初级微rna表达盒的制作方法

专利名称：：初级微rna表达盒的制作方法初级微RNA表达盒
背景技术：
：本发明涉及病毒基因表达的抑制。具体而言，本发明涉及采用RNA序列抑制乙型肝炎病毒复制的方法。在该方法中采用含有来自于内源微RNAs(miRs)序列的表达构建体以产生对HBV序列特异性沉默的序列。RNA干扰(RNAi)是对双链RNA的保守进化生物反应，其已在植物[1]，无脊椎动物[24]和哺乳动物细胞[5]中描述过。RNAi功能为直接抑制与内源或引入的RNAi效应子具有同源序列的基因表达[6]而对无关序列的基因没有影响[7，8]。RNAi被认为是一个古老的响应途径，其在调控蛋白编码基因的表达中发挥作用[8]并介导了对内源寄生和外源病原核酸的抗性。天然存在的能激活RNAi的小RNAs是微RNAs(miRs)复合网络结构的一部分，其是在实现基因表达沉默之前由Drosha和Dicer加工而成。这些miRs通过调控特定细胞mRNAs的翻译而发挥其影响[9]。Dicer对'rogue'双链病毒和细胞RNA的加工也可导致短干扰RNAs的形成[10-12]。这些siNRAs通常是21_23bp并在3'端具有2个核苷酸突出[13]且激活RNAi以实现潜在有害RNA的沉默。首先采用PolII转录调控序列和RNA聚合酶II将miR序列从细胞DNA序列转录成初级miRs(pri-miRs)。Drosha对pri-miRs的加工形成了前体miRs(pre-miRs)，其在成熟miRs(大约22nt长度)诱导基因表达沉默之前被胞内Dicer切开。Drosha和Dicer都是RNAi途径正常功能化所必需的RNaseIII酶[14]。已经报道了RNAi的转录后沉默作用比核酶或反义RNA作用都更有效[15]。为引起基因沉默，将miRs或siRNA的一条链引入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。在其他亚单位[17，18]中RISC包括Ago2(—种RNA内切核酸)和解旋酶[16]。利用miR或siRNA的反义链作为杂交指导序列，RISC识别靶mRNA[lO，19]。通常地，如果指导序列与其同源物完全互补，会发生靶的裂解。如果在RISC内杂交存在错配，则会发生翻译的抑制。在哺乳动物细胞中也表现出由siRNA介导的启动子DNA序列的甲基化的基因沉默会降低基因的转录[20]。时至今日，在哺乳动物细胞中进行RNAi仍是一个难题。长于30个碱基对的双链RNAs可触发非特异性的干扰素响应途径，该途径是由dsRNA依赖的蛋白激酶(PKR)[21]和2'，5'-低聚腺苷酸合成酶(2'5'0AS)[22]的活化所介导的。该响应途径造成翻译的全面抑制并最终导致细胞调亡[23]。为诱导特异性的和明显的基因沉默，精确大小的siRNA或短发夹RNA(shRNA)片段的细胞内递送或产生是很重要的。通过将以短合成退火低聚核苷酸(<30bp)的siRNAs直接导入哺乳动物细胞中，Tuschl和同事能够成功地绕开干扰素途径并在哺乳动物细胞培养物中实现RNAi[15]。许多实现了基因沉默的研究中都采用了预合成的RNAs。通常地，在体外将互补RNA低聚核苷酸退火以产生外源的siRNA用于递送至细胞内。因为合成的低聚核糖核苷酸不会天然地在于细胞内补充，为保持足够的胞内浓度以具有持续活性，需要定期给予这些分子。可对合成的低聚核糖核苷酸进行化学修饰以保持其在生理流体内的寿命。但是，这种修饰可能在体内具有毒副作用[24]。大量的研究结果表明siRNA在体内被表达成独立的正义和反义RNA链[25，26]，shRNAs[27-31]或天然存在miRs的衍生物[32，33]。miR基6因的转录会自然产生pri-miR序列，其在核内被Drosha酶加工形成pre-miR。然后通过输出蛋白5的途径将pre-miR转运到细胞质中，在那其被Dicer加工形成成熟的miR。因为对参与miR表达的启动子所知甚少，大部分研究都采用U6核内小RNA[34]启动子[27]或更紧密的的HI启动子[8]或tRNAVal启动子[35]。这些启动子可被RNA聚合酶III识别，并能在结构上形成RNAi的效应子。PolIII启动子具备包含所有转录起始位点上游控制元件的优势，这能形成可产生确定长度的转录物的表达盒。但是，PolIII启动子转录的结构活化特性可引起正常细胞RNAi途径的饱和和生成毒性[36]。PolIII启动子可诱导组织或细胞类型特异性的RNA表达，但在转录起始位点下游控制元件的要求上不具有优势。从而除了有效治疗RNA之外，来自调控元件的附加序列也包含在转录物中。之前的研究显示了这些附加序列抑制传统shRNA分子的功能[37]。事实上，转录shRNAs，或单独的正义和反义siRNA链的沉默作用是被存在于5'端的在转录启动位点和21个碱基对发夹之间的小至9个额外碱基所破坏导致的[37]。目前无法实现由PolII转录方便地产生功能性RNAi效应子。化学合成RNA，体外转录和采用基于PolIII的表达盒目前都是产生精确长度的短RNA的优选方法。除非另外指明，此处所用术语具有本领域公知的意义。根据它们的用途，以下术语具有如下定义。转录由DNA模板产生RNA的过程。核酸术语"核酸"表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限定，包括以类似于天然存在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似物。除非另外指明，特定核酸序列包括其互补序列。表达盒"重组表达盒"或简称的"表达盒"是与允许细胞中特定核酸转录的核酸元件重组或合成形成的核酸结构。重组表达盒可以是质粒，病毒或核酸片段的一部分。通常地，重组表达盒包括要转录的核酸，可操作的连接启动子。在一些实施方式中，表达盒还可包括复制起点和/或染色体整合元件(例如逆转录病毒LTR)。可操作的连接术语"可操作的连接"表示在核酸表达控制序列(例如启动子，增强子或一组转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。启动子启动子是一组DNA控制序列，其参与了RNA聚合酶的结合以启动核酸转录。如此处所用的，启动子包括接近转录启动位点的必需核酸序列。启动子还任选地包括远侧增强子或阻遏子元件，其可位于离转录启动位点长达几千个碱基对之处。PolII启动子PolII启动子是包括可被RNA聚合酶II识别以便由该酶启动转录的元件。PolII启动子通常包括特征元件，如TATA盒。PolIII启动子PolIII启动子是包括可被RNA聚合酶III识别以便由该酶启动转录的元件。转录终止信号转录终止信号是终止转录的DNA序列。这些元件对于RNA聚合酶II和RNA聚合酶III是不同的。RNA干扰该过程是双链核酸(包括miR、siRNA、shRNA)的表达引起互补RNA的序列特异性降解，序列特异性翻译抑制或转录基因沉默。耙点识别序列如此处所使用的，术语"靶点识别序列"是指来自于基因的序列，在本发明中该序列被设计成可抑制，阻断或防止基因表达，酶活性或与其它细胞或病毒因子的相互作用。指导序列被并入RISC的来自于RNAi效应子，例如miR、siRNA、shRNA的短单链RNA片段，其负责靶RNA在靶点识别序列的序列特异性降解或翻译抑制。RNAi效应子能弓I发RNAi的包含其前体的任何RNA序列(例如，shRNA、miR和siRNA)。RNAi效应子加工单元包括RNA效应子以及加工单元(例如锤头核酶)序列的RNA。RNAi效应子加工盒具有可操作连接启动子的RNAi效应子加工单元。RNAi前体被加工形成指导序列，然后被并入RISC并实现RNAi的任何RNA种类。Dicer—种RNAaseIII酶，其消化双链RNA并负责RNAi前体的成熟。例如，Dicer是负责作用于pre-miRs以形成成熟miR。DroshaDrosha是能形成可识别特异性pri-miR二级结构以切除和释放大约60_80nt的pre-miR序列的核微处理器复合物部分的RNaseIII酶。RNAi编码序列当其表达时可引发RNA干扰的核酸序列。Pri-miRPri-miR通常是来自于PolII转录的初级miR转录物。这些序列可源于独立miR转录单位，转录物包括大于一个的miR前体或内含miR前体。这些序列通常被细胞核内的Drosha力口工以产生pre-miR。Pre-miRPre-miR是由Drosha加工pri-miR的产物。pre-miRs通常是60_80nt的长度。pre-miRs是由输出蛋白_5从细胞核输出的。在细胞质中，pre-miRs由Dicer加工以形成成熟miR。miRmiRs是大约22nt长度的小RNA分子，其来自于pri-miR和之后的pre-miR序列的加工。miR表达盒miR表达盒是指能编码可模仿内源miR的DNA序列。pri-miR转录物是由该盒产生的并由细胞机制加工以产生pre-miR和成熟miR。Pri-miR表达盒编码pri-miR序列的核酸结构。shRNA短发夹RNA(shRNA)是由自身回叠以使来自两个分离片段的核苷酸形成碱基对的短序列单链RNA，得到的结构形如其名。shRNA是Dicer的底物并实现RNAi(发夹的双链结构区可包含碱基错配即非AU或GC对)。siRNA小干扰RNA(siRNA)是由短双链RNA分子组成。siRNA分子通常含有在3'端具有2nt的突出的19bp双螺旋区。一条链被并入细胞质RNA诱导的沉默复合物(RISC)。这指导由RISC实现的序列特异性RNA切除。siRNA指导和其靶点之间的错配可引起翻译抑制以取代RNA切除。siRNA可被合成或来自于Dicer对前体的加工。shRNA前体shRNA前体是由Dicer胞内加工以产生shRNA分子的发夹RNA序列。多聚体盒单体单元的串联排列，其可包括miR的编码序列。电子的(insilico)电子的是指在试管(或相当的容器)中进行反应且不存在活体细胞的实验室条件。单体单元编码一个RNAi效应子序列的成分的核酸序列。子序列在本文中特定核酸序列的术语"子序列"表示等于或小于所述特定核酸，或其部分的核酸区。体外转录采用含有RNA聚合酶和RNA前体的实验室培养基将DNA分子转录成RNA分子。胞内转录在活体细胞内DNA分子转录成RNA分子。体内转录在活生物体内DNA分子转录成RNA分子。杂交所要求保护的核酸可在足够严谨度条件下特异性地与此处公开的核酸杂交。特异性或选择性杂交是核酸与靶核酸的结合具有最小背景的杂交，并且对非靶核酸进行非特异性杂交。实现选择性杂交的杂交严谨度通常是比Tm(—半分子与其配对链解链的熔解温度)低大约5t:-2(rc，但其由溶液的盐浓度和介电常数进一步确定。杂交温度通常高于DNA-RNA和RNA-RNA杂交。如本领域所知的，清洗温度可类同用于实现选择性严谨度的(Sambrooketal.，1987)。发明才既述本发明描述了可通用方法，该方法将天然存在miRs的特征并入表达盒内，以允许由PolII或PolIII启动子形成RNAi效应子。根据本发明的一方面，提供的pri-miR表达盒包括含有预定长度的调控包含在pri-miR序列内的靶基因表达的RNAi效应子序列的pri—miR序歹廿。pri-miR表达盒可在细胞内由PolII或PolIII启动子表达。换而言之，广泛地提供了pri-miR表达盒，其包括选择以产生RNAi效应子序列的单体单元，禾口可以由PolII或PolIII启动子表达的所述的表达盒。RNAi效应子序列可以是miR编码序列或shRNA编码序列。pri-miR表达盒可以是多聚体RNA表达盒。可采用可操作连接的PolII或PolIII启动子表达RNA表达盒。单体单元可包括miR-30、miR-31-或miR-122衍生序列。在一个优选实施方式中，RNA表达盒可包括编码RNAi效应子以选择耙点的所述的miR-30、miR-31-或miR-122衍生序列。RNA表达盒可包括任意数量的单体单元。RNA表达盒可包括除了第一pri-miR衍生序列外，至少一个另外的pri-miR衍生序列；禾口在不同于pri-miR序列的情况下，至少一个另外的编码RNAi效应子的序列。pri-miR表达盒可包括离散的编码引发序列特异性翻译抑制的RNAi效应子分子的序列组。pri-miR表达盒可包括离散的编码引发序列特异性转录沉默的RNAi效应子分子的序列组。实现序列特异性翻译抑制的siRNA序列或RNAi前体分子可包括来自于乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx)或丙型肝炎病毒(HCV)的靶点识别序列。所述靶点识别序列可来自于HBVHBx基因的至少两个特异性位点。根据本发明的另一方面，提供了分离的编码本发明pri-miR表达盒的核酸序列。所述核酸序列可包括选自由SEQIDNos:3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、38、39和106，其互补序列(SEQIDNO:109-131和169-171)或其RNA序列(SEQIDNO:135-163、167、168和172)组成的组中的至少一个序列。所述核酸序列可包括SEQIDNO:3或135;与SEQIDNO:3或135互补的核酸序列；与SEQIDNO:3或135特异性杂交的核酸序列；嗜肝DNA病毒的同源序列；或与所述序列之一具有至少90%序列同一性的核酸序列。所述核酸序列可包括SEQIDNO:4或136;与SEQIDNO:4或136互补的核酸序列；与SEQIDNO:4或136特异性杂交的核酸序列；嗜肝DNA病毒的同源序列；或与所述序列之一具有至少90%序列同一性的核酸序列。优选地，所述核酸序列与所述序列具有至少95%的序列同一性。根据本发明的另一方面，提供了编码靶序列的核酸序列，其中所述核酸序列是5'_CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTG-3'(SEQIDNO:38);互补的核酸序列；与所述序列特异性杂交的核酸序列；或与所述序列之一具有至少90%的序列同一性的核酸序列。核酸序列与所述序列具有至少95%的序列同一性。根据本发明的另一方面，提供了编码靶序列的核酸序列，其中所述核酸序列是5'_TGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGT-3'(SEQIDNO:39);互补的核酸序列；与所述序列特异性杂交的核酸序列；或与所述序列之一具有至少90%的序列同一性的核酸序列。所述核酸序列与所述序列具有至少95%的序列同一性。根据本发明的另一方面，提供了抑制至少一个具有至少一个靶点识别序列的靶RNA转录物表达的方法，该方法包括如下步骤提供编码具有本发明pri-miR表达盒的表达结构的核酸序列，其中miRs特异性识别位点的RNAi效应子结构域在耙点内；表达编码pri-miR表达盒的核酸序列以产生成熟miR;使加工的RNAi效应子分子接触至少一个靶RNA转录物，以RNAi效应子分子指导靶RNA转录物表达的抑制。表达所述核酸序列的步骤，使切除RNAi效应子分子或其前体以接触至少一个靶RNA转录物并抑制耙RNA转录物表达的步骤可基本同时发生。根据本发明的一个实施方式，提供了并入编码本发明pri-miR表达盒的核酸序列的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的任何适宜载体，例如病毒或非病毒载体。根据本发明的另一实施方式，提供了包括本发明载体和生理可接受介质的组合物。根据本发明的另一实施方式，提供了包括编码本发明RNAi效应子序列或其前体的RNA序列的细胞。本发明还扩展至包括编码可衍生出本发明RNAi效应子分子的RNA序列的DNA的细胞。根据本发明的另一方面，提供了包括上述载体的细胞。根据本发明的另一方面，提供了调控DNA表达的方法，该方法包括如下步骤将并入编码本发明pri-miR表达盒的核酸序列的载体导入细胞，其中RNAi效应子序列，或其子序列识别含有至少一个靶点识别序列或其子序列的至少一个靶RNA转录物；和使载体表达编码pri-miR表达盒的核酸序列，并在表达时将RNA表达盒或其子序列被切割成其RNAi效应子，因此加工的RNAi效应子识别靶RNA转录物，从而抑制靶序列或其子序列的表达。根据本发明的另一方面，提供了体内抑制DNA表达的方法，该方法包括如下步骤将载体导入生物体内，其中所述载体中并入了编码本发明pri-miR表达盒的核酸序列，其中RNAi效应子序列，或其子序列识别含有包含RNA干扰识别位点的至少一个靶点识别序列或其子序列的至少一个靶RNA转录物；禾口使载体表达编码pri-miR表达盒或其子序列的核酸序列，并在表达时将RNA表达盒或其子序列切割成其RNAi效应子前体序列，因此RNAi效应子识别靶RNA转录物，从而抑制靶序列或其子序列的表达。根据本发明的另一方面，提供了体内抑制DNA表达的方法，该方法包括如下步骤将载体导入生物体内，其中所述载体中并入了编码本发明pri-miR表达盒的核酸序列，其中RNAi效应子序列，或其子序列识别含有包含抑制识别位点的至少一个靶点识别序列或其子序列的至少一个靶DNA序列；禾口使载体表达编码pri-miR表达盒或其子序列的核酸序列，并在表达时将RNA表达盒或其子序列切割成RNAi效应子前体序列，因此RNAi效应子抑制靶序列的转录。根据本发明的另一方面，提供了体外抑制DNA表达的方法，该方法包括如下步骤将载体导入细胞内，其中所述载体中并入了编码本发明pri-miR表达盒或其子序列的核酸序列，其中RNAi效应子序列，或其子序列识别含有包含RNA干扰识别位点的至少一个耙点识别序列或其子序列的至少一个耙RNA转录物；禾口使载体表达编码pri-miR表达盒或其子序列的核酸序列，并在表达时将RNA表达盒或其子序列切割成RNAi效应子前体序列，因此RNAi效应子识别靶RNA转录物，从而抑制靶序列的表达。多聚体pri-miR表达盒可包括任意数量的单体单元。靶点识别序列可来自于乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的HBx开放式读码框。具体而言，RNAi效应子序列的靶点识别序列可来自于位于HBV的HBx开放式读码框之内的至少两个区域。根据本发明的另一方面，提供了此处所述的pri-miR表达盒在制备治疗乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，或由此而引起的疾病的制剂中的应用。根据本发明的另一方面，提供了用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，或由此引起的疾病的方法中的组合物，所述组合物包括此处所述的pri-miR表达盒，所述方法包括给予有效治疗剂量的所述组合物。根据本发明的另一方面，提供了治疗乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，或由此引起的疾病的方法，所述方法包括将有效治疗剂量的本发明pri-miR表达盒给予受试者。现在将参照所附图片通过非限制实施例的方式描述本发明。在附图中图1A显示了具有由典型抗HBVmiRs耙向位点的乙型肝炎病毒(HBV)基因组的结构。基因组的核苷酸协调与单个EcoRI限制酶切位点有关。部分双链HBVDNA包含具有粘性互补5'端的+和-链。调整HBV转录的顺式元件由圆形和矩形符号指示。紧靠的围绕箭头表示包括整个基因组的病毒开放式读码框(具有起始密码子)。四个外周箭头指示了HBV转录物，其具有包含HBx的普通3'端。图IB显示了抗HBVmiRDNA表达盒的示意图(未按比例)。指示了PolII(CMV)或PolIII(U6)启动子、miR-31/5-或miR-122/5-编码序列以及转录终止序列的排列。并图示了初级miR(pri-miR)、前体miR(pre-miR)和miR转录物的产生和加工。图2显示了pri-miR-31和pri-miR-122以及典型的抗HBV衍生物pri-miR-31/5和pri-miR-122/5的结构和序列的示意图。Drosha加工后产生的推定pre-miRs的序列以彩色(紫色和红色)指示，而Dcier加工和由RISC链选择之后产生的成熟加工指导序列仅用红色表示。pri-miR-31/5的抗HBV指导靶向HBV等同物(coordinate)1575-1595，而pri-miR-122/5耙向HBV等同物(coordinate)1575-1597。图3显示了从用编码所示miR或shRNA盒的质粒转染之后的HEK293细胞中提取的表达miR穿梭序列的Northern印迹杂交分析。杂交是放射性标记探针与推定成熟抗HBV指导5链的互补。典型的杂交信号检测成熟miRs的前体。将印迹剥离并和与内源U6snRNA互补的探针再杂交以证实细胞RNA的等量负载(a、b、c的下面的组)。图4显示了采用NORTHERN印迹分析检测由表达抗HBVmiRs产生的加工siRNA序列。杂交是放射性标记探针与成熟miR-31/5序列的互补(上面的组)。从被含有所示的CMV(PolII)或U6(PolIII)pri-miR表达盒的质粒载体所转染的被转染HEK293细胞中提取RNA。将印迹剥离并和与内源U6snRNA互补的探针再杂交以证实细胞RNA的等量负载(下面的组)。图5显示了采用NORTHERN印迹分析检测由表达抗HBVmiRs产生的加工siRNA序列。杂交是放射性标记探针与成熟miR-122/5序列的互补(上面的组)。从被含有所示的CMV(PolII)或U6(Polin)表达盒的质粒载体所转染的被转染HEK293细胞中提取RNA。将印迹剥离并和与内源U6snRNA互补的探针再杂交以证实细胞RNA的等量负载(下面的组)。图6显示了从转染Huh7肝细胞的HBsAg分泌物。图6A图示了具有开放式读码框和位于pCH-9/3091耙载体内位点的HBV基因组结构，所述pCH-9/3091耙载体是与miR-31/5和miR-122/5表达载体的加工产物互补的病毒序列靶点。四个平行箭头指示了HBV转录物，其含有普通的3'端，并包含miR-31/5和miR-122/5靶点。图6B显示了由以所示miR-或shRNA编码质粒和HBV靶质粒共转染的Huh7细胞分泌的HBsAg相关数据。以定量ELISA的HBsAg测量值作为对应于模拟处理细胞的标准平均值。结果来自于4次独立转染而线条指示了平均值的标准差(SEM)。图7A图示了具有HBV序列以及萤火虫荧光素酶开放式读码框的pCH萤火虫Luc耙载体的结构。由miR-31/5和miR-122/5耙向的位点以箭头指示。图7B显示了在以所示miR编码质粒和组成型活性海肾(Renilla)荧光素酶表达质粒共转染的Huh7细胞中萤火虫荧光素酶报告基因活性。以给出的测量值作为萤火虫与Renilla荧光素酶活性的标准化比值(±SEM)，其是由3次独立实验测量而得。图8显示了在HBV复制的动力进样模型中miR序列对HBV复制的标记的影响。在用pCH-9/3091HBV耙点和CMVmiR-31/5、CMVmiR_122/5或U6shRNA5质粒对小鼠动力进样之后3和5天测量血清HBsAg浓度。将对应于模拟处理小鼠的结果标准化并以来自至少5只小鼠的值表示为平均值(士SEM)。图9显示了在HBV复制的动力进样模型中miR序列对HBV复制的的标记影响。在用pCH-9/3091HBV耙点和CMVmiR_31/5、CMVmiR-122/5或U6shRNA5质粒对小鼠动力进样之后3和5天测量病毒颗粒等效物(VPEs)。采用具有Euroh印校对标准的实时PCR测定循环基因组等效物的数量。将对应于模拟处理小鼠的结果标准化并以来自至少5只小鼠的值表示为平均值(士SEM)。图IO显示了由经历HDI程序(下面的组)的每组小鼠中的2只代表动物中提取的HBVDNA复制中间体的Southern印迹杂交分析。小鼠被注射了所示的质粒和pCH9/3091HBV复制子感受态耙。仅在模拟处理动物中可检测到HBV双链(DS)和单链(SS)复制中间体，而在一起注射了CMVmiR-31/5、CMVmiR-122/5或U6shRNA5质粒的任何小鼠中都检测不到。在模拟处理小鼠中检测到的HBVDNA带与任意pCH9/3091带的大小都不相对应。下面的组是表示溴化乙啶染色后且Southern转移和杂交之前分离的DNA。图11显示了在感染HEK293细胞中干扰素响应的分析。用所示的miR编码盒或用聚(I:C)感染细胞。24小时后从细胞中提取RNA，然后进行定量实时PCR以检测OAS1、IFN-P、p56和GAPDHmRNA的浓度。由三次独立实验表示IFN-P、p56或OAS1与GAPDHmRNA标准化比值的平均值(士SEM)。聚(I:C)阳性对照证实了在此处所采用条件下在细胞中诱导了干扰素响应。图12显示了独立RNAi介导的沉默衰减的分析，该分析是通过用肝源Huh7细胞和表达所示shRNA或miR盒的质粒以及pCMVmiR-31/8和psi-CHECK_8T二元荧光素酶载体共转染而实现的。报告质粒包含在Renilla荧光素酶0RF的独立HBVmiR-31/8同源序列(cognatesequence)下游。Renilla:萤火虫荧光素酶活性的测量值用于评估shRNA5、miR-31/5或miR-122/5表达质粒对其自身独立靶点miR-31/8沉默的影响。图13显示了转染pU6HBVshRNA5的量对CMVmiR-31/8沉默衰减的影响。用所示比值的pCMVmiR-31/8与pU6HBVshRNA5载体和psi-CHECK_8T载体共转染。Renilla:萤火虫荧光素酶活性的再次测量值(±SEM)用于评估pU6HBVshRNA5的减少量对其自身独立耙点miR-31/8沉默的影响。图14显示了用减少量的pU6HBVshRNA5转染之后Huh7细胞HBsAg分泌物的抑制效价。用所示比值的pU6HBVshRNA5与HBV复制感受态pCH_9/3091载体转染并在此后48小时测定培养物上清液中的HBsAg浓度。以来自ELISA法的0D读数的标准化相对平均值(±SEM)表示。图15显示了在体内miR穿梭对独立沉默的影响的评估。用psi-CHECK_8T载体以及所示RNAi表达盒对小鼠进行HDI。其中，CMVmiR_31/5、CMVmiR-122/5和U6shRNA5与CMVmiR-31/8载体的比值表示在圆括号中。注射质粒3天之后，在肝匀桨中测定Renilla:萤火虫荧光素酶活性的标准化平均值(士SEM)。图16显示了产生肝特异性表达载体的克隆策略示意图。在pTZ衍生载体中增殖的肝特异性启动子以绿色箭头指示且表示为从5'端到3'端。图17显示了萤火虫荧光素酶在用所示表达载体转染的转染细胞中的表达。显示了在肝源细胞(黑条)和肾源细胞(灰条)中萤火虫荧光素酶活性的相对平均值。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。图18显示了在不同表达载体中pri-miR-122穿梭的表达。显示了萤火虫荧光素酶活性相对于Renilla荧光素酶活性的平均值。黑条表示在Huh7细胞中的表达，而灰条表示在116细胞中的表达。误差线表示SEM。图19显示了三聚体抗HBVpri-miR31表达盒的示意图。由含有3个pri-miR序列的CMVPol11启动子产生的转录物被加工以形成独立的pre-miRs，其依次是可耙向HBV独立位点的成熟miR指导序列的前体。图20显示了从用所示抗HBVRNAi激活表达盒或用不含miR序列(模拟)的骨架pClneo质粒转染的培养肝源细胞中提取的RNA的NORTHERN印迹分析。用与推定指导5序列互补的低聚核苷酸做探针探查电泳分辨的RNA(上面的组)。U6质粒含有驱动shRNA5或miR31/5表达的PoilIIU6启动子。还采用在三聚体盒内具有单独的primiRs的每一个可能排序组合的载体转染培养细胞。由来自于pClneo质粒的CMV启动子表达这些多聚体pri-miR穿梭。为控制等量负载和RNA转移，将印迹剥离并以与U6snRNA互补的低聚核苷酸再次探查(下面的组)。图21显示了从用所示抗HBVRNAi激活表达盒或用不含miR序列(模拟)的骨架pClneo质粒转染的培养肝源细胞中提取的RNA的NORTHERN印迹分析。以与推定指导8序列互补的低聚核苷酸做探针探查电泳分辨的RNA(上面的组)。U6质粒含有驱动shRNA8或miR31/8表达的PolIIIU6启动子。还采用在三聚体盒内具有单独的primiRs的每一个可能排序组合的载体转染培养细胞。由来自于PClneo质粒的CMV启动子表达这些多聚体pri-miR穿梭。为控制等量负载和RNA转移，将印迹剥离并以与U6snRNA互补的低聚核苷酸再次探查(下面的组)。图22显示了从以所示抗HBVRNAi激活表达盒或以不含miR序列(模拟)的骨架pClneo质粒转染的培养肝源细胞中提取的RNA的NORTHERN印迹分析。以与推定指导9序列互补的低聚核苷酸做探针探查电泳分辨的RNA(上面的组)。U6质粒含有驱动shRNA9或miR31/9表达的PolniU6启动子。还采用在三聚体盒内具有单独的primiRs的每一个可能排序组合的载体转染培养细胞。由来自于PClneo质粒的CMV启动子表达这些多聚体pri-miR穿梭。为控制等量负载和RNA转移，将印迹剥离并以与U6snRNA互补的低聚核苷酸再次探查(下面的组)。图23显示了采用二元荧光素酶试验评估报告基因表达的下调。以含有与指导序列5、8和9互补的所示靶序列的PsiCHECK衍生质粒和三聚体pri-miR穿梭表达质粒一起转染培养细胞。采用在三聚体盒内具有单独的primiRs的每一个可能排序组合的质粒转染培养细胞。模拟处理的细胞接受psiCHECK载体以及不含抗HBV序列的pClneo骨架质粒。在所有转染中，细胞以RNAi效应子与psiCHECK衍生质粒为10:l质量比接受质粒。测量了Renilla与萤火虫荧光素酶活性的比值并用于测定下调效力。图24显示了由转染细胞分泌的HBsAg的下调评估。将pCH9/3091HBV复制感受态靶质粒与单聚体或三聚体pri-miR穿梭表达质粒转染培养细胞。模拟处理的细胞接受pCH9/3091载体以及不含抗HBV序列的pClneo骨架质粒。阴性细胞不接受pCH9/3091因而仅以pClneo骨架质粒转染。U6质粒含有驱动单聚体shRNA5、primiR31/5、primiR31/8或primiR31/9表达序列的PolIIIU6启动子。以U6shRNA5载体与pCH9/3091为10:l和l:1比值进行试验，但对于所有其它的组合，RNAi表达载体对pCH9/3091的比值为10:1。PolII单聚体质粒由CMV启动子产生了primiR31/5、primiR31/8或primiR31/9。再次将由CMV表达的在三聚体盒内具有单独的primiRs的每一个可能排序组合的质粒转染培养的细胞。为评估这些RNAi效应子对HBsAg分泌的影响，在转染后48小时测定了培养物上清液中这种病毒抗原的浓度。图25显示了由在线软件mF0LD预测的miR_30二级结构。图26显示了由在线软件mF0LD预测的miR31二级结构。图27显示了由在线软件mF0LD预测的sh260靶向HCV5'UTR二级结构。图28显示了由在线软件mF0LD预测的miR260耙向HCV5'UTR二级结构。图29(A)pGEM-T-UTR和pGEM-T-LUC的克隆琼脂糖电泳图，其中Benchtoplkb标记(第1道)和HCV5'UTR的PCR扩增产物(第2道)和萤火虫荧光素酶(第3道)；(B)EcoRI-限制性推定pGEM-T-UTR的琼脂糖电泳图，其中Benchtoplkb标记(第1道)，来自克隆1的未限制性质粒DNA(第2道)，和来自克隆1-10的EcoRI-限制性质粒DNA(第3-12道)；和(C)EcoRI-限制性推定pGEM-T-LUC的琼脂糖电泳图，其中来自克隆l的未限制性质粒DNA(第1道)，和来自克隆1-10的EcoRI-限制性质粒DNA(第2-11道)。图30显示pCineoUTRLUC克隆Benchtoplkb标记(第1道)，来自克隆1的未限制性质粒DNA(第2道)，和来自克隆1-22的Sphl-限制性质粒DNA(第3-24道)的。图31(A)pTz57R-sh260的克隆，两步法PCR反应产物的琼脂糖电泳图，其中Benchtoplkb标记(第1道)和第一次sh260PCR反应的PCR产物(第2道)和第二次sh260PCR反应的PCR产物(第3道)；(B)PCR筛选推定pTz57R-sh260质粒DNA的琼脂糖电泳图，其中Benchtoplkb标记(第1道)，克隆1_6的PCR筛选的PCR产物(第2_7道)；和(C)SalI-限制性推定pTz57R-sh260质粒DNA的琼脂糖电泳图，其中BenchtoplOObp标记(第1道)，和来自克隆3的Sail-限制性质粒DNA。图32(A)pTz57R-miR260的克隆，两步法PCR反应产物的第一步的琼脂糖电泳图，其中BenchtoplOObp标记(第1道)和第一次miR260PCR反应的PCR产物(第8道)；(B)两步法PCR反应产物的第二步的琼脂糖电泳图，其中BenchtoplOObp标记(第1道)和第二次miR260PCR反应的PCR产物(第8道)；和(C)SalI-限制性推定(restrictedputative)pTz57R-miR260质粒DNA的琼脂糖电泳图，其中Benchtoplkb标记(第1道)和来自克隆1-4的SalI-限制性质粒DNA(第1-4道)。图33是显示以耙构建体pCineoUTRLUC和pCMV-Ren转染并以pTz57R_miR118、pTz57R-sh260或pTz57R-miR260共转染的HuH_7细胞相对荧光素酶活性(萤火虫/Renilla)的条线图，其中结果是来自于三次重复进行的2个实验中的一次代表试验(线表示平均值±SD)。图34人类PRMIR31图35人类PRMIR122图36PRMIR31/5图37PRMIR122/5图38U6启动子图39HBV基因组登录号AY233296图40PRMIR31/8图41PRMIR31/9图42PR皿R122/6图43PR皿R122/10图44HBV1575图45HBV1581图46HBV1678图47HBV1774图48HBV59图49HBV62图50HBV220图51HBV228图52HBV239图53HBV251图54HBV423图55HBV1261图56HBV1774图57HBV1826图58HBV1868图59HBV1899图60HBV2312图61HBV2329图62HBV2393图63HBV2456图64HBV2458图65HBV158图66HBV332图67HBV登录号Y13184图68人类MIR30图69shRNA260图70MIR260图71耙序列图72耙序列图73PRIMIR31/5互补物图74PRIMIR122/5互补物图75HBV1575互补物图76HBV1581互补物图77HBV1678互补物图78HBV1774互补物图79HBV59互补物图80HBV62互补物图81HBV220互补物图82HBV228互补物图83HB3V239互补物图84HBV251互补物图85HBV423互补物图86HBV1261互补物图87HBV1774互补物图88HBV1826互补物图89HBV1868互补物图90HBV1899互补物图91HBV:2312互补物图92HBV2329互补物图93HBV2393互补物图94HBV2456互补物图95HBV2458互补物图96HBV158互补物图97HBV332互补物图98HBV登录号Y3184互补物图99人类PRIMIR31RNA图100人类PRIMIR122RNA图101PRIMIR31/5RNA图102PRIMIR122/5RNA图103PRIMIR31/8RNA图104PRIMIR31/9RNA图105PRIMIR122/6RNA图106PRIMIR122/10RNA图107HBV1575RNA图108HBV1581RNA图109HBV1678RNA图110HBV1774RNA图111HBV59RNA图112HBV62RNA图113HBV220RNA图114HBV228RNA图115HBV239RNA图116HBV251RNA图117HBV423RNA图118HBV1261RNA图119HBV1774RNA图120HBV1826RNA图121HBV1868RNA图122HBV1899RNA图123HBV2312RNA图124HBV2329RNA图125HBV2393RNA图126HBV2456RNA图127HBV2458RNA图128HBV158RNA图129HBV332RNA图130人类MIR30RNA图131shRNA260RNA图132MIR260RNA图133耙序列RNA图134耙序列RNA图135耙序列互补物图136耙序列互补物图137革巴10图138革巴10互补物图139革巴10RNA发明详述已积极提出将激活RNAi途径以实现特异性基因沉默应用于基于核酸的HBV治疗的可能性。RNAi涉及通过RNAi效应子及其靶点之间的可预料的互补作用特异性和强烈地使基因沉默。天然地RNAi在通过加工内源miRs来调控基因表达中发挥重要作用，其控制了包括器官发生，细胞凋亡，细胞增殖和肿瘤发生的几个细胞过程。miRs由PolII转录成pri-miR发夹样结构，然后其在核内被加工形成前体miRs(pre-miRs)。该步骤由Drosha(—种RNAseIII酶)和DiGeorge临界区8蛋白(DGCR8)共同催化，其是它的双链RNA结合(dsRBD)对象。一些内源miRs是多顺反子的且是多于一个成熟miR，具有由单个转录物产生的区别。从核输出之后，pre-miRs被Dicer与结合的dsRBDTARRNA结合蛋白加工。在选择一条链作为成熟miR指导之前，制得的19-24bp双螺旋被交付于RNA诱导沉默复合物(RISC)。miR通常不会与其耙点完全互补并结合到同源mRNA的3'非翻译区以诱导翻译抑制。当指导与靶点之间的碱基配对完美匹配时，RISC的Ago2组分通过位点特异性切除指导互补物实现沉默。已提出将由RNAi诱导的特异性和强烈基因沉默用于研究基于RNAi的治疗形式以抑制致病基因的表达，所述致病基因包括这些病毒，例如HBV和丙型肝炎病毒(HCV)。通常地，外源RNAi诱导序列是合成短干扰RNA(siRNA)双螺旋或表达的shRNA序列。合成siRNAs类似于Dicer切除产物并通过直接激活RISC引起基因沉默。shRNAs在早期进入RNAi途径并充当pre-miR模拟物。组成型激活PolIII启动子优选转录shRNAs，因为在转录编码序列内调控元件的最低要求下它们能够产生短的，确定转录物。HBV基因组的几个位点已被合成的和表达的RNA序列所靶定并显示出病毒复制标记的强烈下调。但是，由于内源miR途径的饱和U6PolIII表达的抗HBVshRNAs在体内引发严重毒性的最新论证是表达RNAi序列治疗用途的重要关注点。因此组织特异性和可诱导PolII启动子对于PolIII调控元件是优选的，因为它们提供了表达RNAi效应子的转录控制和剂量调整的更优方式。一些报道已证实由PolIIRNAi表达盒可实现有效沉默，但是该途径被常规发夹序列的不可预测和不定沉默效力所牵制。被并入PolII衍生转录物的发夹序列上游和下游可干扰沉默基因的加工。为改善有效治疗序列的转录控制，我们利用细胞miRs的天然PolII介导转录控制。抗HBV序列被并入编码pri-miR-31或pri-miR-122模拟物的表达盒中。当抗HBVpri-miR穿梭表达盒被置于PolII肝特异性启动子控制下时在体内和体外都实现了病毒复制标记的有效沉默。此外，这些穿梭序列可产生能同时靶向不同序列的多聚体沉默序列。本发明描述了采用编码并入肝炎病毒的一个或多个靶序列的初级微RNAs模拟物的表达盒抑制或沉默肝炎病毒(尤其是乙型或丙型肝炎病毒)表达的方法。抗肝炎初级微RNA(pri-miR)表达盒通常包括编码模拟天然存在的miR序列(例如miR-30，miR-31和mi-R-122)的人工(即工程化)pri-miR序列的DNA序列，以耙向肝炎病毒的序列所置换的天然存在pri-miR序列的指导序列(和指导序列的互补序列)。表达盒包括PolII启动子，其可以是组成型启动子，例如CMV，或组织特异性启动子，例如肝特异性组织启动子a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)启动子，因子VIII(FVIII)启动子，HBV基本核心启动子(BCP)和PreS2启动子。表达盒还可包括启动子/转录调控序列和/或终止信号。用于针对乙型肝炎病毒(HBV)的靶点的选择是基于所有HBV基因型之中的序列保守性，还基于所预测的靶点对短发夹RNAs(shRNAs)沉默的易感性。通过CityofHopeHospital(Duarte，CA)(Healeetal[45])在线提供的算法对此进行分析。尽管乙型肝炎病毒是相对非常保守的，存在许多不同的已知基因型，仍要求是实施例中所描述的靶序列90%和95%序列以便还覆盖其他基因型中的耙点。表达盒可被并入病毒或非病毒载体中，其可用于将表达盒导入宿主细胞或生物体中。欲将表达盒用于治疗或预防尤其是人的肝炎感染，其可被并入药物组合物中，例如还包含药物可接受佐剂和/或载体的抗肝炎药物。将通过以下实施例进一步描述本发明。但是这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明的实质或范围。以miRs沉默乙型肝炎靶点5，6，8，9和10，而本文所述的其他靶点进行更简单的shRNA沉默试验。本领域技术人员会理解如果shRNAs可以则miRs也可以。实施例1:抗HBVpri-miR表达质粒的设计和增殖1.设计通过以指导序列耙向HBV序列(SEQIDNO:11/109/141)置换天然存在的miR-31(SEQIDN0s:1/107/133)和miR-122(SEQIDNO:2/108/134)来设计pri-miR表达盒。编码抗HBVprimiR序列的完整序列如SEQIDNO:3(135)和4(136)所给出的。尽可能地维持miR的野生型序列且转录物二级结构的计算机辅助预测[38]不会明显区别于相应的野生型miRs的。最终的表达盒含有与pre-miR任一端侧接的野生型序列的51个核苷酸(Zeng和Cullen，2005)。为利于miR的克隆，分别在其5'和3'端引入NheI和SpeI限制性酶切位点。图l中显示了HBV的靶基因组位点以及pri-miR表达盒的示意图。图2显示了野生型pri-miR-31和miR122序列以及它们的抗HBV衍生物(pri_miR-31/5和miR122/5)的结构。1.生成编码靶向HBV的miR序列的盒miR衍生抗HBV序列。通过成对的pre_miR31/5和pre_miR-122/5正向和反向低20聚核苷酸的引物延伸生成了编码含有靶向乙型肝炎病毒(HBV调配物1781-1801)(SEQIDNO:3和4)(图1)的指导序列的pre-miR-31和pre-miR-122的DNA。编码miR序列的低聚脱氧核苷酸是采用亚磷酰胺(phosphoramidite)化学法(InqabaBiotech,南非)合成的。如PCR采用Promega'sPCRMasterMix(Promega，WI，USA)—样进行引物延伸。热循环条件如下94°C5分钟起始变性，之后94°C10秒变性，5(TC10秒退火并在72t:延伸10秒循环30次以及72°C10分钟的最终延伸步骤。编码靶向HBV调配物1781-1801的miR盒的低聚核苷酸序列是Pre-miR-31/5正向5'-GTAACTCGGAACTGGAGAGGGGTGAAGCGAAGTGCACACGGGTTGAACTGGGAACGACG-3'(SEQIDNO:40)Pre-miR-31/5反向5'-CTGCTGTCAGACAGGAAAGCCGTGAATCGATGTGCACACGTCGTTCCCAGTTCAACCCTG-3'(SEQIDNO:41)Pre-miR-122/5正向5'-GAGTTTCCTTAGCAGAGCTGGAGGTGAAGCGAAGTGCACACGGGTCTAAACTAACGTGTGCA-3'(SEQIDNO:42)Pre-miR-122/5反向5'-GGATTGCCTAGCAGTAGCTAGGTGTGAAGCTAAGTGCACACGTTAGTTTAGACCCGTGTGCA-3，(SEQIDNO:43)将引物延伸产物进行琼脂糖凝胶电泳(1%凝胶)，切离并采用Qiagen'sMinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)从凝胶切块中提取。以大约lOOng的纯化pre-miR-31/5和pre-miR-122/5作为模板并以正向和反向pri-miR-31和pri-miR-122引物进行扩增。Pri-miR-31正向5'-GCTAGCCATAACAACGAAGAGGGATGGTATTGCTCCTGTAACTCGGAACTGGAGAGG-3，(SEQIDNO:44)Pri-miR-31反向5'-AAAAAAACTAGTAAGACAAGGAGGAACAGGACGGAGGTAGCCAAGCTGCTGTCAGACAGGAAGC-3'(SEQIDNO:45)Pri-miR-122正向5'-GACTGCTAGCTGGAGGTGAAGTTAACACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCCTTAGCAGAGCTG-3'(SEQIDNO:46)Pri-miR-122反向5'-GATCACTAGTAAAAAAGCAAACGATGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGGATTGCCTAGCAGTAGCTA-3，(SEQIDNO:47)U6P0IIII启动子序列的扩增。还以下列引物扩增U6启动子U6F5'-GATCAGATCTGGTCGGGCAGGAAGAGGGCC—3'(SEQIDNO:48)禾PU6R5'-GCTAGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3'(SEQIDNO:49)。热循环参数如上。以扩增子进行琼脂糖凝胶电泳(1%凝胶)，将其切离并采用Qiagen的MinElute凝胶提取试剂盒从凝胶切块中提取。21miR和U6序列的增殖。将编码pri_miR-31/5、pri-miR-122/5(SEQIDNO:3和4)和U6启动子(SEQIDNO:5)的DNA片段连接到pTZ_57R/T(InsTAclonePCR克隆试剂盒，Fermentas，Hanover，MD，USA)上以分别生成pTZ-57R/Tpri_miR-31/5和pTZ_57R/Tpri-miR-122/5。类似地通过将扩增的U6P0IIII启动子序列插入到pTZ中生成pTZ-U6。按照供应商的说明进行连接和选择。简而言之，在22t:温育2-3小时进行连接反应。以连接混合物转化化学感受态大肠杆菌，并将其涂布在氨苄青霉素，IPTG，X-gal阳性的LB琼脂平板上，将平板在37t:温育过夜。按照标准双脱氧链终止法(I叫abaBiotechnology,南非)对插入阳性克隆及其相反方向(相对于P-半乳糖苷酶基因)进行测序。抗HBVmiR表达盒。为生成PolIII驱动pri-miR载体，将pri-miR-31/5和pri-miR-122/5的编码序列克隆到U6启动子下游。为生成U6pri_miR-31/5，通过Nhel和SeaI消化从pTZ-57R/Tpri-miR-31/5切离的pri_miR-31/5，并将其插入以SpeI和SeaI消化的pTZ-U6中。通过NheI和EcoRI消化从pTZ_57R/Tpri-miR-122/5切离的pri-miR-122/5并将其插入以SpeI和SeaI消化的pTZ_U6中以生成U6pri_miR-122/5。pHBxshRNA5的生成如之前所述[39]，其涉及两步PCR反应，其中U6PolIII启动子与下游发夹编码序列一起被扩增，然后被插入pTZ-57R/T(InsTAcloneTMPCR克隆试剂盒，Fermentas,WI，USA)中。通过克隆pCI-neo(Promega，WI，USA)的CMV启动子的下游pri-miR-31/5和pri-miR-122/5序列生成了PolII驱动pri-miR载体。通过SalI和NheI从pTZ_57R/Tpri-miR-31/5切离的pri-miR-31/5并将其连接到以XhoI和XbaI消化的pCI-neo上以生成CMVpri-miR-31/5。通过NheI禾PXbaI消化从pTZ-57R/Tpri_miR-122/5切离的pri-miR-122/5之后连接到以相同限制性酶消化的pCI-neo上生成CMVpri_miR-122/5按照类似的程序生成了耙向HBx开放式读码框内不同位点(位点8和9)的表达盒。由这些盒靶向的HBV序列(SEQIDNO:6，登录号AY233296)调配物(co-oridinate)如下pTZ-57R/Tpri-miR-31/8革E向HBV1678—1698(SEQIDNO:7(137))，pTZ—57R/Tpri-miR-31/9耙向HBV1774—1794(SEQIDNO:8(138)，pTZ-57R/Tpri_miR-122/6耙向HBV1678-1700(SEQIDNO:9(139))和pTZ-57R/Tpri_miR-122/10革巴向HBV1774-1796(SEQIDNO:10(140))。实施例2:来自pTZ-57R/Tpri-miR-31/5和pTZ-57R/Tpri_miR-122/5的抗HBV序列在转染培养细胞中的细胞内表达。以编码miR-31/5和miR122/5的质粒转染培养细胞。在添加了10%FCS，青霉素(50IU/ml)和链霉素(50yg/ml)(GibcoBRL，UK)的DMEM中增殖HEK293细胞。在转染前一天，将1500000HEK293细胞种入直径为10em的培养皿中。按照供应商的说明采用阳离子脂质体(Invitrogen，CA，USA)以10yg的shRNA-或miR-表达质粒进行转染。RNA印迹分析。在转染之后第4天收集HEK293细胞，并采用Tri试剂(Sigma，MI，USA)按照供应商说明提取总RNA。在尿变性12.5%聚丙烯酰胺凝胶中分辨20ygRNA并将其印染在尼龙膜上。放射性标记的DNA低聚核苷酸在细胞RNA旁边以作为大小指示剂。印染是与设计成推定成熟miR-31/5和miR-122/5产物特异性的探针的杂交。该探针低聚核苷酸的序列是5'GACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCA3'(SEQIDNO:50)。为确认泳道具有细胞RNA的等量负载，将印染剥离并以与内源U6snRNA互补的低聚核苷酸再次探查。U6snRNA探针的序列是5'TAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCA3'(SEQIDNO:51)。按照标准程序采用聚核苷酸激酶和Y—32PATP对所有探针进行放射性标记。加工序列的检测。图3，4和5显示了从用来自于抗HBV表达盒的miR-31(图3和4)和miR-122(图3和5)转染细胞中提取的RNA的RNA印染分析之后获得的杂交信号。主要的加工产物是可检测到的大约21nt大小的条带，其与天然存在的成熟miR-31和miR-122产物[40，41]具有相似长度。U6shRNAHBVshRNA5表达盒被包含作为高水平发夹表达的阳性对照。与shRNA5表达载体相比，在miR-31和miR-122载体表达背景下加工的指导miR的量以低得多的浓度而存在(达85倍低浓度)。令人感兴趣的是，对应于长度20和22ntRNA的条带在以CMVmiR-31/5和U6miR-31/5转染的细胞中也检测到(图3)，这意味着在miR-31穿梭背景下抗HBV指导链的加工可以是异源的。在以含U6启动子载体转染细胞中提取的RNA中检测到更大分子量的miR/shRNA中间体，但在表达CMVmiR-31/5或CMVmiR-122/5盒的细胞中未检到。这表明CMVPolII转录物的完全加工比PolIII表达RNA的效率更高。令人感兴趣的是，来自U6盒的miR衍生指导的胞内浓度低于U6shRNA5的，其可能是由于更长的miR-122/5和miR-31/5序列的更低PolIII转录效力。检到的指导链信号是特异的，因为当探针杂交到从以相似靶向不同HBV位点(图4和5)的pri-miR表达载体转染的细胞中提取的RNA上时检测不到条带。通过相似的U6snRNA探针信号强度证实了在每条泳道内为等量负载的细胞RNA。实施例3:在HBV复制的细胞培养物模型中miR序列的抗HBV效力试验靶质粒。pCH-9/3091如前所述[42]。它含有大于基因组长度的HBV序列，其类似于HBVAl亚基因型共有序列(consensus)，由它的CMV启动子产生了3.5kbHBV前基因组转录物。通过以萤火虫荧光素酶编码DNA置换pCH-9/3091的preS2/S0RF，按之前所述的与生成pCHGFP所采用的相似程序[43]制备了pCH萤火虫Luc载体。简而言之，采用PCR从psiCheck2(Promega，WI，USA)中扩增萤火虫荧光素酶序列。扩增萤火虫荧光素酶序编码区的引物组合是5，ACTGCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGTGAGCAAGGGCG3，(正向；SEQIDNO:52);和5'ACGTTCTAGAGTATACGGACCGTTACTTGTACAGCTC3'(反向；SEQIDNO:53)。正向引物含有与来自于调配物129-159的HBV序列互补的序列(包括天然存在的XhoI限制性酶切位点)和5'萤火虫荧光素酶序列。在该引物中，萤火虫荧光素酶起始密码子的位置等同于中间HBs蛋白的翻译起始密码子的位置。反向引物包括与萤火虫荧光素酶0RF的3'端互补的序列以及SpeI限制性酶切位点。PCR引物序列如下荧光素酶正向5'-ACTGCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAAG-3'(SEQIDNO:54);和荧光素酶反向5'-ACTGACTAGTTTACACGGCGATCTTTCC-3'(SEQIDNO:55)通过引物并入的XhoI和SpeI位点以粗体指示。将PCR产物克隆至pTZ_57R/T(InsTAclonePCR克隆试剂盒，Fermentas，WI，USA)中。然后以Xhol和Spel从pCI-EGFP上切离萤火虫荧光素酶序列并将其插入pCH-9/3091的XhoI和Spel位点以生成pCH-萤火虫Luc。将XhoI-NotI消化的来自于pCI-neoHBx[44]的HBx片段直接插入质粒psiCheck2(Promega，WI，USA)来制备psiCheck-HBx耙质粒以便HBx0RF处于Renilla荧光素酶盒的3'未翻译区(UTR)。细胞培养。将Huh7细胞维持在添加了2.5%胎牛血清(FCS)，青霉素(50IU/ml)和链霉素(50iig/ml)(GibcoBRL，UK)的RPMI培养基中。并在添加了10%FCS，青霉素(50IU/ml)和链霉素(50iig/ml)(GibcoBRL，UK)的DMEM中增殖HEK293细胞。在转染前一天，将250000HEK293细胞和150000Huh7细胞种入直径2cm的孔中。采用阳离子脂质体(Invitrogen，CA，USA)按照供应商说明进行转染。为检测miR-31/5和miR122/5_编码质粒的影响，以6iigpCH-9/3091[42]或pCH萤火虫Luc靶载体和2iigmiR-31/5和miR122/5pTZ-衍生质粒或缺乏miR盒的质粒的组合转染Huh7细胞。在以pCH萤火虫Luc靶载体转染的情况下，包括在CMV启动子控制下组成性产生Renilla荧光素酶的质粒以控制转染效力(pCMV-Ren载体，其由DrjohnRossi，CityofHopeHospital，Duarte，CAUSA所捐赠)。采用Monolisa(ELISA)免疫试剂盒(BioRad，CA，USA)检测被分泌至培养物上清液中的HBV表面抗原(HBsAg)。在每个共转染中还包括组成性产生EGFP.[43]的质粒载体，通过荧光显微镜法证实了相当的转染效力。以二元荧光素酶检测试剂盒(Promega，WI，USA)并采用Veritas二元注射光度计(TurnerBioSystems，CA，USA)测量Renilla和萤火虫荧光素酶的活性。miR介导的转染细胞分泌HBV抗原(HBsAg)的抑制。首先，为在体外评估针对HBV的效力，以miR-31/5-和miR-122/5-表达载体以及pCH-9/3091HBV靶质粒[42]共转染Huh7细胞。HBx序列是所有HBV转录物(图6A)共有的且HBsAg分泌的抑制与RNAi介导的HBV复制沉默是相关联的[39、43、44]。对照含有U6shRNA编码质粒(U6shRNA5)，其如之前所示可有效针对HBV[39]以及由CMV启动子控制shRNA5序列表达的载体。与模拟处理细胞相比，通过U6shRNA5、miR-31/5-和miR-122/5表达载体实现了95_98%病毒抗原的下调(图6B)。在U6Po1III以及CMVPolIImiR-31/5-和miR-122/5表达载体中都观察到这种影响。CMVmiR-122/5影响略低于其他miR载体(下调85_90%)。编码来自于CMV启动子的shRNA5的载体可实现至少大约60%的有效沉默。miR介导的转染细胞中萤火虫荧光素酶活性的抑制。采用报告基因质粒(pCH萤火虫Luc)确证来自于转染细胞分泌HBsAg的分析(图6)数据以测量原位的下调效力(图7)。在pCH萤火虫Luc中，以萤火虫荧光素酶0RF置换pCH-9/3091的preS2/S序列，其具有保持完整的靶向HBx0RF。pCH萤火虫Luc和miR编码载体的共转染可通过测定荧光素酶报告基因活性方便地在原位定量测量抗HBV序列。分析表明了萤火虫荧光素酶活性被含U6shRNA5、U6miR-31/5、U6miR-122/5、CMVmiR-31/5和CMVmiR-122/5载体明显降低。每个这类载体都实现了相对于对照大约75%的下调(图7B)。CMVshRNA5载体未明显抑制萤火虫荧光素酶活性。与图6所示结果放在一起，这些数据表示了miR-31或miR-122的miR样结构的并入能够由PolII或PolIII启动子表达沉默序列且不影响沉默效力。此外，图3、4和5所列的数据显示了由降低很多的RNAi效应子浓度所引起的沉默效力。对总共23个革巴点(SEQIDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33(RNASEQIDNO:141-163))进行了评估。这些序列的长度为21_25nt，开始于HBV核苷酸调配物1575、1581、1678、1774、59、62、220、228、239、251、423、1261、1774、1826、1868、1899、2312、2329、2393、2456、2458、158和332。对HBV耙点的鉴别依靠评估基24因型之间的保守性以及根据Healeetal[45]所述算法评估的RNAi介导沉默的适应性。[O333]实施例4:采用HBV复制的动力进样模型在体内试验miR序列的抗HBV效力小鼠的动力进样。采用鼠动力尾部静脉注射(HDI)法测定miR质粒载体对体内HBV基因表达的景》口向。按照UniversityoftheWitwatersrandAnimalEthicsScreeningCommittee核准的方案进行动物实验。在5_10秒内由尾部静脉注射为小鼠体重10%的盐水溶液。该盐水溶液包含三个质粒载体的组合5iig靶DNA(pCH-9/3091);5yg缺乏HBV序列的pCI-neo质粒DNA(PromegaWI，USA)或5iig抗HBV序列(pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5或pCMVmiR-122/5质粒)；和5iigpCIneoEGFP(肝DNA递送的对照，其组成性表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)标记基因[43])。在中止未进行最佳注射的动物研究之后，每个实验组含有5-8只小鼠。在HDI之后的第3和5天在麻醉下通过眶后穿剌收集血液。采用Monolisa(ELISA)免疫试剂盒(BioRad，CA，USA)按照供应商说明测量血清HBsAg浓度。为测量miR穿梭序列对病毒颗粒等效物(VPEs)循环的影响，在HDI之后的第3和5天从50ii1小鼠血清中分离总DNA，并按照之前所述的方法[39]采用定量PCR测定病毒DNA。简而言之，采用RocheDiagnostics的总核酸分离试剂盒和MagNApure设备从从50iU小鼠血清中分离总DNA。对照包括空白水和HBV阴性血清。采用SYBRgreenTaq即用预混物(readymix)(Sigma，M0，USA)对从8y1小鼠血清等效物中提取的DNA进行扩增。利用交叉点分析测量病毒体DNA浓度并采用EuroH印校准器[45]生成标准曲线。HBV表面引物组是HBV表面正向5'-TGCACCTGTATTCCATC-3'(SEQIDNO:56)和HBV表明反向5，-CTGAAAGCCAAACAGTGG-3，(SEQIDNO:57)。采用RocheLightcyclerV.2进行PCR。毛细管反应体积是20ii1而热循环参数是由95°C30秒热启动之后57°C10秒，72°C7秒循环50次然后95°C5秒所组成。通过溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的特异性。HDI之后第5天处死小鼠后收集肝。按照标准程序[46]从肝中提取总DNA。没有进行限制性消化将DNA进行标准琼脂糖凝胶电泳，之后加工以采用R即id-hyb缓冲液(Amersham，UK)进行Southern印迹分析。为产生探针，以下列探针扩增HBVX开放式读码框DNA:HBx正向5'-GATCAAGCTTTCGCCAACTTACAAGGCCTTT-3'(SEQIDNO:58)和HBx反向5'-GATCTCTAGAACAGTAGCTCCAAATTCTTTA-3'(SEQIDNO:59)。纯化PCR产物作为模板以HexaLabel"DNA标记试剂盒(Fermentas，MD，USA)按照供应商说明进行随机引物标记。处理固定冷冻肝部分以按照标准程序检测eGFP。图8显示了在以所示质粒进行HDI程序的小鼠血清中检测到的HBsAg浓度。pU6shRNA5，pCMVmiR-31/5和pCMVmiR-122/5质粒每个都使病毒抗原下调至少95%。这可在HDI之后的第3和5天进行的测量中观察到。在3个质粒载体中，含有U6shRNA5的是最有效的而在以该质粒注射的小鼠血清中检测不到HBsAg浓度。也可在第3和5天采用定量实时PCR测量在相同小鼠中循环VPEs的数量。这些数据如图9所示。结果确证了HBsAg测定值(图8)，其中pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5和pCMVmiR-122/5质粒每个都使循环VPEs的数量下调至少95%。在第3和5天，在模拟处理动物中VPEs的数量大约是每毫升血清中分别为1.3X10，P2.1X106。在pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5和pCMVmiR-122/5处理动物中循环VPEs大约低10倍，为每毫升血清0.5-2.5X105。在这种复制标记的下调上pU6shRNA5和pCMVmiR-31/5具有大约相等的效力，且两种载体效力都略高于pCMVmiR-122/5。在来自经过了HDI实验的每组2个动物的代表性肝组织中测量HBVDNA复制中间体。分析结果如图10所示。仅在模拟处理动物中检测到HBV双螺旋线性(DL)和松弛环状(RC)复制中间体，而在共注射了CMVmiR-31/5、CMVmiR-122/5或U6shRNA5质粒的任何小鼠中都检测不到。在模拟处理小鼠中检到的HBVDNA条带在大小上与pCH9/3091的任何条带都不相对应，这表明检到的DL和RCHBVDNA不同于输入质粒DNA。在Southern转移之前以溴化乙啶对分离DNA进行染色，杂交证实了加载至每条泳道中的细胞DNA是等量的。从而泳道的不等量负载不作为所观察到的HBVDNA复制中间体浓度差异的考虑因素。综合地，图8-10中的数据显示了CMVmiR-31/5和CMVmiR-122/5表达盒是高度有效的HBV基因表达的沉默子，且它们的效力约等于含U6shRNA5的载体。实施例5:抗HBVmiR穿梭对非特异性诱导干扰素反应基因的诱导试验细胞培养物、转染和RNA提取。如上所述培养HEK293细胞并转染。简而言之，将细胞维持在添加了10%FCS、青霉素(50IU/ml)和链霉素(50yg/ml)(GibcoBRL，UK)的DMEM中。在转染前的一天，将250000HEK293细胞种入直径2cm的培养皿中。采用阳离子脂质体(Invitrogen，CA，USA)按照供应商说明以800ngshRNA-或miR-表达质粒进行转染。作为诱导IFN反应的阳性对照，还以800ng聚(I:C)(Sigma，MI，USA)转染细胞。转染之后2天，以Tri试剂(Sigma，MI，USA)按照供应商说明提取RNA。干扰素反应基因的实时定量PCR。采用Song等[47]所述的程序扩增低聚腺苷酸合成酶-1(OAS-1)、干扰素(IFN-13)、p56和磷酸甘油醛_3脱氢酶(GAPDH)cDNA。采用RocheLightcyclerV.2进行所有的qPCRs。对照包括空白水和未进行反转录的RNA提取物。采用Taqreadmix(即用预混物)禾PSYBRgreen(Sigma，MO，USA)进行扩增并检测反应中的DNA。热循环参数包括95°C30秒热启动之后58°C10秒，72°C7秒循环50次然后95°C5秒。通过溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的特异性。用于扩增人HEK293细胞IFN反应相关mRNA的引物组合如下IFN-P正向5'TCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCT3'，IFN-P反向5'CCACAGGAGCTTCTGACACTGAAAA3'，GAPDH正向5，AGGGGTCATTGATGGCAACAATTCCA3'，GAPDH反向5'TTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG3'，OAS1正向5'CGAGGGAGCATGAAAACACATTT3'，OAS1反向5'GCAGAGTTGCTGGTAGTTTATGAC3'，p56正向5'-CCCTGAAGCTTCAGGATGAAGG-3'禾口p56反向5'-AGAAGTGGGTGTTTCCTGCAAG-3'图ll显示了OAS-l、p56和IFN-l3基因与持家基因GAPDH的浓度比值的比较结果。在以聚(I:C)处理细胞24小时之后IFN基因表达增加了，这证实了在所用实验条件下激活了IFN反应。未观察到从以pU6shRNA5、pCMVmiR_31/5、pCMVmiR_122/5、pU6miR_31/5或pU6miR-122/5载体转染的细胞中提取的RNA可诱导IFN-PmRNA。这些数据表明了miR表达盒对HBV标记复制的沉默作用不可能是由干扰素的非特异性诱导和所导致的程序性细胞死亡(细胞调亡)而引发的。实施例6:由HBVmiR穿梭减弱独立RNAi介导的沉默的评估细胞培养、转染和RNA提取。如上所述培养HEK293细胞和Huh7细胞并转染。在26转染前的一天，将250000HEK293细胞种入直径2cm的培养皿中。为评估miR-31/5-和miR-122/5表达质粒对独立RNAi介导沉默的影响，以35-40%的密度将细胞种入24孔培养皿中，然后以80ngpsi-CHECK-8T、40ngpCMVmiR-31/8和780ngshRNA5或miR5表达质粒进行转染。通过0-10iig范围的pU6shRNA5转染测定pU6shRNA5质粒剂量对pCMVmiR-31/8独立沉默的影响。类似地，为测定pU6shRNA5对pCH-9/3091的沉默能力，以0-10iig范围的pU6shRNA5进行转染。在每个孔中以恒定量的1PgpCMVmiR-31/8和pCH-9/3091转染。在所有情况下都包含骨架质粒以确保转染等量的总质粒DNA。组成性产生eGFP[43]的质粒载体也包括在每次共转染中，以采用荧光显微镜法确认等量转染效率。采用阳离子脂质体(Invitrogen，CA，USA)按照供应商说明以800ngshRNA-或miR-表达质粒进行转染。为生成含有miR8靶点的psi-CHECK-8T，利用引物8T正向5'-CAATGTCAACGACCGACCTT-3'和引物8T反向5'-ACTAGTGCCTCAAGGTCGGT-3'扩增HBV基因组的核苷酸1678-1702，并在扩增子的3'端引入SpeI位点。将纯化片段连接到pTZ-57R/TPCR克隆载体中，并以SalI和SpeI移除插入物再连接到psi-CHECK2.2(Promega，WI，USA)的XhoI和SpeI位点中，以生成在Renilla荧光素酶0RF下游具有HBV耙点的psi-CHECK-8T。按照标准双脱氧链终止法(I叫abaBiotechnology,南非)确认所有质粒序列。miR穿梭对独立RNAi介导沉默的影响的评估。为测定miR表达载体对独立RNAi介导基因沉默的影响，将含有Renilla荧光素酶0RF下游独立HBVmiR-31/8耙序列的二元荧光素酶报告质粒(psi-CHECK-8T)与pCMVmiR-31/8和每个shRNA5_、miR-31/5-或miR-122/5表达载体一起进行转染(图12)。符合之前观察到的由U6PolIH启动子过量表达shRNA引起内源miR途径的破坏[36]，在pU6HBVshRNA5的存在下由pCMVmiR-31/8耙向的psi-CHECK-8T沉默降低了。然而以miR-122/5-或miR-31/5-表达质粒进行共转染时未观察到这种影响。这样的结果可能是依赖于RNAi效应子浓度的，这符合我们所发现的胞内pri-miR衍生指导序列以低于U6shRNA5指导而存在(图3、4和5)。为确证这一假定，以减少浓度的pU6HBVshRNA5质粒和恒定量的CMVmiR-31/8和psi-CHECK_8T耙进行共转染(图13)。在低浓度的pU6HBVshRNA5下实现了有效的miR-31/8介导下调。然而，当pU6HBVshRNA5的量增加时，针对HBV耙点8的效力减弱。相似范围的pU6HBVshRNA5浓度和pCH-9/3091HBV复制感受态质粒的共转染证明了通过HBV耙点5实现了HBsAg分泌的有效沉默(图14)。这些数据还支持了表达shRNA5的浓度影响pU6HBVshRNA5对独立pCMVmiR-31/8沉默的破坏的观点。重要的是，当以抗HBVmiR穿梭表达盒共转染细胞时未观察到对独立沉默的破坏。实施例7:在体内评估抗HBVmiR穿梭对独立RNAi介导沉默的毒性和破坏小鼠的动力进样和肝荧光素酶活性的测量。为在体内测定miR对报告基因活性的影响，使BALB/c小鼠接受0.5iig报告革巴DNA(psi-CHECK-8T)，5ygpCH_9/3091，抗HBV质粒(pCMVmiR-31/8、pU6shRNA5、pCMVmiR-31/5或pCMVmiR-122/5)的组合或模拟(pCI-neo骨架)。HDI之后第3天将小鼠处死，收集其肝脏，并在磷酸缓冲盐溶液中均质，再按如上所述测定Renilla和萤火虫荧光素酶的活性。评估独立RNAi介导沉默的毒性和破坏。为评估独立RNAi介导沉默可能的破坏，以及pri-miR穿梭在体内对肝细胞的毒性，还以psi-CHECK-8T二元荧光素酶报告质粒和多种抗HBV表达盒注射小鼠(图15)。HDI之后第3天测量肝匀浆中的萤火虫和Renilla荧光素酶活性。以pCMVmiR-31/8实现了选择性的和有效的Renilla荧光素酶活性沉默。这种下调未被共注射20倍过量U6shRNA5、CMVmiR-122/5或CMVmiR-31/5所减弱，这表明了在此处所述实验条件下独立沉默不受miR穿梭表达的影响。采用HDI模型，注射程序本身所固有的酶标记释放对肝细胞的损坏使直接评估由miR模拟物引起的肝毒性变得复杂。作为由pri-miR穿梭引起对肝细胞的损害的替代的指示剂，在小鼠组中独立计算未靶定的和组成型激活psi-CHECK-8T-衍生萤火虫荧光素酶活性。与未接受RNAi效应子的动物相比，在那些接受miR穿梭的小鼠中的肝匀浆中未观察到萤火虫荧光素酶活性的减弱。综合地，这些数据显示了由CMVmiR-31/5和CMVmiR-122/5生成的miR模拟物是体内HBV复制的特异性沉默子且对独立RNAi介导沉默几乎无影响。而且，miR表达盒的效力约等于U6shRNA5序列的效力。实施例8:肝特异性启动子的miRNA穿梭表达盒的特征采用表1的引物组从Huh7细胞中提取的总基因组DNA中扩增人a-1抗胰蛋白酶(A1AT)和因子VIII(FVIII)启动子。采用表1的引物组从质粒pCH-9/3091中扩增HBV基本核心启动子(BCP)和PreS2启动子。通过标准亚磷酰胺化学法(InqabaBiotechnology,南非)合成所有低聚核苷酸。设计引物以便在扩增子的5'端扩增引入BglII位点(若为AIAT则是BclI)，在3'端引入HindIII位点。采用高保真延伸(ExpandHighFidelity)PCRpms系统(Roche，德国)按照供应商说明扩增启动子序列。在50iU反应混合物中建立PCRs，并添加5XExpandHiFiPLUS缓冲液(含MgCl2)，0.2mMdNTPs(dGTP、dATP、dTTP和dCTP)、分别0.5iiM的正向和反向引物、2.5UExpandHiFi腦酶混合物和含lOOpg质粒DNA的50ng基因组DNA。PCR条件如下在94°C2分钟启动变性；94°C30秒变性，55°C30秒退火并在72t:延伸3分钟循环30次(在20-30个循环期间每个循环延伸时间增加10秒)；72。C最终延伸7分钟。表1:扩增肝特异性启动子的低聚核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>限制性酶切位点以粗体表示。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并采用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)进行洗提。将纯化片段连接到PCR克隆载体pTZ57R/T(InsTAclonePCRCloningKit,Fermentas，WI，USA)。将摩尔比为l:3的载体和插入物在16。C连接过夜。以连接混合物转化化学感受态大肠杆菌(XLl-Blue，Invitrogen，CA，USA)，并将其涂布在含氨节青霉素、X-gal-和IPTG的LuriaBertani琼脂平板上，然后37。C温育过夜。选择插入阳性克隆(白色菌落)进行质粒纯化。将质粒进行限制性内切酶消化并对产生所需结果的克隆进行测序(I叫abaBiotechnology,南非)。接着，以肝特异性启动子序列取代pCl-neo内的CMV立即早期增强子启动子序列(图16)。因此所建立的新表达载体会在肝特异性启动子而不是组成型激活CMV启动子下运行。以Bglll和Hindi11的限制性将编码FVIII、BCP和PreS2启动子从它们相应的质粒(pTZ-FVIII、pTZ-BCP和pTZ-PreS2)消化出。Bell对甲基化很敏感，因此通过dcm-和dam-甲基化酶缺陷株大肠杆菌、GM2929增殖pTZ-AlAT。然后以Bell和Hindi11从pTZ-AlAT中限制性切离编码A1AT启动子的序列。用Hindi11和EcoRI消化pCl-neo以产生3815bp、1317bp和340bp片段。其次，用EcoRI和Bglll消化pCl-neo以产生4371bp和llOlbp片段。将肝特异性启动子序列与340bpHindlII-EcoRI和4371bpEcoRI-Bglll片段连接以产生新肝特异性表达载体(pCI-AlAT、pCI-FVIII、pCI-BCP和pCI-PreS2)。Bell和Bglll产生的互补末端可使A1AT启动子序列被连接到pCl-neo骨架上。肝特异性表达载体功能性评估为评估肝特异性表达载体的功能性，将编码萤火虫荧光素酶的序列克隆到启动子序列下游。以Nhel和Smal从pCl-neoFLuc中消化出萤火虫荧光素酶序列，并将其连接到肝特异性表达载体的等效位点中以生成pCI-AlATFLuc、pCI-FVIIIFLuc、pCI_BCPFLuc和pCI-PreS2FLuc。组织培养将人肝瘤细胞株、Huh7和人胚肾衍生物、116细胞维持在添加了10%胎牛血清(GibcoBRL，區)的DMEM生长培养基中(Sigma，M0，USA)。在转染前一天将细胞按40%密度种入24孔培养皿中(CorningInc.，NY，USA)。以100ng不同萤火虫荧光素酶表达载体，100ngphRL-CMV和100ngpCI-neoeGFP转染细胞。将质粒DNA与50iUOpti-MEM(Invitrogen，CA，USA)混合并在室温下温育5分钟。将额外的50ii10pti-MEM与0.5ii1阳离子脂质体2000(Invitrogen,CA，USA)混合，也在室温下温育5分钟。温育期过后，将DNA:0pti-MEM和阳离子脂质体Opti-MEM混合物组合，并在室温下再温育20分钟以形成脂质DNA复合物。第二次温育期之后，往24孔培养皿的每孔中添加100iil转染混合物。将转染重复三次。将细胞在37t:和5%0)2下温育5小时。其后以新鲜培养基替换生长培养基，并将细胞温育48小时。荧光素酶试验采用二元荧光素酶试验系统(Promega，WI，USA)对转染后48小时的细胞进行原位荧光素酶活性试验。简而言之，去除生长培养基，以lOOiU被动性裂解缓冲液在搅动下裂解细胞15分钟。将10微升细胞裂解物分散在光度计平板上，采用Veritas二元注射光度计(TurnerBioSystems，CA，USA)测量萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶活性。肝特异性miRNA穿梭载体的生成为生成肝特异性miRNA穿梭载体，以Nhel和Smal从pCI_miR-122/5、pCI-miR-122/6和pCI-miR-122/10中消化出pri-miR-122穿梭，并将其连接到pCI-AIAT、pCI-FVIII、pCI-BCP和pCI-PreS2的等效位点中。肝特异性miRNA穿梭载体功能性评估在转染之前24小时，将细胞以40%密度种入24孔培养皿中。以80ng耙质粒(pCH-FLuc)、800ng不同miRNA穿梭载体、50ngphRL-CMV和50ngpCI-neoeGFP转染细胞。质粒DNA被制成共liig含有pCI-neo，并以50ii1Opti-MEM进行稀释。将一微升阳离子脂质体2000稀释在50ii1Opti-MEM中。如上所述进行转染并测量萤火虫和Renilla荧光素酶活性。构建的表达载体能够组织特异性表达萤火虫荧光素酶以表达萤火虫荧光素酶的载体转染培养的哺乳动物细胞可实现作为以下两方面的指示剂的荧光素酶的方便测量(i)构建载体功能性和(ii)载体表现组织特异性能力。包括表达萤火虫荧光素酶的泛宿主和组成型激活CMV启动子作为表达的阳性对照。图17说明了由不同启动子原位表达萤火虫荧光素酶活性。CMV立即早期启动子增强子是强大的，组成型激活启动子，而且如预期地可在多种细胞类型中强烈表达萤火虫荧光素酶。如所预期地，在以pCI-neoFLuc转染的Huh7以及116细胞中的萤火虫荧光素酶表达相对于未接受萤火虫荧光素酶载体(阴性)的细胞，显示出高水平的萤火虫荧光素酶活性。肝特异性表达载体无一表现出与由pCI-neoFLuc在Huh7细胞中实现的相同程度。最强表达是由pC-BCPFLuc实现的，其大约比由CMV启动子表达低3倍。由pCI-FVIIIFLuc、pCI-AlATFLuc和pCI-PreS2的表达大约比pCI-neoFLuc表达低50、7和25倍。但是，在116细胞中这些载体的萤火虫荧光素酶表达明显减弱。表达载体能够组织特异性表达miRNA穿梭已证实载体的组织特异性表达，下一步就是检测这些载体是否能以组织特异性方式沉默HBV复制。抗HBVpri-miR-122衍生穿梭被克隆在肝特异性启动子下游并检测了它们仅选择性地在肝源细胞中抑制HBV标记复制的能力。图18显示了通过之前显示出最佳表达水平(即pCI-AlAT和pCI-BCP，图17)的两个载体下调萤火虫荧光素酶活性(如HBV复制的测量)。在报告载体中，将HBV靶插入如实施例3和图7所述的萤火虫荧光素酶开放式读码框下游。CMVmiRNA在Huh7细胞和116细胞中都下调HBV复制，然而pCI-AlAT和pCI-BCPmiRNA载体沉默HBV限于Huh7细胞。这些数据证实了表达载体可组织特异性表达miRNA穿梭。而且在Huh7细胞中由pCI-AlAT和pCI-BCP表达载体实现的下调水平相当于由更强大CMV表达盒所实现的。实施例9:多聚体抗HBVpri-miR31穿梭质粒的设计和增殖原理。通过生成能同时靶向多个HBV位点的盒应该可改善病毒复制的沉默效力。而且，作用于病毒不同源位点的RNAi效应子的组合会限制病毒逃逸的几率并抵抗抗HBVpri-miR穿梭的抑制效力。在图19中显示了产生此处用于针对HBV的三聚体pri-miR盒的盒示意图。miR衍生抗HBV序列。通过成对正向和反向低聚核苷酸的引物延伸生成了含有指导序列靶HBV调配物1775-1797(靶5)(SEQIDNO:3(135))、1678-1700(耙8)(SEQIDNO:7(137))和1574-1596(耙9)(SEQIDNO:8(138))的pre-miR-31模拟物的编码DNA。采用亚磷酰胺化学法(InqabaBiotech,南非)合成了编码pre-miR序列的低聚脱氧核苷酸。如PCR采用Promega'sPCRMasterMix(Promega，WI，USA)—样进行引物延伸。热循环条件如下94°C5分钟起始变性，之后94°C10秒变性，5(TC10秒退火并在72t:延伸10秒循环3030次，以及72°C10分钟的最终延伸步骤。编码抗HBVmiR穿梭的低聚核苷酸序列是Pre-miR-31/5正向IDNO:78)Pre-miR-31/5反向QIDNO:79)Pre-miR-31/8正向IDNO:80)Pre-miR-31/8反向QIDNO:81)Pre-miR-31/9正向IDNO:82)Pre-miR-31/9反向QIDNO:83)将引物延伸产物进行标准琼脂糖凝胶电泳(1%凝胶)，切离并采用Qiagen'sMinEluteTM凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)从凝胶切块中提取。以大约lOOng的纯化扩增子作为模板并以具有以下序列的通用正向和反向pri-miR-31引物进行扩增。Pri-miR-31正向5'-GCTAGCCATAACAACGAAGAGGGATGGTATTGCTCCTGTAACTCGGAACTGGAGAGG-3，(SEQIDNO:84)Pri-miR-31反向5'-AAAAAAACTAGTAAGACAAGGAGGAACAGGACGGAGGTAGCCAAGCTGCTGTCAGACAGGAAGC-3'(SEQIDNO:85)将纯化DNA片段连接到pTZ-57R/T(InsTAcloneTMPCR克隆试剂盒，Fermentas，Hanover，MD，USA)上，以分别生成pTZ-57R/Tpri-miR-31/5和pTZ-57R/Tpri_miR-122/5。按照供应商的说明进行连接和选择。简而言之，在22t:温育2-3小时进行连接反应。以连接混合物转化化学感受态大肠杆菌，并将其涂布在氨苄青霉素、IPTG、X-gal阳性的LB琼脂平板上，将平板在37t:温育过夜。按照标准双脱氧链终止法(InqabaBiotechnology,南非)对插入阳性克隆及其相反方向(相对于P-半乳糖苷酶基因)进行测序。通过将pri-miR-31/5、-31/8和31/9序列组合插入CMV立即早期启动子增强子下游而形成由RNA聚合酶II启动子表达的多聚体pri-miR穿梭盒(图19)。将该盒设计成包括在5'-3'顺序上所有可能组合的单个复制所有三个单聚体pri-miR模拟物。从而生成总6个三聚体盒(pri-miR-31/5/8/9、-5/9/8、-8/5/9、-8/9/5、-9/5/8和-9/8/5)。为生成pri-miR-31/5/8/9盒，首先以Nhel和EcoRI从pTZpri-miR-31/8上切离pri_miR-31/8，并将其连接到以Spel禾PEcoRI消化的pTZpri-miR-31/5上以构建pTZpri-miR-31/5/8。其后，以Nhel和EcoRI从pTZpri-miR-31/9上切离编码pri-miR-31/9的序列，并将其连接到以Spel和EcoRI消化的pTZpri-miR-31/5/8上。成功的连接生成pTZpri_miR-31/5/8/9。通过类似克隆策略生成其他5个三聚体盒。将以Nhel和Xbal切离的三聚体pri_miR-31盒克隆到pCI-neo(Promega，WI，USA)的等效位点中以生成基于CMVpri-miR-31多聚体质粒Northern印迹分析以10iigRNAi效应子质粒转染汇合率为40%的10cm直径培养皿2天之后收集HEK283细胞，并采用Tri试剂按照供应商说明提取总RNA(Sigma，MI，USA)。在尿变性12.5%聚丙烯酰胺凝胶中分辨30gRNA，并将其印染到尼龙膜上。印染是杂交到三个与抗HBV指导5、8和9互补的DNA低聚核苷酸上。以[a-32p]ATP和T4多聚核酸激酶标记探针的5'端。采用标准程序纯化后，将它们与固定RNA杂交，并曝光于X光胶片，然后剥离并再探查。以与U6snRNA互补的低聚核苷酸序列作为等量负载的细胞RNA的对照。探针低聚核苷酸序列是以前和上文描述过pCH-9/3091质粒[42]。如上所述进行Huh7和HEK293系的培养和转染[39]。如上所述采用Monolisa(ELISA)免疫试剂盒(BioRad，CA，USA)进行HBsAg的测量。以10:1禾P1:l比例的U6shRNA5载体和pCH9/3091进行试验，但对于所有其他组合，RNAi表达载体与pCH9/3091的比例是10:1。采用12孔培养皿格，细胞接受100ngpCH9/3091和liigRNAi效应子质粒。组成性产生eGFP[43]的质粒载体也包括在每次共转染中，并通过荧光显微镜证实相等的转染效率。评估多聚体miR穿梭介导的沉默。为测定miR表达载体对报告基因沉默的影响，将含独立靶序列的二元荧光素酶报告质粒(psi-CHECK-5T、psi-CHECK-8T和psi-CHECK-9T)与pri-miR穿梭表达载体一起进行转染。组成性产生eGFP.[43]的质粒载体也包括在每次共转染中，以利用荧光显微镜证实相等的转染效率。以二元荧光素酶分析试剂盒(Promega，WI，USA)并采用Veritas二元注射光度计(TurnerBioSystems，CA，USA)测量Renilla和萤火虫荧光素酶活性。统计分析。采用student's配对双尾t-检验进行统计学显著性差异的分析。以Gr即hPadPrism软件包(GraphPadSoftwareInc.，CA，USA)进行计算。以三聚体miR表达盒转染的细胞的RNA的Northern印染分析以探针探查与每个指导HBV靶点5、8和9互补的指导序列后从以三聚体表达盒转染的细胞中提取RNA进行Northern印染杂交，如图20、21和22所示。在从以每个三聚体pri-miR表达盒转染的细胞提取的RNA中可检测到耙向HBV位点5的推定指导序列(图20)。检测到的条带的大小在长度上大约是20-22个碱基，这表明了对表达序列存在异源加工。重要地，指导序列的浓度约等于每个三聚体盒且pri-miR5序列的位置不影响加工。除成熟加工指导链之外，也可检测到更大分子量的前体，这表明了转录物的不完全加工。指导靶向HBV序列8的探针探查也揭示了大约21nt长度的待加工指导(图21)。不同于pri-miR5衍生指导，成熟序列的大小是均匀的，在Northern印染分析中检测不到不完全加工前体。重要地，浓度等于除含CMVmiR5-9-8和CMVmiR9_8_5盒的质粒之外以每个三聚体盒转染的细胞。这些数据显示了当紧邻pri-miR9RNA下游时指导8序列的加工是折衷的。采用与序列9互补的探针的类似northern印染杂交分析揭示了在所有分析样品中都存在加工指导序列(图22)。但是若观察的与探针5和8杂交信号相比时浓度明显下降。检测的指导9序列浓度也有变化，可在以CMVpri-miR9、CMVpri-miR5-9-8和CMVpri-miR9-8-5转染的细胞中检测到的量产生了最高浓度的指导9耙。然而即使有，这些变化的显著性也是不明显的。评估多聚体miR表达盒的效力为评估下调的效力，对以表达pri-miR表达盒的质粒和在Renilla荧光素酶开放式读码框下游插入单个HBV耙点的psiCHECK衍生载体共转染的细胞裂解物进行二元荧光素酶试验(图23)。对照(模拟处理细胞)是以报告基因质粒和无pri-miR穿梭的骨架pCIneo载体tat共转染。利用Reni1la与组成性表达的萤火虫荧光素酶活性的计算比值测定下调效力，并将对照组值标准化为l。图23显示了由此分析获得的数据。当与psi-CHECK-5T共转染时所有6个三聚体pri-miR穿梭盒都能够明显沉默Renilla荧光素酶活性。实现了大约85-90%的下调效力。当采用psi-CHECK-8T耙载体时，6个三聚体表达质粒的4个实现了有效沉默(大约90%)。然而CMVmiR5-9-8和CMVmiR9_8_5盒不能实现沉默，Renilla荧光素酶活性等于模拟处理细胞的活性。重要地，这个观察与Northern印染分析的结果一致，这显示了针对靶点8的指导序列没有效力(图21)。因此如所预期的，低的RNAi效应子生成效力与沉默不足直接相关。当估计共转染对来自psi-CHECK-9T质粒的Renilla荧光素酶活性的影响时，效力低于以psi-CHECK-5T和psi-CHECK-8T靶报告所实现的。这些细胞的Renilla荧光素酶活性大约为模拟处理细胞的45-75%。这又与Northern印染的数据一致，33其中与序列5和8指导相比，加工指导序列的量是下降的(图22)。而且，以CMVmiR5-9-8和CMVmiR9-8-5载体实现了最佳沉默(大约75%)，其也是可生成最大量的成熟指导9序列的盒(图20)。还测定了多聚体pri-miR表达盒对培养物中转染肝细胞分泌HBsAg的影响(图24)。每个三聚体盒都可以抑制转染细胞分泌HbsAg，且可实现的下调为〉90X。这个高效力的下调几乎等于模拟处理细胞的本底信号。因此，在培养细胞中，三聚体盒可以有效沉默HBV复制的标记。獵综合地，这些数据证实了三聚体pri-miR表达盒能够生成单个抗HBV指导序列，该序列含HBV靶点的报告基因构建体的有效沉默子。指导序列生成的效率是不均一的，可能取决于miR穿梭(例如由pri-miR9穿梭实现较低的加工和沉默)以及外周pri-miRs(例如当紧邻primiR9序列下游时实现更低的pri-miR8沉默)的固有序列特征。实施例10:由外源病毒基因HCV5'UTR转录物的下调实现的基于miR31的发夹设计材料和方法克隆到pTAG-A的HCV5'UTR区的DNA序列是由英国格拉斯哥大学病毒研究所的RichardM.Elliot教授捐赠的。pGL3-Basic、二元Glo荧光素酶分析系统、和pGEM-TEasy载体试剂盒是来自Promega，USA。BenchToplkbDNAladder、InsTAclonePCR克隆试剂盒和PCRMasterMix(2X)是来自立陶宛Fermentas。低聚核苷酸引物是来自IDT，USA。限制性内切酶PstI、EcoRI、Xhol和Xbal是来自NewEnglandBiolabs，USA。a-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、氨苄青霉素、阳离子脂质体200()TM是来自Sigma，區。QIApr印Spin小量制备试剂盒和QIAGENEndofree大量制备试剂盒是来自德国Qiagen。RPMI、FCS、青霉素/链霉素和OptiMEM是来自Gibco，UK。Nucleospin试剂盒是来自德国Machery-Nagel。Veritas微板光度计是来自T證erBiosystems，USA。HCV5'UTR靶序列和萤火虫荧光素酶编码序列的亚克隆以质粒构建体pTAG-A作为模板，正向引物F5'UTRXhoI(ATTACTCGAGTTCACGCAGAAAGCGTC;SEQIDNO:96)和反向引物R5，UTREcoRI(ATTAGAATTCGAACTTGACGTCCTGTGG;SEQIDNO:97)通过PCR扩增HCV5'UTR区(SEQIDNO:34)的DNA序列。F5'UTRXhoI和R5'UTREcoRI由4个间隔子5'-末端核苷酸、ATTA、分别识别用于以后定向克隆和筛选目的的Xhol和EcoRI限制性内切核酸酶的6-nt序列，和分别与其中包括了第一个351nt的HCV转录物的HCV5'UTR区5'禾P3'端互补的序列所组成。类似地以pGL-3-Basic为模板，正向引物FLucEcoRI(ATTAGAATTCATGGAAGACGCCAAAAAC;SEQIDNO:98)和反向引物RLucXbal(ATTATCTAGATTACACGGCGATCTTTCC;SEQIDNO:99)扩增萤火虫荧光素酶的编码区。FLucEcoRI和RLucXbal是由4个间隔子5'-末端核苷酸、ATTA、分别识别用于以后定向克隆和筛选目的的EcoRI和Xbal限制性内切核酸酶的6-nt序列，和分别与其中包括了1653nt全长的萤火虫荧光素酶编码序列的5'和3'端互补的序列所组成。PCR反应在50ii1终体积的溶液中进行，该溶液含有模板DNA[2ii1，100ng]、正向引物[ly1100iiM]、反向引物[lii1100iiM]、PCRMasterMix(2X)[25ii1]。PCR反应条件为94°C2分钟；94。C30s，55。C1分钟，72。C2.5分钟，30个循环；72。C10分钟。通过如实施例1所述的琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的长度。分辨BenchToplkbDNAladder作为分子标记。在UV射线下显现分辨好的PCR产物。采用pGEM(D"TEasy载体试剂盒，在终体积ioyl的含有2x快速连接缓冲液]和T4连接酶[3U，liU]连接反应液中，将来自HCV5'UTR和萤火虫荧光素酶PCR反应的PCR产物[1ii1]连接到pGEM-T[lii1]上以分别产生pGEM-T-UTR和pGEM-T-LUC。将连接反应液在15t:温度过夜之后转化到[5iU]感受态埃希式大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a[50y1]。将转化反应液[55y1]在冰上温育30分钟，并在42。C热激2分钟，冰上温育2分钟之后涂布在含0.lmg/ml氨苄青霉素并散布有a_D_吡喃半乳糖苷(X-gal)[40iil，在匿S0的20mg/ml]的2xYT肉汤琼脂平板上。根据标准方案制备感受态大肠杆菌DH5a细胞。将平板在37。C温育16小时。采用实施例1所述的QIApr印Spin小量制备试剂盒通过改良标准碱性裂解法从显示为pGEM-T-UTR和pGEM-T-LUC转化的白色克隆的转化株大肠杆菌培养物中提取推定质粒DNA。然后在供应商提供的缓冲液中以实施例1所述的5UEcoRI限制性酶切筛选推定质粒DNA。将显示出预期长度的DNA片段的质粒DNA用于进一步的克隆。克隆HCV5，UIR耙表达构建体(pCineoUTRLUC)批量(bulk)限制内切核酸酶消化制备pGEM-T-UTR、pGEM-T-LUC和pCineoHBX质粒DNA。以Xhol和EcoRI限制pGEM-T-UTR，以EcoRI和Xbal限制pGEM+LUC，并以Xhol和Xbal限制pCineoHBX。利用pCineoHBX替换pCineo以更好地分离双限制性pCineo载体片段。体积消化液是由质粒DNA[60iil，200ng/ia]、10XEcoRI缓冲液，、第一种酶[20U，4iU]、第二种酶[20U，4iU]和水[22iU]组成的。将批量(bulk)消化液在37"温度1.5小时，如上通过琼脂糖凝胶电泳分辨和凝胶纯化。对于凝胶纯化将适宜条带从凝胶中切离并采用Nucleospin试剂盒提取。简而言之，将缓冲BT[300iU]添加到凝胶切片中并将琼脂糖样品在5(TC温育IO分钟且频繁颠转。将融化的琼脂糖样品加载至Nucleospin柱中并在12000xg离心30秒。然后以缓冲NT3[700将Nucleospin柱离心洗涤两次。通过加入洗脱缓冲液NE[50iil，5mMTris-HCl，pH8.5]之后在12000xg离心1分钟以洗脱结合DNA。在终体积为21ii1的含有2x快速连接缓冲液[10ii1]和T4连接酶[3U，1yl]的连接反应液中按l:3:3比例的5'UTR:LUC:pCineo[liil:3iU:3iU]将洗脱DNA片段连接在一起。将连接反应液在15t:温育过夜并如上转化到感受态大肠杆菌DH5a。如上以在lxBufferTango[3.3mMTris乙酸、pH7.9at37°C、lmM醋酸镁、6.6mM醋酸钾、0.lmg/mlBSA]的5USphl通过限制性酶切提取和筛选推定质粒DNA。批量DNA的制备如实施例1所示。sh260和miR260的电子(insilico)设计以miR-30(图25)和miR-31(图26)[41]的结构作为基础设计耙向HCV5'UTR的miR-30样(SEQIDNO:35(164))和miR-31样(SEQIDNO:1(133))发夹。简而言之，发夹设计途径如下将在Yokotaetal.(2003)[48]中公开为"siRNA331"的siRNA改造成HCV链5a特异性的sh30-260和miR31_260设计以分别产生sh260和miR31_260，采用标准生物信息学软件电子定位(insilico)使错配发生在正义链中。将U6启动子起始序列的鸟嘌呤碱基电子定位插入miR-30样(sh260，图27，SEQIDNO.36(165))和miR-31样(miR260，图28，SEQIDNO.37(166))发夹的开始且在3'端插入由一排六个尿嘧啶碱基组成的终止序列。将sh260和miR260的RNA序列转换成相应的DNA序列并电子定位插入到U6启动子DNA序列的下游以形成sh260和miR260表达盒。克隆sh260和miR260表达构建体(pTz57R-sh260和pTz57R-miR260)在两步PCR反应中将U6启动子的DNA序列进行PCR扩增，期间sh260或miR260的DNA序列被插入到U6启动子的下游。对于sh260:在所有PCR步骤中使用与24_nt的U6启动子5'端互补的正向引物，FU6(ATTAGAATTCAAGGTCGGGCAGGAAGAG)(SEQIDNO:100)和4个间隔子5'-末端核苷酸、ATTA。在第一轮PCR中，使用反向引物，RU6-sh260-l(ACCCCCATCTGTGGCTTCACAGGGTGCACGGGATCTACGAGACCTTCGCCGGTGTTTCGTCCTTTCC)(SEQIDNO:101)。在第二轮PCR中，使用反向引物RU6-sh260-2(GTCGACAAAAAAGCAGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCCCCATCTGTGGCTTCACAGG)(SEQIDNO:102)。对于miR260:在所有PCR步骤中使用与24_nt的U6启动子5'端互补的正向引物，(ATTAGAATTCAAGGTCGGGCAGGAAGAG)(SEQIDNO:103)，和4个间隔子5'-末端核苷酸、ATTA。在第一轮PCR中，使用反向引物，RU6-miR31-260-1(GCTTCCCAGTTCAAGAGGTCTCGTAGACCGTGCACTCCTCTCCAGTTCCGAGTTACAGCGGTGTTTCGTCCTTTCC)(SEQIDNO:104)。在第二轮PCR中，使用反向引物，RU6_miR31-260-2(GTCGACAAAAAAGCTGCTGTCCAGACAGGAAAGATGTGCATGGTATACGAGACCAGCTTCCCAGTTCAAGAGGTCTC)(SEQIDNO:105)。第一次PCR反应在50ii1终体积中含有pTz57-U6模板[1iU，100ng];FU6引物[lii16mM);反向引物[2ii16mM];dNTPs[lii1lOOmM];GoTaqPCR体系酶;和GoTaq⑧PCR体系10x缓冲液[5yl]。PCR反应条件是94°C，2分钟；94°C30秒，55°C1分钟，72t:2.5分钟，30个循环；72°C10分钟。除了替换模板和反向引物之外，第二次PCR反应含有与第一次相同的试剂。以l微升的第一次PCR反应混合液作为模板采用相同的正向引物FU6和第二种反向引物在第二轮PCR进行扩增。通过琼脂糖凝胶电泳确认来自第二轮PCR的PCR产物长度并将其连接到pTz57R/T上。简而言之，将第一和第二轮PCR反应的PCR产物[5iU]加入琼脂糖凝胶上样缓冲液[5iil，30^甘油v/v，0.25%w/v溴酚蓝]中，并在TBE缓冲液[45mMTris，45mM硼酸盐，ImMEDTA，pH8.3]中的含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶[50ml，0.8%w/v]中在100V下分辨2小时。分辨以Pstl消化的ADNA作为分子标记。在UV射线下显现分辨好的PCR产物。通过如实施例1所述的EcoRI限制性酶消化筛选推定pTz57R-sh260转化物和推定pTz57R-miR260转化物，并如前所述通过琼脂糖凝胶电泳分辨消化片段。还采用FU6和RU6-sh260-2在如上所述扩增条件下通过PCR乘PCR扩增所提取的质粒DNA确定推定pTz57R-sh260。采用QIAGENEndofree大量制备试剂盒按照供应商说明制备纯化的pTz57R-sh260和pTz57R_miR260。培养Huh-7细胞将人肝瘤细胞系Huh-7在增湿空气中于37t:，5X0)2下维持在添加了10%胎牛血清(FCS)、青霉素(100UmL—0和链霉素(100UmL—0[完全培养基]的RPMI培养基中。通36常每2-3天将细胞进行传代培养并维持在6cm培养皿中。所有溶液在使用前预热。在37t:下将细胞在lx胰蛋白酶/EDTA中胰蛋白酶作用3-5分钟。通过加入等体积的含10%FCS的DMEM终止胰蛋白酶反应，且在台式离心机中以2000rmp离心2分钟收集细胞。将细胞团重悬在完全培养基[5ml]中，该悬浮液用于在6cm培养皿中种入[lml]新鲜完全培养基[15ml]。以pCineoUTRLUC、pCMV-Ren、pTz57R-sh260和pTz57R-miR260共转染HuH-7细胞，并通过光度计测量分析HCV5'UTR下调采用阳离子脂质体2000按照供应商的说明在播种汇合率为60%的6孔培养板中以pCineoUTRLUC、pCMV-Ren禾PpTz57R-sh260或pCineoUTRLUC、pCMV-Ren和pTz57R-miR260，或pCineoUTRLUC、pCMV-Ren和pTz57R-miR118(以低效力表达耙向丙型肝炎病毒的miR31发夹的表达构建体，而此处用作阴性对照)瞬时共转染HuH-7细胞三份。pCMV-Ren用于表达Renilla荧光素酶作为内效率的转染对照。每次转染都含有pCineoUTRLUC[100ng]、pCMV-Ren[50ng]和pTz57R构建体[1Pg]。质粒DNA:每次反应按如下制备阳离子脂质体2000复合溶液将预温的阳离子脂质体2000[每次反应4i！1]加入到OptiMEM[每次反应150ii1]，并使其在室温下温育15分钟。将质粒DNA[每次反应1.06iil总DNA]加到OptiMEM[每次反应150y1]，并使其在室温下温育15分钟。然后将阳离子脂质体2000和质粒DNA溶液组合，通过吸液温和地混合并使其在室温下复合15分钟以发生转染反应。将种入汇合率为60%的12孔培养皿以PBS进行洗涤。然后将每个分离的转染反应液加至孔内并在增湿空气，37t:和5%C02中温育2小时。然后移除转染反应液，添加完全培养基[2ml]，将培养皿在增湿空气，37t:和5%C02中温育48小时。为评估HCV5'UTR下调，采用二元GloTM荧光素酶试验系统评估了荧光素酶的表达。温育48小时之后，以PBS将转染细胞洗涤三次之后，在细胞中直接添加lxPLB缓冲液[100ia]，接着在室温下温和振荡30分钟。然后将细胞裂解物[20iU]从每个转染孔分散至白色不透明的光度计微孔板上。采用Veritas微孔板光度计进行光度测量。P和M进样器分别注入荧光素酶试验试剂II(LARII)和终止和Glo试剂。微孔板置于光度计上，并在每孔中进样LARII[100yl]之后以2秒预测量延迟和10秒整合读取光度值以检测萤火虫荧光素酶。用M进样器中往每孔中进样终止和Glo试剂[100iU]，并以2秒预测量延迟和10秒整合读取光度值以检测renilla荧光素酶。重复实验。通过计算萤火虫/renilla光度比并标准化由pTz57R-sh260和pTz57R-miR260转染获得的与pTz57R-miR118转染获得的比值以分析读数。采用StudentsT-检验计算统计差异。结果和讨论克隆HCV5，UTR耙表达构建体(pCineoUTRLUC)HCV5'UTR和萤火虫荧光素酶PCR扩增成功地产生了346bp禾P1653bpDNA产物(图29A，第2和3道)。PCR产物被成功地连接到如通过限制性内切核酸酶消化所示的pGEM-T上(图29B和29C)。以EcoRI限制pGEM+UTR和pGEM+LUC分别产生了3015bp和346bp(图29B，第3-12道)，3015bp和1653bp(图29C，第4、5、7_9和11道)的预期片段。为pGEM-T-UTR选择克隆2并为pGEM-T-LUC选择克隆3以进一步克隆。HCV5'UTR和萤火虫荧光素酶DNA被成功地亚克隆到pCineo以产生pCineoUTRLUC(图30)。由克隆l-5、8-12、17-19、21和22中提取的质粒DNA的Sphl-限制性酶切产生了4593bp、2026bp和779bp的预期片段(图30，，第3-7、10-14、19-21和23-24道)。选择克隆1。sh260和miR31_260的设计和pTz57R_sh260和pTz57R-miR31260的克隆通过在线软件程序mF0LD[49]预测，miR_30[41](图25)的预测结构未展现出类似于sh260(图27，SEQIDNO:36)的预测结构。但是，miR_31(图26)的预测结构展现出类似于所设计的miR260(图28，SEQIDNO:4)的结构，这显示了miR260具有典型的miR31二级结构。sh260和miR260表达构建体的克隆(pTz57R-sh260和pTz57R_miR260)pTz57R-sh260:通过琼脂糖凝胶电泳确定了两步PCR反应的PCR产物长度，第一轮PCR反应的产物是大约347bp(图31A，第2道)而第二轮PCR反应的产物是大约486bp(图31A，第3道)。对于克隆1-4和6，推定pTz57R-sh260的PCR筛选成功地产生了486bp的PCR产物(图31B，第2-5和7道)。以SalI从克隆3中消化推定pTz57R-sh260产生了2S86bp和386bp的预期片段(图31C，第2道)。因此选择克隆3。pTz57R-miR260:通过琼脂糖凝胶电泳确定了两步PCR反应的PCR产物长度，第一轮PCR反应的产物是大约323bp(图32A，第8道)而第二轮PCR反应的产物是大约377bp(图32B，第8道)。以SalI从克隆1中消化推定pTz57R-miR260产生了2886bp和377bp的预期片段(图32C，第1道)。因此选择克隆l。miR260表达比sh260产生了更好的HCV5'UTR下调为测定sh260和miR260是否下调HCV5'UTR区的表达，我们将5'UTR融合到萤火虫荧光素酶指示基因中。当与阴性对照的miR118相比时，sh260(p=0.000562004)和miR260(p=9.96473E-05)都可以明显地下调指示基因的表达(图33)，但是相对sh260(26%)，miR260实现了更强的下调(50%)。因此发现基于miR-31设计的miR260在耙向HCV5'UTR转录物中比sh260更有效。当参照特定其实施方式具体描述本发明时，本领域技术人员应认识到对本发明所作的各种变更，修改和其他变化都未偏离本发明的实质和范围。因此权利要求覆盖或包含了所有这些修改，变更和/或变化。参考文献1.MWassenegger，TPelissier(1998):AmodelforRNA-mediatedgenesilencinginhigherplants.PlantMolBiol37:349.2.HNgo，CTschudi，KGull，EUllu(1998):Double-strandedRNAinducesmRNAdegradationinTrypanosomabrucei.ProcNatlAcadSciUSA95:14687.3丄Misquitta，BMPaterson(1999)-TargeteddisruptionofgenefunctioninDrosophilabyRNAinterference(RNA-i):arolefornautilusinembryonicsomaticmuscleformation.ProcNatlAcadSciUSA96:1451.4.NJCaplen，JFleenor，AFire，RAMorgan(2000):dsRNA-mediatedgenesilencinginculturedDrosophilacells:atissueculturemodelfortheanalysisofRNAinterference.Gene252:95.5.YXLi，MJFarrell，RLiu，NMohanty，MLKirby(2000):Double-strandedRNAinjectionproduces皿llphenotypesinzebrafish.DevBiol217:394.386.HAkashi，MMiyagishi，TYokota，TWatanabe，THino，KNishina，MKohara，TK.(2005):EscapefromtheinterferonresponseassociatedwithRNAinterferenceusingvectorsthatencodelongmodifiedhairpin—RNA.MolecularBioSystems1:382.7.EMMaine(2000):Aconservedmechanismforpost-transcriptionalgenesilencingGenomeBioll:1018.8.GJHarmon(2002)長interference.Nature418:244.9.GHutvagner，PDZamore(2002):AmicroRNAinamultiple-turnoverRNAienzymecomplex.Science297:2056.10.SMElbashir，WLendeckel，TTuschl(2001):RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs.GenesDev15:188.11.MJiang，JMilner(2002)-SelectivesilencingofviralgeneexpressioninHPV_positivehumancervicalcarcinomacellstreatedwithsiRNA，aprimerofRNAinterference.Oncogene21:6041.12.XZou，DRay，AAziyu，KChristov，ADBoiko，AVGudkov，HKiyokawa(2002):Cdk4disruptionrendersprimarymousecellsresistanttooncogenictransformation,leadingtoArf/p53_independentsenescence.GenesDev16:2923.13.AJHamilton,DCBaulcombe(1999):AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants.Science286:950.14.EBernstein,AACaudy，SMHammond,GJHarmon(2001):RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference.Nature409:363.15.SMElbashir，JHarborth，WLendeckel，AYalcin，KWeber，TTuschl(2001):Duplexesof21—nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature411:494.16.TDalmay，RHorsefield，THBraunstein，DCBaulcombe(2001):SDE3encodesanRNAhelicaserequiredforpost—transcriptionalgenesilencinginArabidopsis.EmboJ20:2069.17.ANykanen，BHaley，PDZamore(2001):ATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathway.Cell107:309.18.ASmardon，JMSpoerke，SCStacey，MEKlein，NMackin，EMMaine(2000):EG0—1isrelatedtoRNA—directedRNApolymeraseandfunctionsingerm_linedevelopmentandRNAinterferenceinC.elegans.CurrBiol10:169.19.AFire，SXu，MKMontgomery,SAKostas，SEDriver,CCMello(1998):Potentandspecificgeneticinterferencebydouble—strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391:806.20.HKawasaki,KTaira(2004)-InductionofDNAmethylationandgenesilencingbyshortinterferingRNAsinhumancells.Nature.21.JGil，MEsteban，DRoth(2000):InvivoregulationofthedsRNA-dependentproteinkinasePKRbythecellularglycoproteinp67.Biochemistry39:16016.22.MRPlayer,PFTorrence(1998):The2-5Asystem:modulationofviralandcellularprocessesthroughaccelerationofRNAdegradation.PharmacolTher78:55.23.MKumar，GGCarmichael(1998):AntisenseRNA:functionandfateofduplexRNAincellsofhighereukaryotes.MicrobiolMolBiolRev62:1415.24.SAgrawal，QZhao(1998):Antisensetherapeutics.Curr0pinChemBiol2:519.25.MMiyagishi，KTaira(2002):U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3'overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechno120:497.26.NSLee，TDohjima，GBauer，HLi，MJLi，AEhsani，PSalvaterra，JRossi(2002)-ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-lrevtranscriptsinhumancells.NatBiotechno120:500.27.TRBrummelkamp，RBernards,RAgami(2002):AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science296:550.28.PJPaddison，AACaudy，EBernstein,GJHa翻n，DSConklin(2002):ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.GenesDev16:948.29.GSui，CSoohoo，BAffarel，FGay，YShi，WCForrester(2002):ADNAvector—basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA99:5515.30.JYYu，SLDeRuiter，DLTurner(2002):RNAinterferencebyexpressionofshort—interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA99:6047.31.CPPaul,PDGood,IWi證，DREngelke(2002)-EffectiveexpressionofsmallinterferingRNAinhumancells.NatBiotechnol20:505.32.MTMcManus，CPPetersen,BBHaines，JChen，PASharp(2002):Genesilencingusingmicro_RNAdesignedhairpins.Rna8:842.33.AGrishok，AEPasquinelli，DConte，NLi，SParrish，IHa，DLBaillie，AFire，GRuvkun，CCMello(2001):GenesandmechanismsrelatedtoRNAinterferenceregulateexpressionofthesmalltemporalRNAsthatcontrolC.elegansdevelopmentaltiming.Cell106:23.34.JBeck，MNassal(1995)-Efficienthammerheadribozyme-mediatedcl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27所述的载体，该载体是病毒或非病毒载体。29.—种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求l-28任意一项所述的表达盒或载体。30.—种治疗或预防肝炎的组合物，该组合物包括根据权利要求l-26任意一项所述的表达盒或根据权利要求27或28所述的载体和药学可接受佐剂和/或载体。31.根据权利要求1-26任意一项所述的表达盒或根据权利要求27或28所述的载体在制备用于治疗或预防肝炎方法的药物的方法中的应用。32.—种抑制或沉默肝炎病毒基因表达的方法，该方法包括将有效剂量的根据权利要求1-26任意一项所述的表达盒或根据权利要求27或28所述的载体给药至患者。33.—种抑制或沉默肝炎病毒基因表达的方法，该方法包括以下步骤(i)将根据权利要求27或28所述的载体导入宿主细胞或生物体中；禾口(ii)表达包含在根据权利要求1-26任意一项所述的表达盒内的人工pri-miR。34.—种编码模拟天然存在miR序列的人工pri-miR序列的DNA序列，其中所述人工pri-miR序列不同于所述天然存在pri-miR序列在于所述天然存在pri-miR序列的指导序列和指导的互补序列被靶向肝炎病毒的序列所置换，且当其被PolII启动子所转录时会造成肝炎病毒基因表达的沉默或抑制。35.根据权利要求34所述的DNA序列，其中所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。36.根据权利要求34或35所述的DNA序列，其中所述天然存在miR序列选自miR_30、miR-31和miR-122。37.根据权利要求34-36任意一项所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列选自以下SEQIDNOs中的任意一序列11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、38、39和106;与其具有至少90%的序列同一性的序列；与任意一项上述序列互补的核酸序列；与任意一项上述序列特异性杂交的核酸序列；或嗜肝DNA病毒的同源序列。38.根据权利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:11或SEQIDNO:109，或与其具有至少90%序列同一性的序列。39.根据权利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:12或SEQIDNO:110，或与其具有至少90%序列同一性的序列。40.根据权利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:13或SEQIDNO:lll，或与其具有至少90%序列同一性的序列。41.根据权利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:14或SEQIDNO:112，或与其具有至少90%序列同一性的序列。42.根据权利要求37所述的DNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:106或SEQIDNO:171，或与其具有至少90%序列同一性的序列。43.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQID冊3或与其90%相同的序列。44.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQID冊4或与其90%相同的序列。45.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQID冊7或与其90%相同的序列。46.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQIDNO:8或与其90%相同的序列。47.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQIDNO:9或与其90%相同的序列。48.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQID冊10或与其90%相同的序列。49.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQIDNO:36或与其90%相同的序列。50.根据权利要求34-37任意一项所述的DNA序列，其是SEQID冊37或与其90%相同的序列。51.—种模拟天然存在miR序列的人工pri-miR序列，其中所述人工pri-miR序列不同于所述天然存在pri-miR序列在于所述天然存在pri-miR序列的指导序列和指导的互补序列被靶向肝炎病毒的序列所置换，且当其被PolII启动子所转录时会造成肝炎病毒基因表达的沉默或抑制。52.根据权利要求51所述的RNA序列，其中所述肝炎病毒是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。53.根据权利要求51或52所述的RNA序列，其中所述天然存在miR序列选自miR-30、miR-31和miR-122。54.根据权利要求51-53任意一项所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列选自以下SEQIDN0s中的任意一序列141、142、143、144、145、146、146、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、167、169和172的任意一项；与其具有至少90%的序列同一性的序列；与任意一项上述序列互补的核酸序列；与任意一项上述序列特异性杂交的核酸序列；或嗜肝DNA病毒的同源序列。55.根据权利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDN0:141，或与其具有至少90%序列同一性的序列。56.根据权利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDN0:142，或与其具有至少90%序列同一性的序列。57.根据权利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:143，或与其具有至少90%序列同一性的序列。58.根据权利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDN0:144，或与其具有至少90%序列同一性的序列。59.根据权利要求54所述的RNA序列，其中所述肝炎靶序列是SEQIDNO:172，或与其具有至少90%序列同一性的序列。60.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQID冊135或与其90%相同的序列。61.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQID冊136或与其90%相同的序列。62.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQID冊137或与其90%相同的序列。63.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQID冊138或与其90%相同的序列。64.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQIDNO:139或与其90%相同的序列。65.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQIDNO:140或与其90%相同的序列。66.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQIDNO:165或与其90%相同的序列。67.根据权利要求51-54任意一项所述的RNA序列，其是SEQIDNO:166或与其90%相同的序列。全文摘要本发明涉及肝炎基因表达的抑制。具体而言，本发明涉及采用RNA序列抑制乙型和丙型肝炎病毒复制的方法。含有来自于内源微RNAs(miRs)的DNA序列的表达盒被用于所述方法，其通过PolII启动子转录，然后被加工成产生靶肝炎病毒序列(RNAi效应子序列)特异性的序列。RNAi效应子序列可靶向所选肝炎病毒序列造成肝炎病毒基因的基因沉默或转录抑制。在体外或体内可将表达盒递送至宿主细胞。本发明还要求保护含有所述表达盒的药物组合物。文档编号A61K31/713GK101755049SQ200880025425公开日2010年6月23日申请日期2008年5月29日优先权日2007年5月29日发明者塔努沙·奈杜,维多利亚·玛丽·朗肖,阿卜杜拉·伊利,阿巴思诺特·帕特里克,马克·索尔·温伯格申请人:约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学