专利名称：：木豆叶中木豆芪酸及球松素在制备抗疱疹病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，具体涉及木豆叶中木豆芪酸及球松素的新用途。
背景技术：
：木豆[ay'flm^ca^m(L.)Millsp.]，豆科常绿植物，直立矮灌木，高l-3m，原产于印度，目前全世界种植面积约520万公顷，主要分布在亚洲、非洲和南美洲(赵真忠，2003)。又名鸽子豆、树黄豆等，是一种民间用药。木豆主要有清凉、消热、解毒、止痛止血、抑菌消炎等作用，还可用于治疗外伤、烧伤、感染、褥疮和抗菌消炎等(刘中秋等，1998;孙绍美等，1995)。此外，在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国还有利用木豆提取物制剂治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮肤病、烧伤、溃疡、肿瘤等疾病(AbbiwDK.，1990;DukeJA.etal，1994;MillikenW.，1997;GroverJK.,2002)，疗效显著。我国临床组方用于治疗股骨头坏死等症。已有众多文献介绍从木豆叶中提取活性成分用于制药，如海南省人民医院根据民间经验，用木豆治疗外伤、烧伤感染和褥疮等已经取得了较好的疗效(刘中秋等，1998)。孙绍美等(1995)研究木豆叶有效成分木豆素的药理作用表明木豆素制剂具有明显的抑制毛细血管的通透性、镇痛、消炎作用，毒性小，在有效剂量范围内动物无不良反应，且其抗炎作用强于水杨酸。刘中秋(1998)等在证实木豆的抗菌消炎作用的基础上，以抗炎等药效学为指标，对生脉成骨片中的主药——木豆叶的不同提取物进行筛选，分别用醇提取物、水提取物进行小鼠抗炎作用的药理研究，结果表明，木豆叶水提部分的抗炎作用最强，验证了民间利用木豆叶水煎剂可解毒消肿的功效。木豆中的活性成分包括木豆素、木豆素A、木豆素C、开菜素、木犀草素、牡荆苷、异牡荆苷、球松素、水杨酸等(林励等，1999;ChristopherJC.etal,1982;程誌青等，1992)。其中前三类属于芪类成分，其余为黄酮类成分，因此，木豆叶提取物分为芪类和黄酮类两大类化合物。虽然关于木豆有效成分的提取和分离工艺有待进一步研究，但是可以肯定的是芪类化合物及黄酮类化合物在其发挥药理药效活性过程3中起了至关重要的作用。病毒是最小的病原微生物，但病毒的传播最广，是目前世界上发病率最高的传染性疾病之一。在临床上较多的疾病与病毒感染有关。近3/4的传染病是由病毒引起的，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要不同的针对该病毒的抗病毒药物治疗，但目前世界上有效的抗病毒药物只有20多种。HSV(herpessimplexvirus)是一种单纯疱疹病毒，是疱疹病毒科的典型代表。HSV分为2型HSV-1和HSV-2，HSV-1感染可引起婴幼儿、儿童及成人的唇疱疹、角膜炎、疱疹性脑炎、脑膜炎等；HSV-2主要通过直接接触病灶(性接触)而传播，并导致皮肤病变，可引起早产、流产、死胎、胎儿畸形以及智力低下等,并与子宫颈癌的发生密切相关,特别在艾滋病、器官移植和恶性肿瘤等免疫抑制病人常并发严重的HSV感染(尚小红，2005;伍伟祯，2004)。HSV在人群中感染较为普遍，一旦感染，治愈性较差且具有复发性。近年来新的抗病毒药不断出现，但是病毒性感染的发病率仍持续不衰，特别是20世纪80年代艾滋病及其病原病毒的出现，对抗病毒药的研究开发提出了紧迫的要求，随着临床应用的日益广泛，医生和患者对抗病毒药的要求越来越高，因此抗病毒药的研究成为当前国际研究的热点之一。从1975年发现阿糖腺苷，特别是1977年阿昔洛韦(ACV，无环鸟苷)问世后，抗病毒药物才真正起步。目前市场上已有一些抗HSV中成药和西药，中成药普遍存在服用周期长、疗效不突出的问题，患者需要长时间忍受病毒的折磨，西药存在价格高、副作用大等问题。目前阿昔洛韦(ACV)和泛昔洛韦(FCV)是目前世界上用量较大的第二代广谱抗病毒药物，但是对新生儿或老年人的中枢神经系统的疱疹病毒感染，其结果仍不理想，而且对疱疹病毒潜伏期和复发次数没有多大影响，同时具有神经毒性样的副作用，因而，低毒、高效抗病毒天然产物类药物的开发将会具有广阔的市场前景。
发明内容本发明的目的是提供了从木豆叶中提取分离木豆芪酸及球松素在制备治疗疱疹病毒药物中的用途。本发明的技术解决方案如下本发明中木豆叶中木豆芪酸及球松素提取方法包括超声波辅助提取、热回流提取、超临界C02提取、微波辅助提取等方法。所用溶剂为醇-水(醇包括甲醇和乙醇)、丙酮-水体系。本发明以单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)毒株和vero细胞为实验对象，观察木豆叶中球松素和木豆芪酸抗单纯疱疹病毒I型和II型的活性。结果证明(1)木豆叶中球松素和木豆芪酸对HSV-1及HSV-2感染的细胞具有预防作用；(2)木豆叶中球松素和木豆芪酸对HSV-1及HSV-2感染的细胞具有治疗作用；(3)木豆叶中球松素和木豆芪酸可降低HSV-1及HSV-2的感染性；(4)木豆叶中球松素和木豆芪酸对HSV-1及HSV-2有直接杀伤作用，使HSV-1及HSV-2感染的vero细胞的活性下降。(5)木豆叶中球松素和木豆芪酸在体内对HSV-1及HSV-2感染具有治疗作用。基于上述研究结果，本发明证实了木豆叶中球松素和木豆芪酸具有预防及治疗疱疹病毒感染引起的疾病的新用途，可用于制备抗疱疹病毒的药物。本发明可以纯化的形式与药学上适当的载体一起被使用。可制成的药物剂型包括片剂、胶囊、外用搽剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、口服液、针剂或粉针剂，还可以采用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员普遍知道的任何一种。可以通过任何适当的方式给药，包括非肠道、静脉内、肌内、腹腔内给药，或者也可以通过用导管直接灌注给药。给药的剂量和频率依据年龄、性别、病人状态，同时服用其它药物、不良反应和临床医师考虑到的其它因素而定。本发明的优点1.本发明以新鲜或者干燥木豆枝叶为原料，在不破坏植物生态平衡、不影响农业生产的基础上，对植物资源进行高效合理的利用。2.本发明中的木豆叶中的木豆芪酸和球松素具有低毒不易产生耐药性的特点，且具有很好地抗疱疹病毒活性。具体实施方案实施例l:木豆叶中球松素和木豆芪酸的分离木豆叶中球松素和木豆芪酸通过下列步骤得到将采收的木豆茎叶阴干，粉碎后加入10倍量的6580%乙醇，加热回流25h,得到粗提物。粗提物经乙酸乙酯负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂法富5集后，采用正相硅胶中压柱层析后分离、ODS中压柱层析纯化，TLC监控合并相同流分，低温析晶和重结晶后得到纯度大于95%的目标化合物。目标化合物通过滤纸过滤，上清液经0.22pm滤膜过滤除菌，按实验要求进行适当稀释。实施例2:木豆叶中球松素和木豆芪酸细胞毒分析(1)细胞培养RC-37(非洲绿猴肾细胞)在含有5%胎牛血清和均为100mg/ml青霉素与链霉素的DMEM单层培养基中生长。细胞融合时传代。细胞置24孔和6孔板上分别进行细胞毒和抗病毒分析。(2)病毒HSV-1，HSV-2病毒株购自武汉大学病毒研究所。当RC-37细胞长成单层后接种病毒，放入C02培养箱中培养，当细胞病变达到90%以上时，放入-8(TC冰箱内。反复冻融3次后合并。(3)细胞毒分析a.将细胞置96孔板上，37'C培养24h。b.移去培养基，加入含有适当稀释度的球松素和木豆芪酸，每浓度8个重复。含2%。DMSO而无药物的200pL培养基作为对照。c.3d培养后，移去培养基，各孔加入200pLMTT，37'C培养4h，弃去，各孔加入200pLDMSO，37'C培养0.5h，在混合器中混匀5min，540nm处测OD，计算药物最大无毒浓度(TDo)。(4)实验结果:木豆叶中球松素和木豆芪酸对vero细胞的最大无毒浓度(TDQ)分别为木豆芪酸0.78吗/mL，球松素10(Hig/mL。实施例3:木豆叶中球松素和木豆芪酸体外抗病毒活性效果(1)木豆中球松素和木豆芪酸抗HSV半数抑制浓度(ICso)测定a.采用96孔细胞培养板培养Vero细胞，制成1x105mL细胞悬液，每孔加入200pL细胞液，于5。/。C02培养箱37'C培养24h。b.弃生长液，加100TCID5oHSV-l，HSV-2病毒液200nL，37。C吸附lh,吸出病毒液，加用维持液稀释的不同稀释度的化合物20(^L，每组8个复孔，置5%C02培养箱中37'C继续培养72h。实验同时设细胞对照、病毒对照。c.当病毒对照细胞病变达75%以上，MTT法测吸光值，计算不同木豆中球松素和木豆芪酸浓度的抑制率。实验重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。(2)抗病毒模式为了确定抗病毒的模式，分为以下四组-a.预处理病毒用球松素和木豆芪酸预处理病毒，二者室温下孵育lh，加入到96孔板上，37。C培养lh后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养72h。b.病毒吸附将球松素和木豆芪酸与病毒共同加入到96孔板上，37'C培养lh后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养72h。c.病毒复制将病毒直接加到96孔板上，37'C培养lh后，同时加入覆盖培养基和球松素和木豆芪酸，在培养箱中培养72h。d.预处理细胞在病毒感染前用球松素和木豆芪酸预处理细胞，37'C培养lh后，加入病毒，37'C培养lh后，加入覆盖培养基，在培养箱中培养72h。(3)实验结果不同浓度球松素和木豆芪酸IC5o见表l，木豆叶中球松素和木豆芪酸抗HSV效果及模式分析见表2，表3。表l木豆叶中球松素和木豆芪酸对HSVIC:病毒株IC50(>g/mL)木豆芪酸球松素阿昔洛韦HSV-10.12±0.099.46±0.120.097±0.06HSV-20.15±0.026.14±0.09O.ll士O.Ol表2木豆叶中球松素和木豆芪酸抗HSV-1效果及模式分析病毒抑制率(％)木豆芪酸球松素阿昔洛韦预处理病毒模式91.33±3.21%85.69±2.59%44.10±0.腦预处理细胞模式80.88±2.64%61.20±1.68%39.35±3.22%吸附模式82.36±4.98%74.08±2.05%31.24±2.98%复制模式88.28±2.05%68.48±0.91%94.44±3.51%表3木豆叶中球松素和木豆芪酸抗HSV-2效果及模式分析病毒抑制率(％)木豆芪酸球松素阿昔洛韦预处理病毒模式90.28±1.95%83.34±1.72%24.11±2.48%预处理细胞模式76.88±4.01%72.38±3.60%33.23±4.01%吸附模式52.31±4.98%43.29±1.16%28.05±1.14%复制模式84.25±5.47%78.15±2.37%92.67±3.09%实施例4:木豆叶中球松素和木豆芪酸体内抗病毒活性效果检验每个化合物抗HSV效果体内实验需小白鼠60只(由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，每只重1822克，分为五组，每组12只，公母各半，分别为给药高剂量组(i)，中剂量组(n)，低剂量组(m)，阳性对照组(iv)和空7白对照组(V)，I、II、III、IV组小鼠分别尾静脉注射滴度为108HSV-10.3mL，禁食过夜(24小时)后灌胃给药，I组给药100mg/kg，1I组给药75mg/kg，III组给药50mg/kg，IV组每日给生理盐水，连续给药七天，每日观察老鼠状态，称取体重，定量给食。十四天后脱颈处死并解剖所有小鼠，并观察脏器变化。实验结果木豆叶中球松素和木豆芪酸体内抗HSV半数有效浓度见表4。表4木豆叶中球松素和木豆芪酸体内抗HSV半数有效浓度(ED5o)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上述实施例可做出如下小结:1.木豆芪酸，球松素对vero细胞的最大无毒浓度(TDQ)分别为0.78pg/mL，廳ng/mL。2.木豆芪酸，球松素抗HSV-1及HSV-2的IC5o值分别为0.12±0.09pg/mL，9.46土0.12吗/mL;0.15±0.02pg/mL，6.14±0.09pg/mL，。阳性对照阿昔洛韦抗HSV-1，HSV-2的值为0.097±0.06ng/mL，0.11士0.01pg/mL。由上述实验结果可知，木豆芪酸的抑制HSV-1，HSV-2作用与阿昔洛韦相近，强于球松素。3.不同作用模式分析木豆叶中木豆芪酸和球松素抗病毒效果可知，木豆芪酸，球松素抗HSV-1效果好于HSV-2，四种作用模式中，预处理病毒模式与复制模式效果最好，木豆芪酸对两种病毒的抑制作用强于球松素。虽然两种化合物的复制模式活性都要低于阿昔洛韦，但此两种化合物对于病毒作用于细胞的不同阶段(吸附阶段，复制阶段，释放阶段)都有作用，对于病毒防治的作用较阿昔洛韦更为全面。4.木豆叶中木豆芪酸和球松素体内抗病毒活性实验结果表明，木豆芪酸抗HSV活性最好，木豆芪酸抗HSV-1的半数有效浓度(65.63mg/kg)略低于阿昔洛韦(73.62mg/kg)，而其抗HSV-2的半数有效浓度(70.28mg/kg)高于阿昔洛韦(55.44mg/kg)。上述结果证明，木豆芪酸抗HSV-1的活性要好于阿昔洛韦，但其抗HSV-2活性比阿昔洛韦稍弱。阿昔洛韦(ACV)和泛昔洛韦(FCV)等世界上用量较大的第二代广谱抗病毒药物具有对于疱疹病毒潜伏期疗效差，且具有神经毒性样的副作用，而本发明中的木豆叶中的木豆芪酸和球松素具有低毒、高效、不易产生耐药性的特点，由上述实施例可知，木豆叶中木豆芪酸和球松素对HSV-1，HSV-2有明显的抑制作用，有望成为一种治疗疱疹病毒的新药。本发明中所提到的木豆叶中木豆芪酸及球松素加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型，包括片剂、胶囊、外用搽剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、口服液、针剂或粉针剂，还可以采用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。图1木豆叶中木豆芪酸的结构式图2木豆叶中球松素的结构式图3木豆芪酸紫外光谱图4球松素紫外光谱图5木豆芪酸ESI-MS谱图6球松素ESI-MS谱图7木豆苠酸的'H-NMR图图8木豆芪酸的13C-NMR图图9球松素的^-NMR图图10球松素的13C-NMR图9权利要求1.木豆叶中木豆芪酸及球松素在治疗疱疹病毒药物中的用途。包括木豆叶中木豆芪酸及球松素的提取方法和木豆叶中木豆芪酸及球松素在治疗疱疹病毒方面的新用途。木豆叶中木豆芪酸及球松素加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型。本发明涉及从木豆叶中提取分离木豆芪酸及球松素的提取精制工艺，包括以下步骤(1)源于各品种木豆植株的新鲜或干燥枝叶匀浆破碎后用溶剂提取，提取液经过浓缩后，得到粗提物。(2)粗提物经乙酸乙酯负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂法富集后，采用正相硅胶中压柱层析后分离、ODS中压柱层析纯化，TLC监控合并相同流分，低温析晶和重结晶后得到纯度大于95％的目标化合物。2.权利要求1所述的化合物提取精制工艺，其特征在于，步骤(1)中化合物提取方法包括超声波辅助提取、热回流提取、超临界C02提取、微波辅助提取等方法。所用溶剂为醇-水(醇包括甲醇、乙醇和丙醇)、丙酮-水体系。3.权利要求1中步骤(2)所述的化合物精制工艺，其特征在于，木豆茛酸及球松素可以用连续正相硅胶中压柱层析纯化，洗脱剂为三氯甲垸(或二氯甲烷、乙酸乙酯)-甲醇(或丙酮)体系梯度洗脱。4.权利要求1所述的疱疹病毒，其特征在于包括疱疹病毒科所有病毒，即单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，爱泼斯坦一巴尔氏病毒等70多种病毒。5.权利要求1所述的治疗疱疹病毒的木豆叶中木豆芪酸及球松素，其特征在于加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型，包括片剂、胶囊、外用搽剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、口服液、针剂或粉针剂，还可以采用现代制药界所公认的控释或缓释剂型。全文摘要本发明涉及了木豆叶中木豆芪酸及球松素在制备抗疱疹病毒药物中的应用。包括木豆叶中木豆芪酸及球松素的提取方法和木豆叶中木豆芪酸及球松素在治疗疱疹病毒方面的新用途。木豆叶中木豆芪酸及球松素加入不同的赋形剂后可加工成任何一种药剂学上所说的剂型。木豆叶中木豆芪酸及球松素具有毒副作用小，疗效确切，安全可靠等特点。木豆资源丰富，采集方便，提取工艺简单，便于工业化生产。文档编号A61K31/185GK101485649SQ20091007147公开日2009年7月22日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者付玉杰,威刘,欣华,楠吴,羽孔,祖元刚申请人:东北林业大学;付玉杰