特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽的制作方法

专利名称：：特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药领域，具体涉及一种能特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽及其制备方法。
背景技术：
：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一类严重威胁人类健康的疾病。在全球范围内，HBV感染者超过3亿人[1]，每年约100万人死于急慢性乙型肝炎[2]。乙肝感染人群的肝癌发病风险约为正常人群的100倍，约60-80%的原发性肝癌患者伴有乙肝病史[3]。同时，持续的HBV感染还会引起慢性肝功能不全、肝硬化等疾病[1-4]。最新的流行病学调査表明，我国人群的乙肝表面抗原(HBsAg)携带率为7.18%，HBV感染总人数达9300万(根据2008年4月21日公布的全国人群乙肝血清流行病学调査结果)。因此，通过研究HBV感染机体的病理生理过程，寻找新的抗病毒作用耙位，以期对HBV慢性感染患者进行更有效的抗病毒治疗，已成为临床治疗的迫切需要。目前，临床上用于治疗HBV感染患者的一线药物，主要有干扰素类和拉米夫定等抗病毒核苷类似物。a干扰素的作用机理为非特异性抗病毒效应，但仅对20%-40%的病人有效，且不良反应发生率较高[5];而拉米夫定等核苷类抗HBV药物，则通过与HBVDNA聚合酶或逆转录酶竞争性结合、特异性阻止HBVDNA链延长而抑制病毒的复制。后者短期疗效好，HBVDNA转阴率可达80。/。以上；然而，长期使用易导致病毒变异、产生耐药性(如YMDD变异)。拉米夫定治疗随用药时间的延长，耐药性发生率逐渐增高(year1，10-27%;year2，37-48%;year4，60-65%)，若停药还可能发生病毒反跳。其他核苷类药物如阿德福韦、替比弗定等，长期使用也可产生不同程度的耐药性[5]。因此，开发治疗效果更佳的药物，特别是根据病毒复制、增生的不同阶段，设计与核苷类药物作用机理不重叠的新型药物，对于降低耐药株产生的几率，达到对HBV慢性感染患者的长期、有效治疗，有十分重要的意义。生物制药领域近年来发展迅速，肽类药物的研发则是生物制药的一个重要发展方向。与传统药物相比较，肽/蛋白质类药物有其独特的优势，它能与目标蛋白高特异性结合而不与其他结构域类似的蛋白结合(或仅有较低的亲和力)，因而可以避免产生广泛的副反应或较强的毒性作用。同时，肽类药物也不易与其他药物相互作用，能较安全地用于人体，国外现已有数种针对HIV感染的抗病毒肽/蛋白质类药物进入临床试验。目前，国内针对HBV感染的肽/蛋白质类药物有十余种已申请发明专利，其中有数种进入临床试验阶段，但其均为治疗性乙肝疫苗，其主要成分多为乙肝病毒表面抗原的一部分氨基酸序列，依靠添加细胞因子或佐剂等加强其诱导机体免疫反应的能力。疫苗本身并无抑制病毒或杀伤病毒的作用，其作用机理为刺激机体免疫反应，通过机体免疫应答产生的细胞免疫反应或体液免疫反应来抑制病毒复制或杀伤病毒感染细胞。研究证实，在HBV慢性感染过程中，病毒进入宿主细胞后，能脱去病毒衣壳进入胞核内，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)，并以之为原始模板，转录为前基因组RNA(pgRNA);位于胞浆的pgRNA可与病毒的特异性多聚酶一起被由核心蛋白二聚体构成的约180到240个核心蛋白亚基形成的内壳蛋白所包裹，此时病毒再以pgRNA为模板，逆转录为新的非共价闭合的双链环状HBVDNA基因组[6]。随后此种含病毒DNA的内壳蛋白进入内质网或邻近的高尔基体，再与表面蛋白形成的糖蛋白外壳组装，最终以小囊泡的形式分泌到胞外[7]。病毒还会把部分新合成的胞浆内衣壳包裹的核酸再次转移至核内、并将部分双链DNA转化为cccDNA，以维持HBV的慢性持续感染[8]。在上述过程中，不论是以pgRNA为模板的逆转录反应，还是组装完整的HBV病毒颗粒，都需要完整的病毒内壳蛋白，而核心蛋白则是组装病毒内壳蛋白的关键蛋白。因此，特异性结合核心蛋白以阻断核心蛋白亚基的形成，是一种新颖有效的治疗策略既可通过阻断pgRNA逆转录反应抑制病毒的复制，又可阻止完整病毒颗粒的产生，从而中断病毒的分泌和再感染过程。针对核心蛋白亚基来设计抗HBV药物是一条新的思路。由于药物作用于病毒蛋白的组装阶段，不直接干扰HBVDNA的合成，理论上可能会减少因DNA突变导致耐药株产生的几率。同时，由于与现有的核苷类药物作用机理并不重叠，若与该类药物进行联用，还可增加抗病毒治疗的靶位，通过协同作用减少病毒基因突变及耐药的机会，从而提高抗病毒效果，达到长期、有效治疗的目的。为此，我们需寻找能够与HBV核心蛋白特异性结合的化合物或生物大分子，作为进行药物开发的基础。但到目前为止，尚未见特异性作用于HBV核心蛋白的肽/蛋白质药物。肽适配体系统是近年来发展的一种新型酵母双杂交技术，用于筛选能与靶蛋白特异性结合的肽适配体[9，10]。我们根据近年来的文献报道和本实验室的研究结果，获得了数条候选序列，并利用本实验室自主构建的人源化肽适配体筛选系统和Westernblot等方法，证实与HBV核心蛋白结合能力最强的一条由20个AA组成的多肽序列；我们将之命名为C20，作为开发抗HBV药物的基础。但其具有空间稳定性差，膜穿透能力低，体内易降解，可能诱发一定的免疫反应等缺陷，无法进行实际应用。参考文献1.LiangX，LiuY，ZhangQ，etal.HepatitisBvirussensitizesh印atocytestoTRAIL-inducedapoptosisthroughBax.JImmunol.2007Jan1;178(1):503-10.2.DongQ，ChanHL，LiuZ，etal.A1762T/G1764Amutationsofh印atitisBvirus,associatedwiththeincreasedriskofhepatocellularcarcinoma,reducebasalcorepromoteractivities.BiochemBiophysResCommun.2008Oct3;374(4):773-6.3.PisaniP，ParkinDM，MuN，etal.Cancerandinfection:estimatesoftheattributablefractionin1990.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.1997Jun;6(6):387-概4.LauJT，WrightTL.MolecularvirologyandpathogenesisofhepatitisB.Lancet.1993Nov27;342(8883):1335—40.5.PapatheodoridisGV，ManolakopoulosS，DusheikoG，ArchimandritisAJ".TherapeuticstrategiesinthemanagementofpatientswithchronichepatitisBvirusinfection.LancetInfectDis.2008Mar;8③167-78.6.ConwayJ"F，ChengN，ZlotnickA，etal.Visualizationofa4-helixbundleinthehepatitisBviruscapsidbycryo-electronmicroscopy.Nature.1997Mar6;386(6620):91-4.7.RoingeardP，LuSL，SureauC，etal.ImmunocytochemicalandelectronmicroscopicstudyofhepatitisBvirusantigenandcompleteparticleproductioninhepatitisBvirusDNAtransfectedH印G2cells.H印atology.1990Feb;11(2):277-85.8.WuTT，CoatesL，AldrichCE，etal.Inh印atocytesinfectedwithduckhepatitisBvirus,thetemplateforviralRNAsynthesisisamplifiedbyanintracellularpathway.Virology.1990Mar;175①255-61.9.ColasP，CohenB，J"essenT，etal.Geneticselectionofpeptide邻tamersthatrecognizeandinhibitcyclin-d印endentkinase2.Nature.1996Apr11;380(6574):548-50.10.ButzK，DenkC，FitscherB，etal.PeptideaptamerstargetingthehepatitisBviruscoreprotein:anewclassofmoleculeswithantiviralactivity.Oncogene.2001Oct4;20(45):6579-86.11.RuttekolkIR，DuchardtF，FischerR，etal.HPMAasaScaffoldfortheModularAssemblyofFunctionalPeptidePolymersbyNativeChemicalLigation.BioconjugChem.2008Sep9.[Epubaheadofprint]12.ParkYJ，ChangIX，LiangJF，etal.Nontoxicmembranetranslocationpeptidefromprotamine,lowmolecularweightprotamine(X丽P)，forenhancedintracellularproteindelivery:invitroandinvivostudy.FASEBJ.2005S印；19(11):1555-7.Epub2005Jul20.13.BhoradeR，WeisslederR，Nakakoshi.MacrocyclicchelatorswithparamagneticcationsareinternalizedintomammaliancellsviaaHIV-tatderivedmembranetranslocationpeptide.BioconjugChem.2000May-Jun;11(3):301-5.
发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽。该特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽的结构为将具HBV核心蛋白结合能力的多肽序列插入硫氧还蛋白序列中，并在硫氧还蛋白序列的C末端连接膜转位序列。其中，上述具HBV核心蛋白结合能力的多肽的氨基酸序列为SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。其中，上述硫氧还蛋白的氨基酸序列为PTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVKL。其中，上述具HBV核心蛋白结合能力的多肽序列插在了硫氧还蛋白序列的第34个氨基酸与第35个氨基酸之间。其中，上述膜转位序列为AAVLLPVLLAA。其中，上述重组蛋白是具有SEQIDNO.l所示氨基酸序列的重组蛋白或其保守性变异体本发明所解决的第二个技术问题是提供了一种编码上述特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽的编码基因。其中，上述编码基因具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。SEQIDNO.2:AtggtgaagcagatcgagagcaagactgcttttcaggaagccttggacgctgcaggtgataaacttgtagtagttgacttctcagccacgtggagcgGtccgagcttctacagcgttctgttcctgtggggcacctgcggcggcttcagccacagctggtaccgtccgagcaaaatgatcaagcctttctttcattccctctctgaaaagtattccaacgtgatattccttgaagtagatgtggatgactctcaggatgttgcttcagagtctgaagtcaaatccatgccaacattccagttttttaagaagggacaaaaggtgGgtgaattttctggagccaataaggaaaagctcgaagccaccattaatgaattagtcAAGCTTGCAGCCGTTCTTCTCCCTGTTCTTCTTGCCGCACCC。本发明所解决的第三个技术问题是提供了含有上述基因序列的基因载体。本发明所解决的第四个技术问题是提供了含有上述基因载体的宿主细胞。本发明所解决的第五个技术问题是提供了上述特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽、其编码基因、基因载体及宿主细胞在制备防治由乙肝病毒引发的疾病的药物中的用途。本发明所解决的第六个技术问题是提供了一种防治由乙肝病毒引发的疾病的药物。该药物是由上述特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽、编码基因、基因载体及宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分的载体制备而成的。根据本发明的第一个方面，筛选出具HBV核心蛋白强结合能力的多肽的序列为SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。并从增加多肽空间稳定性、减少多肽在人体内的免疫原性、使多肽获得高效的膜穿透能力、以及优化药物包封方式等方面，对之进行了一系列改造，以使其能有效治疗乙肝病毒感染，并达到临床应用的要求。由于体外合成的短肽分子构像易变，难以与耙蛋白稳定结合；因此，将短肽插入合适的骨架蛋白，使其在体内进行正确折叠并获得稳定的空间构像，是保持目的肽段与靶蛋白稳定结合的有效手段[ll]。在本发明中，将目的序列C20插入到优选的骨架蛋白TrxA的第34和35位氨基酸之间，以维持肽适配体的空间构像，使之能与HBV核心蛋白有效结合。为了适应临床应用的要求，还将通常所用的骨架蛋白更换为人源化的TrxA，以避免或减少异源蛋白产生的免疫原性。同时，由于C20是在体外由酵母双杂交技术筛选出的肽适配体，并非机体内自然存在的多肽，缺乏必要的胞膜受体结合位点或信号肽等结构，因此难以通过由磷脂双分子构成的脂质胞膜[12，13]。为此，本发明在C末端添加了一段优选的由12个氨基酸组成的膜转位序列(MTS)，该序列可将C20高效转入细胞膜内而发挥作用。目前，临床上用于治疗HBV感染的抗病毒药物，是通过作用于不同的特定靶位(如核苷类药物)、或通过非特异性效应(如干扰素)而产生的病毒抑制效果。由于HBV在体内的感染和病毒复制过程已被逐步阐明，从理论上说，无论对HBV的病毒DNA复制、病毒蛋白合成和病毒颗粒组装的任何一个关键过程进行干涉，均有可能达到抗HBV的治疗目的。本发明重组蛋白是在蛋白质水平上直接阻断HBV核心蛋白亚基的形成、从而中止内壳蛋白的组装和完整病毒颗粒的装配，这不同于目前临床上应用的抗HBV药物。由于完整的HBV内壳蛋白，在以pgRNA为模板的逆转录阶段、以及感染性病毒颗粒的组装过程中均起关键作用，而核心蛋白亚基则是组装病毒内壳蛋白的关键蛋白，因此，本发明重组蛋白不仅可通过阻断核心蛋白亚基形成、使PgRNA无法被内壳蛋白包裹而启动逆转录、从而中断病毒复制，还可通过阻断内壳蛋白的形成、使其无法与表面蛋白装配成完整的病毒颗粒、从而中止病毒的分泌和再感染过程。本发明有益效果在于目前进入临床的治疗抗乙肝病毒引发的疾病的新药主要是核苷类药物，如拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦等，其作用机理多为抑制DNA聚合酶或RNA逆转录酶，作用发生在DNA复制水平。本发明特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽，作用在蛋白组装阶段，不会掺入到病毒DNA链内，不直接干扰HBVDNA的合成，会减少因DNA突变导致耐药株产生的几率。另外，由于与现有的核苷类药物作用靶位不同，在临床应用中还可与该类药物进行联用，从而提高抗病毒效果，达到长期、有效治疗的目的。已有试验，本发明特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽在HBV转基因细胞株和动物模型体内不仅可与HBV核心蛋白特性结合并降低核心蛋白亚基水平，还能有效抑制病毒的复制和分泌；而未添加MTS序列的C20由于无法有效透过细胞膜，其作用效果很弱、与对照组相比无明显差异图l多肽药物C20-MTS结构示意图将C20插入人源化的骨架蛋白TrxA的34位和35位氨基酸之间，在TrxA的C末端连接MTS序列；图2表达载体pET3d-(TrxA-C20-TrxA)-MTS的体外诱导表达和纯化(A)M:marker;0:重组载体诱导表达过夜；Cl4:对照组空载体(pET-3d)在IPTG诱导1，2，3，4小时后的蛋白表达情况；Vl4:重组载体在IPGT诱导1，2，3，4小时后的蛋白表达情况；由图可知，蛋白在IPTG诱导后表达量随时间增高，诱导过夜后表达量达峰值，光密度分析外源蛋白含量占菌体蛋白的65%以上。(B)M:marker;L:细菌裂解液；Sl3:匀浆液上清；Pl2:匀浆液沉淀；由图可知，外源蛋白以可溶蛋白和不溶蛋白两种方式表达。(C)M:marker;F:流穿液；El6:离子交换柱洗脱液；E46为最后收集的蛋白样品。图3对照蛋白口￡13(1-(1^八-C20-TrxA)的体外诱导表达和纯化(无MTS):(A)M:marker;C:对照组空载体(pET-3d)诱导过夜；Vl3:重组载体的重组载体在IPGT诱导1，2，4小时后的蛋白表达情况；由图可知，蛋白在IPTG诱导后2h，表达量即达峰值，光密度分析外源蛋白含量占菌体蛋白的40%左右。(B)M:marker;S:匀浆液上清；P:匀浆液沉淀；由图可知，外源蛋白主要以不溶蛋白形式表达。(CandD)M:marker;F:流穿液；El9:离子交换柱洗脱液；E69为最后收集的蛋白样品。图4ELISA检测HBV转基因细胞中HBsAg含量在细胞培养液中加入未用脂质体包裹的药物(A)以及用脂质体包裹的药物(B)，ELISA检测HBsAg含量:H印G2.215细胞以0.8X105个细胞接种于12孔板中，加入实验组药物C20-MTS(令)和对照组C20(0)，空白组孔内仅加入1.5mL含10。/。小牛血清DMEM培养液用作阴性对照(參)，每组设3个复孔。贴壁培养24h后弃上清，加入不同浓度的药物，终体积1.5mL。继续培养72h后，换药至每孔1.5mL。总共加药培养8d后，取培养液上清检测HBsAg。图5Westernblot检测给予不同剂量的C20-MTS后核心蛋白水平可见给药剂量至lU/ml开始生效，至10y/ml时核心蛋白水平下降70X左右。图6分别给予10yg/mlC20-MTS或C20后，探针法检测HBVDNA的复制水平可见给予C20后，未见明显的病毒抑制效应，而添加了MTS序列的药物C20-MTS则有较明显的抑制效应，与C20相比，HBVDNA复制水平下降约65。/o;图7HBV转基因小鼠血清HBsAg检测分别给予5mg/kgC20-MTS，C20，10。/。NCS(小牛血清，用作阴性对照)，第8天检测小鼠外周血HBsAg含量，观察药效；可见与对照组相比，给予C20无病毒抑制效果，而给予C20-MTS则可见明显的病毒抑制效应，HBsAg水平下降约70X;图8HBV转基因小鼠肝细胞HBV核心蛋白水平检测给予不同剂量的C20-MTS和C20，杀死小鼠、切除小鼠肝脏，Westernblot检测病毒的核心蛋白水平；可见C20剂量增加至10yg/ml时也未见病毒抑制效应，而C20-MTS在0.1yg/ml时即显示出抑制效果，至10yg/ml时抑制效率最高，与C20相比，核心蛋白含量减少约70%左右。具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式的描述以详细说明但不限制本发明。研究证实，完整的HBV内壳蛋白，在以pgRNA为模板的逆转录阶段、以及感染性病毒颗粒的组装过程中均起关键作用，而核心蛋白(coreprotein)则是组装病毒内壳蛋白的关键蛋白。因此，设计可特异性地抑制核心蛋白亚基形成的药物，是一种新颖有效的治疗策略既可通过阻断pgRNA逆转录反应从而抑制病毒复制，又可阻止完整病毒颗粒的产生、中断病毒的分泌和再感染过程。肽适配体系统(P印tideAptamerSystem)是近年来发展的一种新型酵母双杂交技术，可用于筛选与目的蛋白特异性结合的肽适配体。根据近年来的文献报道和本发明的研究结果，获得了数条候选序列，并利用人源化肽适配体筛选系统和Westernblot等方法，鉴定出与HBV核心蛋白结合能力最强的一条由20个AA组成的多肽序列，命名为C20，作为本发明开发抗HBV药物的基础。为增加药物疗效、并达到未来临床应用的要求，本发明对C20进行了重要的分子改造(1)将C20装入骨架蛋白(proteinscaffold)中，以维持肽适配体的空间构像，使之能与HBV核心蛋白有效结合。经过ll前期试验的筛选，确定的骨架蛋白为人源化的TrxA，能在充分维持肽适配体的前提下还能避免或减少异源蛋白产生的免疫原性。(2)在骨架蛋白的C末端添力口了一段膜转位序歹[J(membranetranslocationsequence,MTS)，该序歹[J可将整条多肽高效转入细胞膜内，解决了基因工程肽由于缺乏必要生理活性位点难以穿过脂质胞膜的问题。(图l)实施例一本发明重组蛋白的制备根据HBV病毒特性，设计以HBV核心蛋白为作用耙位的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽药物C20-MTS。首先筛选能与HBV核心蛋白特异性强结合的多肽序列作为药物开发的基础；根据文献报道，并利用人源化肽适配体筛选系统，鉴定出与HBV核心蛋白结合能力最强的一条20由个AA组成的多肽序列，命名为C20，其氨基酸序列为SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。为达到临床应用的要求，对该序列(C20)进行分子改造1、选取人源化的骨架蛋白TrxA以减少异源蛋白的免疫源性；将C20插入骨架蛋白TrxA内以稳定小分子肽的空间构像。2、在肽链C末端加入膜转位序列MTS:AAVLLPVLLAAP，以使肽分子获得膜穿透能力。脂质体包裹以增加多肽药物的体内稳定性和生物利用度，利用脂质体对肝脏的被动靶向性达到定向给药的目的。经分子改造后的得到的多肽药物C20-MTS的氨基酸序列如下(共计141个氨基酸残基)1、通过基因工程技术构建可表达完整药物分子的载体;1)选取pET3d原核表达载体；2)在人工合成的MTS序列，N端添加NcoI、Hindin酶切位点，C端添加EcoRI、Bgll頂每切位点；3)3d用NcoI和BamHI双酶切，MTS用NcoI和BglII双酶切，再将两条片断连接，形成pET-MTS重组子；4)pET-MTS和人源化的TrxA骨架蛋白(hTrxA)分别用NcoI和HindIII双酶切，连接，形成pET-hTrxA-MTS重组子；5)将pET-hTrxA-MTS和人工合成的C20分别用RsrlI单酶切，连接，形成最终的重组表达载体pET-hTrxAhead-C20-hTrxA-MTS。2、原核表达系统和离子交换技术进行体外蛋白质的表达和纯化；(见附图2、3)1)普通LB培养基，选取大肠杆菌BL21(DE)3作为工程菌；摇菌至OD值O.50.7时，加入0.5mMIPTG诱导蛋白表达(图2.A);2)在lh，2h，3h，4h，过夜5个时段吸取10y1菌液，SDS-PAGE检测目的蛋白表达量；可见诱导4h后外源蛋白表达量已达峰值，诱导过夜表达量也未见增加；光密度扫描分析，外源蛋白含量占菌体蛋白总量的65%左右(图2.A);3)用含脱氧胆酸钠的缓冲液处理大肠杆菌沉淀，匀浆器反复匀浆并离心沉淀后，检测沉淀(为包涵体蛋白)和上清(为可溶性蛋白)中目的蛋白的含量；可见目的蛋白约一半以包涵体形式表达，一半以可溶蛋白形式表达；包涵体蛋白经过8M尿素溶解后复性，再与可溶性蛋白一起进行离子交换纯化；(图2.B)4)我们使用离子交换法对蛋白质进行纯化；经过2轮过柱，可得到较纯的目的蛋白(图3.C);5)为了与本发明药物C20-MTS进行药效对照，专门对未添加MTS序列的C20进行了表达和纯化，以在后续实验中用作对照；C20与C20-MTS的表达和纯化过程均相同，但从(图3.B)中可见，C20基本存在于包涵体中，以不溶蛋白的形式表达，因此收集的全部菌沉淀均需用8M尿素溶解处理后复性，再用离子交换纯化得到。实施例二体外药效研究获得HBV转基因H印G2.215细胞株进行体外模型药效验证，并以C20为对照(未添加MTS序列)，检验C20-MTS膜穿透能力。ELISA检测细胞培养液上清HBsAg含量，细胞培养液和血浆表面HBsAg抗原水平，可以提示分泌性病毒颗粒含量。Westernblot检测细胞裂解液中HBV核心蛋白亚基含量；确定胞内HBV核心蛋白亚基DNA含量，以提示HBV核心蛋白亚基形成情况探针法检测细胞裂解液HBVDNA含量，确定胞内HBVDNA含量，以提示病毒DNA的复制情况。结果如下在体外实验中，每2天给药一次C20-MTS(带有MTS序列的多肽药物)，第8天进行检测，当给药浓度增至lyg/ml以上时，可见HBsAg水平显著降低，抑制效率约78.5%(见图4A)。Westernblot检测，当药物浓度增至lug/ml时HBV核心蛋白水平开始降低，至10yg/ml核心蛋白水平最低，光密度扫描分析抑制率约71.5%(图5);分析胞内HBVDNA含量，10yg/ml时DNA水平降低约650/0(图6)。结论体外药效学实验证实，本发明设计制备的多肽药物C20-MTS可降低HBV核心蛋白水平约70%，有效抑制了病毒颗粒的包装；同时HBsAg分泌水平和HBVDNA含量也分别降低了78.5%和65%，提示药物可有效抑制病毒颗粒的分泌和病毒复制。本发明用未添加MTS序列的C20用于对照观察，未发现有明显的病毒抑制效应。探讨了药效差异产生的原因可能是由于C20为一段由酵母双杂交系统筛选出的肽适配体，并非机体内自然存在的生理性肽段，缺乏必要的胞膜受体结合位点或信号肽序列，因此难以穿过由磷脂双分子构成的脂质胞膜；而添加了膜转位序列MTS的药物C20-MTS，则可高效透过胞膜进入胞内，发挥其抗病毒作用。实施例三体内药效学研究使用HBV转基因Balb/c小鼠模型(小鼠来源广州军区医院。)检测本发明蛋白的体内药效，并以C20为对照(未添加MTS序列)，检验C20-MTS膜穿透能力。ELISA检测小鼠外周血HBsAg含量。Westernblot检测小鼠肝细胞HBV核心蛋白亚基含量。探针法检测小鼠肝细胞HBVDNA含量。在体内实验中，我们使用HBV转基因小鼠模型进行药效验证。根据体外实验结果，我们选择每2天给药1次，结果示在给药剂量为2.5mg/kg以上时可检测到HBsAg分泌水平降低；剂量为5mg/kg时，第8天检测HBsAg水平降低70。/。左右(附图7);处死小鼠后收集肝细胞、Westernblot分析证实，核心蛋白水平降低约70%(附图8)。以上实验均可观察到明显的量效关系。并且可以看见同剂量的C20-MTS和C20的效果之间有明显差异。表明本发明多肽能高效透过胞膜，直接作用于乙肝病毒本身。由上可见，本发明多肽能高效透过胞膜，直接作用于乙肝病毒本身，通过与HBV核心蛋白特异性结合，阻断内壳蛋白的形成、抑制依赖内壳蛋白的PgRNA的逆转录反应，从而抑制病毒复制；同时由于内壳蛋白无法与壳蛋白结合形成完整的病毒颗粒，从而中断了病毒的分泌和再感染。而未添加MTS的C20由于难以透过胞膜，因而作用微弱，未观察到明显的抗病毒效应。SEQUENCELISTING〈110>四川大学华西医院〈120>特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽〈130>A080370k〈160>2〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>141〈212>PRT〈213>Artificial〈220>〈223>artificial〈400>1MetValLys1AlaAlaGlyGlyProSer35PheSerHis50HisSerLeu65ValAspAspGinlieGluSerLysThrAlaPheGinGluAlaAsp20Phe5LysSerGin85LeuValValTyrSerValSerTrpTyrSerGluLys70AspArg55TyrLeu40ProVal25Phe10AspValAlaSerGlu90PheSerLeuTrpGlySerLysMetSerAsnVallie75Serlie60PheAlaThr30ThrCys45LysProLeuGluGluValLysProThrPheGliiPhePheLysLysGlyGliiLysValGlyGluLeuAsp15TrpSerGlyGlyPhePheValAsp80SerMet95PheSer100105110GlyAlaAsnLysGluLysLeuGluAlaThrlieAsnGluLeuValLys115120125LeuAlaAlaValLeuLeuProValLeuLeuAlaAlaPro130135140〈210>2〈211>423〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400〉2atggtg肌gc卿tcg卿gcaagactgcttttcaggaagccttggacgctgcaggtgat60tagttgacttctcagccacgtggagcggtccgagcttctacagcgttctg120ttcctgtggggcacctgcggcggcttcagccacagctggtaccgtccgag180aagcctttctttcattcccttattccaacgtgatattccttgaagtagat240gtggatgactctcaggatgttgcttcagagtctgaagtcaaatccatgcc肌cattccag300ttttttaagaggtgggtg肌ttttctggagcc肌t肌ggaa肌gctcg肌360gccaccattacaagcttgcagccgttcttctccctgttcttcttgccgca420ccc42权利要求权利要求1特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽，其特征在于其结构为将具HBV核心蛋白结合能力的多肽序列插入硫氧还蛋白序列中，并在硫氧还蛋白序列的C末端连接膜转位序列，所述的具HBV核心蛋白结合能力的多肽序列为SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。2.根据权利要求l所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽，其特征在于所述的硫氧还蛋白的序列为MPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVKL。3.根据权利要求l所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽，其特征在于所述具HBV核心蛋白结合能力的多肽序列插在了硫氧还蛋白序列的第34个氨基酸与第35个氨基酸之间。4.根据权利要求l所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽，其特征在于所述的膜转位序列为AAVLLPVLLAA。5.根据权利要求l所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽，其特征在于具有SEQIDNO.l所示氨基酸序列。6.编码权利要求15任一项所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽的核苷酸序列。7.含有权利要求6所述核苷酸序列的基因载体。8.含有权利要求7所述基因载体的宿主细胞。9.权利要求15任一项所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽、权利要求6所述核苷酸序列、权利要求7所述的基因载体或权利要求8所述的宿主细胞在制备防治由乙肝病毒引发的疾病的药物中的用途。10.防治由乙肝病毒引发的疾病的药物，其特征在于是由权利要求l5任一项所述的特异性阻断乙肝病毒组装和复制的膜穿透性多肽、权利要求7所述的基因载体或权利要求8所述的宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。全文摘要本发明属于生物医药领域，具体涉及一种能特异性阻断乙肝病毒组装和复制的新型膜穿透性多肽及其制备方法。本发明的重组蛋白结构为将HBV核心蛋白结合能力的多肽序列插入硫氧还蛋白序列中，并在硫氧还蛋白序列的C末端连接膜转位序列。其中，具HBV核心蛋白结合能力的多肽序列插在了硫氧还蛋白序列的第34个氨基酸与第35个氨基酸之间。本发明重组蛋白在HBV转基因细胞株和动物模型体内不仅可与HBV核心蛋白特性结合并降低核心蛋白亚基水平，还能有效抑制病毒的复制和分泌，具有很好的应用前景。文档编号A61K48/00GK101423555SQ20081030554公开日2009年5月6日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者吴思思,巍张,辛洪波申请人:四川大学华西医院