慢性炎症状态的治疗的制作方法

专利名称：慢性炎症状态的治疗的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及慢性炎症状态的治疗，具体而言，涉及减轻或在其它方面改善这种状态在患者中的影响的方法。在一具体的实施方案中，本发明涉及关节炎的治疗，尤其是类风湿性关节炎的治疗，所述类风湿性关节炎是以多种炎性介质的存在和动关节的破坏为特征的慢性炎性疾病。
背景技术：
作为免疫系统的一部分，白介素-3(IL_3)是能提高身体对疾病的天然应答的细胞因子。IL-3刺激多能造血干细胞(多能的(pluripotent))分化成髓系祖细胞以及刺激髓系中所有细胞(红细胞、血小板、粒细胞、单核细胞和树突细胞)的增殖。其由活化的T细胞分泌以在免疫应答中支持来自骨髓的T细胞的生长和分化。
IL-3通过与称为白介素-3受体(IL-3R)的特异性细胞表面受体的结合而展示其活性。IL-3R 是由 70kDa 的 IL_3Ra (CD123)和 120_140kDa 的 IL-3R β (CD131)组成的异二聚体结构。IL-3Ra链(IL-3Ra)具有非常短的胞内结构域，而IL-3R0链(IL_3R0)具有非常大的胞质结构域。IL-3Ra以相对低的亲和力结合IL-3。然而，在存在IL_3Ri3的情况下，IL-3R a对IL-3具有相对非常高的亲和力。还不清楚在IL-3结合之后信号转导是如何发生的，不过最近的研究提示信号转导需要包含十二聚物的更高级的复合物的形成、IL-3R0链还为IL-5和GM-CSF的受体共享。已知表达IL-3受体的细胞包括造血祖细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和血单核细胞以及各种造血谱系更成熟的细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、红细胞和CD5+B细胞亚群2。还显示表达所述受体的非造血细胞包括一些内皮细胞、基质细胞、树突细胞和莱迪希细胞2’3。IL-3在免疫系统和造血系统之间提供了可能至关重要的关联4。这对于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的产生和功能，尤其在免疫应答期间，可能是至关重要的5。IL-3还可以促进巨噬细胞谱系群的生长和活化6_8，并且可以帮助生成树突细胞9。如上文所指出的，IL-3信号转导由通用受体β亚基(IL_3Ri3)和特异性配体结合a亚基(IL-3Ra)介导，尽管在小鼠中还有另外的β亚基'关于IL-3在慢性炎症状态如类风湿性关节炎(RA)中的作用还知之甚少。在一项研究11中在RA患者的滑膜中无法检测到IL-3mRNA，但在以后的研究12中却发现了IL-3mRNA ;发现一些而不是所有的RA患者在循环中具有可检测的IL-313，并且IL-3基因启动子中的单核苷酸多态性和RA之间存在相关性14。然而，在大鼠关节炎模型的关节炎进展期间，IL-3水平下降15，并且最近已经报道，IL-3给药能抑制鼠的炎性关节炎16。在引起本发明的工作中，发明人已经发现，通过阻断或干扰IL-3和IL-3R之间的配体/受体相互作用能够抑制或减轻慢性炎症状态如RA的影响。该发现是非常意外的，并且相对于近期报道16而言是预料不到的，该报道表明IL-3给药有减小炎性应答的潜能并且间接阻止炎性关节炎中的软骨和骨骼丧失。本说明书中提到的出版物的题录详情在说明书的末尾处弓I用。
本说明书对任何现有出版物(或从其得到的信息)或任何已知内容的引用不是，且不应被视为是对该现有出版物(或从其得到的信息)或形成本说明书所涉及的研究领域中的一般公知常识的一部分的已知内容的承认、应允或任何形式的暗示。在本说明书及随后的权利要求书的全文中，除非上下文指示并非这样，否则词语“包含(comprise) ”及其变形如“包含(comprises) ”和“包含(comprising) ”,都应当被理解为暗示包含所陈述的整数或步骤，或整数或步骤组，但并不排除任何其它整数或步骤，或整数或步骤组。发明概述一方面，本发明提供了治疗患者中慢性炎症状态的方法，其包括给予患者阻断或抑制所述患者中IL-3信号转导事件的试剂。
另一方面，本发明提供了阻断或抑制IL-3信号转导事件的试剂在治疗患者的慢性炎症状态中的用途，或在制备用于治疗患者的慢性炎症状态的药物中的用途。另一方面，本发明提供了用于治疗患者中慢性炎症状态的试剂，其中所述试剂阻断或抑制患者中的IL-3信号转导事件。在本发明的其它方面中，所述试剂可被配制成带有一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物，或者可以将所述试剂提供在试剂盒中，所述试剂盒任选地包含按照用于治疗患者中慢性炎症状态的方法使用所述试剂的说明书。慢性炎症状态可以例如是关节炎，更具体而言是炎性关节炎如RA。优选地，所述试剂是阻断或抑制患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Ra相互作用的试剂。还优选的是，患者是人。


图I显示了接受抗IL_3mAb或PBS(对照)的小鼠中胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的进程(临床评分)。结果表示为平均值土SEM。小鼠处理组n=10，小鼠对照组n=6。图2显示了 IL-3信号转导对单核细胞(来源于PBMC的⑶14+)的细胞活力的影响。以每只6cm IWAKI (低贴壁)TC盘大约I. 8x IO6细胞的密度接种单核细胞，并在 RPMI+10%FCS 以及单独的 IL-3 (3ng/ml)、IL-3 (3ng/ml) +IL-3-R 抗体、或单独的IL-3 (O. 3ng/ml)、或IL-3 (O. 3ng/ml)+IL-3-R抗体中培养7天。在每种情况下使用I μ g/ml的IL-3-R抗体。在第4天时，添加新的IL-3和IL-3-R抗体。在第7天时，取出细胞并进行计数。图3显示了 IL-3以剂量依赖的方式诱导嗜碱性粒细胞活化标志物⑶203c。从荨麻疹患者(URT)和正常供体(NOR)分离PBMC，并用多克隆IgE、FMLP、FMLP和IL-3、或逐渐增加浓度的IL-3刺激PBMC。在用鉴定嗜碱性粒细胞的混合型抗体和抗嗜碱性粒细胞活化标志物CD203c的抗体染色，然后通过流式细胞仪分析之后，计算CD203+ve嗜碱性粒细胞的百分比。图4显示了抗IL-3R抗体封闭IL_3诱导的嗜碱性粒细胞活化。从正常供体分离PBMC，并在存在或不存在中和抗IL-3R抗体(CSL360)的情况下，用逐渐增加浓度的IL-3刺激PBMC。在用鉴定嗜碱性粒细胞的混合型抗体和抗嗜碱性粒细胞活化标志物CD203c的抗体染色，然后通过流式细胞仪分析之后，计算CD203+ve嗜碱性粒细胞的百分比。
图5显示了抗⑶123单克隆抗体(CSL362)以时间依赖的方式消耗嗜碱性粒细胞。从正常供体分离PBMC，并在没有抗体或有消耗性抗CD123抗体(CSL362)的情况下孵育不同的时间(如图所示)。在用鉴定嗜碱性粒细胞的混合型抗体染色，并通过流式细胞仪分析之后，计算残余的嗜碱性粒细胞的百分比。图6显示了抗⑶123mAb在24小时内可再现地消耗嗜碱性粒细胞。从三名正常供体分离PBMC，并在没有抗体或有消耗性抗CD123抗体的情况下孵育24小时。在用鉴定嗜碱性粒细胞的混合型抗体染色，并通过流式细胞仪分析之后，计算残余的嗜碱性粒细胞的百分比。图7显示了抗⑶123mAb在24小时内活化NK细胞。从三名正常供体分离PBMC，并在没有抗体(实线)或有消耗性抗CD123抗体(CSL362，虚线)的情况下孵育24小时。通过⑶16的下调来确定NK细胞(⑶56+ve细胞)的活化。用鉴定NK细胞的抗⑶56抗体，和抗CD16抗体对PBMC进行染色。通过流式细胞仪确定与没有抗体的对照相比的CD16染色的缺失。
图8显示了通过体内给予抗IL-3Ra抗体而对外周血中鼠嗜碱性粒细胞的消耗。通过静脉给予BALB/c小鼠抗IL-3Ra抗体(1C2)、抗CD200R3 (Bal03)、或同型对照抗体小鼠IgG2a(mIgG2a)或大鼠IgG2b (rIgG2b)。所有抗体均以每只小鼠30 μ g进行注射，除了1C2，其以每只小鼠18 μ g进行注射。在给予抗体后24小时分离外周血细胞，并对Fe ε Rl α和⑶49b表达进行染色以鉴定嗜碱性粒细胞。(a)显示了来自流式细胞仪分析的代表性染色图。嗜碱性粒细胞群用框框上。从流式细胞仪分析计算每只小鼠的嗜碱性粒细胞的百分t匕，并且(b)显示了每组3只小鼠的平均值(+SEM)。#*:p〈0. 001，#:p〈0. 01。发明的详细描述—方面，本发明提供了治疗患者中慢性炎症状态的方法，其包括给予患者阻断或抑制所述患者中IL-3信号转导事件的试剂。优选地，所述试剂是阻断或抑制患者中IL-3/IL-3R或IL_3/IL_3R α相互作用的试剂。可以按照本发明进行治疗的慢性炎症状态是本领域技术人员熟知的，并且包括具体的关节炎，更具体为炎性关节炎如成人和青少年RA。其它适应症包括但不限于慢性阻塞性肺病(COPD);炎性肠病(IBD)如克罗恩病和溃疡性结肠炎；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP);动脉粥样硬化；硬皮病；系统性红斑狼疮(SLE);舍格伦综合征(Sjogren’ssyndrome);痛风；骨关节炎；风湿性多肌痛；血清阴性脊柱关节病包括强直性脊柱炎；莱特尔氏病(Reiter’s disease)、银屑病性关节炎、混合性结缔组织病(MCTD);慢性莱姆关节炎；斯提耳病(Still’s disease);慢性荨麻疹；类风湿性关节炎相关的葡萄膜炎和导致随意肌和其它肌肉炎症的病症，包括皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎和淋巴管平滑肌瘤病。本文提及的“治疗”以其最宽泛的含义来理解，包括治疗性处理和预防性措施或防治性措施。需要治疗的患者包括已遭受慢性炎症状态的患者以及待预防这种状态的患者。部分或完全从所述状态康复的患者可能还需要治疗。术语“治疗”并不必然暗指治疗患者直至完全康复。因此，治疗包括减轻或改善特定慢性炎症状态的症状以及停止或至少延迟特定慢性炎症状态的发作、发展或进程，减轻特定慢性炎症状态的严重程度或消除特定慢性炎症状态。
按照本发明给予的试剂优选通过阻断或抑制IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Rci相互作用，来阻断或抑制患者中IL-3信号转导事件的活化。如本文所用的，提及“阻断或抑制患者中的IL-3信号转导事件”包括导致IL-3起始的信号转导水平降低的任何干预。这类干预包括，举例来说，使用特异性阻断或抑制IL-3信号转导事件活化的试剂(例如，靶向IL-3、IL-3Ra、IL-3Ri3的试剂)，以及使用选择性靶向能够进行IL-3信号转导的细胞并且通过这种靶向能诱导细胞死亡的指定试剂(例如，靶向IL-3R且携带抗细胞部分的试剂)。在本发明的一个实施方案中，试剂可以是选择性结合IL-3或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3的抗原结合分子。本文所用的术语“抗原结合分子”指完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体，如嵌合、人源化或人单克隆抗体，或者指免疫球蛋白的抗原结合片段(包括例如，Fv, Fab、Fab’和F(ab’)2片段)和/或包含可变结构域的片段，所述片段是与完整免疫球蛋白竞争与免疫球蛋白的结合伴侣(如宿主细胞蛋白)的特异性结合的片段。无论结构如何，抗原结合片段都与完整免疫球蛋白所识别的相同抗原结合。抗原结合片段可以通过合成或通过酶促 或化学切割完整免疫球蛋白来产生，或者它们可以通过重组DNA技术而进行遗传工程化改造。产生抗原结合分子及其片段的方法是本领域内公知的，且描述于例如Antibodies，ALaboratory Manual, Edited by E.Harlow and D.Lane (1988), Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York 中，通过引用将其并入本文。优选地，抗原结合分子是单克隆抗体。在本发明的本实施方案中，抗原结合分子可以包含修饰的Fe区，更具体地，包含经修饰以提供增强的效应器功能的Fe区，例如增强的与Fe受体的结合亲和力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒作用(OTC)。对于IgG类抗体，这些效应器功能受Fe区与被称为Fe Y受体(Fe y Rs)的受体家族的结合的控制，所述Fe Y受体在各种免疫细胞上表达。Fc/FcyR复合物的形成将这些细胞募集至结合的抗原的位点，通常导致信号转导和随后的免疫应答。为了增强效应器功能，尤其为了改变相对于“亲本” Fe区的ADCC和/或CDC活性而优化Fe Y R与抗体Fe区的结合亲和力的方法是本领域技术人员公知的，且描述于例如国际专利公开号WO2009/070844中。这些方法可以包括修饰抗体的Fe区以增强其与相关Fe受体的相互作用并提高其促进ADCC和ADCP的潜能。还描述了在Fe区内的保守Asn297处进行将寡糖共价连接于IgGl抗体这样的修饰之后ADCC活性的增强。本文所用的关于抗原结合分子(如抗体或抗体片段)与其结合伴侣(如抗原)的相互作用的术语“选择性结合”，表示所述相互作用依赖于结合伴侣上特定结构如抗原决定簇或表位的存在，换句话来说，抗体或抗体片段优先结合或识别结合伴侣，即使当结合伴侣存在于其它分子或生物的混合物中时。不希望受任何具体理论的束缚，认为在本发明的本实施方案中，通过与IL-3、或IL-3R、IL-3RQ、或IL_3Ri3的选择性结合，抗原结合分子诸如抗体或抗体片段阻断或抑制配体/受体相互作用，并进而干扰IL-3信号活化。在一实施方案中，抗原结合分子可以是与IL-3Ra (⑶123)选择性结合的单克隆抗体。因此，抗原结合分子可以是抗⑶123而生成的单克隆抗体(MAb) 7G3，之前报道该抗体显示出能够抑制IL-3介导的白血病细胞系和原代细胞的增殖和活化(参见Lopez的美国专利第6，177,678号)。可选择地，试剂可以是单克隆抗体CSL360，通过将小鼠单克隆抗体7G3的轻链可变区和重链可变区移植到人IgGl恒定区而获得的嵌合抗体(参见国际专利公开号WO 2009/070844)。同7G3—样，CSL360以高亲和力结合CD123 (人IL-3R α )，与IL-3竞争受体的结合并阻断IL-3的生物活性。凭借CSL360的人IgGl Fe区，CSL360作为人治疗剂还具有潜在功效的优势，其能够启动人类体系中的效应器活性。而且，在人体中可能的是，其相对于小鼠7G3等同物将显示出降低的肃清作用，并且可能具有较低的免疫原性。这种抗原结合分子的其它实例包括7G3或CSL360的人源化抗体变体、具有增强的效应器功能(诸如ADCC活性)的全人抗CD123抗体和抗CD123抗体，例如国际专利公开号W02009/070844的实施例4中所描述的。在本发明的另一实施方案中，试剂可以是能与IL-3R结合但是不导致IL-3信号活化或至少导致降低的IL-3信号活化的IL-3突变蛋白。通常，这些‘IL-3突变蛋白’包括通过一个或多个连续或非连续氨基酸残基的添加、缺失和/或取代而不同的天然或人工突变体。能与IL-3R结合但是表现出降低的IL-3信号活化的IL-3突变蛋白的实例是16/84C — A突变体17。IL-3突变蛋白还可以包括其中一个或多个残基经修饰以例如增加其体内半衰期 的修饰多肽。这能够通过连接其它元件如PEG基团来实现。多肽PEG化的方法是本领域内公知的。在本发明的另一实施方案中，试剂是能够结合IL-3的可溶性受体。这类可溶性受体的实例包括IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL_3Ra胞外部分与IL_3Ri3胞外部分的融合蛋白。在另一实施方案中，试剂可以包含可靶向能够进行IL-3信号转导的细胞以诱导细胞死亡的抗细胞部分。在一些实施方案中，试剂可以包含与抗原结合分子缀合的抗细胞部分，所述抗原结合分子能与IL-3、或IL-3R、IL-3Ra、或IL_3Ri3选择性结合。在其它实施方案中，试剂可以包含与IL-3突变蛋白缀合的抗细胞部分。合适的抗细胞部分的实例包括化疗药物、放射性同位素或细胞毒素。化疗药物包括激素如类固醇；抗代谢物如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或氨基蝶呤；蒽环类抗生素；丝裂霉素C ;长春花生物碱；秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素；刺孢霉素、CC-1065及其衍生物、或诸如苯丁酸氮芥或美法仑的烷化剂、凝结剂、细胞因子、生长因子、细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分。放射性同位素包括a -放射体，诸如例如211砹、212铋和213铋；以及β -放射体，诸如例如131碘、90钇、177镥、153钐和109钯；以及俄歇放射体，诸如例如111铟。细胞毒素通常包括植物、真菌或细菌来源的毒素，诸如A链毒素、核糖体灭活蛋白、a-帚曲菌素、曲霉素、restirictocin、核糖核酸酶、白喉毒素或假单胞菌外毒素等，以及来源于海生生物如海绵的细胞毒素，例如 Kahalalide F、Ecteinascidin (Yondelis )或 Variolin B。以有效量给予试剂。“有效量”表示至少部分地达到期望的反应,或延迟或抑制或完全终止被治疗的具体状态的进程所需的量。所述量随以下而不同待治疗的个体的健康和身体状况、待治疗的个体的种族背景、需要保护的程度、组合物的配方、医疗形势的评价和其它相关因素。预期的是，所述量将落入能够通过常规试验来确定的相对宽泛的范围内。如果需要，试剂的给药可以重复一次或数次。所给予的实际量将由被治疗的状态的性质和试剂被给予的速率两者决定。优选地，患者是人，然而，本发明延伸至治疗和/或预防其它哺乳动物患者，包括灵长类、家畜(例如，绵羊、猪、牛、马、驴)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、宠物(例如，狗、猫)以及捕获的野生动物。根据本发明，优选通过肠胃外给药途径给予患者试剂。肠胃外给药包括不通过消化道(即非肠)的任何给药途径，包括通过注射、输注给药等。通过注射给药包括，举例来说，进入静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌肉内)和皮肤以下(皮下)。还可以以贮库制剂或缓释制剂，例如通过皮下、皮内或肌肉内，以足以获得期望的药理效应的剂量给予试剂。另一方面，本发明提供了阻断或抑制IL-3信号转导事件的试剂在治疗患者的慢性炎症状态中的用途，或在制备用于治疗患者的慢性炎症状态的药物中的用途。另一方面，本发明提供了用于治疗患者中慢性炎症状态的试剂，其中所述试剂阻断或抑制患者中的IL-3信号转导事件。在本发明的该方面中，上文所述的试剂可被配制成带有一种或多种药学上可接受 的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。适于肠胃外给药的组合物适于包含活性成分的无菌水性制剂，其在接受者的血液内优选是等渗的。可以利用合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂按照已知方法配制该水性制齐U。无菌可注射制剂还可以为处于非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如为聚乙二醇和乳酸溶液。可以利用的可接受介质和溶剂是水、林格氏合齐 、合适的碳水化合物(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定性油常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，发现诸如油酸的脂肪酸可用于制备注射剂。这类治疗组合物制剂是本领域技术人员公知的。合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水性溶液、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域内公知的，并且举例来说，其描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18thEdition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA.中。除非另有所指，任何常规介质或试剂均与活性组分相容，还考虑其在本发明药物组合物中的用途。还可以将补充的活性组分并入组合物中。在本发明的另一方面中，提供了试剂盒，其包含(i)上文所述的试剂以及任选地
(ii)按照用于治疗患者中慢性炎症状态的方法使用所述试剂的说明书。进一步通过以下的非限制性实例来说明本发明。实施例I在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中测试鼠IL-3的中和单克隆抗体(mAb)对疾病进程的影响，该模型是类风湿性关节炎最广泛使用的鼠模型。在第O天和第21天，用在佐剂中的II型胶原蛋白经皮内免疫雄性DBA/1小鼠(8-12周龄，每组10只小鼠)18。利用所建立的如下的评分系统评价小鼠四肢的红肿并为每条腿分配临床评分O -正常；I -轻微肿胀和/或红斑；2 -大范围肿胀和/或红斑；3 -重度肿胀；4 -重度肿胀和/或僵直。根据所有四条腿总计的平均临床评分表示关节炎的严重程度(每只小鼠范围为0-16)。
在第21、23、25、28 和 30 天时，用 250 μ g抗 IL_3mAb (Southern Biotech)/小鼠或PBS处理小鼠。如图I所示，在抗IL-3处理的组中，疾病严重程度受到抑制。该实验特别振奋人心，因为在该特定的实验中，存在对非常严重的疾病的非常快速的诱导，在对照小鼠具有快速达到的平台期。通常在大约一周后达到该平台期。相对急性的鼠CIA的文献数据表明，中和抗-IL_3Ab在疾病诱导之后被马上需要，且如果在疾病发作后推迟给予是无效的19。这并不必然表示，IL-3不是炎症中的靶标。我们还不了解对驱动疾病如类风湿性关节炎(RA)负责的背景炎症/自身免疫事件，以及这些事件被多么密切地映射在动物模型中。即使对于慢性状态如RA，也有患“急性发作”疾病的患者。还有，抗IL-3疗法可能在RA中仍是有利的，例如因为该疾病通常会复发，提供时机来抑制其恶化。还应当记住，常用的抗炎症糖皮质激素被广泛认为通过在转录水平下调炎性介质基因表达来起作用——如果在引发刺激后添加，它们在替代炎症测定中在体外不起作用。实施例2
研究了 IL-3信号转导作为促炎性细胞因子在CD14+单核细胞中的作用。从红十字会捐赠者白细胞袋(Red Cross donor buffy pack)分离外周血单核细胞(PBMC)。然后通过阴性选择(MACS分离)纯化CD14+单核细胞，使得通过流式细胞术估计大约有80%的细胞为⑶14+。以每个6cm IWAKI (低贴壁)TC盘约I. 8x IO6细胞的密度接种单核细胞，并在RPMI+10%FCS 以及单独的 IL-3(3ng/ml)、IL-3(3ng/ml)+IL-3-R抗体、单独的 IL_3(0. 3ng/ml)、或IL-3(0. 3ng/ml)+IL-3-R抗体中培养7天。在每种情况下使用lug/ml的IL-3-R抗体。在第4天时，添加新的IL-3和IL-3-R抗体。在第7天时，取出细胞并计数，然后在RNA裂解缓冲液中裂解。结果表明，IL-3以剂量依赖的方式为单核细胞提供促存活刺激，并且该效应受到抗IL-3R抗体的抑制(图2)。因此，阻断或抑制CD14+单核细胞中的IL-3信号转导阻止其在炎症位点的存活和积累，并且这样提供了控制炎症的方法。实施例3荨麻疹(Urticaria)，通常称为荨麻疹(hives)，是表现为复发的水疱的炎症状态，所述水疱大小范围从数厘米低至几毫米。通常，水疱呈淡红色具有苍白色的中心，且伴有灼烧感或刺痛感。荨麻疹可存在于任何年龄段，并且1%_5%的人群在其一生的某时间点会出现荨麻疹。慢性荨麻疹极大地影响生活质量，与重度特应性皮炎、牛皮鲜或痤疮患者类似。大多数慢性荨麻疹病例实际上是天生的；然而，然而正在变得越来越清楚的是，在很多病例(35%-50%)中，存在高亲和力IgE受体(Fe ε Rl)或IgE自身的自体抗体，这表明慢性荨麻疹可能是自身免疫病。肥大细胞和嗜碱性粒细胞是荨麻疹患者中表达Fe ε Rl并且响应自体抗体的主要细胞类型。当活化时，肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放大量的组胺，组胺是驱动荨麻疹水疱形成的主要效应器分子。肥大细胞和嗜碱性粒细胞两者都表达IL-3受体，并且当暴露于诸如IgE和C5a的触发因素时，IL-3能够引发这些细胞产生升高水平的效应器分子如组胺。分析了来自7个荨麻疹患者样品和4个正常供体样品的PBMC。IL_3能够活化离体的人嗜碱性粒细胞(图3)，并且中和抗IL-3Ra抗体(CSL360-参见国际专利公开号W02009/070844)能够抑制IL-3诱导的人嗜碱性粒细胞活化(图4) JDCC优化的抗IL_3Ra抗体(CSL362-如国际专利公开号WO 2009/070844中所描述的人源化和亲和力成熟的抗CD123mAbl68-26的无岩藻糖化变体)能够以时间依赖的方式从PBMC消耗人嗜碱性粒细胞(图5)。在添加CSL362的24小时内，在三个独立的供体中观察到嗜碱性粒细胞完全或近乎完全耗尽(图6)。在添加CSL362的24小时内观察到NK细胞活化，表明嗜碱性粒细胞的耗尽是通过NK细胞介导的ADCC (图7)。实施例4本实施例表明抗IL-3R抗体也能够影响体内嗜碱性粒细胞活化的数量和水平。用尾静脉静脉注射抗IL3Ra抗体1C2(参照实施例5)或对照小鼠IgG2a来处理雌性BALB/c小鼠(10-12周龄)。靶向⑶200R3的商购抗体Bal03显示出特异性地消耗小鼠嗜碱性粒细胞2°，并且平行测试其对照抗体大鼠IgG2b作为对照。所有抗体以200 μ I PBS中30 μ g进行注射，除了 1C2，其给予18 μ g。一天后，分离外周血和腹膜细胞，并制备单细胞悬浮液。细胞用抗Fe Y RII-III预孵育以防止非特异性结合。细胞用FITC偶联的抗Fe ε RIa单克隆抗体和PE偶联的抗⑶49b单克隆抗体染色以鉴定嗜碱性粒细胞(Fe ε RI a +⑶49b+)。FITC-仓鼠IgG和PE-大鼠IgM分别用作Fe ε RI α和⑶49b抗体的同型对照。利用前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)控出碎片，并用7氨基放射菌素D(7-AAD)染色辨别死细胞。然 后用FACSCanto (BD Biosciences)分析染色的细胞，并利用Flowjo软件分析数据。单次静脉注射18 μ g抗IL3Ra抗体1C2诱导外周血中嗜碱性粒细胞频数显著下降至同型对照(小鼠IgG2a)处理的小鼠水平的大约23%(图8)。该消耗效力与30 μ g Bal03给药的效力相当。与对嗜碱性粒细胞的效应不同，在用抗IL3Ra或Bal03抗体处理的小鼠中没有观察到腹膜肥大细胞频数的显著下降(数据未显示)。用Bal03抗体对肥大细胞的观察结果与Obata及其同事的研究相一致2°。实施例5I)鼠IL3受体特异性单克隆抗体的产生从表现为与丝状噬菌体M13表面的gill蛋白融合的Fab片段的人抗体序列文库(Dyax Corp.)分离特异性识别鼠IL-3R a (mIL3Ra)的抗体序列。通过将噬菌体文库与商购获得的纯化的重组融合蛋白孵育来分离抗mIL3Ra噬菌体展示的抗体片段，所述融合蛋白由相融合的mIL3Ra的氨基酸17-331和人IgGl (Fe片段)的残基100-330以及由R&D systems Inc提供的短多肽连接物(序列IEGRID)组成。利用标准方法富集特异结合的噬菌体，并作为单克隆而分离。测试单克隆与原始靶标(mIL3Ra _ Fe融合)和mIL3Ra的胞外结构域的特异性结合，mIL3R α的胞外结构域表现为具有C末端六组氨酸标签(msIL-3R-6His)的残基1_331。选择与这些靶标结合且不与对照蛋白结合的噬菌体克隆用于进一步分析。通过编码抗体的多肽链的DNA测序鉴定独特的克隆，并通过竞争性ELISA定量这些克隆对mIL-3R-6His的结合亲和力。选择具有可接受亲和力的克隆用于再重组工程并表达为嵌合抗体(人可变区和鼠IgG2a/K恒定区)用于进一步的分析。2)用于瞬时表达的哺乳动物表达载体构建 利用标准分子生物学技术从噬菌粒载体PCR扩增mIL3R α特异性抗体的重链和轻链可变区。然后，将重链可变区克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3. l(+)-mIgG2a，该载体基于pcDNA3. 1(+)表达载体(Invitrogen),其经修饰包括鼠IgG2a恒定区和终止密码子。将轻链可变区克隆入表达载体pcDNA3. I (+) -m κ，该载体基于pcDNA3. I (+)表达载体，其经修饰包括鼠κ恒定区。表达载体还含有Kozak翻译起始序列、ATG起始密码子和合适的信号肽。3)细胞培养从Genechoice Inc获得适应无血清悬浮的合适的293-T细胞。细胞在补充了青霉素/链霉素/两性霉素B试剂(Invitrogen)的FreeStyle ExpressionMedium(Invitrogen)中培养。在转染之前，将细胞在37° C下在潮湿的孵化器中维持，且大气为8%C02。4)瞬时转染利用293fectin转染试剂(Invitrogen),按照生产商的说明书,进行利用293-T细 胞的抗mIL3Ra表达质粒的瞬时转染。合并轻链和重链表达载体，并用293-T细胞共转染。以IxlO6活细胞/ml的终浓度转染细胞(1000ml)，并在37° C下，在2/10Wave Bioreactor系统 2/10 或20/50 (Wave Biotech/GE Healthcare)上，在大气为 8%C02 的 Cellbag 2L (WaveBiotech/GE Healthcare)中孵育5天。培养条件为以8°的角度每分钟转35转。在转染后4小时,添加Fluronic. F-68 (Invitrogen)至O. 1%ν/ν的终浓度。转染后24小时，为细胞培养物补充胰蛋白胨NI (Organotechnie, France)至O. 5%v/v的终浓度。通过在2500rpm下离心来收集细胞培养物上清，然后在纯化之前使上清通过O. 45 μ M过滤器(Nalgene)。5)蛋白表达分析5天后，将20 μ I培养物上清在4-20%Tris_甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并通过考马斯亮蓝试剂染色来显现抗体。6)抗体纯化在4° C下，利用蛋白A亲和层析纯化抗mIL3Ra抗体，其中将MabSelect树脂(5ml, GE Healthcare, UK)装入 30ml Poly-Prep 空柱(Bio-Rad, CA)。首先用 10 柱体积的无热原GIBCO蒸懼水(Invitrogen, CA)洗漆树脂，以去除存留的甲醇，然后用5柱体积的无热原磷酸盐缓冲盐水(PBS)(GIBC0 PBS, Invitrogen, CA)平衡。通过重力供给将经过滤的条件细胞培养物培养基(IL)加载于树脂上。然后，用5柱体积的无热原PBS洗涤树脂，以去除非特异性蛋白。用2柱体积的O. IM甘氨酸(pH 2.8) (Sigma, MO)将结合抗体洗脱入含有O. 2柱体积的2M Tris-HCKpH 8. O) (Sigma, MO)的级分，以中和低pH。在4° C下，将洗脱的抗体在截留MW为3. 5kD的12ml Slide-A-Lyzer盒(Pierce, IL)中相对5L PBS透析18小时。利用Ultraspec 3000 (GE Healthcare, UK)分光光度计，通过测量280nm处的吸光度来确定抗体浓度。通过SDS-PAGE分析抗体的纯度,将处于还原样品缓冲液(Invitrogen, CA)中的2μ g蛋白加载至Novex 10_20%Tris甘氨酸凝胶(Invitrogen, CA),按照生产商的说明书，在具有 Tris 甘氨酸 SDS 电泳缓冲液的 XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen, CA)中施加150V的恒定电压持续90分钟，然后利用考马斯染色显现。参考文献I. Hansen G, Hercus TR, McClure BJ, Stomski FC, Dottore M, Powell J, RamshawH, Woodcock JM, Xu Y, Guthridge M, McKinstry WJ, Lopez AF, Parker MW. The structureof the GM-C SF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptoractivation. Cell. 2008;134(3):496-507.2. Moretti S, Lanza F, Dabusti M·，Tieghi A, Campioni D, Dominici M, CastoldiGL.CD123 (Interleukin 3 receptor a chain). J Biol Regul Homeost Agents2001;1598-100.3. Yamada M，Suzu S，Tanaka-Douzono M，Wakimoto N，Hatake K，HayasawaHj Motoyoshi K.Effect of cytokines on the proliferation/differentiation ofstroma-initiating cells. J Cell Physiol.2000;184:351-355.4. Schrader JW. In:Thomson AW, Thotze M，eds. The Cytokine Handbook(ed2nd) · London;2003:201-225.5. Lantz CS，Boesiger J，Song CH，et al. Role for interleukin-3 in mast-celland basophil development and in immunity to parasites. 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权利要求
1.治疗患者中慢性炎症状态的方法，其包括给予所述患者阻断或抑制所述患者中IL-3信号转导事件的试剂。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述试剂阻断或抑制所述患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3RQ的相互作用。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中所述试剂是与IL-3、或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3选择性结合的抗原结合分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗原结合分子是单克隆抗体、或其抗原结合片段和/或包含可变结构域的片段。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述抗原结合分子是与IL-3选择性结合的单克隆抗体。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述抗原结合分子是与IL_3Ra选择性结合的单克隆抗体。
7.如权利要求I所述的方法，其中所述试剂包含抗细胞部分。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗细胞部分是选自以下的放射性同位素a-放射体，尤其是211砹；β -放射体，尤其是131碘；以及俄歇放射体。
9.如权利要求I或2所述的方法，其中所述试剂是结合IL-3R但不会导致IL-3信号活化的IL-3突变蛋白。
10.如权利要求I或2所述的方法，其中所述试剂是能与IL-3结合的可溶性受体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述试剂是IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL-3Ra胞外部分与IL_3Ri3胞外部分的融合多肽。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述慢性炎症状态是关节炎，尤其是炎性关节炎。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述慢性炎症状态是类风湿性关节炎(RA)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
15.阻断或抑制IL-3信号转导事件的试剂在治疗患者的慢性炎症状态中的用途，或在制备用于治疗患者的慢性炎症状态的药物中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述试剂阻断或抑制所述患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Ra的相互作用。
17.如权利要求15或16所述的用途，其中所述试剂是与IL-3、或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3选择性结合的抗原结合分子。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述抗原结合分子是单克隆抗体、或其抗原结合片段和/或包含可变结构域的片段。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述抗原结合分子是与IL-3选择性结合的单克隆抗体。
20.如权利要求18所述的用途，其中所述抗原结合分子是与IL-3Ra选择性结合的单克隆抗体。
21.如权利要求15所述的用途，其中所述试剂包含抗细胞部分。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述抗细胞部分是选自以下的放射性同位素a -放射体，尤其是211砹；β -放射体，尤其是131碘；以及俄歇放射体。
23.如权利要求15或16所述的用途，其中所述试剂是结合IL-3R但不会导致IL-3信号活化的IL-3突变蛋白。
24.如权利要求15或16所述的用途，其中所述试剂是能与IL-3结合的可溶性受体。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述试剂是IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL-3Ra胞外部分与IL_3Ri3胞外部分的融合多肽。
26.用于治疗患者中慢性炎症状态的试剂，其中所述试剂阻断或抑制所述患者中的IL-3信号转导事件。
27.如权利要求26所述的试剂，其中所述试剂阻断或抑制所述患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Ra的相互作用。
28.如权利要求26或27所述的试剂，其中所述试剂是与IL-3、或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3选择性结合的抗原结合分子。
29.如权利要求28所述的试剂，其中所述抗原结合分子是单克隆抗体、或其抗原结合片段和/或包含可变结构域的片段。
30.如权利要求29所述的试剂，其中所述抗原结合分子是与IL-3选择性结合的单克隆抗体。
31.如权利要求29所述的试剂，其中所述抗原结合分子是与IL-3Ra选择性结合的单克隆抗体。
32.如权利要求26所述的试剂，其中所述试剂包含抗细胞部分。
33.如权利要求32所述的试剂，其中所述抗细胞部分是选自以下的放射性同位素a -放射体，尤其是211砹；β -放射体，尤其是131碘；以及俄歇放射体。
34.如权利要求26或27所述的试剂，其中所述试剂是结合IL-3R但不会导致IL-3信号活化的IL-3突变蛋白。
35.如权利要求26或27所述的试剂，其中所述试剂是能与IL-3结合的可溶性受体。
36.如权利要求35所述的试剂，其中所述试剂是IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL-3Ra胞外部分与IL_3Ri3胞外部分的融合多肽。
37.药物组合物，其包含权利要求26-36中任一项所述的试剂以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
38.试剂盒，其包含⑴权利要求26-36中任一项所述的试剂，以及任选地(ii)按照用于治疗患者中慢性炎症状态的方法使用所述试剂的说明书。
全文摘要
治疗患者中慢性炎症状态的方法，其包括给予所述患者阻断或抑制所述患者中IL-3信号转导事件的试剂。
文档编号A61K51/10GK102821815SQ201080064317
公开日2012年12月12日 申请日期2010年2月18日 优先权日2010年2月18日
发明者基诺·路易吉·瓦伊洛, 约翰·艾伦·汉密尔顿, 安德鲁·大卫·库克 申请人:Csl有限公司, 墨尔本大学