含肌腱细胞的生物支架和使用该生物支架的治疗方法

专利名称：含肌腱细胞的生物支架和使用该生物支架的治疗方法
技术领域：
本发明涉及制备用于修复撕裂(tear)的生物支架的方法。具体而言，本发明涉及 使用接种有肌腱细胞的生物支架来修复肩袖撕裂(rotator cufftears)的方法。
背景技术：
肩袖腱撕裂是由于持续头上活动(overhead activities)引起的损伤所造成的常 见后果(Briner et al. ， (1997) Sports Med. 24(1) :65-71)。大量研究描述了肌腱修复的不 同技术。包括缝合技术(Gerber et al. ， (1999) J. Bone Joint Surg. Am. 81 (9) :1281-90)、 腱骨固定技术(Burkhart et al. ， (2000) Arthroscopy. 16 (7) :82-90)、用于收縮撕裂的肌 腱移动和滑动技术(Tauro et al. ， (1999)Arthroscopy. 15(5) :527-30)和采用多种组织或 合成的肌腱移植物的技术(Amstutz et al. (1976) J. Biomed. Mater. Res. 10(1) :47-59)。
外科手术修复通常可获得在术后前期高水平的功能改善和患者满意度，但存 在明显的与较大面积的慢性撕裂相关的发病率(Hattrup， (1995)J. Shoulder Elbow Surg.4(2) :95-100)。此外，对失败的肩袖修复进行修正手术的成功率是非常低的 (Bigliani et al. (1992) J. Bone Joint Surg. Am. 74 (10) :1505-15)。因此，本领域需要发 展更好的用于治疗肩袖撕裂的方法。 已提出在肩袖撕裂中试图改善手术结果的生物支架和合成埋植物(参见US Patent No. 4，668，233、 US Patent No. 4，775，380、 US Patent No. 5，352，463、 US Patent No.4，902，508、以及EP 0 223 370)。这些装置可促进埋植术中的组织入侵，希望组织与装 置一起向内生长，这些装置将获得改善的伤口愈合和患者的功能改善。然而，用于治疗肩 袖撕裂的装置通常未能表现出成功的长期结果，并且经常发生由于非功能性脂肪组织的入 侵、腱鞘炎、松弛或植入物失效所导致的失败。而且，所述装置的持续负载和对关节组织的 磨损导致装置的耗损(wear)、移位(cre印)和劳损，并最终造成装置失效。
同样地，在肩袖撕裂中使用装置(如生物支架)的增补手术修复也未显示出对患 者临床结果的改善(Iannotti， (1994) J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2 (2) :87-95)。如此，目前 的方法是欠佳的，需要发展更好的用于修复肩袖撕裂的疗法。

发明内容
现在本发明发展了一种治疗肩袖撕裂的基于细胞的组织工程学新方法，该方法包 括植入已接种有经体外扩大培养的肌腱细胞的生物支架。 因此，本发明的第一方面提供了治疗哺乳动物患者的肩袖撕裂的方法，其中，该方 法包括(i)在含有胰岛素或胰岛素的功能性衍生物以及糖皮质激素或糖皮质激素类分子 的培养基中，在体外选择性地扩大培养(e邓anding)肌腱细胞，以制备经扩大培养的肌腱 细胞培养物；(ii)将所述经扩大培养的肌腱细胞接种至生物支架，以制备接种有肌腱细胞 的生物支架；和(iii)将所述接种有肌腱细胞的生物支架植入到邻近肩袖撕裂的位置。
在一些实施方式中，将接种有肌腱细胞的生物支架在体外培养足够时间，以在植入之前建立肌腱细胞。 在一些实施方式中，肩袖撕裂是大面积的肩袖撕裂。 令人赞赏的是，本文所述的用于该方法的肌腱细胞和本发明装置可从任何含有肌 腱细胞的组织中分离得到。在一些实施方式中，所述组织是肌腱。肌腱可来自哺乳动物的 任何解剖位点，并且可以是肩袖肌腱(rotator cufftendon)、冈上肌腱(supraspinatus tendon)、肩月甲下月几鍵(subcapularis tendon)、胸大月几鍵(pectoralis major tendon)、 腓肌腱(peroneal tendon)、跟腱、胫前肌腱(tibialis anterior tendon)、前交叉韧带 (anterior cruciate ligament)、后交叉韦刃带(posterior cruciate ligament)、月国鍵 (hamstring tendon)、夕卜侧顿带(lateral ligament)、内侧顿带(medial ligament)、骨宾骨 肌腱(patella tendon) 、二头肌腱(bic印s tendon)、以及三头肌腱(tric印s tendon)。
在一些实施方式中，含肌腱细胞的组织可以是从任何哺乳动物中分离的，所述哺 乳动物包括但不限于羊、牛、猪或人。在其他实施方式中，含肌腱细胞的组织是从人身上分 离的。在另外的实施方式中含肌腱细胞的组织是从需要治疗的患者身上分离的。
分离的肌腱细胞是在含有胰岛素或胰岛素的功能性衍生物的培养基中，通过体外 培养进行选择性扩大培养的。在一些实施方式中该培养基含有约0. 00005-0. 1重量/体 积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。在其他实施方式中培养基含有约0. 0001-0. 001 重量/体积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。在另外的实施方式中培养基含有约 0. 0006重量/体积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。 所述培养基还可含有糖皮质激素，如合成的糖皮质激素，或糖皮质激素类分子 (glucocorticoid-like molecule)。在一些实施方式中糖皮质激素是倍他米松。培养基可 含有约0.00001-0. 1重量/体积％的糖皮质激素或糖皮质激素类分子。在一些实施方式中 培养基含有约0. 0001-0. 001重量/体积％的糖皮质激素或糖皮质激素类分子。在另外的 实施方式中培养基含有约0. 0002重量/体积％的糖皮质激素或糖皮质激素类分子。
在一些实施方式中，经扩大培养的肌腱细胞的培养物含有至少80%的肌腱细胞和 不多于20%的非肌腱细胞。在其他实施方式中，所述培养物中的至少90%的细胞是肌腱细 胞。在另外的实施方式中，选择性扩大培养的肌腱细胞培养物中至少95%的细胞是肌腱细 胞。 在一些实施方式，经扩大培养的肌腱细胞培养物所含的细胞中至少80%的细胞表 达编码以下因子的一种或多种基因I型胶原、III型胶原、EphA4、巩膜(Scleraxis)、Sixl、 C0MP禾口 /或Cbf al 。 在第二方面，本发明提供了治疗人患者大面积肩袖撕裂的方法，其中，该方法包 括(i)从所述患者身上提取的肌腱组织中分离肌腱细胞；(ii)在含有约0. 0006重量/体 积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物以及约0. 0002重量/体积％的糖皮质激素或糖皮 质激素类分子的培养基中，在体外选择性地扩大培养所述肌腱细胞，以制备含有至少80% 肌腱细胞的经扩大培养的肌腱细胞培养物；(iii)将所述经扩大培养的肌腱细胞接种至生 物支架并将所述生物支架和肌腱细胞培养不大于5天，以制备接种有肌腱细胞的生物支 架；和(iv)将所述接种有肌腱细胞的生物支架植入到肩袖撕裂处。 在第三方面，本发明提供了含有细胞的生物支架，其中，所述细胞中大于80%的细 胞是肌腱细胞。在一些实施方式中，所述生物支架含有至少90%、95%或99%的肌腱细胞。
所述生物支架可含有细胞，其中，所述细胞中的至少80%的细胞表达编码以下因 子的一种或多种基因1型胶原、III型胶原、EphA4、巩膜、Sixl、 C0MP和/或Cbfal。
所述生物支架可含有骨架(matrix)、膜、微球、毛状物(fleece)、线状物 (thread)、或凝胶，和/或它们的组合。在一些实施方式中，所述生物支架含有I/III型胶 原骨架(ACI Matrix )或小肠粘膜下层(Vitrogen )。


图1 :动物研究的实验设计。
图2 :兔大面积肩袖撕裂的模型。 图3 :在培养的肌腱细胞和肌腱组织中表达I/III型胶原和EphA4。 图4 :1型胶原在肌腱细胞体外培养物中的免疫染色。(A)试验孔(100倍)；(B)
对照孔(100倍)。 图5 : (A) ACI-Maix 生物支架中疏松多孔的胶原纤维排列(100倍)。(B) 72小时 之后整合到ACI-MaixTM胶原纤维内的肌腱细胞层(200倍)。(C)示例性ACI-Maix 生物支 架中两类前突(泡黑色箭头&层形足板(lamellipodia):白色箭头)的单细胞形态(1500 倍)。(D)显示Restore 小肠粘膜下层生物支架的平面形态和高度紧密的胶原结构的横切 扫描电镜检查(400倍)。(E)肌腱细胞(箭头)显示了 Restore 生物支架中的单层生长模 式与体外所观察到的模式类似，具有纺垂形的外观和双极或三极的层形足板细胞附着(200 倍)。(F) Restore 生物支架中的在细胞表面具有可见突起(泡黑色箭头&层形足板白 色箭头)的单细胞(650倍)。 图6 :对照组；苏木精和伊红。(A) 4周对照样品的特征在于细胞质的增加和新生成 血管和胶原纤维组织的变化(250倍)。(B)4周样品的骨槽(BT)特征在于细胞数量的增加 和矿化区的缺乏(IOO倍)。(C)8周样品显示了具有更低细胞密度和不均匀排布平行胶原 纤维排列的更加有组织的结构(IOO倍)。(D)8周样品的骨槽示范了典型的成熟4-区结构 (100倍)。MT :再生肌腱的中间质(Mid-substance)。 图7 :ACI-MaixTM生物支架组；苏木精和伊红。(A)大部分的ACI-Maix 生物支架在 4周时不被吸收，在生物支架周围具有明显的淋巴细胞渗透(25倍)。(B)4周样品的吸收区 域证实了以粗糙胶原排列、增加的细胞质、以及形成新生血管为特征的一期修复模式(100 倍)。(C)4周样品的骨槽由软骨组织形成，具有由骨槽边缘延展出来的致密纤维组织(100 倍)。(D)8周样品显示了更加有组织的结构(IOO倍)。(E)骨槽形成也是成熟的。(F)再
生肌腱的中间质中脂肪组织(箭头)的导入(100倍)U:未吸收的生物支架；L:淋巴细胞的 入侵；A :吸收区域；V :血管化组织。 图8 -Restore 生物支架组；苏木精和伊红。(A) ReSt0reTMSIS生物支架的原始结 构看起来是紊乱的纤维。在植入物内部和周围可观察到大量炎症细胞(25倍)。(B)吸收 区域证实了存在于富含血管化结缔组织骨架中的具有双圆和纺锤形形态的成纤维细胞数 量的增加(IOO倍)。(C)8周样品不完全吸收并且存在明显的淋巴细胞渗透(IOO倍)。(D)
骨骼肌腱结合处显示了成熟的4区结构(100倍)。A :吸收区；U :未吸收的生物支架；L :淋 巴细胞；V:血管化组织。 图9 :接种自体同源肌腱细胞的ACI-Maix 生物支架组；苏木精和伊红。(A)在4周，植入肌腱细胞的ACI-Maix 生物支架完全不被吸收并引起淋巴细胞的渗透(100倍)。 (B)几乎未植入的自体同源肌腱细胞(箭头)也被点染至剩余的生物支架中(200倍)。(C) 在8周，植入肌腱细胞的ACI-MaixTM生物支架显示了与对照组一致的结果(IOO倍)。(D)
骨槽(BT)组织学不能与对照组显示出区别(IOO倍)。A :吸收区；U :未吸收的生物支架；L : 淋巴细胞；MT :再生肌腱的中间质。 图10 :RestoreTM生物支架+自体同源肌腱细胞组；苏木精和伊红。(A)在8周，植 入自体同源肌腱细胞的Restore 生物支架证实了具有与对照组类似的优异肌腱结构(100 倍)。(B)肌腱骨骼结合处也是成熟的，显示了典型的4区结构(IOO倍)。(C)将一些肉芽 组织与胶原纤维混合点染，类似慢性的肉芽反应(100倍)。(D)在植入Restore 生物支架 的所有的组中均发现异位骨的小病灶(100倍)。
图11 :发炎率被炎症细胞占有的修复肌腱的百分比。 图12 :在4周和8周时，单独植入的ACI-Maix 和Restore 生物支架或接种有自 体同源肌腱细胞的ACI-Maix 和Restore 生物支架的组织学评分。 图13 :对ACI-MaixTM+肌腱细胞的I型胶原(A)的免疫染色试验(蓝色箭头细胞 质区域；黑色箭头细胞外基质)(400倍)。(B)阴性对照(400倍)。 图14 :在4周和8周时，单独植入的ACI-Maix 和Restore 生物支架或接种有自 体同源肌腱细胞的ACI-Maix 和Restore 生物支架内的I型胶原阳性细胞。
图15 :操作条件和兔I/III型胶原蛋白、EphA4、以及GAPDH基因的引物序列。
图16 :几何测量由从未接受手术肩部收集的五十个标准兔肩袖肌腱中测量的正 常厚度，宽度和长度。所有测量是在室温放松状态下进行。
具体实施例方式
在具体描述本发明之前，应该理解的是本发明不限于具体例举的方法，是可以变 化的。还应理解的是本文所用术语仅是为了描述本发明的具体实施方式
，并不会限制仅由 所附权利要求限制的那些。 本文所引用的所有出版物、专利和专利申请(无论是上文或下文中)都因此以参 照被整体并入。但是，本发明所述的出版物是为了描述与公开出版物中所述的可能用于接 连本发明的方案和试剂目的而引用的。但没有证据表明由于这些先前的公开而能够导致本 发明不能够被授权。 除非另有说明，本发明的实践将采用细胞培养、细胞生物学和矫形外科的常规技 术，这都是本领域技术人员所知的。在以下文献中描述了这些技术，参见，例如Coligan et al. ， 1999 "Current protocols in Protein Science"Volume land II(John Wiley & Sons Inc.) ;Ross et al. ， 1995 "Histology :Text and Atlas ，，， 3rd Ed. ， (Williams & Wilkins) ;Kruse & Patterson (eds. ) 1977 "Tissue Culture，， (Academic Press); Canale (ed. ) 2003 "Campbell' s Operative Orthopaedics" 10thed. (St. Louis， Mo. :MD Consult LLC) ;and Alberts et al. 2000 "MolecularBiology of the Cell" (Garland Science)。 必须注意的是，除非上下文明显指示否则本文和所附权利要求中使用的单数形式 "一个"，和"该"包括复数。因而，例如"一个细胞"包括这种细胞的复数，和"一种试剂"是指一种或多种试剂，等等。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所 属的领域普通技术人员通常理解相同的含义。 尽管类似于或等同于本文所述的任何材料和方法可用于实践或试验本发明，现在 将描述优选的材料和方法。 在一些实施方式中，本发明关注于治疗肩袖撕裂的方法。 本文所用的术语"治疗"或"处理"或其语法等同成分涵盖了治疗哺乳动物患者 (优选人)的肩袖撕裂，包括(a)救护或改善肩袖撕裂症状，即使肩袖撕裂的症状恢复；或 (b)预防或抑制易发生肩袖撕裂但还未被诊断为患病的患者(例如之前治疗过肩袖撕裂的 人)中肩袖撕裂的复发。治疗的结果可以是鉴于部分或完全治愈肩袖撕裂的治疗或鉴于完 全或部分预防发生肩袖撕裂的预防。 肩袖是指用于固定肩部的肌肉及肌腱群。肩袖肌肉是一组围绕肩部的四块肌肉 (冈上肌、冈下肌、小圆肌和肩胛下肌)。四个肩袖肌肉肌腱组合形成宽的连接肌腱，称为肩 袖肌腱，并附在肩部肱头的骨骼上。 术语"肩袖撕裂"是指四个肩袖肌肉肌腱中的一个或多个或肩袖的连接肌腱的撕 裂。肩袖肌腱的撕裂可以是局部厚度的撕裂，全部厚度的撕裂或全部厚度的撕裂且肌腱与 骨骼的完全解离。全部厚度的撕裂是指贯穿整个肌腱的创伤。其在尺寸上可以从很小或极 小向很大至包括大部分的肌腱变化。全部厚度的撕裂还可以包括肌腱从肱头的完全解离。
在一些实施方式中，肩袖撕裂是大面积的肩袖撕裂。 术语"大面积肩袖撕裂"是指大于约5cm的撕裂和包括大于一个肌腱的撕裂。
令人欣喜的是，大部分哺乳动物含有肌腱且所有的这些肌腱含有内含在富含糖蛋 白的骨架中的胶原纤维。从而，在本说明书中术语"哺乳动物患者"是指任何哺乳动物，如人 或对人具有经济重要性和/或社会重要性的哺乳动物，例如除人之外的食肉动物(如猫和 狗)。还提供了修复家畜类的肩袖损伤，所述家畜包括但不限于驯养猪(猪(pigs)和肥猪 (hogs))、反刍动物、马等等。所述术语不指定特定年龄。从而，包括成年的和新生的患者。
在一些实施方式中，第一步包括从来源处分离一组肌腱细胞。本文所用术语"肌腱 细胞"是指可在所有哺乳动物肌腱中发现的纺垂形的成纤维样细胞。肌腱细胞通常具有狭 长的细胞核和浓稠细胞质，且通常被发现位于肌腱的胶原纤维中。在它们产生I型胶原和 表达标记"巩膜"的方面，肌腱细胞通常是一致的。因此，在一些方面本发明的肌腱细胞是 表达巩膜的细胞或能够表达I型胶原或巩膜的细胞。 本文所用术语"来源"是指在任何哺乳动物中任何含有肌腱细胞的组织。在一些 实施方式中，含肌腱细胞的组织是肌腱。肌腱是哺乳动物中连接肌肉和骨骼的组织。肌腱 可来自哺乳动物的任意解剖位点且可以是肩袖肌腱、冈下肌腱、冈上肌腱、肩胛下肌腱、胸 大肌腱、腓肌腱、跟腱、胫前肌腱、前交叉韧带、后交叉韧带、胭腱、外侧韧带、内侧韧带、髌骨 肌腱、二头肌腱、以及三头肌腱。 肌腱细胞可通过本领域技术人员已知的多种方式从来源处分离到。在一些实施方 式中，肌腱细胞可通过常规方法从活组织材料分离。如以下具体描述的，在一些实施方式 中，通过酶促消化来分离肌腱细胞。 在一些实施方式中，含肌腱细胞的组织可从任何哺乳动物中分离得到，包括但不 限于羊、牛、猪或人。在其他实施方式中，含肌腱细胞的组织是从人身上分离的。
在一些实施方式中，含肌腱细胞的组织是"自体同源的"，即从需要治疗肩袖撕 裂的患者身上分离的。例如，患肩袖撕裂的哺乳动物患者可具有从它们身体中任何肌腱 提取的活组织。这些肌腱包括但不限于，桡侧腕屈肌的肌腱(tendon of flexor carpi radial is)和跟骨肌腱。 可通过对作为肌腱细胞来源的组织做适当处理，而从活组织材料中获取肌腱细 胞。为获取肌腱细胞的组织处理技术是本领域技术人员已知的，参见例如"Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique" 2nd ed. (A. R. Lisslnc.)。例如，组织或器 官可被机械地解离和/或，以消化酶处理或螯合剂以减弱细胞之间的作用以便获取单个细 胞的悬浮液。典型的方法可包括机械解离、酶处理和螯合剂的组合。在一个技术中组织是 剁碎的并以消化酶单独或组合地进行同时或依次的处理。可用于分离细胞的酶的实例包 括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、玻璃酸酶(hyaluronidase)、 DNA酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶等等。在一些实施方式中，采用含有具有约43nkat/ml至约 51nkat/ml胶原酶活性和约0. 22nkat/ml至约0. 44nkat/ml木瓜凝乳蛋白酶活性的水性混 合液的酶组合物来分离细胞，例如US PatentNo. 5， 422， 261所述。机械解离也可通过例如 采用搅拌器、筛、均质器、压敏元件(pressure cell)等等完成。 制得的细胞和细胞簇的悬浮液还可分成实质同源的细胞类型的组。这可采用细胞 分离的标准技术完成，包括例如阳性筛选法(例如克隆性增殖和特定细胞类型的筛选)； 阴性筛选(例如不期望细胞的裂解)；基于在密度溶液中的特定重力、混合的细胞群中细胞 的不同粘附特性的分离；荧光活化细胞分类术(FACS)，等等。本领域已知的其他筛选和分 离方法参见例如Freshney，，Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique"2nd ed. (A. R. Liss Inc.)。 在一些实施方式中，将通过活组织切片分离的肌腱组织进行清洗、切分和消化，以 形成可在细胞培养液中生长以产生游离肌腱细胞的外植体。在一些实施方式中，对活组织 切片组织进行酶促消化和/或加入可结合或螯合细胞相互粘附所依赖的Ca2+的试剂，如乙 二胺四乙酸(EDTA)。适宜使用的酶实例包括胶原酶、胰蛋白酶、以及蛋白酶中的一种或多 种。 在一些实施方式中，将剁碎至不大于1mm的肌腱组织在含有约2. 5重量/体积％ 胰蛋白酶和约5. 5重量/体积％胶原酶且不含酚红的标准组织培养基中约37t:约5% C02 下温育至少3小时。 在一些实施方式中，在酶促消化后，通过离心活组织溶液和以细胞生长培养基清 洗所得小片，从活组织中回收肌腱细胞。可选地，通过例如筛网如无菌150微米尼龙网的 过滤，可从活组织溶液中回收肌腱细胞。另一方式是基于一些细胞类型牢固地粘附在塑料 或玻璃的趋向，可实现它们与粘附不牢固的肌腱成分的分离。可选地，采用能够与所述细 胞特异性结合的抗体可将所述细胞与肌腱的其他成分分离，例如采用结合骨架的抗体或偶 联荧光染料，然后可通过荧光活化细胞分类术(FACS)进行分离。在一些实施方式中，通过 0. 22 i！ m过滤器过滤活组织溶液以去除骨架碎片，并离心滤过液以形成细胞沉淀物来分离 肌腱细胞。然后以细胞生长培养基对所述细胞沉淀物进行清洗。 在体外选择性扩大培养分离出的肌腱细胞。本文所用术语"选择性扩大培养"是 指培养分离的肌腱细胞，通过这种方式使肌腱细胞生长并增加肌腱细胞数量，而不要其他细胞类型。 在一些实施方式中，在含有胰岛素或胰岛素的功能性衍生物的培养基中，在体外 扩大培养分离的肌腱细胞。胰岛素是由胰腺产生的以其天然形式存在的激素。但是，用于 选择性扩大培养肌腱细胞的培养基中的胰岛素可以是合成的，例如重组胰岛素，或天然存 在的。 胰岛素的"功能性衍生物"是如Chan et al. ， 2000，" Insulin-through the ages: Phylogeny of a growth promoting and metabolic regulatory hormone，，(美国动物 学家；可登录http://www. findarticles. com/p/articles/mi_qa3746/is_200004/ai_ n8899929)中描述的那些分子，其具有胰岛素活性(即培养肌腱细胞能力)，并且包括胰岛 素的生物活性片段、变体和衍生物。 在一些实施方式中，胰岛素的"功能性衍生物"或其片段或变体的一个或几个氨基 酸残基被天然存在的20个标准氨基酸或合成的氨基酸同源物取代。这种同源物的实例是 4_羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、P-丙氨酸和4-氨基丁
酸、e-丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、Y-氨酪酸、高丝氨酸、瓜氨酸等等。 胰岛素的功能性衍生物的制备可使用聚乙二醇(PEG)并按照Sehon和合作者 (Wie et al.， supra)的方法来制备偶联PEG的胰岛素分子。此外，可在化学合成胰岛素 的过程中加入PEG。制备胰岛素的衍生物或其片段的其他方法包括还原/烷化(Tarr， Methods of Protein Micro_characterisation，J. E. Silver ed. ，Humana Press, Clifton N. J. 155-194(1986));酰化(Tarr， supra);化学偶联适宜的载体(Mishell and Shiigi， eds， Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, Calif. (1980) ，U. S. Pat. No. 4， 939， 239 ;或 益和福尔马林处理(Marsh， 1971， Int. Arch, of Allergy and Appl. Immunol. ，41 :199-215)。 应该注意的是，术语"功能性衍生物"不包括如胰岛素类生长因子I或II在内的 分子。 胰岛素或胰岛素的功能性衍生物可在添加待培养的肌腱细胞之前，被引入到培养 基中。可选地，胰岛素或胰岛素的功能性衍生物可在整个培养期间被添加到培养基中，例如 通过在细胞滋养层(cell feeder layer)的存在下培养细胞(如P细胞)，这些细胞能够 分泌胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。 本文所用的"片段"是指胰岛素蛋白的一部分，其保持了胰岛素的功能尤其是对培 养物中肌腱细胞生长的支持能力。胰岛素片段可以是至少约io个氨基酸残基的长度，优选 10-16个氨基酸残基的长度，更优选约10-20个氨基酸残基的长度。 胰岛素的"变体"是指具有一个或多个取代基而其二级结构保持不变的胰岛素分 子。这种保守性取代的实例包括与原始氨基酸残基具有实质相同的疏水性、大小和电荷的 氨基酸。这种取代通常是蛋白或肽化学领域技术人员公知的。例如，保守性取代包括脯氨 酸对甘氨酸的取代和甘氨酸对脯氨酸的取代；丙氨酸或缬氨酸对甘氨酸的取代和甘氨酸对 丙氨酸或缬氨酸的取代；异亮氨酸对亮氨酸的取代和亮氨酸对异亮氨酸的取代；组氨酸对 赖氨酸的取代和赖氨酸对组氨酸的取代；苏氨酸对半胱氨酸的取代和半胱氨酸对苏氨酸的 取代；谷胺酰胺对天冬酰胺的取代和天冬氨酸对谷胺酰胺的取代；和精氨酸对谷胺酰胺的取代和谷胺酰胺对精氨酸的取代。 胰岛素变体的其他实例是半胱氨酸残基被取代以通过双硫连接而使二聚化作用 最小化的变体。优选地，半胱氨酸残基是被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或谷氨酸残基取 代。此外，胰岛素或其片段或衍生物的氨基酸侧链可以被化学修饰。另一种修饰是胰岛素 的环化。 在一些实施方式中，所述培养基含有约O. 00005重量/体积％至0. 1重量/体积％ 的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。在其他实施方式中，所述培养基含有约0. 0001重量/ 体积％至0. 001重量/体积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。在另外的实施方式中培 养基含有约0. 0006重量/体积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物。 所述培养基还可含有糖皮质激素(如合成的糖皮质激素)、或糖皮质激素类分 子。糖皮质激素是一类类固醇激素，其特征在于具有与皮质醇受体结合的能力和与触发器 (trigger)类似的作用，例如影响代谢或抗炎症或免疫抑制的效果。糖皮质激素可以是天然 存在的(激素)或合成的(药物)。 适宜用于选择性扩大培养肌腱细胞的培养基的合成糖皮质激素实例包括氢化可 的松(hydrocortisone)、醋酸可的松(cortisone acetate)、泼尼松(predisone)、泼尼松 龙(prednisolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米 松(betamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氢可 的松(fludrocortisones acetate)、醋酸脱氧皮质固酮(D0CA)、以及醛固酮。
"糖皮质激素类"分子可以是具有糖皮质激素活性的任何分子，即培养肌腱细胞 的能力。用于本发明的糖皮质激素类分子实例包括抗肝癌物，鱼藤酮(Youssef et al.， 2003， J. Carcinogenesis 2:2)、利福平(Calleja et al. ， 1998， Nat. Med. ，4 :92-96)、甘 草皂苷( 一种甘草成分)(Kuroyanagi & Sato， 1966， Allergy, 15 :67-75)、以及睡茄交 酉旨(来自herb Withanthia somnifera)(Grandhi etal. ，1994， J. Ethnopharmacol. ，44 : 131-135)。 在一些实施方式中，糖皮质激素是13 -倍他米松。|3 -倍他米松是具有式C22H29F05 的合成糖皮质激素。 所述培养基可含有约0. 00001重量/体积％至0. 1重量/体积％的糖皮质激素或 糖皮质激素类分子。在一些实施方式中，所述培养基含有约0. 0001重量/体积％至0. 001 重量/体积％的糖皮质激素或糖皮质激素类分子。在另外的实施方式中，所述培养基含有 约0. 0002重量/体积％的糖皮质激素或糖皮质激素类分子。 在一些实施方式中，将分离肌腱细胞在约37t:约5% C02气氛中培养约3天至约5 周。当然，细胞培养的时间是可以改变的。 制得的"扩大培养的肌腱细胞"培养物可以作为表示基本纯的肌腱细胞培养物的 术语。本文所用的术语"基本纯的"是指培养物中主要的细胞是肌腱细胞且其他杂质细胞 (如成纤维细胞，软骨细胞等等)是少量的。在一些实施方式中，扩大培养的肌腱细胞中至 少80%的细胞是肌腱细胞和不大于20%的细胞是非肌腱细胞。在其他实施方式中，至少 90%的细胞是肌腱细胞。在另外的实施方式中，扩大培养的肌腱细胞培养物中存在的至少 95%的细胞是肌腱细胞。 在一些实施方式中，扩大培养的肌腱细胞培养物含有细胞，其中至少80%的所述细胞表达编码以下因子的一种或多种基因1型胶原、III型胶原、EphA4、巩膜、Sixl、 C0MP 和/或Cbf al 。 选择性扩大培养的肌腱细胞可接种在生物支架上。术语"生物支架"是指用或不 用粘合剂的适宜于肌腱细胞或细胞粘附的任何骨架或支架。通过例举的方式但不限制，所 述生物支架可以是以下形式膜、微球、毛状物(fleece)、线状物(thread)、或凝胶，和/或 它们的混合物。所述生物支架可以是由具有植入所要求的物理或机械属性的任何材料所制 备的，例如充当止血屏障。止血屏障抑制附属细胞和组织向治疗缺陷区的渗透。
在一些实施方式中，所述生物支架是由半渗透性材料制成的，所述半渗透性材料 包括交联或不交联的胶原，优选I型与III型或II型的组合。所述生物支架也可包括从天 然来源或通过合成获取的多肽或蛋白，例如透明质酸、小肠黏膜下层(SIS)、腹膜、心囊、聚 乳酸和相关的酸、血(即它是一种循环组织包括流体部分(血浆)和悬浮的有形成分(红 血球，白血球，血小板))、或生物可吸收的其它材料。生物可吸收的聚合物，如弹性蛋白、纤 维蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白也可用于本发明。US Publication No. 20020173806中描述 的制成骨架或支架的材料也可用于本发明，其全文引入作为参照。 最初，所述生物支架优选(即与待移植细胞接触之前)不含完整的细胞，并且是哺 乳动物患者可吸收的。所述生物支架可具有一个或多个表面，例如多孔表面、致密表面、或 两者的组合。所述生物支架也可包括半渗透性的、不渗透性的、或渗全透性的表面。
具有多孔表面的支撑骨架如US Pat. No. 6， 569， 172中所描述，其被全文引入作为 参照。 所述生物支架可以是自体同源的或异源的。在一些实施方式中，适宜的自体同 源支撑骨架是从血液中形成的，如Berretta， et al.于2002年4月9日提出的US Pat. No. 6， 368， 298所例举的，其被全文引入作为参照。 适宜的生物支架可以是固体的、半固体的、凝胶的、或凝胶的支架，其特征在于可 以长时间保持稳定形式，以在移植之前和移植之后使其中的细胞粘附和/或生长，并提供 类似于细胞天然环境的体系以优化细胞生长。适宜支撑骨架的实例如US Publication No. 20020173806所描述，其被全文引入作为参照。 适宜于肌腱细胞生长的生物支架的其他实例包括Nitrogen ,这是一种 含胶原溶液，该溶液可凝胶形成用于组装细胞的骨架；以及Hwang的结缔组织支架 (US patent application no.20040267362) ， Kladaki et al(US patentapplication no.20050177249)， Giannetti(US patent application no.20040037812)和Binette et al(US patent即plication no. 20040078077);所有都被引入作为参照。
所述生物支架可被切制或形成为任何规则的或不规则的形状。在一些实施方式 中，所述生物支架可切成符合撕裂的形状。所述生物支架的形状可以是平的、圆的和/或圆 柱。所述生物支架的形状也可以被铸成配合特定撕裂的形状。如果所述生物支架是纤维材 料或具有纤维的特性，则支撑骨架可被织成所需的形状。可选地，所述生物支架可以是凝 胶、凝胶类、或非纺织材料。 在一些实施方式中，所述生物支架由猪源I/III型胶原构成，例如ACIMatrixTM。在
其他实施方式中，所述生物支架是由小肠粘膜下层构成，例如Restore1, 术语"接种"是指在移植之前引入肌腱细胞并 生物支架接触足够时间以使它们粘附到生物支架上(用或不用粘合剂)。在一些实施方式中，将细胞与生物支架培养过夜或 超过一周。在一些实施方式中，使用之前可将选择性扩大培养的肌腱细胞在体外与生物支 架共培养约5天。 在一些实施方式中，优选不均匀地接种。相信接种的肌腱细胞的数量不对最终产 生的组织产生限制；然而优化的接种可增加产生率。优化的接种量取决于特定的培养条件。 在一些实施方式中，生物支架被接种约0. 05倍至约5倍的天然组织类型(即肌腱)的生理 细胞密度。在其他实施方式中，细胞密度可小于每平方厘米约1 X 106个至1 X 107个细胞或 更多，通常每平方厘米约4X 106个细胞。在一些实施方式中，生物支架被接入每平方厘米 约3. 5X 106个选择性扩大培养的肌腱细胞。 令人欣喜的是，接种有选择性扩大培养的肌腱细胞的生物支架可被包装并作为装 置出售。因此，在一些实施方式中，本发明提供了一种接种有肌腱细胞的生物支架。这样的 装置包装可包括由无菌粘合膜层密封的塑料板，如US Pat. No. 5， 842， 573所例举的，其被引 入作为参考。 在一些实施方式中，在最邻近肩袖撕裂的位点植入该装置。 本文所用的术语"植入"或"埋植"或其语法同等成分涵盖了将含肌腱细胞的生物 支架导入到患者肩袖撕裂中的任何操作。 术语"邻近的"是指肩袖之内的位点以便在该位点的治疗可使肩袖撕裂症状恢复。
在一些实施方式中，接种有肌腱细胞的生物支架被植入到面向撕裂的撕裂单元 (tear cells)中。在一些实施方式中，盖片(covering patch)可用于覆盖缺陷，以进一步 防止不期望的物质从周围环境中渗入，例如成纤维细胞或巨噬细胞。在一些实施方式中，所 述盖片可以是本文所述的任意支撑骨架，和/或所述盖片可包括胶原(I/III型)、透明质 酸、纤维蛋白和聚乳酸。优选地，所述盖片不含细胞且是可吸收的，并可以是半渗透性的。
接种有肌腱细胞的生物支架可通过本领域技术人员已知的任何常规手段被固定 在适当位置，例如缝合、缝合锚、骨固定装置和骨螺丝。在一些实施方式中，接种有肌腱细胞 的生物支架被缝合到位置中。 本发明也提供了含有细胞的生物支架，其中大于80%的所述细胞是肌腱细胞。在 一些实施方式中，所述生物支架中至少90%的细胞是肌腱细胞。在另外的实施方式中，所述 生物支架中至少95%的细胞是肌腱细胞。 可选地，所述生物支架可含有细胞，其中至少80%的所述细胞表达编码以下因子
的一种或多种基因1型胶原、III型胶原、EphA4、巩膜、Sixl、 C0MP和/或Cbfal。 现在将通过仅参照以下非限制实施例的方式进一步描述本发明。但应该理解的是
以下实施例仅是示例性的，不应以任何方式当作对上述本发明普遍性的限制。尤其是，将本
发明与大面积肩袖撕裂进行关联描述时，应清楚地明确本文的发现本身不限于大面积肩袖
撕裂，还包括之前描述的更小的肩袖肌腱损伤。 实施例1动物和生物支架 本研究中采用五十只12-20周龄的，体重在3-5kg之间的白化种新西兰白兔 (Oryctolagus cuniculus)。所有兔子都由在西澳大利亚大学(Nedlands，澳大利亚)动物 房所饲养的外养兔群中繁殖而来。随意地给兔子喂食兔/豚鼠饲料、干草，并随意提供水。 兔子被置于宽1.5m、长0.75m和高0.75m且带栅格底板的笼子中以防止足部皮炎。所有操作程序和笼内活动都按照由国家健康和医学研究委员会(NHMRC，堪培拉，澳大利亚)编撰 的详细指南进行操作。 猪源类型的I/III型胶原生物支架(ACI Maix )是由Matricel (Herzogenrath， 德国)供应和制造。胶原生物支架是具有两个不同面的白色复合物粗糙面和光滑面。粗 糙面看似是孔径接近200ym的交联纤维而光滑面表现为紧密排列的纤维(Willers et al. 2005)。在断点的机械特性是约14. 6+2. 4N/mm2(Chen J. M.未公开数据来自之前研究)。 小肠粘膜下层(Restore )的生物支架是由D印uy (USA)制造。小肠粘膜下层(SIS)生物支 架为lmm厚，是具有半透明外观的高度紧密材料，其是由IO层单独的小肠粘膜下层通过真 空干燥层压在一起而构成的。生物支架的两面都非常光滑(Zheng et al. 2005) 。 SIS生物 支架的高度紧密结构使其具有很强的抗拉强度，断点接近75.6+6.3N/mm2(Chen J. M.未公
开数据来自之前研究)。
实施例2实验设计 五十只兔子被随机分配成5个组，每组10只(图1)。左肩袖被完全切开并通过 以下五种方法之一进行重构(l)组A(对照处理)将在形成创伤期间切离的肌腱在原处 立即再植入创口内并使用5-0可吸收缝线缝合到骨槽；(2)组B(ACI-MaixTM):通过将作为 内置移植物的ACI-MaixTM胶原生物支架缝合到天然肌腱和骨槽边缘以修复创口 ；(3)组 C(ACI-MaixTM和自体同源肌腱细胞)按照与组B相同的方式采用细胞生物支架组合物修复 撕裂创口 ；(4)组D(RestoreTM):按照与组B相同的方式修复撕裂创口 ，但采用Restore 作 为内置移植物；和(5)组E(Restore 和自体同源肌腱细胞)按照与组C相同的方式采用 接种肌腱细胞的Restore 组合物修复撕裂创口。在每组中，对10只兔中的五只在4周实 施安乐死，其他的在8周实施安乐死。 所有统计数据以平均值±标准差来表示，并采用统计软件SPSS (SPSS inc. USA) 通过ANONA进行比较。P值小于O. 05即认为显著。
实施例3肌腱细胞的收集和培养 如图2所示3mm直径的肌腱组织是通过活检穿孔器从兔髌腱上获取的，并在添加 了 10%胎牛血清(FBS)、100ii g/ml青霉素和lOOii g/ml链霉素(下文中的培养基表示相同 成分)的DMEM F-12培养基(GIBCO，Invitrogen，USA)清洗。然后将肌腱组织切分成0. 5mm 的直径，并以胶原酶(誦I/ml Gibco， Invitrogen， USA)在37"消化过夜。消化之后，通 过0. 22 ii m过滤器过滤溶液以去除骨架碎片，并将组织中释放出的细胞2000rpm离心8分 钟成细胞层。排出含酶的上清液，将细胞层重悬在新培养基中。将该清洗步骤重复三次。
然后将制得的肌腱细胞层重悬在5ml培养基中并置于含密度在l(f-l(^个细胞/ml 之间培养基的培养瓶中。该培养基含有达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM) (Invitrogen)、 15体积/体积％胎牛血清、0. 0006重量/体积％胰岛素、0. 0002重量/体积％的倍他米松、 0. 5重量/体积％的青霉素、0. 5重量/体积％的链霉素、以及0. 6% L-脯氨酸，且pH 7. 0。 然后将细胞在5% C02下37t:进行温育。应该在3-5周内每三天更换培养基直到细胞在第五 代达到最大细胞数，通常是20 X 107个细胞。对于移植，将第二代肌腱细胞按接近3. 5 X 106/ cm2的密度装负在ACI MaixTM(粗糙面)或Restore 生物支架，并培养5天以在植入前得到 接种有细胞的生物支架。 实施例4体内和体外肌腱细胞mRNA表达的比较
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为证实肌腱细胞是否在培养期间保持其表型，检查了 I/III型胶原和EphA4mRNA 的表达。使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN澳大利亚)，从肌腱组织和体外培养的肌腱细胞 中提取总RNA样品。使用RETROscriptTM第一链合成试剂盒(Ambion USA)将RNA逆转录成 cDNA。进行半定量RT-PCR以产生和扩增I/III型胶原和EphA4 cDNA。通过1. 2%琼脂糖 凝胶电泳分析最终PCR产物，并通过UV透射仪(IBI)和偏振膜进行显示。将实验重复四次 以确保结果的统一性。按照图15所列条件进行PCR扩增。
实施例5肌腱细胞体外培养物中的I型胶原蛋白的免疫染色
为证实肌腱细胞在培养中保持了产生I型胶原的能力，按以下顺序进行了免疫染 色将第二代肌腱细胞培养物置于6孔板中；按50%配合度以4%低聚甲醛在室温下固定 10分钟；以3% H202封闭内源过氧化物酶5分钟；更换3次Tris缓冲盐水(TBS)进行清洗； 以O. 1^TritonX100对细胞进行可渗透化处理5分钟；以O. 2%牛血清白蛋白(BSA Sigma， USA)/磷酸缓冲盐水(PBS)清洗两次；以稀释在O. 2% BSA/PBS中的胶原I (1 : 3000abcam， cat :106017， UK)第一抗体在室温下温育1小时(该步骤中阴性对照以PBS进行处理)；以 0. 2% BSA/PBS清洗4次，PBS洗4次和0. 2% BSA/PBS洗4次；采用LSAB系统(Dako， cat : K0675Denmark)以第二抗体温育；重复清洗步骤；以DAB试剂盒(Dako，cat :K3468Denmark) 使蛋白呈褐色实现显色。 实施例6接种有肌腱细胞的生物支架的形态学特征 为确定生物支架上肌腱细胞的行为特征，通过扫描电镜术(SEM)在第1、3、和5天 研究了接种有肌腱细胞的生物支架的形态学。以2.5%戊二醛(TAAB，Reading,UK)将样品 在室温下固定7天，然后以单宁酸(tannic acid)进行处理。用0. 2M 二甲基砷酸盐缓冲 液洗涤样品；在1%四氧化锇的二甲基砷酸盐缓冲液在室温下固定60分钟；更换3次二甲 基砷酸盐缓冲液进行清洗；在室温下1%单宁酸的0. 05M 二甲基砷酸盐缓冲液中放置60分 钟；以盐水溶液清洗；在双蒸馏水中以0. 5%乙酸双氧铀染色60分钟；以盐水溶液进行洗 涤；在室温下依次在25%、50%、70%、95%和纯乙醇中放置30分钟；然后在室温下以超干 乙醇清洗两次，每次30分钟。临界点干燥后，包埋样品并使用Phillips XL30扫描电镜进 行观察。 实施例7操作技术 通过肌肉注射氯胺酮(Parke-Davis，奥克兰，新西兰)和塞拉嗪(特洛伊实验室澳 大利亚)麻醉五十只兔子。在左肩上造成纵切口 (右肩不作操作)并通过从肩峰释放一部 分斜方肌和三角肌，实现肩袖肌腱的手术显露。将整个肩袖肌腱从肌腱骨骼插入处到肌肉 肌腱结合处，完全切离以形成面积约为7X8mm2的长方形创口 (图2)。使用牙钻，在肱骨大 结节垂直于肌腱纤维方向上制造一个长10mm、宽2mm、深2mm的骨槽。从肱部侧面到骨槽中 制造两个直径0.5mm的小钻洞。然后采用对应各组的方法修复创口。根据肌腱重建，伤口 被包在层板中并包扎，但上肢并未被夹住。
实施例8样品收集和几何评价 在4和8周，通过静脉注射戊巴比妥，麻醉并处死兔子。从双肩(操作的和未操作 的)上收集肱头、肩袖肌腱和部分肌肉。在松弛状态下，以游标卡尺测量操作的和未操作 的肌腱的长度和宽度，并以测微尺测量厚度。然后以4%低聚甲醛固定样品。固定之后，以 10%甲酸对样本进行脱钙，脱水，石蜡包埋，并切成5 ii m片段，并以苏木精和曙红和阿辛蓝进行染色。 实施例9组织学检查 通过发炎率评估对埋植物的炎症反应，所述发炎率是指由炎症细胞占有的修复肌 腱的面积百分比。使用绘图软件Image Pro Plus 4. 5 (Mediacybernetics，USA)测量整个肌 腱面积和由炎症细胞占有的面积。以苏木精和曙红和阿辛蓝染色进行普通的组织学检查。 半定量地评估了八个参数(Movinet al. 1997 ;Shalabi et al. 2002) : (1)显微结构;(2)纤
维排列；(3)核的圆度；(4)炎症；(5)增加的血管分布；(6)骨骼肌腱结合；(7)生物相容性
(植入材料的吸收率)；和(8)糖胺聚糖的含量(在阿辛蓝片段中蓝色的强度)。对这些变 量的每个进行0-3分的打分，O是正常而3是最大异常。因此，最正常的肌腱会得0分，最异 常得肌腱会得24分。 炎症参数由发炎率转化而来，其小于10 %为0分，10-20 %为1分，20-30 %为2分， 而大于30%炎症细胞渗透则为3分。骨骼肌腱结合的释义以骨槽形成为基础。如果骨槽存 在典型的4区构成的肌腱组合处组织学，(骨皮质，矿化纤维软骨，纤维软骨和肌腱)则为 0分。缺少这些区中的一个就在得分中加1，结合处完全解离则为3分。这个评分体系是改 良的Likert， s分级(Movin et al. 1997 ;Shalabi et al. 2002)。
实施例10修复肌腱中的I型胶原的免疫染色 为测定合成I型胶原蛋白的细胞比率，按以下顺序进行免疫染色脱蜡和再水合 之后，将载玻片在O. 1%胰岛素中消化20分钟以寻找抗原；用水清洗；以3%11202将内源 过氧化物酶封闭5分钟；以TBS清洗3次每次5分钟；以20 %胎牛血清(FBS)封闭30分 钟；以I型胶原第一抗体(1 : 3000abcam， cat :106017， UK)在室温下温育3小时(该步 骤中阴性对照以PBS进行处理)；以TBS清洗3次每次5分钟；采用LSAB系统(Dako， cat : K0675Denmark)以第二抗体温育；重复清洗步骤；以DAB试剂盒(Dako，cat :K3468Denmark) 使阳性蛋白呈褐色实现显色；和以苏木精进行对比染色。 随机选择每个载玻片的五个高倍视图(400倍)。对每个视图中的总细胞和I型胶 原阳性细胞数量进行计数。通过以I型胶原阳性蛋白数量除以总细胞数量计算比率。5个 视图的平均值是该载玻片的最终比率。
实施例11实验设计 五十只兔子被随机分配成5个组，每组10只(图l)。左肩袖被完全切开并通过五 种方法之一进行重构。在原处再植入切离肩袖肌腱的作为对照。每组中的5只兔子在操作 后的4-8周被处死。 本研究所采用的兔大面积肩袖撕裂模型的示意图如图2所描绘。体外培养从由 髌腱收集的活组织中酶消化的自体同源肌腱细胞，并将其接种至两种生物支架(细胞密 度3.5X107cm2)。当准备好细胞生物支架时，将肩袖肌腱从肱骨大结节的插入部到肌肉 肌腱结合部，完全切离以形成约7X8mm2的创口。在对照组中，其将被重新植入切离位点。 在其他四组中，切离的肌腱部分被丢弃，并以带或不带自体同源肌腱细胞的ACI-MaixTM和 Restore 生物支架置换。 实施例12肌腱细胞中I/III型和EphA4的蛋白和mRNA表达 使用RT-PCR分析，我们比较了在肌腱组织和培养肌腱细胞中I/III型胶原
和EphA4的基因表达特征。如图3所示，肌腱细胞在体外保持了表达I/ni型胶原和EphA4mRNA的能力。当比较管家基因GAPDH时，表达水平体现为从体外培养的肌腱细胞中提 取的mRNA样品高于从肌腱组织提取的。 为进一步证实肌腱细胞是否在体外产生I型胶原蛋白，在培养肌腱细胞中进行了 I型蛋白的免疫组织化学染色。结果显示了体外培养的肌腱细胞的细胞质中观察到了 I型 胶原蛋白(图4的A)，而在对照孔中没有阳性染色(图4的B)。
实施例13接种有肌腱细胞的生物支架的形态学分析 对ACI-Maix 胶原生物支架的扫描电镜分析表明了疏松多孔的胶原纤维排列，且 孔径大约为200 m(图5的A)。在24小时肌腱细胞已粘附到胶原骨架上并形成了层状 排列。到72小时，肌腱细胞进行了大量复制细胞覆盖了生物支架的大部分表面(图5的 B)。单个细胞形态学的高倍放大(图5的C)证实了从细胞表面伸出了两种类型的突起泡 (blebs)和层形足板(lamellipodia)。 ReSt0reTMSIS生物支架的特征在于平表面拓扑学和 高度紧密的结构(图5的D)。在Restore 生物支架上肌腱细胞的生长模式类似于在培养 瓶中的，显示出平的成纤维细胞样外表。肌腱细胞复制与单层生长模式相关缓慢(图5的 E)。高倍放大揭示了 Restore 接种的肌腱细胞(图5的F)也在细胞表面伸出了突起，该 突起类似于ACI-Maix 生物支架的突起。
实施例14肉眼检查 手术之后，所有兔子存活直至预定的安乐死。没有观察到伤口感染或任何其他并 发症。在手术后的头一周内观察到操作前肢的瘸形步态，然后在第2周恢复正常步态。肉 眼检查显示了在任何样品任何时间点都观察不到撕脱或失败。从五十只正常兔未操作肩部 收集的肩袖肌腱的平均厚度，宽度和长度分别是2. 5+0. 3mm，6. 6+0. 5mm和8. 8+0. 5mm(图 16)。通常地，在4周样品的平均厚度明显(p<0.01)厚于正常肌腱，而8周样品明显(p <0.01)薄于正常肌腱。正常和修复肌腱在宽度上没有区别。4和8周修复肌腱与正常肌 腱相比明显伸长了 (图16)(长4-5.5mm，p <0.01)。
实施例15对照处理组的组织学分析 在手术后4周修复的自体同源肌腱特征在于细胞质的增加、新生血管形成、以及 胶原纤维正常纵向排列的改变(图6的A)。胶原变得比具有一些紊乱区和略圆的肌腱细胞 核的正常肌腱具有更大波浪。骨槽上的肌腱骨骼结合部是被软骨纤维样的大球形软骨细胞 所充满的空间。类似于正常肌腱骨骼结合部，除了致密的细胞群和缺乏矿化的类骨质骨架 (图6的B) 。 8周时，样品显示出具有正常细胞密度和形状的更有组织的结构，并显示出修 复胶原纤维的健康平行排列(图6的C) 。 8周样品的骨槽显示出更为成熟的4区构成，并 与骨髓具有更好的结合(图6的D)。 实施例16不带自体同源性肌腱细胞的生物支架的组织学分析
ACI-Maix 组在手术后4周，所有不带自体同源肌腱细胞的ACI-Maix 移植物表 现出生物支架的大部分不被吸收。在保持生物支架原始结构的区域中，可在保留生物支架 内和周围看到大量的淋巴细胞(图7的A)。移植物被吸收的区域体现了具有粗糙平行胶原 排列，增加的细胞质和新生血管形成特征的一期修复(图7的B)。由修复软骨组织包围的 骨槽，具有从骨槽边缘延伸出的致密纤维组织(图7的C)。在8周，植入位点显示了更多的 平行胶原纤维束；含有低密度成纤维细胞和减少的新生血管形成(图7的D)。也如胶原纤 维结构一样成熟的骨槽构成被改造，并与皮层和松质骨形成了更好的结合度(图7的E)。但是，五个样品中的两个仍包含未被吸收的生物支架片段且有明显的淋巴细胞渗透。此外， 在5个8周样品中都发现了在再生肌腱的中间质中诱生了脂肪组织(图7的F)。
Restore 组在所有5个4周样品中，不带自体同源肌腱细胞的Restore 移植物 仅部分被吸收。Restore 的原始结构呈现为沿着肌腱结构的紊乱的生物支架。在移植物 边缘观察到许多炎症细胞，主要是淋巴细胞(图8的A)。少数巨噬细胞、血桨、嗜酸性粒细 胞和多形细胞偶尔点染在生物支架纤维内部。在RestoreTM被吸收的区域，大量成纤维细胞 和淋巴细胞存在于富含新生血管结缔组织骨架类似肉芽组织内(图8的B)。骨槽被与软骨 细胞混合的纤维组织占据在所有样品中实质没有矿化区。 在8周，5个RestoreTM生物支架中的4个已被完全吸收。未被完全吸收的那个类 似于4周样品存在明显的淋巴细胞渗透(图8的C)。在吸收区域，胶原纤维按更少波状模 式排列，且血管生成的强度更小。肌腱骨骼结合部显示了成熟的4区结构包括骨皮质，矿化 纤维软骨；纤维软骨和肌腱(图8的D)。在胶原纤维的空隙之间点染了一些肉芽组织，类 似慢性肉芽反应。预料不到的是，在两个样品的中间质中发现了一些异位骨的形成。
实施例17带自体同源肌腱细胞的生物支架的组织学分析 ACI-MaixTM组在手术后的4周，与自体同源肌腱细胞一起植入的ACI-Maix 生物 支架的新生肌腱和骨槽都类似于4周不带肌腱细胞植入的生物支架。 一部分生物支架仍保 持且在生物支架内和周围再次观察到淋巴细胞(图9的A)。在未被吸收生物支架的表面也 观察到植入的自体同源肌腱细胞(图9的B)。在生物支架吸收的区域，可观察到类似于其 他实验组的粗糙纤维排列和血管床(vascular beds)。 有趣的是，在植入后的8周，类似于对照处理的肌腱组织学证实了良好修复结果 (p > 0. 05)(图9的C)。在8周所有植入生物支架都被完全吸收并被肌腱组织取代。胶原 束纵向排列骨槽组织学外观无异于对照组织学(图9的D)。略微增加成纤维细胞数量以典 型的平、薄和波状模式，均匀地分布在各束之间。五个样品中仅有一个在新生肌腱中间含有 脂肪组织。 Restore 组带自体同源肌腱细胞植入的Restore 在4周表现出与其他组类似 的修复模式。在8周可观察到与对照肌腱修复具有类似的组织学形态的良好的修复效果， 这证明形成了纵向排列的胶原束(图10的A)和成熟的骨槽(图10的B)，在各胶原束之 间以纺锤形模式均匀地分布有成纤维细胞。在所有五个样品中没有发现未被吸收的生物支 架，且大部分骨槽结构显示出典型的四区结构。但是，仍在所有5个样品观察到肉芽组织 (图10的C)且在2个样品中发现异位骨(图10的D)。
实施例18修复肌腱组织学的半定量分析 对生物支架的发炎率分析显示了在生物支架细胞构造组中炎症反应强度小于仅 有生物支架的炎症反应强度(图ll)。在4周，ACI-MaixTM的平均发炎率是56X (炎症细胞 占有的修复肌腱面积百分比)，而ACI-MaixTM+细胞组明显地(p < 0. 01)减少至26%。在 采用Restore 生物支架的组中观察到类似现象，自体同源肌腱细胞植入的发炎率从46% 减少至27% (p<0.05)。但是，与对照相比时，无论带有或不带细胞，四个实验组的发炎率 明显提高(p<0.05)。在8周，生物支架被吸收，所有组的炎症反应与4周相比明显降低 (p < 0. 05)。在自体同源肌腱细胞被植入的组中，发炎率与对照组非常类似(p > 0. 05)，而 在仅有生物支架的组观察到的发炎率仍明显高于对照(P < 0. 05)。
普通的组织学检测显示了在4周时所有实验组与阳性对照相比(p < 0. 01)都具 有较差的组织学得分(图12)。在8周，单独植入的ACI-MaixTM生物支架表现出比对照明 显更差的组织学得分(P <0. 05)，而与自体同源肌腱细胞植入的表现出与对照相同的更好 得分(P > 0. 05)。然而，这两组(带有和不带肌腱细胞的ACI-Maix )之间的区别不明显 (p > 0. 05)。尽管不带肌腱细胞的ACI-Maix 的组织学得分比植入肌腱细胞的组和对照要 差，但其仍实现了统计学上明显不同于它们任何一个的结果(P > 0. 05)。
免疫染色显示了细胞质和细胞外基质对I型胶原为阳性染色(图13的A)而在阴 性对照中没有阳性染色(图13的B)。在4周，对照组的I型胶原阳性细胞的平均比率是 53. 4% ， ACI-Maix 是38. 4% ，接种有肌腱细胞的ACI-Maix 是58 % ， Restore 是36. 2 % ， 接种有肌腱细胞的Restore 是48. 8%。在8周，所有组中的I型胶原阳性细胞的比率略 微增加，对照组达到63. 2% ， ACI-Maix 达到50. 60% ，接种有肌腱细胞的ACI-Maix 达到 61. 2%， Restore 达到51. 80%，接种有肌腱细胞的Restore 达到65%。在两个时间点， 接种有肌腱细胞的生物支架的阳性比率明显高于不带肌腱细胞的那些(P < 0. 05，图14)， 但与对照类似(P > 0. 05)。
权利要求
一种治疗哺乳动物患者肩袖撕裂的方法，其中，该方法包括以下步骤(i)在含有胰岛素或胰岛素的功能性衍生物以及糖皮质激素或糖皮质激素类分子的培养基中，在体外选择性地扩大培养肌腱细胞，以制备经扩大培养的肌腱细胞培养物；(ii)将所述经扩大培养的肌腱细胞接种至生物支架，以制备接种有肌腱细胞的生物支架；和(iii)将所述接种有肌腱细胞的生物支架植入到邻近肩袖撕裂的位置。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述肩袖撕裂是大面积肩袖撕裂。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述肌腱细胞是在选择性扩大培养之前从含肌 腱细胞的组织中分离的。
4. 如权利要求3所述的方法，其中，所述含肌腱细胞的组织是肌腱。
5. 如权利要求1-4中的任意一项所述的方法，其中，所述肌腱细胞来自哺乳动物，该哺 乳动物选自由羊、牛、猪和人所组成的组中。
6. 如权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
7. 如权利要求1-6中的任意一项所述的方法，其中，所述肌腱细胞是自体同源的。
8. 如权利要求1-7中的任意一项所述的方法，其中，所述肌腱细胞在含有0. 0006重量 /体积％的胰岛素和0. 0002重量/体积％的糖皮质激素的培养基中，在体外被选择性地扩 大培养。
9. 如权利要求1-8中的任意一项所述的方法，其中，所述经扩大培养的肌腱细胞培养 物含有至少80%的肌腱细胞。
10. 如权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其中，所述经扩大培养的肌腱细胞培养 物中至少80%的细胞表达编码以下因子的一种或多种基因1型胶原、III型胶原、EphA4、 巩膜、Sixl、 C0MP和/或Cbfal。
11. 如权利要求i-io中的任意一项所述的方法，其中，将所述接种有肌腱细胞的生物 支架在体外培养足够时间，以在植入之前建立肌腱细胞。
12. 如权利要求l-ll中的任意一项所述的方法，其中，所述哺乳动物患者是人。
13. —种治疗人患者大面积肩袖撕裂的方法，其中，该方法包括以下步骤(i) 从在所述患者体内提取的肌腱组织中分离肌腱细胞；(ii) 在含有约0. 0006重量/体积％的胰岛素或胰岛素的功能性衍生物以及约0. 0002 重量/体积％的糖皮质激素或糖皮质激素类分子的培养基中，在体外选择性地扩大培养所 分离的肌腱细胞，以制备含有至少80%肌腱细胞的经扩大培养的肌腱细胞培养物；(iii) 将所述经扩大培养的肌腱细胞接种至生物支架，并将该生物支架和肌腱细胞培 养不大于5天，以制备接种有肌腱细胞的生物支架；禾口(iv) 将所述接种有肌腱细胞的生物支架植入到肩袖撕裂处，并以缝合线来固定。
14. 如权利要求1-13中的任意一项所述的方法，其中，所述生物支架含有骨架、膜、微 球、毛状物、线状物、或凝胶，和/或它们的组合。
15. 如权利要求1-14中的任意一项所述的方法，其中，所述生物支架含有I/III型胶原 骨架(ACI Matrix )或小肠粘膜下层(Vitrogen )。
16. —种含有细胞的生物支架，其中，所述细胞中大于80%的细胞是肌腱细胞。
17. 如权利要求16所述的生物支架，其中，所述细胞中至少80%的细胞表达编码以下因子的一种或多种基因1型胶原、ni型胶原、EphA4、巩膜、Sixl、C0MP和/或Cbfal。
18.如权利要求1所述的方法，其实质上如本文任一实施例所描述的。
全文摘要
本申请涉及制备用于修复撕裂的生物支架的方法。具体而言，本发明涉及治疗哺乳动物患者肩袖撕裂的方法，其中，该方法包括以下步骤(i)在含有胰岛素或胰岛素的功能性衍生物以及糖皮质激素或糖皮质激素类分子的培养基中，在体外选择性地扩大培养肌腱细胞，以制备经扩大培养的肌腱细胞培养物；(ii)将所述经扩大培养的肌腱细胞接种至生物支架，以制备接种有肌腱细胞的生物支架；和(iii)将所述接种有肌腱细胞的生物支架植入到邻近肩袖撕裂的位置。本发明还涉及含有细胞的生物支架，其中，所述细胞中大于80％的细胞是肌腱细胞。
文档编号A61L27/36GK101795718SQ200880021481
公开日2010年8月4日 申请日期2008年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者郑铭豪 申请人:西澳大利亚大学