人抗pd-1、pd-l1和pd-l2的抗体及其应用的制作方法

专利名称：：人抗pd-1、pd-l1和pd-l2的抗体及其应用的制作方法人抗PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体及其应用相关申请本申请要求2008年9月沈日提交的美国临时申请号61/100，534的优先权权益，在此引入其全部作为参考。
背景技术：
：T细胞对外源多肽做出应答，必须由抗原递呈细胞(APC)向静止的T淋巴细胞提供至少两个信号(Jenkins,Μ.andSchwartz,R.(1987)J.Exp.Med.165:302-319；Mueller，D.L.等·(1990)J.Immunol.144:3701-3709)。第一个信号，其赋予免疫应答特异性，在识别主要组织相容性复合物(MHC)中存在的外源抗原肽后通过T细胞受体(TCR)转导。第二个信号，其被称为共刺激，诱导T细胞增殖并具有功能性(Lenschow等.(1996)Armu.Rev.Immunol.14:233)。共刺激既不具有抗原特异性，也不受MHC限制，并且由APC表达的不同细胞表面分子提供。(Jenkins,Μ.K.等.(1988)J.Immunol.140:3324-3330；Linsley，P.S.等.(1991)J.Exp.Med173:721-730；Gimmi,C.D.等.(1991)Proc.Natl.AcadSci.USA88:6575-6579；Young,J.W.等·(1992)J.Clin.Invest.90:229-237；Koulova,L.等·(1991)J.Exp.Med.173:759-762;Reiser，H.等·(1992)Proc.Natl.AcadSci.USA89:271-275；van-Seventer,G.A.等·(1990)J.Immunol.144:4579-4586；LaSalle,J.Μ.等·(1991)J.Immunol.147:774-80；Dustin,Μ.I.等·(1989)J.Exp.Med.169:503；Armitage,R.J.等.(1992)Nature357:80-82；Liu,Y.等·(1992)J.Exp.Med175437-445)。蛋白质B7-1(CD80)和B7-2(CD86)是重要的共刺激分子(Freeman等·(1991)J.Exp.Med.174:625；Freeman等.(1989)J.Immunol.143:2714；Azuma等.(1993)Nature366:76;Freeman等.(1993)Science262:909)。B7_2在初级免疫应答中起主要作用，而B7-1，其在免疫应答后期被上调，可能对延长初次T细胞应答或共刺激二次T细胞应答是重要的(Bluestone(1995)Immunity2:555)。⑶观是B7-1和B7-2的配体，其被静止的T细胞组成型表达，并且在T细胞激活后表达增加。结合TCR信号的CM8的连接造成共刺激信号转导，该共刺激信号诱导T细胞增殖和分泌IL-2(Linsley，P.S.等·(1991)J.Exp.Med.173:721-730；Gimmi,C.D.等·(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:6575-6579June,C.H.等·(1990)Immunol.Today11211-6；Harding,F.Α.等.(1992)Nature356:607-609)。第二个B7-1和B7-2配体-CTLA4(⑶15，与⑶观同源，但不被静止的T细胞表达。CTLA4表达在T细胞激活后发生(Brunet,J.F.等.(1987)Nature328=267-270)CTLA4的连接造成阻止T细胞增殖和细胞因子分泌的抑制信号转导。因此，CTLA4是重要的T细胞应答负调控因子(Waterhouse等·(1995)Science270:985)(AllisonandKrummel(1995)Science270:932)。所发现的CD^家族第三个成员是ICOS(Hutloff等.(1999)Nature397263；WO98/38216)。ICOS通过其配体(ICOS-L)的连接造成高水平的细胞因子表达，但造成有限的T细胞扩张(RileyJ.L.等·(2001)J.Immunol.166:4943-48；AicherA.等·(2000)J.Immunol.164:4689-96；MagesH.W.^.(2000)Eur.JImmunol.30:1040-7；BrodieD.^.(2000)Curr.Biol.10333-6；LingV.等.O000)J.Immunol.1641653-7;YoshinagaS.K.等.(1999)Nature402:827-32)。如果T细胞在共刺激信号缺失下通过T细胞受体受到刺激，其就变为无应答性、无变应性，或死亡。已在体外和若干体内模型系统中证明B7:ra^/CTLA4/IC0S共刺激途径的重要性。该共刺激途径的阻断造成鼠和人系统的抗原特异耐受性得到发展(Harding，F.Α.等·(1992)Nature356:607609；Lenschow,D.J.等·(1992)Science257789792；Turka,L.A.^.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1110211105；Gimmi,C.D.^.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:65866590；Boussiotis,V.等·(1993)J.Exp.Med.178:17531763)。相反，B7阴性鼠肿瘤细胞的B7表达诱导T细胞介导的特异性免疫，该特异性免疫伴随肿瘤排斥和长期持续防止肿瘤侵袭(Chen，L.等.(199细胞7110931102；Townsend,S.E.andAllison,J.P.(1993)Science259:368370；Baskar,S.等·(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:56875690·)。因此，共刺激的途径的控制提供巨大的潜力来刺激或抑制人免疫应答。B7-1和⑶观家族更多成员的发现已经揭示了另外的向T细胞提供共刺激性第二信号和抑制性第二信号的途径。该更新途径其中之一由程序性死亡1(programmeddeath1)(PD-1；也被称为CD279)受体及其配体PD-Ll(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)代表。PD-I是⑶^/CTLA4家族的成员，其在激活而非静止的T细胞上表达(Nishimura等·(1996)Int.Immunol.8773)0通过其配体的PD-I连接介导了抑制信号，该抑制信号造成细胞因子的生成减少和T细胞的存活减少(Nishimura等.(1999)Immunity11:141；Nishimura等.Q001)Science291:319；Chemnitz等.Q004)J.Immunol.173:945)。PD-Ll是B7家族成员，其在多种细胞类型上表达，包括APC和激活的T细胞(Yamazaki等·(2002)J.Immunol.169:5538)。PD-Ll与PD-I和B7-1结合。通过PD-Ll结合T细胞表达的B7-1和通过B7-1结合T细胞表达的PD-Ll导致T细胞的抑制(Butte等.(2007)Immunity27:111)。也有这样的证据与其他B7家族成员一样，PD-Ll也可向T细胞提供共刺激信号(Subudhi等.Q004)J.Clin.Invest.113:694；Tamura等.Q001)Blood97:1809)。PD-L2是在不同APC上表达的B7家族成员，包括树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性肥大细胞(Zhong等.Q007)Eur.J.Immunol.37:2405)。APC表达的PD-L2能通过PD-1的连接抑制T细胞激活和通过PD-I独立机制共刺激T细胞激活(Shin等.000J.Exp.Med.2011531)。此外，树突细胞表达的PD-L2的连接导致树突细胞细胞因子表达和存活提高(Radhakrishnan等·(2003)J.Immunol.37:1827；Nguyen等·(2002)J.Exp.Med.1961393)。PD-1、PD-L1和PD-L2的结构和表达以及这些分子在调控T细胞激活和耐受性情况中的信号传导特征和功能(例如，治疗效果)在Kier等·(2008)Ann.Rev.Immunol.26:677中得到更详细地评述，在此引入其全部作为参考。对这种和其他共刺激途径的控制为刺激或抑制人免疫应答提供巨大的潜力，并且对用于实现这种控制的组合物和方法存在需要。发明概述本发明基于与人PD-1、人PD-Ll和人PD-L2特异性结合的新型复合型人单克隆抗体的产生和分离、以及这种新型抗体的表征及其治疗多种由PD-1、PD-Ll和/或PD-L2介导的病症的治疗价值的证明。用于人源化鼠抗体的常用技术通常生成这样的人源化抗体相比原鼠抗体具有降低的抗原结合亲和力(AlmagroandFransson(2008)FrontiersinBioscience13:1619-1633；FooteandWinter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；Hwang等·(2005)Methods36:35-42)。惊奇的是，本发明的复合型人抗体(composite,humanantibody)已经显示出以非常接近鼠抗体的亲和力结合PD_1、PD-Ll或PD-L2。此外，常规的人源化技术生成保留一些鼠序列的人源化抗体。因此，这种抗体在被给予人类时可保留免疫原性。例如，人源化抗体CAMPATH在约50%患者中诱发出免疫原性。另一方面，本发明的复合型人抗体完全得自人源序列。因此，其可能具有显著降低的免疫原性，并且在被给予人类患者时比其他抗人PD-1、PD-L1和/或PD-L2抗体在治疗上更有效和更有用。因此，本发明的复合型人抗体为治疗和预防由PD-1、PD-Ll和/或PD-L2介导的疾病提供了改善的方法，部分归因于其独特的特异性、亲和力、结构、功能活性及其得自人抗体序列的事实。本发明也基于新治疗应用的发现，包括通过给予本文所述的复合型人抗体，治疗持续性传染病、哮喘、炎性疾病和癌症。本发明的一个实施方式是如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-I蛋白质、PD-L1蛋白质或PD-L2蛋白质(如人PD-1、PD-L1或PD-L2蛋白质)，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、人或人的，并且含有一个、两个、三个、四个、五个或六个选自SEQIDNO7-24的⑶R序列。本发明也提供如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-I蛋白质(如包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的PD-I蛋白质)，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、人或人的，并且含有包含SEQIDNO7-9(SEQIDNO:7的CDRl序列、SEQIDNO8的CDR2序列和SEQIDNO9的CDR3序列)的重链可变区序列和/或包含SEQIDNO:10-12(SEQIDNO10的CDRl序列、SEQIDNO:11的CDR2序列和SEQIDN0:12&CDR3序列)的轻链可变区序列。本发明也提供如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-Ll蛋白质(如，包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的PD-Ll蛋白质)，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、人或人的，并且含有包含SEQIDNO:13-15(SEQIDN0:13的⑶Rl序列、SEQIDNO14的CDR2序列和SEQIDNO15的CDR3序列)的重链可变区序列和/或包含SEQIDNO:16-18(SEQIDNO16的CDRl序列、SEQIDNO17的CDR2序列和SEQIDNO18的⑶R3序列)的轻链可变区序列。本发明也提供如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-L2蛋白质(如，包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的PD-L2蛋白质)，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、人或人的，并且含有包含SEQIDNO:19-21(SEQIDN0:19的CDRl序列、SEQIDNO20的CDR2序列和SEQIDNO21的CDR3序列)的重链可变区序列和/或包含SEQIDNO:22-24(SEQIDNO22的CDRl序列、SEQIDNO23的CDR2序列和SEQIDNO24的⑶R3序列)的轻链可变区序列。本发明也包括如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-I蛋白质、PD-Ll蛋白质或PD-L2蛋白质(如，人PD-I、PD-Ll或PD-L2蛋白质)，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、和/或人的，并且含有选自SEQIDNO:25-、34-38或43-47的重链序列、或者与SEQIDNO25~29、34-38或43-47具有至少约95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或以上相同同源性的序列；和/或选自SEQIDNO:30-33,39-42或48-51的轻链序列、或者与SEQIDNO:30_33、39_42或48-51具有至少约95%、96%、97%,98%,99%,99.5%,99.9%或以上相同同源性的序列。本发明也提供如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合包含SEQIDNO2的氨基酸序列的PD-I蛋白质，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的或人的，并且含有选自SEQIDNO:25-的重链序列、或者与SEQIDNO:25-具有至少约95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或以上同一性或同源性的序列；和/或选自SEQIDNO:30-33的轻链序列、或者与SEQIDNO:30-33具有至少约95%、96%、97%、98%,99%,99.5%,99.9%或以上同一性或同源性的序列。例如，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:27或观的重链可变区序列和SEQIDNO:32或33的轻链可变区序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:28的重链可变区序列和SEQIDNO32的轻链可变区序列。本发明也提供如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合包含SEQIDNO4的氨基酸序列的PD-Ll蛋白质，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的或人的，并且含有选自SEQIDNO:34-38的重链序列、或者与SEQIDNO:34-38具有至少约95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或以上同一性或同源性的序列；和/或选自SEQIDNO:39-42的轻链序列、或者与SEQIDNO:39-42具有至少约95%、96%、97%、98%,99%,99.5%,99.9%或以上同一性或同源性的序列。例如，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:35或37的重链可变区序列和SEQIDNO:39、40或42的轻链可变区序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:35的重链可变区序列和SEQIDNO42的轻链可变区序列。本发明也提供如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合包含SEQIDNO6的氨基酸序列的PD-L2蛋白质，其中分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的或人的，并且含有选自SEQIDNO:43-47的重链序列、或者与SEQIDNO:43-47具有至少约95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或以上同一性或同源性的序列；和/或选自SEQIDNO:48-51的轻链序列、或者与SEQIDNO:48-51具有至少约95%、96%、97%、98%,99%,99.5%,99.9%或以上同一性或同源性的序列。例如，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:44或46的重链可变区序列和SEQIDNO:49、50或51的轻链可变区序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:46的重链可变区序列和SEQIDNO51的轻链可变区序列。本发明的另一个实施方式是本文所述的如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-I蛋白质，其中分离的抗体在竞争ELISA分析中抑制生物素化的EH12.2H7抗体与Fc-PD-I的结合。另一个实施方式是本文所述的如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-Ll蛋白质，其中分离的抗体在竞争ELISA分析中抑制生物素化抗体与Fc-PD-Ll的结合。另一个实施方式是本文所述的如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-L2蛋白质，其中分离的抗体在竞争ELISA分析中抑制生物素化的MF.10C12抗体与Fc-PD-L2的结合。本发明的另一个实施方式是本文所述的如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-I蛋白质，其中分离的抗体抑制PD-I介导的信号。另一个实施方式是本文所述的如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-Ll蛋白质，其中分离的抗体抑制PD-Ll介导的信号。另一个实施方式是本文所述的如下分离的抗体或其抗原结合片段其结合PD-L2蛋白质，其中分离的抗体抑制PD-L2介导的信号。特别地，本发明的实施方式是编码多肽的分离的核酸，其中多肽包含选自SEQIDNO:25-51的序列、或者与SEQIDNO:25-51具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上同一性或同源性的序列。另一个实施方式是包含这些核酸中一个或多个的载体、宿主细胞或动物。另一方面是在严格的条件下与下述核酸的互补序列(complement)杂交的核酸所述核酸编码选自SEQIDNO25-51的多肽或与SEQIDNO:25-51具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98^^99%或以上相同同源性的序列。本发明也提供编码本文所述抗体或其抗原结合片段中任一个的重链可变区和/或轻链可变区的分离的核酸。在一些实施方式中，核酸在载体——如，表达载体——中。本发明也提供宿主细胞，其含有一种或多种编码本文所述抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸。在一些实施方式中，宿主细胞产生抗体或抗原结合片段。本发明也提供产生本文所述抗体或抗原结合片段的方法，包括培养产生抗体或抗原结合片段的细胞和从细胞培养物中回收抗体或抗原结合片段。本发明进一步包括药物组合物，包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。本发明包括使耗竭的T细胞重新激活的方法，包括用本文所述的抗体或其抗原结合片段在体外、离体或或体内接触T细胞群——其中至少一些细胞表达PD-、PD-Ll和/或PD-L2。本发明进一步涉及治疗遭受持续感染——包括病毒感染、细菌感染、蠕虫感染或原生动物感染——的个体的方法，包括向个体给予包含有效量本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物。本发明进一步包括治疗癌症的方法，包括向个体给予包含有效量本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物，包括其中分离的抗体诱导出抗体介导的细胞毒性，或经修饰诱导出抗体介导的细胞毒性，或与选自毒素和成像剂的药剂(试剂)结合。在一些实施方式中，与PD-Ll结合的抗体或抗原结合片段被给予患有过表达PD-Ll癌症的个体。在一些实施方式中，与PD-L2结合的抗体或抗原结合片段被给与患有过表达PD-L2癌症的个体。本发明进一步涉及治疗遭受哮喘的个体的方法，包括向个体给予组合物，该组合物包含有效量本文所述的结合PD-L2蛋白质的分离的抗体或其抗原结合片段。本发明也包括治疗遭受炎性疾病或移植排斥的个体的方法，包括向个体给予组合物，该组合物包含有效量本文所述的结合PD-Ll蛋白质或PD-L2蛋白质的分离的抗体或其抗原结合片段。本发明也包括用于本文所述方法的任一个中的本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽。本发明也包括本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽对于药物——如用于治疗个体中的本文所述疾病中任一种疾病的药物——制造的应用。附图简述图1显示本发明所述用于克隆组装的人免疫球蛋白序列的表达载体的示意图。图2A-2E显示复合型人重链(图2A，VHl；图2B，VH2；图2C，VH3；和图2D，VH4；图2E，VH5)可变区序列，其被设计为相应于鼠抗人PD-I抗体EH12.2H7的重链可变区序列。图3A-3D显示复合型人轻链(图3A，Vκ1；图3B，Vκ2；图3C，Vκ3；图3D，Vκ4)可变区序列，其被设计为相应于鼠抗人PD-I抗体ΕΗ12.2Η7的轻链可变区序列。图4Α-4Ε显示复合型人重链(图4Α，VHl；图4Β，VH2；图4C，VH3；图4D，VH4；图4Ε，VH5)可变区序列，其被设计为相应于鼠抗人PD-Ll抗体^E.2Α3的重链可变区序列。图5A-OT显示复合型人轻链(图5Α，Vκ1；图5Β，Vκ2；图5C，Vκ3；图5D，Vκ4)可变区序列，其被设计为相应于鼠抗人PD-Ll抗体^E.2Α3的轻链可变区序列。图6Α-6Ε显示复合型人重链(图6Α，VHl；图6Β，VH2；图6C，VH3；图6D，VH4；图6E,VH5)可变区序列，其被设计为相应于鼠抗人PD-L2抗体MF.10C12的重链可变区序列。图7A-7D显示复合型人轻链(图7A，Vκ1；图7B，Vκ2；图7C，Vκ3；图7D，Vκ4)可变区序列，其被设计为相应于鼠抗人PD-L2抗体MF.10C12的轻链可变区序列。图8A-8C显示分别相应于鼠抗人抗体ΕΗ12.2Η7.29Ε.2Α3、和24F.10C12的1μg复合型人抗体的SDS-PAGE结果。图9A-9C显示分别相应于和相对于鼠抗人抗体EH12.2H7.29E.2A3和MF.10C12的人抗体的ELISA竞争结果。在图9A中，通过竞争ELISA检验纯化的抗体与人PD-I的结合。将不同浓度的各个抗体(0.06μg/ml至8μg/ml)与固定浓度的生物素化的EH12.2H7(40ng/ml)混合，并结合于PD-1涂布的immulonmaxisorb板。通过链霉抗生物素蛋白-HRP和OPD底物检测结合。在板读数仪(platereader)上测量490nm下的吸光度，并将其相对于检验抗体浓度作图。在图9B中，通过竞争ELISA检验纯化的抗体与人PD-Ll的结合。将不同浓度的各个抗体(0.02μg/ml至8μg/ml)与固定浓度的生物素化的29E.2A3(40ng/ml)混合，并结合于PD-L1涂布的immulonmaxisorb板。通过链霉抗生物素蛋白-HRP和OPD底物检测结合。在板读数仪上测量490nm下的吸光度，并将其相对于检验抗体浓度作图。在图9C中，通过竞争ELISA检验纯化的抗体与人PD-L2的结合。将不同浓度的各个抗体(0.02μg/ml至8μg/ml)与固定浓度的生物素化的MF.10C12(40ng/ml)混合，并结合于PD-L2涂层的immulonmaxisorb板。通过链霉抗生物素蛋白-HRP和OPD底物检测结合。在板读数仪上测量490nm下的吸光度，并将其相对于检验抗体浓度作图。图10A-10C显示由复合型人抗体的ELISA竞争分析产生的IC5tl结合数据，该复合型人抗体根据分别被设计为相应于鼠抗人抗体EH12.2H7(图10A)J9E.2A3(图10B)和MF.10C12(图10C)的那些重链和轻链的复合型人重链和轻链的不同组合而形成。该分析如图3所示进行。重链和轻链的每一种组合的IC5tl相对于鼠抗体的IC5tl标准化。ND=无数据。图11显示PD-I、PD-Ll和PD-L2的氨基酸序列。图12显示本文所述复合型人抗体其中一些的⑶R区的氨基酸序列。图13显示本文所述复合型人抗体其中一些的可变区的氨基酸序列。图14A和14B显示在体外人源化抗PD-1抗体和人源化抗PD-L1抗体对SIVGag特异性CD8T细胞的增殖能力的影响。每一个标记表示一个猕猴。括号中的数表示在阻断Ab存在下相对于无阻断Ab时的增殖增加倍数。图15显示PD-Ll的阻断使肝内⑶8T细胞抗原驱动的增殖恢复(代表性数据来自动物1564)。发明详述本发明提供了基于新型抗体的用于治疗和诊断多种由PD-1、PD-Ll和/或PD-L2介导的疾病的治疗剂(例如，持续性传染病、哮喘、炎性疾病、移植排斥和癌症的治疗)。为了使本发明更易于理解，首先定义某些术语。另外的定义在通篇细述中提出。如本文所用，除非另外明确定义，术语“PD-1”、“PD-Ll”和“PD-L2”包括由细胞自然表达的任何变体或同种型和/或其片段，该片段具有全长多肽的至少一种生物活性。此外，术语“PD-1配体”包括PD-Ll(Freeman等·(2000)J.Exp.Med.192:1027)和PD-L2(Latchman等.(2001)Nat.Immunol.2:261)其中一种或二者以及由细胞自然表达的任何变体或同种型和/或其片段，该片段具有全长多肽的至少一种生物活性。例如，来自不同物种——包括人——的PD-1、PD-Ll和PD-L2序列在本领域中被公知(参见，例如，在此引入其全部作为参考，Honjo等，美国专利号5，629，204，其公开了人和小鼠PD-I序列；Wood等，美国专利7，105，328，其公开了人PD-I序列；Chen等，美国专利6，803，192，其公开了人和小鼠PD-Ll序列；Wood等，美国专利7，105，328，其公开了人PD-Ll序列；Freeman等，美国专利公开20020164600，其公开了人和小鼠PD-L2序列)。如本文所用，术语“抗体”包括整个抗体及其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。“抗体”指包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(本文中简称为Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(本文中简称为和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。Vh区和\区可被进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，与较保守区穿插，该较保守区被称为框架区(FR)。各Vh和八由三个⑶R和四个FR组成，从氨基末端向羧基末端以下列顺序排列FR1，⑶Rl，FR2，⑶R2，FR3，⑶R3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。“失活抗体”指不诱导补体系统的抗体。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在本文中使用时指抗体可变结构域的区域，该区域的序列高变和/或形成结构上限定的环。一般，抗体包含六个HVR;三个在VH(H1、H2、H3)中和三个在VL(L1、L2、L3)中。在天然抗体中，H3和L3在六个HVR中显示最具多样性，尤其认为H3在赋予抗体细微特异性中具有独一无二的作用。参见，例如，Xu等，Immunity13:37-45(2000)JohnsonandWuinMethodsinMolecularBiology248:l-25(Lo,ed.，HumanPress,Totowa，NJ，2003)。事实上，天然存在的仅由重链组成的骆驼(camelid)抗体在轻链的缺失下具有功能性和稳定性。参见，例如，Hamers-Casterman等，NatureM3446-448(1993)和Sheriff等，NatureStruct.Biol.3:733-736(1996)。本文应用和包括大量高变区描述。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性，并且最常用(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia相反指结构环的位置(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。ChothiaCDR-Hl环的末端在利用Kabat编号规则编号时取决于环长在H32和H34(参见以下)之间变化(这是因为Kabat编号方案着点于在H35A和H35B的插入；如果35A和35B均不存在，环在32结束；如果仅35A存在，环在33结束；如果35A和35B均存在，环在34结束)。AbM高变区表示KabatCDR和Chothia结构环之间的折中，并且通过OxfordMolecular，sAbM抗体模拟软件应用。基记录在下C环LlL2iContact"高变区基于可用复杂晶体结构的分析。这些高变区中每一个的残KabatL24-L34L50-L56AbML24-L34L50-L56ChothiaL24-L34L50-L56ContactL30-L36L46-L55L3HlHlH2H3L89-L97L89-L97L89-L97L89-L96H31-H35BH26-H35BH26-H32,33或34H30-H35B(Kabat编号)H31-H35H26-H35H26-H32H30-H35(Chothia编号)H50-H65H50-H58H52-H56H47-H58H95-H102H95-H102H95-H102H93-H101高变区可包含如下“延伸高变区”:VL中的M-36或M-34(Li),46-56或50-56(L2)和89-97(L3)和VH中的26-35B(Hl)、50_65、47_65或49-65(H2)和93-102,94-102或95-102(H3)。这些延伸高变区是Kabat和Chothia定义的典型组合，其可任选地进一步包含利用Contact定义鉴定的残基。对这些定义中的每一个，根据上述Kabat等，将可变结构域残基编号。“框架”或“FR”残基是除本文所定义的HVR残基外的那些可变结构域残基。表达“如Kabat中的的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体指上述Kabat等中的用于抗体编译中重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。利用该编号系统，实际的线性氨基酸序列相应于可变结构域的FR或HVR缩短或插入可包含较少的氨基酸或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可在H2的残基52后包含一个插入氨基酸(根据Kabat的残基52a)，可在重链FR残基82后包含插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列比对可确定给定抗体的Kabat残基编号。本文中术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变种Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以发生改变，但通常限定人IgG重链Fc区从或从ftx)230位的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可被去除，例如，在抗体生成或纯化过程中，或通过重组地改造编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组成可包含全部K447残基被去除的抗体群、无K447残基被去除的抗体群、和具有含K447残基和无K447残基的抗体混合物的抗体群。用于本发明所述抗体的适当的天然序列Fc区包括人IgGl、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。“Fe受体”或“FcR”描述了结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体可选的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcyRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域不同的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。(参见M.Dagron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在Ravetch禾口Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等，Immunomethods4:25-34(1994)；禾口deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中得到评述。其他FcR，包括未来将鉴定的FcR，也被本文中的术语“FcR”包含在内。术语“⑶R”及其复数“⑶Rs”指互补决定区(⑶R)，其中三个构成轻链可变区的结合特征(⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)，三个构成重链可变区的结合特征(⑶RH1、⑶RH2和CDRH3)。CDRs有助于抗体分子的功能活性，并被包含支架区或框架区的氨基酸序列分开。确切的限定⑶R边界和长度经受不同的分类和编号系统。⑶Rs由此可被Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义——包括本文所述的编号系统——指代。尽管边界不同，这些系统中的每一个于可变序列内在所谓“高变区”的构成中具有一定程度的重叠。根据这些系统的⑶R定义由此关于相邻框架区在长度和边界区域上可不同。参见，例如Kabat、Chothia,禾口/或MacCallum等(Kabat等，于"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,"5thEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1992；Chothia等，J.Mol.Biol.，1987，196:901；和MacCallum等，J.Mol.Biol.，1996，262:732，在此引入其每一个全部作为参考)。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简化为“抗体部分”)指保留特异性结合抗原(例如，PD-UPD-Ll和/或PD-L2)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段实例包括(i)Fab片段，由Vh、Vl、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含由二硫桥在绞链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由Vh和CHl结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的Vh和八结构域组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544546)，其由Vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个分离的CDRs的组合，其可任选地通过合成的连接体连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域Vh和\被单独的基因编码，但可利用重组方法将其通过合成的连接体连接，该合成的连接体使其能形成单个的蛋白质链，其中区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))；参见，例如，Bird等.(1988)Science242:423似6;和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:58795883)。这种单链抗体也意为被包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。利用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选可用的片段。抗体可以是多克隆或单克隆的；异种的、同种异基因的或同种同基因的；或其改性形式(例如，人源化的、嵌合的等)。抗体也可以是全人类的。优选地，本发明的抗体特异性结合或基本特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2多肽。本文所用的术语“单克隆抗体”指对特定的表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性并具有得自人生殖系或非生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方式中，由杂交瘤生成人单克隆抗体，该杂交瘤包含得自转基因非人动物——例如，转基因小鼠，其具有包含融合到永生细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组——的B细胞。如本文所用，术语“分离的抗体”意图指基本不含其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，特异性结合PD-1、PD-L1或PD-L2的分离的抗体基本不含不分别结合PD-1、PD-Ll或PD-L2的抗体)。然而，特异性结合PD-I、PD-Ll和/或PD-L2表位的分离的抗体可以具有分别与不同物种的其他PD-1、PD-L1和/或PD-L2蛋白质的交叉反应性。但是，抗体总是优选结合人PD-1、PD-L1和/或PD-L2。此外，分离的抗体一般基本不含其他细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方式中，对PD-I、PD-L1和/或PD-L2具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合被组合在明确限定的组合物中。如本文所用，术语“人源化抗体”指由得自除人类外哺乳动物的抗体CDR和人抗体的FR区和恒定区组成的抗体。人源化抗体可用作根据本发明治疗剂的有效组分，因为人源化抗体在人体中的抗原性降低。如本文所用，术语“复合型抗体(复合抗体，compositeantibody)”指这样的抗体其具有包含来自两个或更多个不相关可变区的生殖系或非生殖系免疫球蛋白序列的可变区。此外，术语“复合型人抗体”指这样的抗体其具有得自人生殖系或非生殖系免疫球蛋白序列的恒定区和包含来自两个或更多个不相关人可变区的人生殖系或非生殖系序列的可变区。复合型人抗体可用作根据本发明的治疗剂的有效组分，因为复合型人抗体在人体中的抗原性降低。如本文所用，术语“重组的人抗体”包括通过重组手段制备、表达、生成或分离的全部人抗体，如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)分离的抗体或由其制成的杂交瘤(下文第I节中进一步说明)；(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞——例如，从转染瘤——分离的抗体；(c)从重组的组合人抗体库分离的抗体；和(d)通过任意其他手段制备、表达、生成或分离的抗体，包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。这种重组的人抗体具有得自人生殖系和/或非生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而在某些实施方式中，这种重组的人抗体可进行体外诱变(或在应用人Ig序列转基因动物时的体内体细胞诱变)，因此重组的抗体的Vh和\区的氨基酸序列是这样的序列虽然得自人生殖系Vh和\序列并与人生殖系Vh和\序列相关，但可不在人抗体生殖系组库系统中体内天然存在。如本文所用，术语“异源抗体”被定义为与转基因非人生物体生成这种抗体有关。此术语指这样的抗体具有与非由转基因非人动物组成的生物体中所发现的序列相应的氨基酸序列或编码核酸序列，并且一般来自除转基因非人动物外的物种。如本文所用，术语“KD”意指特定抗体抗原相互作用的解离平衡常数。如本文所用，术语“特异性结合”指抗体与预定抗原结合。一般，在将重组的人PD-I、PD-Ll或PD-L2用作分析物和将抗体用作配体，于BIAC0RE3000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时，抗体以约小于IO-7M——如约小于IO-8MUO-9M或KTiciM或更低——的亲和力(Kd)结合，并且以如下亲和力与预定抗原结合比其与除预定抗原或密切相关抗原外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力大至少1.1、1.2、1.3、1.4、1·5、1·6、1·7、1·8、1·9、2·0、2·5、3·0、3·5、4·0、4·5、5·0、6·0、7·0、8·0、9·0、或10.0倍。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性地结合抗原的抗体”互换使用。如本文所用，术语“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如，IgM或IgGl)。如本文所用，术语“糖基化模式”被定义为与蛋白质——更具体地与免疫球蛋白蛋白质——共价连接的糖单位模式。异源抗体的糖基化模式可被表征为与非人转基因动物物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式基本相似，此时本领域技术人员会知道异源抗体的糖基化模式与非人转基因动物物种中所述的糖基化模式比与得到转基因的CH基因的物种更为相似。如本文所用，被用于物质的术语“天然存在”指这样的事实可在自然中发现该物质。例如，生物体(包括病毒)中存在、可从天然来源分离并且未被人类在实验室中有目的地修饰的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。如本文所用，术语“重排的”指这样的重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型其中V区段位于与分别实质上编码完整的Vh和\结构域的构象的D-J或J区段直接相邻。通过与生殖系DNA比较，可确认重排的免疫球蛋白基因基因座；重排的基因座会具有至少一个重组的七聚物/九聚物同源性成分。如本文所用，关于V区段的术语“未重排的”或“生殖系构型”指这样的构型其中V区段没有重组，从而与D或J区段直接相邻。如本文所用，术语“核酸分子”意为包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。如本文所用，关于编码与PD-1、PD_L1或PD-L2结合的抗体或抗体部分(例如，VH、Vl,CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”意指这样的核酸分子其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与除PD-1、PD-Ll或PD-L2外的抗原分别结合的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，该其他序列可天然地侧接(flank)人基因组DNA中的核酸。图2_7分别相应于包含本发明的人抗PD-1、PD-L1或PD-L2抗体的重链(Vh)和轻链(Vj可变区的核苷酸和氨基酸序列。本发明也包括图(例如，图2-7)中所示的序列的“保守序列修饰”，包括核苷酸和氨基酸序列修饰，该修饰不显著影响或改变由核苷酸序列编码的抗体或含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征。这种保守序列修饰包括核苷酸和氨基置换、增加和剔除。通过本领域已知的标准技术——如定点诱变和PCR介导的诱变——可将修饰引入图(例如，图2-7)中所示的序列中。保守的氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的置换。本领域已定义具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，人抗PD-1、抗PD-Ll或抗PD-L2抗体中预期的非关键氨基酸残基优选被相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换。或者，在另一个实施方式中，如通过饱和诱变，可沿全部或部分人抗PD-1、PD-Ll或PD-L2抗体编码序列随机引入突变，并且由结合活性筛选由此产生的改性人抗PD-1、抗PD-Ll或抗PD-L2抗体。因此，由本文所公开的重链和轻链可变区核苷酸序列编码和/或包含本文所公开的重链和轻链可变区氨基酸序列(例如，图2-7)的抗体包括基本相似的抗体，该基本相似的抗体由经保守修饰的相似序列编码或包含经保守修饰的相似序列。下面提供关于如何可以基于本文所公开的序列(即，重链和轻链可变区)(例如，图2-7)生成这种基本相似的抗体的进一步讨论。此外，如通过遗传密码(以下所示)所限定，特定蛋白质的氨基酸序列与可编码该蛋白质的核苷酸序列之间具有已知和明确的相应性。同样，如通过遗传密码所限定，特定核酸的核苷酸序列与由该核酸编码的氨基酸序列之间具有已知和明确的相应性。遗传密码丙氨酸(Ala，A)GCA、GCC、GCG、GCT精氨酸(Arg,R)AGA、ACG、CGA、CGC、,CGG、CGT天冬酰胺(Asn,N)AAC、AAT天冬氨酸(Asp,D)GAC、GAT半胱氨酸(Cys,C)TGC、TGT谷氨酸(Glu,E)GAA、GAG谷氨酰胺(Gin,Q)CAA、CAG甘氨酸(Gly，G)GGA、GGC、GGG、GGT组氨酸(His,H)CAC、CAT异亮氨酸(lie,I)ATA、ATC、ATT亮氨酸(Leu,L)CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG赖氨酸(Lys，K)AAA、AAG蛋氨酸(Met,M)ATG苯丙氨酸(Phe,F；TTC、TTT脯氨酸(Pro,P)CCA、CCC、CCG、CCT丝氨酸(Ser,S)AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT苏氨酸(Thr,T)ACA、ACC、ACG、ACT色氨酸(Trp,W)TGG酪氨酸(Tyr,Y)TAC、TAT缬氨酸(Val,V)GTA、GTC、GTG、GTT终止信号(终)TAA、TAG、TGA遗传密码的重要和公知的特征是其冗余性，S卩，对于大多数用于构成蛋白质的氨基酸来说，可利用一个以上的编码核苷酸三联体(以上所述)。因此，多个不同的核苷酸序列可编码给定的氨基酸序列。这种核苷酸序列被认为在功能上是等效的，因为其造成在所有生物体中生成相同的氨基酸序列(虽然某些生物体翻译一些序列可能比翻译其他序列更有效)。此外，有时可在给定的核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。这种甲基化作用不影响三核苷酸密码子与相应氨基酸之间的编码关系。对于核酸，术语“基本同源性”指带有适当的核苷酸插入或删除的两个核酸或其指定的序列在最优化比对和比较时，至少约80%核苷酸，通常至少约90%、91%、92%、93%、94^^95%,96%或以上的核苷酸，更优选至少约97^^98%,99%或以上的核苷酸是相同的。或者，在该区段将在选择性杂交条件下与补链杂交时，存在基本同源性。两个序列之间的同一性百分数是序列所共有的相同位置数目的函数(S卩，同一性％=相同位置#/总位置#X100)，考虑空位数和各空位的长度，需要将其引入以对两个序列进行最优化比对。可利用数学算法实现两序列间的序列比较和同一性百分数确定，如下列非限制性实例所述。可应用GCG软件包(得自万维网GCG公司网站)的GAP程序、应用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重(gapweight)40、50、60、70或80和长度权重(lengthweight)1、2、3、4、5或6确定两个核苷酸序列间的同一性百分数。也可应用已被并入ALIGN程序版)的E.MeyersandW.Miller(CABIOS,41117(1989))算法、应用PAMl2O权重残基表(weightresiduetable)、空位长度罚值12和空位罚值4确定两个核苷酸或氨基酸序列间的同一性百分数。此外，可应用已被并入GCG软件包(得自万维网GCG公司网站)中的GAP程序的NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444453(1970))算法、应用Blosum62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6确定两个氨基酸序列间的同一性百分数。本发明所述的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”，从而进行对公共数据库的搜索，例如，鉴定相关的序列。这种搜索可应用Altschul，等.(1990)J.Mol.Biol.21540310的NBLAST和XBLAST程序(2.O版)进行。BLAST核苷酸搜索可以以NBLAST程序、分值=100、字长=12进行，得到与本发明所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以以XBLAST程序、分值=50、字长=3进行，得到与本发明所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为以比较为目的得到空位比对，可以如Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):33893402所述，应用GappedBLAST。当应用BLAST和GappedBLAST程序时，可使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(得自万维网NCBI网站)。核酸可存在于整个细胞、细胞溶胞产物或者部分纯化或基本纯形式中。在通过标准技术——包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳及本领域公知的其他技术——从其他细胞组分或其他杂质——例如，其他细胞核酸或蛋白质——被提纯出时，核酸是“分离的”或“呈基本纯的”。参见，F.Ausubel，等，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。本发明所述的来自cDNA、基因组或其混合物的核酸组分——通常在天然序列(除了修饰的酶切位点及类似位点)中——可按照标准技术进行突变，以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可如所需地影响氨基酸序列。特别地，考虑与天然V、D、J、恒定序列(constant)、转换序列(switches)和本文所述的其他这种序列基本同源或从天然V、D、J、恒定序列(constant)、转换序列(switches)和本文所述的其他这种序列得到的DNA序列(其中“得到”指序列与另一个序列相同或从另一个序列修饰的)。当其处于与另一个核酸序列的功能关系中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果其影响序列转录，则启动子或增强子被可操作地连接于编码序列。关于转录调节序列，可操作地连接意指被连接的DNA序列相邻，并且在必要时结合相邻且在读码框中的两个蛋白质编码区。对于转换序列，可操作地连接指序列能够影响转换重组。如本文所用，术语“载体”意指能运输已与其所连接的另一个核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其中可连接另外的DNA区段。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可被连接到病毒基因组中。某些载体能在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在被引入宿主细胞时被整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简化为“表达载体”)。一般，重组DNA技术中有用的表达载体通常是以质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意图包括表达载体的这种其他形式，如具有同等功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。如本文所用，术语“重组的宿主细胞”(或简化为“宿主细胞”)意指重组的表达载体已被引入其中的细胞。应当理解的是，这种术语不仅意指特定的对象细胞，也指这种细胞的子代。由于某些修饰可由于突变或环境影响存在于后代中，这样的子代事实上可不与亲代细胞一致，但仍被包含在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。如本文所用，术语“对象(受试者)”包括任何人或非人动物。例如，本发明所述的方法和组合物可用于治疗患有炎性疾病——如关节炎，例如，类风湿关节炎——的对象。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。如本文所用，术语“调节”包括上调和下调，例如，增强或抑制应答。如本文所用，术语“抑制”包括例如特定作用、功能或相互作用的降低、限制或阻断。如本文所用，术语“免疫细胞”指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞具有造血来源，包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞；天然的杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞和粒细胞。如本文所用，术语“T细胞”包括⑶4+T细胞和⑶8+T细胞。术语T细胞也包括T辅助1型T细胞、T辅助2型T细胞、T辅助17型T细胞和抑制性T细胞。术语“抗原递呈细胞”包括专用的抗原递呈细胞(例如，B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、郎格罕细胞)和其他抗原递呈细胞(例如，角质化细胞、上皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)。如本文所用，术语“免疫应答”包括由T细胞共刺激的调节所影响的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答——例如，细胞因子生成——和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括由T细胞激活间接影响的免疫应答，例如，抗体的生成(体液应答)和细胞因子应答细胞——例如，巨噬细胞——的激活。如本文所用，关于激活的免疫细胞所使用的术语“共刺激”包括共刺激性多肽提供诱导增殖和/或效应子作用的第二非激活受体介导的信号(“共刺激信号”)的能力。例如，共刺激信号一例如，在已接收到T细胞受体介导的信号的T细胞中一可导致细胞因子分泌。例如通过激活受体接收细胞受体介导的信号的免疫细胞在本文中被称为“激活的免疫细胞”。如本文所用，术语“抑制信号”指通过免疫细胞上多肽的抑制受体(例如，CTLA4或PD-D传导的信号。这种信号拮抗通过激活受体(例如，通过TCR或CD3多肽)传导的信号，并且可导致——例如，第二信使生成的抑制；增殖抑制；免疫细胞中效应子作用的抑制，例如，吞噬作用降低、抗体生成减少、细胞毒性减少、免疫细胞不生成介质(如细胞因子(例如，IL-2)和/或变应性反应介质)；或无反应性的发展。如本文所用，术语“无应答性”包括免疫细胞对刺激——例如，通过激活受体或细胞因子的刺激——的折射本领。例如，由于暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量抗原，可存在无应答性。如本文所用，术语“无反应性”或“耐受性”包括对激活受体介导的刺激的折射本领。这种折射本领一般具有抗原特异性，并且在停止暴露于耐受(tolerizing)抗原后持续存在。例如，T细胞的无反应性(相对于无应答性)被表征为没有细胞因子——例如，IL-2——生成。T细胞的无反应性在T细胞暴露于抗原并在第二信号(共刺激信号)缺失下接收到第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时存在。在这些条件下，细胞再次暴露于同一抗原(即使在共刺激的多肽存在下发生再次暴露)造成不产生细胞因子，从而不发生增殖。然而如果与细胞因子(例如，IL-幻一起培养，无变应性T细胞则能够增殖。例如，T细胞的无反应性也可通过T淋巴细胞不生成IL-2而观察到，这是利用指示细胞系通过ELISA或通过增殖分析测定的。或者，可利用报道基因构建体。例如，无变应性T细胞不能启动由异源启动子在5’IL-2基因增强子的控制下诱导的IL-2基因转录或由可在增强子中发现的APl序列的多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等.(1992)kience257:1134)。如本文所用，在关于多肽——例如，PD-UPD-Ll或PD-L2多肽——应用时，术语“活性”包括蛋白质结构中固有的活性。例如，关于PD-I配体，术语“活性”包括调节免疫细胞共刺激(例如，通过调节激活的免疫细胞中的共刺激信号)的能力或通过调节免疫细胞中的抑制信号调节抑制(例如，通过使天然受体连接在免疫细胞上)的能力。本领域技术人员会知道当PD-I配体多肽结合共刺激的受体时，共刺激信号可在免疫细胞中生成。当PD-I配体多肽结合抑制受体时，抑制信号在免疫细胞中生成。同样，当PD-I配体结合B7-1多肽时，抑制信号可生成(Butte等.(2007)Immunity27:111)。关于PD-I，术语“活性”包括PD-I多肽——例如，通过使天然的PD-I配体连接在抗原递呈细胞上——调节免疫细胞中的抑制信号的能力。PD-I以类似CTLA4的方式将抑制信号传至免疫细胞。调节免疫细胞中抑制信号导致免疫细胞的增殖和/或由免疫细胞进行的细胞因子分泌受到调节。因此，术语“PD-1活性”包括PD-I多肽结合其天然配体(一个或多个)的能力、调节免疫细胞共刺激信号或抑制信号的能力和调节免疫应答的能力。如本文所用，在涉及两种分子间的相互作用时，术语“相互作用”指分子相互的物理接触(例如，结合)。一般，这种相互作用产生所述分子其中一个或二者的活性(其产生生物作用)。该活性可以是所述分子其中一个或二者的直接活性(例如，信号转导)。或者，相互作用中的分子一个或二者可阻碍结合配体，从而对于配体结合活性(例如，结合其配体，并且引发或抑制共刺激)呈无活性。抑制这种相互作用造成相互作用中所涉及的一种或多种分子的活性被破坏。增强这种相互作用是延长或增大所述物理接触的可能性以及延长或增大所述活性的可能性。如本文所用，除非文中明确另外表示，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(所述，the)”)包括复数表示。要理解的是，本文所述的本发明方面和实施方式包括“由方面和实施方式组成”和/或“基本由方面和实施方式组成”。以下子章节中对本发明所述的各个方面进行更详细地说明。I.分离的核酸分子本发明的一方面涉及编码本发明所述多肽(例如，图2-7中的多肽)或其生物活性部分的分离的核酸分子以及足以用作杂交探针以鉴定编码这些多肽和片段的核酸分子的核酸片段，用作PCR引物以进行核酸分子的扩增或突变。如本文所用，术语“核酸分子”意为包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)及利用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。术语“分离的核酸分子”包括从核酸天然来源中存在的其他核酸分子中分离的核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括从基因组DNA天然相关的染色体中分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸分子不含这样的序列其天然地侧接获得核酸的生物体基因组DNA中的核酸(即，位于核酸分子5’和3’末端的序列)。例如，“分离的”核酸分子——如cDNA分子，通过重组的技术生成时可基本不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时可基本不含化学前体或其他化学物质。可利用标准的分子生物技术和本文所提供的序列信息分离本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)或其部分。例如，可利用基于图2-7所示序列设计的合成寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)分离包含全部或部分图2-7所示序列的核酸分子。可根据标准PCR扩增技术，利用cDNA、mRNA或可选地基因组DNA作模板和适当的寡核苷酸引物扩增本发明的核酸分子。可将如此扩增的核酸分子克隆到适当的载体中，并通过DNA序列分析表征。此外，通过标准合成技术——例如，利用自动化DNA合成仪，可制备相应于本发明所述核酸序列的寡核苷酸。在另一个实施方式中，本发明的分离的核酸分子包括本发明核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)或其部分的互补核酸分子。与本发明所述核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)或其部分互补的核酸分子是与图2-7所示核苷酸序列充分互补的核酸分子，以使其可与图2-7所示各核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。还有另一个实施方式中，本发明所述的分离的核酸分子包括与图2-7所示核苷酸序列的全长或这些核苷酸序列中的任一个的部分至少约70^^75^^80^^85^^90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上相同的核苷酸序列。此外，本发明所述的核酸分子可仅包括本发明所述的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的一部分或其部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码本发明所述多肽例如图2-7中的多肽的一部分的片段。探针/引物一般包括基本纯化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包括这样的核苷酸序列区域其在严格的条件下与本发明核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)；本发明核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的反义序列；或本发明核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的突变体的至少约12或15个，优选约20或25个，更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个连续核苷酸杂交。可利用基于本发明核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的探针检测转录物或者编码相同或同源多肽的基因组序列。在一个实施方式中，探针进一步包括连至其上的标记组，例如，标记组可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。通过以下可制备编码“本发明所述多肽的生物活性部分”的核酸片段分离本发明所述核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的部分核苷酸序列，该部分序列编码具有本发明所述多肽生物活性(例如，结合其抗原目标的能力)的多肽；表达本发明所述多肽被编码的部分(例如，通过体外重组表达)；和评价本发明所述多肽被编码部分的活性。本发明进一步包括这样的的核酸分子由于遗传密码简并性而不同于图2-7所示核苷酸序列(一种或多种)，并因此编码与图2-7所示各核苷酸序列编码的多肽相同的多肽。在另一个实施方式中，本发明所述的分离的核酸分子具有编码本发明所述多肽(例如，图2-7中的多肽)的核苷酸序列。可根据标准杂交技术在严格的杂交条件下将本文公开的cDNA或其部分用作杂交探针，基于其与本文所公开核酸的同源性，分离与本发明所述核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的同源体(homologue)相应的核酸分子。因此，在另一个实施方式中，本发明所述的分离的核酸分子的长度至少为15、20、25,30个或更多核苷酸，并且在严格的条件下与包含本发明核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)的核酸分子杂交。如本文所用，术语“在严格的条件下杂交”意为说明杂交和洗涤的条件，在该条件下，彼此显著相同或同源的核苷酸序列保持相互杂交。优选地，该条件是这样的彼此至少约70%，更优选至少约80%，甚至更优选至少约85%或90%相同的序列保持相互杂交。这种严格条件本领域技术人员公知，并且可在CurrentProtocolinMolecularBiology,Ausubel等，eds.，JohnWiley&Sons,Inc.(1995)，第2、4和6节中查找到。另外的严格条件可在MolecularCloning:ALaboratoryManual,Sambrook等，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)，第7、9和11章中查找到。严格的杂交条件的非限制性实例包括在约65-70°C下，4X或6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交(或在约42-50°C下，4XSSC和50%甲酰胺中进行杂交)，然后在约65_70°C下，1XSSC中进行一次或多次洗涤。严格的杂交条件的进一步非限制性实例包括在45°C下，6XSSC中进行杂交，然后在65°C下，0.2XSSC、0.SDS中进行一次或多次洗涤。高严格的杂交条件的非限制性实例包括在约65-70°C下，IXSSC中进行杂交(或在约42-50°CT，lXSS(^n50%甲酰胺中进行杂交)，然后在约65-70°C下，0.3XSSC中进行一次或多次洗涤。降低严格性的杂交条件的非限制性实例包括在约50-60°C下，4X或6XSSC中进行杂交(或者可选地在约40-45°CT，6XSSC和50%甲酰胺中进行杂交)，然后在约50_60°C下，2XSSC中进行一次或多次洗涤。上述取值的中间范围，例如，在65-70V下或在42-50V下，也被意为涵盖在本发明中。在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1XSSPE是0.15MNaClUOmMNaH2PO4和1.25mMEDTA,pH7.4)可替代SSC(1XSSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后，洗涤各自进行15分钟。预期长度小于50个碱基对的杂交分子的杂交温度应比杂交分子的熔解温度(Tm)低5-10°C，其中根据下列方程式确定Tm。对于长度小于18个碱基对的杂交分子，Tffl(0C)=2(A+T碱基的#)+4(G+C碱基的#)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂交分子，Tm(°C)=81.5+16.6(Iog10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)，其中N是杂交分子中的碱基数，[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(IXSSC的[Na+]=0.165M)。技术人员也将知道的是，可向杂交和/或洗涤缓冲液添加另外的试剂，从而降低核酸分子与膜——例如，硝化纤维或尼龙膜——的非特异性杂交，包括但不限于阻断剂(例如，BSA或三文鱼或鲱鱼精子载体DNA)、洗涤剂(例如，SDS)、螯合剂(例如，EDTA)、Ficoll、PVP及类似试剂。特别是当使用尼龙膜时，严格的杂交条件的另一个非限制性实例是在约65°C下，0.25-0.5MNaH2PO4,7%SDS中进行杂交，然后在65°C下，0.02MNaH2PO4U%SDS中进行一次或多次洗涤，参见例如，ChurchandGilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1991-1995(或者可选地，0.2XSSCU%SDS)。技术人员将进一步知道通过突变可向本发明所述的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)中引入改变，从而导致本发明编码多肽的氨基酸序列发生改变，而不改变多肽的功能性能力。例如，可在本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)中进行核苷酸替换，该核苷酸替换导致在“非必需”氨基酸残基上的氨基酸替换。“非必需”氨基酸残基是可以在不改变生物活性的情况下从本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)转变的残基，但生物活性需要“必需”氨基酸残基。例如，预计本发明所述多肽中保守的氨基酸残基一例如，多肽与其目标抗原结合所需的氨基酸残基——特别不宜发生改变。因此，本发明的另一方面涉及编码本发明多肽(例如，图2-7中的多肽)的核酸分子，其包含活性非必需的氨基酸残基改变。这种多肽的氨基酸序列与图2-7中的序列不同，仍保持生物活性。在一个实施方式中，分离的核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，其中多肽包含与图2-7中的序列至少约71%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或以上相同的氨基酸序列。通过在图2-7中核酸分子的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸替换、添加或删除——从而在被编码的多肽中引入一个或多个氨基酸替换、添加或删除，可生成编码与图2-7中核酸分子的多肽相同的多肽的分离的核酸分子。通过标准技术——如定点诱变和PCR介导的诱变，可在本发明所述的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)中引入突变。在一个实施方式中，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明多肽(例如，图2-7中的多肽)中预期的非必需氨基酸残基可被同一侧链家族的另一种氨基酸残基取代。或者，在另一个实施方式中，如通过饱和诱变，可沿全部或部分本发明所述的核酸分子(一种或多种)(例如，图2-7中的核酸分子)随机引入突变，可由生物活性筛选产生的突变体，从而鉴定到保留活性的突变体。本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)发生诱变后，可重组地表达被编码的多肽，并可测定多肽的活性。在一个实施方式中，可分析本发明的突变多肽的如下能力结合和/或调节天然PD-I(例如，PD-I配体)或PD-I配体的配偶体(例如，PD-I和Β7-1)的活性，调节细胞内或细胞间信号传导，调节T淋巴细胞的激活和/或调节生物体免疫应答。还有本发明的另一方面涉及编码融合蛋白质的分离的核酸分子。通过标准重组DNA技术，可制备这种核酸分子，该核酸分子至少包含编码本发明多肽(例如，图2-7中的多肽)的第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列可操作地连接于编码本发明多肽(例如，图2-7中的多肽)的第二核苷酸序列。通过在稳定细胞系或克隆微生物的基因组中插入异源DNA调节元件——从而将被插入的调节元件与本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)可操作地连接，可改变本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)在细胞系或微生物中的表达特征。例如，可利用如靶向同源重组的技术，将异源调节元件插入稳定细胞系或克隆微生物，以使其与本发明的核酸分子(例如，图2-7中的核酸分子)可操作地连接，该技术为本领域技术人员公知，并在如下中被述及例如，0^61，美国专利号5，272，071；PCT公开号WO91/06667，于1991年5月16日公开。II.分离的多肽分子本发明的一方面涉及本发明的分离的多肽(包括本文所述的抗体及其抗原结合片段和图2-7中的多肽)以及其生物活性部分。在一个实施方式中，利用标准蛋白质纯化技术，通过适当的纯化方案可从细胞或组织来源分离本发明的多肽(例如，图2-7中的多肽)及其生物活性部分。在另一个实施方式中，通过重组DNA技术生成本发明的多肽(例如，图2-7中的多肽)及其生物活性部分。或者，利用标准肽合成技术，可化学合成本发明所述的多肽(例如，图2-7中的多肽)及其生物活性部分。“分离的，，或“纯化的，，多肽或其生物活性部分基本不含获得本发明所述多肽(例如，图2-7中的多肽)的细胞或组织来源的细胞物质或其他杂质蛋白质，或者在被化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质。“基本不含细胞物质”的表述包括本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)及其生物活性部分的制备物，其中多肽是从分离到该多肽的细胞的细胞组分分离的或重组生成的。在一个实施方式中，“基本不含细胞物质”的表述包括这样的本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)及其生物活性部分的制备物其具有小于约30%(干重)的非本发明蛋白质(在本文中也被称为“杂质蛋白质”)，更优选小于约20%的非本发明蛋白质，还更优选小于约10%的非本发明蛋白质，最优选小于约5%的非本发明蛋白质。当重组地制备本发明的多肽(例如，图2-7中的多肽)或其生物活性部分时，同样优选基本不含培养基，即，培养基占蛋白质制备物体积小于约20%，更优选小于约10%，最优选小于约5%。“基本不含化学前体或其他化学物质”的表述包括本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)或其生物活性部分的制备物，其中多肽被从多肽合成涉及的化学前体或其他化学物质中分离。在一个实施方式中，“基本不含化学前体或其他化学物质”的表述包括这样的本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)或其生物活性部分的制备物具有小于约30%(干重)化学前体或非本发明的蛋白质，更优选小于约20%化学前体或非本发明的蛋白质，还更优选小于约10%化学前体或非本发明的蛋白质，最优选小于约5%化学前体或非本发明的蛋白质。如本文所用，本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的“生物活性部分”包括分别参与PD-I与非PD-I分子之间、PD-Ll与非PD-Ll分子之间或PD-L2与非PD-L2分子之间相互作用的多肽，例如PD-1的天然配体——例如，PD-I配体；或PD-I配体的天然配体——例如，PD-I或B7-1。本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的生物活性部分包括这样的肽其含有与本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的氨基酸序列足够相同或得自本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含比本发明的各个全长多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)更少的氨基酸，并呈现本发明的各个多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的至少一种活性。在一个实施方式中，生物活性部分包含这样的结构域或模体具有根据其所被提出或设计结合的抗原分别特异性地结合PD-I或PD-Ll配体的能力。本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的生物活性部分可用作展开剂的目标，该展开剂调节由PD-I、PD-Ll或PD-L2介导的活性，例如，免疫细胞激活或抑制。在另一个实施方式中，本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)具有图2-7所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，多肽与图2-7所示的多肽(一种或多种)基本相同，并保留图2-7所示各个多肽(一种或多种)的功能活性但氨基酸序列由于诱变而不同，如以上小节I所详细描述。因此，在另一个实施方式中，本发明的多肽(一种或多种)是这样的多肽其包含与图2-7所示的多肽(一种或多种)至少约71<%、75%、80%、85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%97%,98%,99%,99.5%或99.9%或以上相同的氨基酸序列。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，比对序列以进行最优化比较(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列其中之一或二者中引入空位，以进行最优化比对，和可以为进行比较而忽略不相同的序列)。在一个实施方式中，为进行比较而比对的参考序列长度为参考序列长度的至少30%，优选至少40%，更优选至少50%，甚至更优选至少60%，以至更优选至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%。然后比较相应氨基酸位点或核苷酸位点上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的位点被与第二序列相应位点上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在该位点相同(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性，，等同于氨基酸或核酸“同源性，，)。两个序列间的同一性百分数是两序列所共有的相同位点数目的函数，其考虑为两序列最优化比对而需要引入的空位数和各空位的长度。本发明也提供嵌合或融合蛋白质。如本文所用，“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包含与非本发明多肽可操作地连接的本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)。“本发明的多肽(一种或多种)”指具有相应于图2-7所示多肽的氨基酸序列的多肽，而“非本发明多肽”指这样的多肽不具有相应于与图2-7所示多肽非基本同源的多肽的氨基酸序列，例如，与图2-7所示多肽不同、得自相同或不同生物体的多肽。在融合蛋白质中，术语“可操作地连接”意指本发明的多肽(一种或多种)与非本发明的多肽(一种或多种)彼此框内融合。非本发明的多肽(一种或多种)可被融合至本发明多肽(一种或多种)的N端或C端，相应于改变本发明所述多肽(一种或多种)的溶解性、结合亲和力、稳定性或效价(valency)的部分。例如，在一个实施方式中，融合蛋白质是具有本发明多肽(一种或多种)的GST融合蛋白质。这种融合蛋白质可促进本发明重组多肽的纯化。在另一个实施方式中，融合蛋白质在其N端包含异源信号序列。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过利用异源信号序列可提高本发明多肽(一种或多种)的表达和/或分泌。通过标准重组DNA技术可生成本发明的嵌合或融合多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)。例如，根据常规技术——例如，通过利用平末端或参差末端进行连接，利用限制性酶消化提供适当的末端，利用粘性末端充填作为适当的碱性磷酸酶处理以防止不需要的连接，以及利用酶促连接——将编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一个实施方式中，通过常规技术——包括自动化DNA合成器——可合成融合基因。或者，利用锚定引物可进行基因片段的PCR扩增，该引物使随后可经退火和再扩增生成嵌合基因序列的两个连续基因片段之间产生互补突出端(参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等，eds.,JohnWiley&Sons:1992)。此外，市售多种已编码融合部分(例如，GST多肽)的表达载体。本文中鉴定的本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的氨基酸序列使本领域技术人员能制备相应于本发明多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的多肽。通过编码本发明所述多肽(一种或多种)(例如，图2-7中的多肽)的多核苷酸的表达，可在原核或真核宿主细胞中制备这种多肽。或者，通过化学方法可合成这种肽。重组宿主中表达异源多肽的方法、多肽化学合成的方法和体外翻译的方法在本领域中公知，并在Maniatis等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989)，2ndEd.,ColdSpringHarbor,N.Y.；BergerandKimmel,MethodsinEnzymology,Volume152,GuidetoMolecularCloningTechniques(1987),AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.；Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501；ChaikenI.M.(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser等·(1989)Science243:187；Merrifield,B.(1986)Science232:342；Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957；禾口0fford，R·E.(1980)SemisyntheticProteins,WileyPublishing中被进一步述及，在此将这些引入作为参考。III.PD-I、PD-Ll和/或PD-L2抗体利用本文所述或本领域已知的的任何方法可制备本文所述的PD-1、PD-Ll或PD-L2的抗体。利用多种已知技术可制备本发明的单克隆抗体(例如，人抗体)，如由KohlerandMilstein,Nature256=495(1975)所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交程序，原则上用于制备单克隆抗体的其他技术也可应用，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化、利用人抗体基因库的噬菌体展示技术(phagedisplaytechnique)。产生本发明单克隆抗体的一种杂交瘤生成方法是小鼠系统。杂交瘤在小鼠中的生成在本领域公知，包括用于分离和融合免疫脾细胞的免疫方案和技术。通过用多肽免疫原使适当的对象免疫，可如上所述制备多克隆抗体。利用固定化的多肽，通过标准技术——如，用酶联免疫吸附法(ELISA)，可随时间监测免疫对象中多肽抗体的滴定度。如需要，通过公知技术——如蛋白质A层析，可从哺乳动物(例如，从血液)中分离针对抗原的抗体，并进行进一步纯化，从而得到IgG部分。在免疫后合适的时间，例如，在抗体滴定度最高时，产生抗体的细胞可从对象中得到，并通过标准技术用于制备单克隆抗体，如最初由KohlerandMilstein(1975)Nature256:495-497)(同样参见Brown等·(1981)J.Immunol.127:539-46；Brown等·(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh等·(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.76:2927-31；和Yeh等·(1982)Int.J.Cancer29269-75)描述的杂交瘤技术、较近期的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等.(1983)Immunol.Today472)>EBV-1^^:(Cole^.(1985)MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96))或三源杂交瘤(trioma)技术。用于制备单克隆抗体杂交瘤的技术公知(一般参见Kenneth，R.H.inMonoclonalAntibodies:ANewDimensionInBiologicalAnalyses,PlenumPublishingCorp.,NewYork,NewYork(1980)；Lerner,Ε.Α.(1981)YaleJ.Biol.Med.54:387-402；Gefter,Μ.L.等·(1977)SomaticCellGenet.3:231-36)。简要地来说，尤其优选地，将永生细胞系(一般是骨髓瘤)与如上所述的用免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(一般是脾细胞)融合，筛选所产生的杂交瘤细胞的培养上清液，从而鉴定出生成与多肽抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤。可利用多种用于融合淋巴细胞和永生细胞系的公知方案中的任一种以生成抗PD-1、PD-L1或PD-L2的单克隆抗体(参见，例如，Galfre，G.等·(1977)Nature266:55052;上述Gefter等.(1977)；上述Lerner(1981)；上述Kenneth(1980))。此外，普通技术人员会理解这种方法的多种变型也将可用。一般，永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)得自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，通过将淋巴细胞——其来自用本发明的免疫原性制备物免疫的鼠——与永生的鼠细胞系融合，可制备鼠杂交瘤。优选的永生细胞系是对含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸啶的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。根据标准技术，多种骨髓瘤细胞系中的任一种可用作融合配偶体，例如，P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可得自AmericanTypeCultureCollection(ATCC),Rockville,Md。一般，利用聚乙二醇(“PEG”)将HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后利用HAT培养基选择由融合产生的杂交瘤细胞，该培养基杀死未融合和低效融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞在若干天后由于其未被转化而死亡)。例如，利用标准ELISA分析，通过筛选结合给定多肽的抗体的杂交瘤培养上清液，检测产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。或者，对于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，通过用适当的多肽筛选重组的组合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示库)——从而分离结合多肽的免疫球蛋白库成员，可鉴定和分离对上述多肽其中之一特异性的单克隆。市售生成和筛选噬菌体展示库的试剂盒(例如，PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,CatalogNo.27-9400-01；和StratageneSurfZAPPhageDisplayKit,CatalogNo.240612)。此外，尤其易用于生成和筛选抗体展示库的方法和试剂的实例可见于例如，Ladner等，美国专利号5，223，409；Kang等，国际公开号WO92/18619；Dower等，国际公开号WO91/17271；Winter等，国际公开WO92/20791;Markland等，国际公开号WO92/15679;Breitling等，国际公开WO93/0U88;McCafferty等，国际公开号WO92/01047;Garrard等，国际公开号WO92/09690；Ladner等，国际公开号WO90/02809；Fuchs等(1991)Biotechnology(NY)91369-1372；Hay等.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85；Huse等.(1989)kience246:1275-1281；Griffiths等·(1993)EMBOJ.12:725-734；Hawkins等·(1992)J.Mol.Biol.226:889-896；Clarkson等·(1991)Nature352:624-628；Gram等·(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580；Garrard等.(1991)Biotechnology(NY)9:1373-1377；Hoogenboom等·(1991)NucleicAcidsRes.19:4133-4137；Barbas等·(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982；和McCafferty等.(1990)Nature348:552-554中。此外，可生成可利用标准重组DNA技术制备的重组抗PD-1、PD-Ll或PD-L2抗体，如嵌合、复合和人源化的单克隆抗体。通过本领域已知的重组DNA技术可制备这种嵌合、复合和人源化的单克隆抗体，例如，利用以下中所述的方法=Robinson等，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184，187；Taniguchi，M.欧洲专利申请171，496;Morrison等，欧洲专利申请173，494;Neuberger等，PCT申请WO86/01533；Cabilly等，美国专利号4，816，567；Cabilly等，欧洲专利申请125，023；Better等.(1988)Science240:1041-1043；Liu等.(1987)Proc.Natl.AcadSci.USA84:3439-3443；Liu等·(1987)J.免疫1.139:3521-3526；Sun等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.84:214-218；Nishimura等.(1987)CancefRes.47:999-1005；Wood等.(1985)Nature314:446-449；和Shaw等·(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559)；Morrison,S.L.(1985)Science229:1202-1207；Oi等·(1986)Biotechniques4:214；Winter美国专利5，225，539Jones等·(1986)Nature321:552-525；Verhoeyan等·(1988)Science239:1534；和Beidler等.(1988)J.Immunol.141:4053_4060。此外，根据标准方案——如美国专利5，565，332所公开的方案，可制备人源化抗体。在另一个实施方式中，利用本领域已知的技术，通过载体——其包含编码特异性结合对成员多肽链与可复制的种属显示包(genericdisplaypackage)组分的融合物的核酸分子——和载体——其包含编码单个结合对成员第二多肽链的核酸分子——之间的重组，可制备抗体链或特异性结合对成员，所述技术例如，如以下所述美国专利5，565，332、5，871，907或5，733，743。本领域也已知胞内抗体在细胞内抑制蛋白质功能的应用(参见，例如，Carlson,J.R.(1988)Mol.Cell.Biol.8:2638-2646；Biocca,S.等·(1990)EMBOJ.9:101-108；fferge,Τ.Μ.等·(1990)FEBSLett.274:193-198；Carlson,J.R.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7427-7428；Marasco,W.A.等·(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893；Biocca,S.等.(1994)Biotechniques(NY)12:396-399；Chen,S-Y.等.(1994)Hum.GeneTher.5:595-601；Duan,L等.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5075-5079；Chen,S-Y.等.(1994)Proc.Natl.Acad.ki.USA91:5932-5936；Beerli,R.R.等·(1994)J.Biol.Chem.269:23931-23936；Beerli,R.R.等·(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.204:666-672；MhashiIkar,A.M.等·(1995)EMBOJ.14:1542-1551；Richardson,J.H.等·(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:3137-3141；Marasco等，PCT发明者F·J·卡尔,G·J·弗里曼,J·P·格雷格森,R·艾哈迈德,T·D·琼斯申请人:埃默里大学,达纳-法伯癌症研究公司