接后进行克隆扩增。2.将歩骤1扩增获得的质粒pMD18-T-GBR和载体pTriEx-4进行HindIII和XhoI双酶切，获得目的基因片段GBR和pTriEx-4载体大片段,将两者在连接体系中进行连接，获得质粒pTriEx-4-GBR。3.选择适合GBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除EcoRI、Hind111酶切位点的双粘末端上游5'端为EcoRI酶切形成的粘末端aatt,下游5'端为HindIII酶切形成的粘末端agct。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成此信号肽序列上游5'aattatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccagg3'下游5'agctcctggctgggcgaaacgaagactgctccacacagcagcagcacacagcagagccctctcttcat3'选择适合GBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除EcoRI、HindIII酶切位点的双粘末端；上游5，aattatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccagg3下幼字3'tacttctctcccgagacgacacacgacgacgacacacctcgtcagaagcaaagcgggtcggtcctcga5将步骤2获得的质粒pTriEx-4-GBR经EcoRI、HindIII双酶切后的大片段与上述合成的双链信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pTriEx-4-SG。4.将步骤3获得的质粒pTriEx-4-SG与pCN-SSIE质粒(实施例1构建)分别用限制性内切酶Xhol和BamHI进行双酶切，回收目的基因片段SGBR和pCN-SSIE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SSISG。以上构建过程的各步骤，都要经大肠杆菌DH5a的转化、筛选扩增和酶切鉴定；最后构建的质粒pCN-SSISG由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，其中的SSISG如序列表中的SEQ.2所示的序列。实施例3:用质粒pCN-SSISG制备防龋疫苗1.用质粒pCN-SSISG转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆。2.37'C通气增菌培养12小时，通气量15m7h，使细菌浓度和质粒pCN-SSISG的拷贝数达到适宜。3.将培养的菌液4。C4000rpm离心IO分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件下离心IO分钟，将沉淀经冷冻真空干燥制得冻干疫苗。4.本疫苗可以是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量为10亿。粉剂使用前须用冷开水稀释。于饭后4小时以后服用，服药前半小时首先口服5%小苏打200毫升，半小时后服用一份剂量即可。不用时储存于2-8'C，有效期10个月。5.pCN-SSISG防龋疫苗免疫对象为2岁及2岁以上的儿童、青少年和成人。免疫一次的有效性可维持10-11个月。保护期过后可同样方法再次免疫，以获得免疫性。注意在服用疫苗的前后3天，应避免用氯胍或抗菌素。实施例4:用质粒pCN-SSISG制备防龋疫苗1.用质粒pCN-SSISG转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆。2.37。C通气增菌培养16小时，通气量25m7h，使细菌浓度和质粒pCN-SSISG的拷贝数达到适宜。3.将培养的菌液4。C4000rpm离心IO分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件下离心IO分钟，将沉淀经冷冻真空干燥制得冻干疫苗。4.本疫苗可以是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量为30亿。粉剂使用前须用冷开水稀释，于进食前l小时首先口服5%小苏打300-500毫升，半小时后服用一个剂量。不用时储存于2-8'C，有效期10个月。5.上述制得的pCN-SSISG防龋疫苗可用于奶牛的免疫来获取含有大量保护性抗体的牛奶，人们可以通过饮用此种牛奶这种主动免疫的方法来减少和预防龋病的发生。奶牛免疫一次的有效性可维持10-11个月。有效期过后可同样方法再次免疫。注意服用疫苗的前后3天,应禁用氯胍或抗生素。此种牛奶适用于任何年龄段的人群。序列表〈110〉济南登益得科贸有限公司〈120〉双启动子二价防龋DNA疫苗pCN-SSISG的制备<160〉2<170>PatentIn3.1<210>1〈211〉2631<212>廳SE(J.l5'-catga已gagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccag60ccaggaaatcatggccgaggttgaacgcattaatgctgcaaatgctgcca120ttatgaagctaaattggctc■tatc^gcagatttagcagccgttc幼a犯accaMgc180tgccaatcaagcagcctatctgctgcttatC3ggCtg朋Ctg3朋Cgtgt240tcagg肌gctaatgcagccgccaaagccgcttatgatactgctgtagcagcaaateLatgc300gaaattgccgctgccaatgaagaaMta^^a_cgcaa_tgcaacggccaa360agctgaatatgagact犯gttC犯gCtg33ct犯agcgtgttcaggaagc420taatgccgca犯cgaagcagactatcaagctaaattgaccgcctatcaaacagagcttgc480tcgtgttcaaagcgacctatg犯gcagctgtagcagcaaa540taatgccaaaaatgcggcactcacagctgaaaMactgca600tgct犯ggcgacttatg犯gctgcactc犯gc犯tatgaggccgatttggcagcggtgaa660gccgca犯cgttgaccgcct720gctcgctcgcgttcaaa犯gccaatgcggatgctaaagcggcctatgaagcagctgtagc780gccgcaaatgcagcgctcacagctgaaa3tactgcaattaagaagcgcaa840tgcggatgct3CttgCt33gatcttgccaa■gatttagcagactatccagtgcatacg犯g960ttctattaaagctgcactggcag犯cttgaaatgaagacg1020agaacc已tctgctcaaaatttggtctatgatcttgagccaMtgCg^LCttatctttgac1080咖卿tgggaagttccttaaggcttctgctgtggatgatgcttttagca犯agcscttc1140tatgaccaaaaaattcttcactagatatc3Ct￡L￡LCttaga1200acaatctaatgatgttgcttcttctatggagctttatgggaattttggtt犯ggcg肌tt1260cacgcgtcgagcatgcatctagggcggccaattccgcccctctccctcccccccccctsa1320cgttactggccga已gccgctccggtgtgcgtttgtctatatgtgattttc1380caccatattgccgtcttttggc犯tgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgac1440gagcattcctcccctxtcgcc^ggtctgttgaatgtcgt1500g卿gaagcaattcctctggaagcttcttgacgtctgtagcgaccctttg1560caggcagcgg犯CCCCCC3Cctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtata1620agatacacctgca鄉gcgggtgccacgttgtgsgttggatagttgtgga1680aagagtca認tggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggt1740accccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtc1800gaggtta^aaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcc1860acgatgata^gcttgccacaacccgggatcctctagagtcgacatggtgagcaagggcga1920ggagctgttc3CCggggtggtgcccatcctggtcgsgctgg3CggCg3Cgtaaacggcca1980caagttcagcgttcatctgcctacggcgtgatccgccatgctacaagaccggL鄉gca^txcaagatccgcC3CCCCC3tCcgccctgagccgccgccggggtgtccggcgaccaccggcacagtgcttc3cccgaaggctcgcgccgagggacttcaaggaacgtctatacacaacatcgggCg3CggCCatcactctcgagggcgagggagctgcccgtgccgctacccacgtccaggatgaagttcgatxatggccgaaggacggcagccgtgctgct3Cg卿3gCggcatggacgacgatgccaccgccctggccccgsccacatggcgcaccatcgggcgacaccC3tCCtggggC33gcag犯gcgtgcsgctcgcccgacaaccgatxacatggctgtacaagteicggcaeigcaccctcgtga33gC3gC3CgttcttcaaggCtggtg33CCC3C犯gCtgggccgaccactcactacctgagtcctgctggt犯gcggccgtgaccctgaaccaccctgacacttcttgca3Cgacggc^gcatcgagct&ggtgaacttaccagcaga^gcacccagtcagttcgtgacc〈210>2〈211〉3126〈212〉腿SEQ.2ccaggaaatcttatgaagcttgccaatcaatcaggaagctagctgaatattaatgccgcatcgtgttcaataatgcca已atgct犯ggcg犯aagctaatgctcgctcgctgcggatgctatatcaaaaattctattaaaagaaccatct犯c卿tgggcacgcgtcgacgttactggccaccatattggagcattcctgaaggaagcacaLggcagcggagatacacctgggctctgctatggccgagg朋3ttggctcgcagcctatcaatgcagccgg犯sttgccggagactaagtaacg犯gc3gaMgcggcaceicttatga^ggccgcaaacggccgcaaatgaaagctgattgatttagcaggctgcactgggctcaaaattaagttccttagatgttgcttgcatgcatctcgaagccgctccgtcttttgaggggtctttgttcctctgg^ccccccacgc認ggcgggtgtgctgctttgaacgcatccaaagccgcctgccaatgatagctca^tacggatgctaatcacagctgactgcactc犯aagcagactaccaatgcggacagcgctcac3cga^gca^actatccagtC3g￡L￡LCttgaitggtctatgaaggcttctgccttctatggaagggcggccagc^tgtgagcccctctcgcaagcttcttgctggcg織ggctgtgtggataatgctgcatgctgcttatttatgatacttc^gctgaaagcgacctat^a^ctgcagcaatatgagtcaagctaaatgctaaagcg3gctgaaaBtacttgctaagtaagtta犯gtcttgagccatgtggatgatattagatgatgctttatgggattccgccccccggtgtgcgggcccggaaaca肌gg犯tggtgcctctgcgtg固cgttgcagtcttcgaatgctgccagccgttcaa3caggctgaacgctgtagcaga33cgca^tgctaaagcgtggcctatcaaagaagcagctgatta已gcaacgccgatttggttgaccgcctgcctatgaaigt3tC犯gC3ggC3t3Cg犯g33tgCg犯Ctgcttttagcact3gatatcaaattttggtttctccctccctttgtctatacctggccctgcaaggtctgtacgtctgtagggccaa已agcgtg3gttgg3tttcgcccagtgaaacgtgtcaaataatgccaacggccaattcaggaagccagagcttgcgcaatgagsacagcggtgaacagctgtagcagaagcgca^atcttgccaatatctttgacaaagcacttcccccccct犯tgtgattttctcttcttgactgaatgtcgtcgaccctttgcacgtgtatatagttgtgga2040210021602220228023402400246025202580263160120180240300360420■540600660720780840■960102010801140120012601320138014401500156016201680aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattc犯caaggggctgaaggatgcccagaaggt1740accccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtc1800gaggttaaasaaacgtctaggccccccgaaccscggggacgtggttttcctttgaaaaac1860acgatgataagcttgccacaacccgggatccgaattatgaagagagggctctgctgtgtg1920ctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggagcttgaaggtgataaatgg1980tattattttgataataacggttatatggtcactggtgctcaatcaattaacggtgttaat2040tattatttcttatcaaatggcctacagctcagagatgctattcttaagaatgaagatgga2100acttacgcttattatggaaatgacggtcgccgttatgaaaatggttattatcaattcatg2160agtggtgtatggcgtcacttcaataatggtgaaatgagtgttggattaactgtaattgat2220ggtcaggttcaatactttgatgaaatgggctatcaagccaaaggaaaatttgtaacaact2280gccgatggtaaaataagatattttgataagcaatctgggaacatgtaccgtaatcgtttt2340attgaaaacgaagaaggtaaatggctgtatctcggtgaagatggtgcagcagtgacagga2400tctcaaaccattaacggtcaacacctgtactttagagcaaacggtgttcaggtcaagggt2460g犯tttgtC3Ctg3CC3CC3CggCCgt3tC￡LgCt￡Ltt￡LCg3CggC幼ttCagggg6ltcaa2520atccgcaaccgctttgtccgcaatgctcagggtcaatggttctactttgataacaatggc2580tatgccgtaaccggtgccagaaccattsacggtcasctcctatactttagagcaaacggt2640gttcaggtcaagggtgaatttgtcactgaccgctacggccgtatcagctattacgacggc2700aattcaggggatcaaatccgcaaccgctttgtccgcaatgctcagggtcaatggttctac2760tttgataacaatggctatgccgtaaccggtgccagaaccattaacggtcaacacctatac2820tttagagcaaacggtgttcaggtcaagggtgaatttgtcactg已ccgccacggccgtatc2880agctattacgacggcaattcaggggatcaaatccgcaaccgctttgtccgcaatgctcag2940ggtcaatggttctactttgataacaatggctatgccgtaaccggtgccagaaccattaac3000ggtcaacacctatactttagagc犯acggtgttcaggtcaagggtgaatttgtcactgac3060cgctacggccgtatcagttattacgatgctaactctggagaacgagttcggattaactaa3120ctcgag312权利要求1.一种二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG，其中的SSISG具有SEQ.2所示的序列。2.—种二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG的构建方法，利用分子克隆技术在载体pCMVnir中插入抗原基因SBR和抗原基因GBR，两者通过IRES连接，以防止两者融合表达；并且在每个抗原基因的5'端融合一段信号肽基因。3.如权利要求2所述二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG的构建方法，其特征在于具体步骤如下(1)PCR扩增GBR片段以质粒pSG52为模板，设计引物用PCR的方法从pSG52中扩增得到GBR片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是HindIII位点，下游添加的是XhoI位点；引物设计如下上游引物5'-CGAAGCTTGAAGGTGATAAATGGTATT-3'5'端含有HindIII酶切位点AAGCTT下游引物5'-CTCGAGTTAGTTAATCCGAACTCGTTCT_3，5'端含有XhoI酶切位点CTCGAG最后获得两端带有酶切位点的编码抗原GBR的基因片段，该GBR基因片段经DNA凝胶回收试剂盒回收后，与克隆载体pMD18-T相连接，获得质粒pMD18-T-GBR;(2)在pTriEx-4载体中插入GBR片段将步骤1扩增获得的质粒pMD18-T-GBR和载体pTriEx-4进行HindIII和XhoI双酶切，获得目的基因片段GBR和pTriEx-4载体大片段，将两者在连接体系中进行连接，获得pTriEx-4-GBR;(3)在pTriEx-4-GBR中插入tPA信号肽序列选择适合GBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除EcoRI、HindIII酶切位点的双粘末端；上游5'aattatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccagg3'下游5'agctcctggctgggcgaaacgaagactgctccacacagcagcagcacacagcagagccctctcttcat3'将步骤(2)获得的质粒pTriEx-4-GBR经EcoRI、HindIII双酶切后的大片段与上述合成的双链信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pTriEx-4-SG;(4)质粒pCN-SSIE中插入目的基因SGBR将歩骤(3)获得的质粒pTriEx-4-SG与pCN-SSIE质粒分别用限制性内切酶Xhol和BamHI进行双酶切，回收目的基因片段SGBR和pCN-SSIE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SSISG。4.权利要求1的质粒pCN-SSISG用于制备防龋疫苗，其特征在于步骤如下用质粒pCN-SSISG转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆，37'C通气增菌培养14小时，通气量20m7h，将培养的菌液4。C4000rpm离心10分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件下离心10分钟，将沉淀经冷冻真空干燥等生产工艺制得冻干疫苗。5.如权利要求4所述的pCN-SSISG用于制备防龋疫苗，其特征是所述防龋疫苗是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量不少于10亿。全文摘要本发明提供二价双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSISG的构建，以及用质粒pCN-SSISG制备防龋疫苗。利用分子克隆技术在载体pCMVnir中插入抗原基因SBR和抗原基因GBR，两者通过IRES连接，以防止两者融合表达；并且在每个抗原基因的5′端融合一段信号肽基因。本发明提高了防龋疫苗的免疫原性，增强了免疫效果。免疫方法简便、有效、经济、持续时间长，并且可多次免疫、副作用小。文档编号A61K9/14GK101591666SQ20081015863公开日2009年12月2日申请日期2008年11月4日优先权日2008年11月4日发明者姜广水申请人:济南登益得科贸有限公司