专利名称：具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，藉由该乳 酸菌株良好的耐酸性、耐胆盐性，以及卓越的肠胃道吸附能力，可确实产生降低动物(包括 人类)体内胆固醇浓度的效用。本发明提供的植物乳酸菌及含彼的组合物可应用于药品、 食品或饮料等领域。
背景技术：
异常的血脂肪是造成心脏血管疾病及粥状动脉硬化的主因之一。此外，三酸甘油 酉旨(Triglyceride，TG)、高密度月旨蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol, HDL-c)及低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol, LDL-c)的浓度 与心脏血管疾病也有极大的相关性。临床上，血中的胆固醇浓度可作为一个很好的预测指 标，根据美国国家胆固醇教育计划(National Cholesterol Education Program，NCEP)，定 义血中总胆固醇达M0mg/dl为过高，介于200至239mg/dl则谓之边缘型高血胆固醇，低于 200mg/dl则为较可接受的浓度范围，意即胆固醇值高者罹患心脏血管相关疾病的机会将会 提高，同时死亡率亦会提高。
乳酸菌普遍存在于人体与动物肠道中，具有各种保健功效，常被作为益生菌添加 于食品中，以增进人体健康，Mann和Spoerry在1974年就发现非洲的马赛族人在吃了大 量由乳酸菌(Lactobacillus)菌株所酸酵的牛奶后，血液中的胆固醇浓度有降低现象，因 此乳酸菌与胆固醇的相关性便成为研究的主题。目前，对于益生性乳酸菌能降低胆固醇的 机制尚未明确，有研究发现乳酸菌可经由菌体直接吸附胆固醇或使其沉淀而降低胆固醇， 更进一步研究发现乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium spp.) 的菌体细胞膜能键结胆固醇，并将胆固醇同化代谢为细菌所需物质。
然而，医学界中虽发现如前述多种乳酸菌能降低胆固醇的现象，而国际间亦有发 表一株具有降低胆固醇效果的嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)ATCC 43121，但 鉴于胆固醇造成如此多的人体心脏血管疾病，因此生物界致力研发更具降低胆固醇效果的 乳酸菌株，基于此背景下，本案发明人为改善前述嗜酸乳杆菌降低胆固醇效果仍有进步空 间，故再潜心研究开发出一种具更佳降低胆固醇效果的乳酸菌株，以期能进一步提供广大 心血管疾病患者或潜在疾病患者新的选择，服用安全性高且可降低或控制体内胆固醇浓度 效用的乳酸菌，而达到降低人体心血管疾病的发生率及临床症状。发明内容
本发明主要目的在于提供一种具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳 Ifisf (Lactobacillus ρIantarum) igiMMi^。
本发明首先提供了一种保藏编号为DSM 22774的植物乳杆菌，其为分离自水 果的植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)BB9，发明人对该菌株进行的原始编号 为FM980220-L01，并委托台湾财团法人食品工业发展研究所分析该菌株的16S rDNA,并将该菌株保藏于德国食品工业研究及发展机构DSMZ，地址为381 布朗施维格德国 (InhoffenstraBe 7 B 38IMBraunschweig GERMAN)，保藏编号为 DSM 22774，保藏日期 2009年7月23日，生物材料的分类命名植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，具有肠胃 道吸附能力及排除胆固醇能力。
本发明还进一步提供了上述植物乳杆菌BB9的主要用途
用于制备调节动物或人类肠胃道细胞内的菌群的药品、食品或饮料。
用于制备降低动物或人类体内胆固醇浓度的药品、食品或饮料。
用于制备降低动物或人类体内三酸甘油酯浓度的药品、食品或饮料。
用于制备改善动物或人类体内血脂质浓度的药品、食品或饮料。
上述食品主要涉及健康食品、减肥食品、保健食品等。
体外试验证实本发明提供的植物乳杆菌BB9具有良好的耐酸性及耐胆盐性，此 外对肠道细胞的吸附能力也相当强；体内试验显示喂食高热量高胆固醇饮食的仓鼠，若 同时喂食1X109 CFU/g的本发明提供的植物乳杆菌BB9，可有效降低血液及肝脏中的胆固 醇和三酸甘油酯，而且血液中的高密度脂蛋白与低密度脂蛋白胆固醇(HDL-c/LDL-c)比值 也较其它组高；体重监测方面发现喂食本发明提供的植物乳杆菌BB9的仓鼠，体重上升的 幅度较其它组低；此外，实验也发现喂食植物乳杆菌BB9的降血脂效果较喂食相同剂量的 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 43121 为佳，此ATCC 43121 菌株为国际发 表公认具有降胆固醇效果的乳酸菌。故，本发明提供的新型植物乳杆菌BB9菌株可有效降 低血液及肝脏中的胆固醇和三酸甘油酯。因此，本发明提供的植物乳杆菌BB9对动物体或 人体在心血管疾病的预防或治疗上将有相当大的帮助。
图1是喂食乳酸菌冷冻干燥粉末对喂食高胆固醇饲料仓鼠的血液胆固醇影响。
图2是喂食乳酸菌冷冻干燥粉末对喂食高胆固醇饲料仓鼠的血液三酸甘油酯影 响。
图3是喂食乳酸菌冷冻干燥粉末对喂食高胆固醇饲料仓鼠的血液高密度胆固醇/ 低密度胆固醇比例。
图4是喂食乳酸菌冷冻干燥粉末对喂食高胆固醇饲料仓鼠的血液高密度胆固醇 和低密度胆固醇浓度影响。
图5是喂食乳酸菌冷冻干燥粉末对喂食高胆固醇饲料仓鼠的肝脏胆固醇影响。
图6是喂食乳酸菌冷冻干燥粉末对喂食高胆固醇饲料仓鼠的肝脏三酸甘油酯影 响。
图7是本发明BB9乳酸菌的脉冲式电泳基因指纹图谱。
生物保藏说明
生物材料的分类命名植物乳杆菌；
Lactobacillus plantarum ；
保藏单位全称德国食品工业研究及发展机构DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)；
保藏编号DSM22774；4
保藏日期2009年7月23日；
保藏单位地址381 布朗施维格德国QnhoffenstraBe 7 B 38124 BraunschweigGERMAN)。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案及其功效。
本发明是有关于一种具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌BB9， 其取样方法、实验步骤以及检验结果如下
取样方法及实验步骤
(一)乳酸菌收集
本实验中受测的乳酸菌，包括购自生物资源保存及研究中心(BCRC，台湾，新 竹)、自行筛选自中部区域的多家医院及坐月子中心等的出生婴儿粪便、成人粪便、水果、坊 间传统泡菜食品及动物来源等。分离的菌株以过氧化氢酶试验O^talase test)、革兰氏染 色(Gramstain)、镜检及运动性实验分析，初步确认为乳酸菌。所有乳酸菌以乳酸菌MRS肉 汤(Lactobacilli MRS broth，含 0. 02% L-半胱氨酸，L-cysteine)在 37°C下培养 24 小时 后，以15%甘油的MRS肉汤(MRS broth)保存于_70°C冰箱。
( 二 )消化道模拟试验
(1)耐酸性试验
取经隔夜培养活化的乳酸菌菌液1ml，以pH 7.2磷酸盐缓冲溶液清洗一次，再以 去离子水回溶菌体，取100 μ 1上述菌液分别加入不同PH值(pH 2. 0,2. 5及7. 2)的9. 9ml 无菌磷酸盐缓冲溶液中。菌液与缓冲溶液充分混合后，置于37°C、转速SOrpm培养箱，3小 时后立刻取出Iml以pH7. 2磷酸盐缓冲溶液进行序列稀释，以MRS琼脂(MRS agar)在37°C 培养48小时，计算存活的乳酸菌菌数。
(2)耐胆盐试验
将隔夜培养活化的乳酸菌菌液，各取100 μ 1分别加入IOml MRS broth或添加 0. 3% (w/v)牛胆汁(ox gall, Sigma)的 MRS 肉汤(MRS broth)中，进一步于 37°C培养 4 小 时后取Iml菌液，加入9ml、pH7. 2的PBS中进行连续稀释，利用倾注平板计数法(pour plate count method)与MRS琼脂(MRS agar)混合培养分析菌数，以评估受试乳酸菌在胆盐存在 下的菌数生长。此外，于0、2及4小时取出Iml菌液离心，以磷酸盐缓冲溶液(PBS)回溶悬 浮后利用分光光度计分析其OD 600nm的吸光值，并计算耐胆盐能力(％ )，公式如下所示
Bile tolerance (% ) = (Increment of OD 600nm in MRS broth with bile salt/increment of 0D600nm in MRS broth without bile salt)X100。
即耐胆盐能力(％ )=(含胆盐MRS肉汤在600nm处吸光值增量/不含胆盐MRS 肉汤在600nm处吸光值增量)X 100。
(三)附着性(adhesion)试验
(1)乳酸菌菌液的制备
所有受试乳酸菌分别以MRS broth活化两次后，接种至5ml MRS broth进行培养， 于对小时后取Iml以6000rpm离心10分钟后，以PBS (pH 7. 2)清洗两次，以进行吸附试验。
(2)附着性试验
a.人体肠道细胞株Caco-2以Iml 0. 05%胰岛素CTrypsin)处理5分钟后，以手 击培养瓶轻轻将细胞拍下，分装于96孔的培养盘中，每个孔洞中加入1 X 104cells,每天换 200 μ 1新鲜的DMEM培养基。
b.接着加入20μ 1乳酸菌菌液于细胞中，接着培养1小时使乳酸菌附着。
c.乳酸菌附着1小时后，倒除培养基，以PBS清洗5次以去除未附着的乳酸菌， 加入100μ1，10%福尔马林(formalin)，30分钟，固定细胞及细菌，再以PBS缓冲液(PBS buffer)洗3次，最后以100 μ 1结晶紫(Crystal violet)进行染色，五分钟后以少量75% 酒精快速冲洗，去除细胞上的染色剂。
d.利用相位差显微镜观察乳酸菌对肠道上皮细胞的吸附性，随机在不同的显微镜 视野(randomized microscopic areas)下，观察并计算50个细胞的乳酸菌吸附情形，最后 计算每个细胞平均吸附的乳酸菌数量。
(四)动物体内试验
(1)实验动物
实验使用的黄金鼠(Syrian Hamster,叙利亚仓鼠)是的雄性仓鼠(Hamster)， 7 8周大，实验前所秤得体重为92-98克，平均95. 3克，每只分别喂养于独立隔离的鼠笼 (IVC)，室温维持于25V，并定时12小时光照与黑暗；饲料及无菌逆渗透水均任由仓鼠自由 取食，而仓鼠在一星期的适应环境期间，所喂食饲料均为美国AIN-93标准配方，但分组后 则喂食不同成分比例的饲料，详述如后。
(2)仓鼠分组与喂食样品制备
饲养一周后将仓鼠随机分为5组，每组6只，组别如下所示。本实验喂食的饲料配 方主要以AIN-76为基础，成分包括酪蛋白、玉米淀粉、玉米油、纤维质、矿物质混合物、维 生素混合物、蔗糖、胆固醇以及胆酸等，除空白对照组外，其余各组均将大豆油比例提高至 15%并添加0. 5%的胆固醇，以诱发高胆固醇血症，实验组则添加乳酸菌冷冻干燥粉末，并 相对降低玉米淀粉的比例。所喂食的饲料皆保存于4°C冰箱，且每天更换新鲜的饲料及无菌 逆渗透水。
A 空白对照组(Blank control group)-此组仓鼠仅喂食AIN-93标准配方，且不 添加胆固醇或任何乳酸菌。
B 高胆固醇组(High-Cholesterol group，HC)-此组仓鼠饲料添加0. 5%的胆固 醇及10%不含乳酸菌的冷冻干燥保护剂基质，并将AIN-93标准配方的玉米淀粉作适当的调整。
C 高胆固醇+Lactobacillus acidophilus ATCC 43121-1 X 109CFU/g 乳酸菌组 (HC+ATCC43121-9' group)-此组仓鼠饲料添加0. 5%的胆固醇及乳酸菌ATCC 43121 的冷冻干燥粉末，使其最终浓度为1 X 109CFU/g并将AIN-93标准配方的玉米淀粉作适当的调整。
D:高胆固醇 +Lactobacillus ρlantarum ΒΒ9-1X 109CFU/g 乳酸菌组 (HC+BB9-9' group)-此组仓鼠饲料添加0. 5%的胆固醇及乳酸菌BB9的冷冻干燥粉 末，使其最终浓度为1 X 109CFU/g并将AIN-93标准配方的玉米淀粉作适当的调整。
E:高胆固醇 +Lactobacillus ρlantarum BB9-1X1010CFU/g 乳酸菌组 (HC+BB9-10' group)-此组仓鼠饲料添加0. 5%的胆固醇及10%乳酸菌BB9的冷冻干燥6粉末，使其终浓度为1 X 1010CFU/g并将AIN-93标准配方的玉米淀粉作适当的调整。
(3)体重测量及牺牲采样
每星期记录仓鼠体重，于饲养4周期满后，禁食一夜后进行牺牲，牺牲后立刻进行 心脏采血并与少量抗凝血剂(0. 68g/l)混合后置入4°C冰箱。另外，将肝脏取出以生理食盐 水清洗灌流并擦拭干净后，精确秤取Ig肝脏置于样品瓶中，加入5ml Folch试剂(氯仿 甲醇=2 1，ν/ν)后避光，并立刻放入-80°C冰箱中。
(4)样品的制备及脂质分析
将收集的血液以3000rpm低速离心，10分钟，吸取上层血液后立刻冷冻于_80°C， 直到进行各项脂质分析。将置于样品瓶中的肝脏，以均质机打碎后室温震荡萃取油脂20分 钟，萃取液再以纤维素定量滤纸(Whatman No. 2)过滤后，再以R)lch试剂(氯仿甲醇= 2 1，ν/ν)定量至10ml，置于-80°C冰箱直至进行分析。各项脂质分析步骤如下
(a)总胆固醇分析
利用市售胆固醇分析试剂CHOD-PAP的方法测定样品中所含的胆固醇含量取 10 μ L的样品加入呈色剂以37°C水浴5分钟，利用胆固醇酯酶(cholesterol esterase)将 样品中所有胆固醇释放出来，再用胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase)处理，产生H2O2， 可藉与试剂中的过氧化物酶(peroxidase)与4_氨基安替比林(4-aminoantipyrine)和水 杨醇(salicylic alcohol)作用，产生有颜色的醌亚胺(quinonimine)，测其500nm吸光值， 再与标准溶液的吸光值对照换算测试样品中胆固醇的含量。
(b)三酸甘油酯含量分析
利用市售三酸甘油酯测定试剂组GPO-PAP的方法来测定样品中三酸甘油酯的 含量取10 μ L的样品加入呈色剂以37°C水浴15分钟，样品中的三酸甘油酯经脂肪酶 (lipase)分解成甘油(glycerol)和自由脂肪酸(free fatty acid)，其中glycerol以甘 油激酶(glycerol kinase)和甘油磷酸氧化 醇(glycerol phosphate oxidase)处理，产生 H2O2,可藉与试剂中的 peroxidase 与 4-aminoantipyrine 禾口 salicylic alcohol 作用,产生 有颜色的quinonimine，测其500nm吸光值，再与标准溶液的吸光值对照换算测试样品中三 酸甘油酯的含量。
(c)血液 HDL-cholesterol 含量分析
利用市售血液脂蛋白胆固醇试剂组(Randox laboratories Ltd. Co.)测定血液中 HDL-c 含量添加沉淀试剂(内含 1. 4mmol/l 磷钨酸(phosphotungstic acid)、8. 6mmol/l 氯化镁(magnesiumchloride))后，取10 μ 1的血液加入呈色剂以37°C水浴15分钟，加入测 量总胆固醇的试剂，测其500nm吸光值，再与标准溶液的吸光值对照换算测试样品中HDL_c 的含量。
(d)血液 LDL-cholesterol 含量分析
利用市售血液脂蛋白胆固醇试剂组(Randox laboratories Ltd. Co.)测定血中 LDL-c含量添加沈淀试剂(内含0. 68g/l肝素(h印arin)、64mmol/l柠檬酸钠(sodium citrate)、稳定剂(stabilizer))后，取10μ 1的血液加入呈色剂以37°C水浴15分钟，加 入测量血胆固醇的试剂，测其500nm吸光值，再与标准溶液的吸光值对照换算测试样品中 LDL-c的含量。
(五)菌种鉴定
(1) 16S rDNA 序列分析
将本菌株委托台湾财团法人食品工业发展研究所(Food Industry Research andDevelopment Institute, FIRDI)进行16S rDNA序列分析(如序列表所示)，以鉴定 此BB9菌种的种名，并于德国食品工业研究及发展机构DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)保藏，其保藏编号为 DSM 22774。
(2) API 50CHL乳酸菌鉴定套组分析
除了 DNA序列分析之外，本菌株亦委托食品工业发展研究所进行API 50CHL乳酸 菌鉴定套组分析，以进一步确认此BB9菌种。此菌种鉴定报告也将一并附上供审查参考。
(3)脉冲电场胶体电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)图谱
利用脉冲电场胶体电泳及不同限制酶的使用来分析乳酸菌的gnomic DNA图谱。故 本发明在针对所分离的BB9乳酸菌，以gnomic DNA来辨识此菌株的基因指纹图谱。
(六)统计
每个实验分析皆进行三次重复，实验结果以SPSS软件包于计算机中进行统计分 析，均先经单因素方差分析(one way AN0VA，analysis of variance)检定处理效应是否有 显著差异，再以邓肯氏多变域测验(Duncan's multiple range test)测定各组间的差异显 著性，显著性差异的判断标准为P < 0. 05。
检验结果
(一 )耐酸性试验
耐酸性试验是将磷酸盐缓冲溶液以盐酸调至pH2. 0,2. 5及3. 2，以预测乳酸菌在 胃酸环境下的存活能力。受测乳酸菌的耐酸性试验结果于下表所示，发现在本试验模式下， 在pH2. 0时，植物乳杆菌BB9菌株有较高的菌数存活，因此相较于其它菌株有较高的耐酸 性；在PH值提高至3. 2时，所有受试菌株的存活菌数皆与提高到pH7. 2相近。
受测乳酸菌的耐酸性试验结果8
权利要求
1.一种具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，其保藏编号为DSM 22774。
2.权利要求1所述具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，其特征在 于其特征在于用于制备调节动物或人类肠胃道细胞内的菌群的药品、食品或饮料。
3.权利要求1所述具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，其特征在 于用于制备降低动物或人类体内胆固醇浓度的药品、食品或饮料。
4.权利要求1所述具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，其特征在 于用于制备降低动物或人类体内三酸甘油酯浓度的药品、食品或饮料。
5.权利要求1所述具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，其特征在 于用于制备改善动物或人类体内血脂质浓度的药品、食品或饮料。
全文摘要
本发明涉及一种具有肠胃道吸附能力及排除胆固醇能力的植物乳杆菌，其为分离自水果的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BB9，该BB9乳酸菌株可表现高度的BSH活性，体外试验证实该菌株有良好的耐酸性及耐胆盐性，此外对肠道细胞的吸附能力也相当强；在体内试验方面，显示喂食高胆固醇饮食并添加BB9菌株的仓鼠，可有效降低血液及肝脏中的胆固醇和三酸甘油酯，而且血液中的高密度脂蛋白与低密度脂蛋白胆固醇(HDL-c/LDL-c)比值相较于无喂食胆固醇的仓鼠有显著性提高，以期藉由该乳酸菌种所提供更佳的耐酸性、耐胆盐性及肠道吸附能力，以切实产生降低人体内胆固醇浓度的效用。
文档编号A61K35/74GK102031229SQ20091016199
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者林真美, 黄美淇 申请人:家医国际生化股份有限公司