专利名称：反义制剂的制作方法
反义制剂
背景技术：
1.发明领域本发明涉及一种室温储存稳定的寡核苷酸液体制剂。更具体地，本发明涉及硫代 磷酸寡核苷酸的稳定制剂，其设计结合Hsp27 mRNA，而Hsp27 mRNA也将聚集体形成减至最 少。2.相关领域说明Hsp-27反义寡核苷酸(ASO)设计结合Hsp27 mRNA以抑制人Hsp27蛋白产生。美 国专利7, 101，991描述了多种Hsp27 AS0。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、目标pH 7. 4的等渗溶液中配制的0GX-427或Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1剂量的早期动物研究显示良好的生物效应。但是，在更高浓度的所述ASO下， 所述0GX-427制剂在室温和冷冻条件下数天之后都形成非共价聚集，因此不适合临床使 用。PBS配制溶液曾经令人满意地用于类似的反义产品(参见涉及凝聚素ASO的美国专利 6，900，187)，也曾经期待相似的配制溶液可用于HSP27 AS0。但是如上面解释以及下面显 示，HSP27 ASO的PBS溶液不能实际用作临床制剂。用于注射给药ASO药物产品的液体制剂习惯上冷冻以确保足够的长期稳定性。将 寡核苷酸制剂冻干成粉末(冷冻干燥)并在使用之前复原可用于提供具有足够稳定特性的 药物产品输送系统。但是，寡核苷酸的液体制剂具有显著的商业利益，尤其是在环境(室 温)条件下保持稳定的制剂。美国专利出版物2003/0119768公开了关于靶向c_myc mRNA的15聚体反义序列， 即AACGTTGAGG GGCAT (Seq. ID No. 2)的发现。观察到该序列包括4个连续的G残基，进行 聚集以形成毒性增大的多聚体。因此所述出版物公开了在使用之前裂解所述多聚体。公开 的一种方法为冻干之前加入糖类冷冻保护剂例如甘露醇、蔗糖、葡萄糖、trialose或乳糖。 已发现这样在用水复原时减少多聚体形成。但是没有提供关于长期溶液稳定性和避免聚集 的信息。不管其生物学效能如何，经受聚集的ASO可能是公司药物计划的不适宜临床候选 物，且不会进一步开发。但是，Hsp27 ASO的体内生物学特性非常适宜，因此做出努力以克 服在液体制剂中长时间储存的聚集和稳定性问题。另外，还应注意ASO药物生产仍然昂贵，其储存的浪费或成本的任何降低可能是 另外的利益，并可能使可商业化和不可商业化药物产生差异。
发明内容
在试验发现提供可接受的溶液稳定性并减少具有Seq. ID No. 1的ASO非共价聚集 的制剂时，发现甘露醇(5%)能够在温度摄氏-20度到摄氏60度范围内保持极低聚集水平 24周时间。当使用葡萄糖代替甘露醇时观察到相似的结果。在此时间内总体稳定性良好直 至摄氏40度。因此，本发明提供了一种室温稳定并极少聚集的药物产品液体制剂，其包含 一种ASO和一种水相载体；其中所述ASO包含Seq ID No. 1或者包含一种变体寡核苷酸，所述变体寡核苷酸中不超过3个非序列碱基与Seq ID No. 1不同；所述水相载体包含一种防 止聚集的化合物，其选自单糖和二糖(例如葡萄糖和乳糖)，以及糖醇(例如甘露醇和山梨 糖醇)。在特定的实施方案中，所述ASO由Seq ID No. 1或者一种变体组成，所述变体中不 超过3个非序列碱基与Seq ID No. 1不同。所述载体也可包含磷酸盐缓冲液或Tris缓冲 液。通过阅读下面本发明特定实施方案的说明并结合附图，本发明的其它方面和特征 对本领域技术人员是显而易见的。
在说明本发明实施方案的附图中，图1为扩展HPLC色谱图，其显示磷酸盐缓冲盐水( 70-75mg/mL)中的0GX-427 在40°C储存在第0、3、5天的两个峰(左峰为0GX-427寡核苷酸单体，右峰为聚集)，表明聚 集随时间增加。图2为HPLC色谱图，其显示0GX-427寡核苷酸及其聚集(右峰)。从制备的溶液 中产生高度聚集的样品(>50%)，其包含？85中的20011^/1^ 0GX-427，并在分析之前在环 境条件下老化4天。图3为无缓冲5%葡萄糖水相制剂中25mg/mL的0GX-427在40°C在第0、3、5天的 扩展HPLC色谱图(无缓冲5%甘露醇制剂产生实质相同的结果，参见表1)；图4 为 Captisol 制剂中 25mg/mL 的 0GX-427 在 40°C在第 0、3、5 天的扩展 HPLC 色谱图；显示聚集形成增加。图5为5种制剂在储存温度60°C的4周中的0GX-427主峰面积百分比纯度( 25mg/mL)的绘图表示，5种制剂即5%甘露醇(Vl)、5%甘露醇在IOmM Tris缓冲液pH 7.4 中(V2)、5%甘露醇在IOmM磷酸钠缓冲液pH 7. 4中(V3)、5%葡萄糖(V4)、5%葡萄糖在 IOmM Tris 缓冲液 pH 7. 4 中(V5)；图6为5%甘露醇和IOmM磷酸钠缓冲液pH 7. 4制剂(V3)在温度-20、2-8、25、40 和60°C在24周中稳定性(以0GX-427浓度显示)的绘图表示；图7为5%甘露醇和IOmM Tris缓冲液pH 7. 4制剂(V2)在温度_20、2_8、25、40 和60°C在24周中稳定性的绘图表示；以及图8为玻璃瓶中的对应稳定性样品(V1-V5)在12周时间点的照片。0GX-427在浓 度 25mg/mL的整体降解效果可简单看作溶液的暗化。瓶19 = 5%甘露醇在IOmM磷酸盐 缓冲液中或V3 ；瓶18 = 5%甘露醇在IOmM Tris缓冲液中或V2 ；瓶17 = 5%甘露醇或Vl ； 瓶16 = 5%葡萄糖在IOmM Tris缓冲液中或V5 ；以及瓶15 = 5%葡萄糖或V4。详细说明在典型的寡核苷酸化合物中，磷酸盐基团共价连接相互邻近的核苷以形成线性 聚合化合物。在寡核苷酸结构中，磷酸盐基团涉及形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和 DNA的正常键或主链为3’到5’磷酸二酯键。0GX-427为抑制热休克蛋白27 (Hsp27)表达 的靶向ASO治疗剂。0GX-427药物物质或活性药物成分(API)为具有硫代磷酸核苷酸间 键的合成寡核苷酸，其通常分类为4-12-4 MOE gapmer寡核苷酸(gapmer讨论参见Isis Pharmaceuticals专利EP 0618925，通过引用结合到本文中，0GX-427详细信息参见美国专利 7，101，991)。0GX-427 (Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1)可表示为5，-GGGAMeCGMeCGGMeCGMeCTMeCGG-U-CA-U-3'其中下划线标记的核苷迨、Δ、、和mW表示核糖核苷鸟苷、腺苷、5_甲基胞苷 和5-甲基尿苷的2’ -0-甲氧基乙基(2’ -Μ0Ε)修饰；其中G、feC、和T代表脱氧核糖核苷 2’ -脱氧鸟苷、2’ -脱氧-5-甲基胞苷、和2’ -脱氧胸苷；并且其中核苷酸间键为硫代磷酸 二酯(钠盐)。0GX-427 的 CAS 登记号(CAS#)为 915443-09-3，CAS 索弓丨名为"DNA, d(P-硫 代)([2，-0-(2-甲氧基乙基)]rG-[2，_0-(2_甲氧基乙基)]rG(-{2，_0-(2_甲氧基乙 基)]rG-[2，-0-(2-甲氧基乙基)]rA-m5rC-G-m5rC-G-G-m5rC-G-m5rC-T-m5rC-G-G-2‘ -0-(2-甲氧基乙基)]m5rU-{2，_0-(2_甲氧基乙基)]m5rC_[2，_0-(2_甲氧基乙基)] rA-[2' -0-(2-甲氧基乙基)]m5rU)，十九钠盐”。本发明致力于0GX-427制剂以及与0GX-427实质相同的反义治疗剂制剂。因此， 所述制剂由Seq. ID No. 1组成，或者本发明制剂中的ASO由该序列的寡核苷酸变体组成，所 述变体中不超过3个非序列碱基相对于Seq. ID No. 1变化，其保留抑制Hsp27表达的能力。 所述ASO也可通过加入末端碱基而比Seq. ID No. 1或上述变体长，而仍然是寡核苷酸(长 度小于100碱基)并保留抑制Hsp27表达的能力。这种较长的寡核苷酸据说包含Seq. ID No. 1或该序列的寡核苷酸变体，其中不超过3个非序列碱基相对于Seq. ID No. 1变化。0GX-427的具体序列提示聚集受长度仅20的寡核苷酸序列中鸟苷核糖核苷(G)数 量影响的可能性。在0GX-427中有9个鸟苷残基；其数量几乎占该序列的50%。虽然申请 人无意受限于任何具体的聚集机制，聚集可能是由于强Watson-Crick互补碱基作用或者 由于高级结构形成。如上所述，配制0GX-427的初选为pH 7. 4的PBS溶液。在更高浓度下，溶液中观 察到HPLC色谱中的附加峰；该峰后来确定为非共价聚集。传闻历史信息提示，具有潜在聚集问题的反义化合物基本还未开发，从而本领域 未留下如何解决聚集和低稳定性问题的教导。因此申请人选择可能的赋形剂以达到多种实验要求必需的0GX-427可溶性和稳 定性，以及0GX-427产品与静脉(IV)给药的相容性。0GX-427在PBS中在监测条件和多种赋形剂类型中作为对照，假定赋形剂可能影 响0GX-427聚集。在氯化钠或其它盐存在下破坏形成的非共价聚集可帮助制剂设计。类似 地，环式糊精可封装药物，可能防止0GX-427聚集体形成。引入有机共溶剂可能破坏氢键结 合现象，否则聚集形成。在此类别中，通过OncoGenex明确知道DMSO帮助逆转聚集形成。包 含单糖的制剂也可改变氢键结合作用以抑制聚集。筛选不同类型的赋形剂时已发现这些制 剂之间在防止Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1聚集的能力方面差异显著，如表1所示。虽然通常糖/糖醇在有限选择中看起来是有希望的实验成果，可能作为此类赋形 剂的代表。进一步的开发产生了多种原始制剂，包括包含甘露醇和葡萄糖的制剂，其经定期 制备并研究聚集形成与总体稳定性长达24周。所述研究的结果获得了选择的制剂甚至在 高达40°C储存数周的情况下的稳定性的显著证据。该结果显示一种可能的长期室温储存的 0GX-427液体制剂。
基于推断一般反义寡核苷酸观察的结果，相关化合物(“硫代磷酸寡核苷酸”)，尤 其是GC含量高的化合物，例如超过50 %，更具体地超过65 %，通过使用甘露醇、葡萄糖或者 其它糖或糖醇，以及可选的合适的缓冲液，例如本发明中的磷酸盐缓冲液，可在液体制剂中 在室温下稳定。所述组合物优选地用于一种方法，其中反义物在液体制剂中与糖或糖醇配制，并 保持在液体状态超过6小时的时间，可选地超过12小时或18小时，在所述时间之后所述液 体制剂用作治疗组合物。材料与方法设备HPLC系统为Shimadzu LC-10，带有UV检测和自动取样器；以及Delta Pak HPLC 柱(C18 5μπι 300Α 2.1 X 150mm)。化学药品标准缓冲液、糖和溶剂例如D-甘露醇、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸、 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、四丁基硫酸氢铵、乙腈、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、酒石酸、聚山梨醇 酯80、聚氧乙烯(20)、去水山梨糖醇单油酸酯、磷酸盐缓冲液、PEG-300、PEG-400以及二 甲基乙酰胺，购自 Sigma (St. Louis，MO)，Aldrich (St. Louis, MO)，Spectrum Chemicals (Gardena, California)，VffR(West Chester, PA, JT Baker (Phillipsburg, NJ)。0GX-427由合同生产商为申请人生产。聚合物例如Cremphor EL聚乙氧基化蓖麻油、Poloxamer 407 α -氧-ω -羟基 聚(氧乙烯)、聚(氧丙烯)b聚(氧乙烯)a嵌段共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇、以及丙二 醇，购自 BASF (Florsham Park, NJ)。Captisol ，一种环式糊精，为 CyDex(Lenexa，KS)的产品。方法Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1为每次分析制备为标准物，其在无菌水中的浓度 为Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1，置于25mL容量瓶。该溶液作为起始溶液用于 25-250 μ g/mL的稀释物以建立5点线性曲线。每个校准点注入HPLC —次。RP-HPLC 方法研究中产生的样品在柱温度50°C通过反相(RP)-HPLC方法分析，使用流动相 “A”20mM四丁基硫酸氢铵和20mM Tris碱pH 7. 8 ；流动相“B”乙腈；以及流动相“C”水。流 速为0. 35mL/min。用水稀释样品至合适的浓度，转移至HPLC瓶，在注入之前保持在冷却的 自动取样器中。注入量为101^，在26011111通过而吸收检测。使用如上所述的HPLC方法评估Hsp27 ASO的稳定性和聚集形成，并计算该化合物 在正常和聚集峰的百分比，或者记录为浓度mg/mL。实施例1赋形剂筛选研究选择支持的赋形剂以提供静脉(IV)给药液体和/或冻干制剂的可能性。0GX-427 的初始PBS制剂作为对照( 75mg/mL)。制剂在40°C和浓度75mg/mL下老化以模拟“加速条件”，依据是早前观察在40°C比 在室温和更高浓度下聚集更快。制备150mg/mL储存溶液之后，使用制备的载体1 1稀释等分样品至研究目标浓度的2倍。最终溶液包含目标浓度 75mg/mL的0GX-427和赋形剂。每份样品在1.5mL管 中制备，然后盖上管并短暂涡旋以混合样品。制备之后，样品移至用于研究的40°C房间。所 有赋形剂(除了基于共溶剂的赋形剂)在用于0GX-427溶液制备之前过滤。所有研究样品 在储存溶液完成约60分钟之内制备。HPLC样品制备0GX-427溶液在水中稀释1000倍以获得750 μ g/mL样品用于注入HPLC。样品在制备(T = 0)和在40°C储存5 (T = 5)天时记录的信息如表1所示。第3 天或T = 3的结果未显示但与T = 5的数据趋势相同。图3、4a和4b反映了葡萄糖、PBS、 和10% Captisol 制剂的结果。表1 在 40°C和浓度 75mg/mL 下储存，Hsp27 ASO Seq. Id. No. 1 (0GX-427)在多种
赋形剂中在时间⑴=0和5天的聚集
权利要求
1.一种室温稳定并极少聚集的液体制剂，其包含(a)寡核苷酸，其包含^^ID No. 1或者包含变体寡核苷酸，所述变体寡核苷酸中不超 过3个非序列碱基与kq ID No. 1不同，以及(b)水相载体，其包含防止聚集的化合物，所述化合物选自单糖和二糖和/或糖醇。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述载体进一步包含磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制剂，其中所述载体进一步包含Tris缓冲液。
4.根据权利要求1、2或3中任一权利要求所述的制剂，其中所述反义寡核苷酸由Seq ID No. 1或变体寡核苷酸组成，所述变体寡核苷酸中不超过3个非序列碱基与％(1 ID No. 1 不同。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述寡核苷酸由具有如下修饰的ASeqID No. 1组成5，-GGGAMeCGMeCGGMeCGMeCTMeCGG-U-CA-U~3，其中下划线标记的核苷迨、4、％、和aeH)表示核糖核苷鸟苷、腺苷、5-甲基胞苷和5-甲 基尿苷的2’ -0-甲氧基乙基(2’ -Μ0Ε)修饰；其中G、MeC和T代表脱氧核糖核苷2’ -脱氧 鸟苷、2’ -脱氧-5-甲基胞苷和2’ -脱氧胸苷；并且其中核苷酸间键为硫代磷酸二酯(钠^Tt. ) ο
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为甘露醇。
7.根据权利要求6所述的制剂，其中所述甘露醇在所述水相载体中的含量以重量计为5%。
8.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的制剂，其中所述防止聚集的化合物为葡萄糖。
9.根据权利要求6所述的制剂，其中所述葡萄糖在所述水相载体中的含量以重量计为5%。
10.一种配制用于体内注射的反义寡核苷酸的方法，其包含将所述反义物在液体制剂 中与糖或糖醇混合，并将所述制剂保持在液体状态超过6小时的时间，可选地超过12小时 或18小时，在所述时间之后所述液体制剂用作体内注射的治疗组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述反义物根据权利要求1到9中任一权利要 求配制。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述反义物具有65%或更高的GC含量，例如 75%或更高。
全文摘要
一种室温稳定并极少聚集的液体制剂，其包含一种寡核苷酸和一种水相载体；其中所述寡核苷酸包含Seq ID No.1或者包含一种变体寡核苷酸，所述变体寡核苷酸中不超过3个非序列碱基与Seq ID No.1不同；所述水相载体包含一种防止聚集的化合物，其选自单糖和二糖和/或糖醇。
文档编号A61K31/713GK102099041SQ200980128901
公开日2011年6月15日 申请日期2009年7月13日 优先权日2008年7月18日
发明者L·尼克松, N·D·克里拉, T·K·海斯 申请人:Ogx科技公司