专利名称：四种及四种以上hiv载体基因疫苗序贯及重复应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域。本发明涉及四种或四种以上HIV载体基因疫苗序贯及重复应用的免疫策略。在具体应用中将不限于本前期研究中所使用的四种疫苗。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，是获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)即艾滋病的病原，于1983年首次被鉴定。艾滋病被认为是世界上直接威胁人类健康的第一大传染病，已经成为世界范围内的重要公共卫生问题。联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合发布的2009年全球艾滋病流行趋势报告显示，目前全球有大约 3340万艾滋病感染者，其中2008年新增感染者270万人，200万人死于与艾滋病相关的疾病。自1983年中国出现首例HIV感染者以来，截至2010年10月底，累计报告艾滋病病毒感染者和病人37万余例，其中病人13万余例，死亡6. 8万余例。艾滋病疫苗是控制艾滋病的重要手段。长期以来科学家们希望能研究出一种预防艾滋病感染的疫苗。在艾滋病流行初期曾经认为产生中和抗体足以预防HIV感染。在早期进行的试验表明由单体HIV膜蛋白Env产生的抗体并不能预防和控制HIV感染，究其原因主要是不能很好地产生广谱中和抗体。因此重心又从诱导中和抗体转向诱导细胞免疫反应。在此基础上进行的研究表明特异性的细胞毒性T细胞反应与病毒载量降低有关，但诱导HIV特异性细胞免疫的预防性疫苗在临床试验中均未观察到明显的保护效果。疫苗免疫可以产生较好的特异性细胞免疫反应，但持续时间较短，即使部分有效，也无法预防HIV感染，这些因素可能和疫苗失败有关。由于对艾滋病免疫保护的机理的认识进展缓慢，完全预防HIV-I感染的疫苗研制还有待突破，因此正确认识和评价疫苗的作用是十分重要的。越来越多的研究表明降低HIV感染者的病毒载量可以延缓其发展为艾滋病的时间，降低其传染给别人的可能性，从而限制HIV-I的流行。由于HIV感染者体内已经产生了针对病毒的免疫反应，通过疫苗免疫来增强对特异抗原的免疫反应，理论上在控制病毒复制，降低病毒载量，对延缓疾病进展方面能起到一定作用。目前已有50多种HIV治疗性疫苗已经完成或正在进行临床试验，这些疫苗大多采取一种疫苗单独应用或者两种疫苗以初免-加强的方案联合应用。在治疗性疫苗的设计中，很重要的一点是要考虑到疫苗的反复应用，因为这些病人可能需要接受终身治疗。载体疫苗能诱导很好的细胞免疫应答，但载体自身的免疫原性大大限制了疫苗的反复应用，因此有必要将多种能很好地诱导HIV特异性免疫应答的载体疫苗序贯应用，达到能够在病人体内多次治疗的效果。当一种疫苗免疫后产生的特异性免疫反应下降到一定水平时再给予另一种疫苗免疫，又可以再次加强已有的特异性免疫反应，依次类推免疫反应再下降时再给予第三种及第四种疫苗免疫。这样通过四种疫苗的序贯免疫即可使接种者体内长期维持较高水平的免疫反应。当一个周期的四联疫苗免疫结束后，可以再给予第二个周期的重复应用。这样可以更长时间的维持接种体内的特异性细胞免疫反应。必要时还可以增加新载体的疫苗。我们对这个设计思路进行了试验验证。
发明内容
本发明的目的是提供可以长期维持高水平特异性免疫反应的HIV多基因四种及四种以上多载体疫苗序贯及重复应用的策略。本发明组合疫苗的技术方案是一种抗艾滋病毒的组合疫苗，可以活化广谱的、抗艾滋病毒的细胞免疫反应，它由四种或四种以上的艾滋病疫苗组成，不同的艾滋病疫苗所包含的HIV基因可以相同，也可以不同，每一种艾滋病疫苗单独接种且至少接种一次，即接种总次数至少为四次。所述艾滋病疫苗可为含有编码HIV膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗等。所述HIV膜蛋白编码基因至少可以为gpl20、gpl40、gpl45、gpl60或含有上述基因片断的编码基因；所述核心蛋白基因为gag全长或部分片段编码基因。所述HIV膜蛋白或核心蛋白基因可来源于HIV-I或HIV-2型，或来源于不同的 HIV-I亚型或毒株，也可以是来源于同一毒株的不同形式，例如(但不局限于)同一亚型来源的gpl40与gpl45被认为是不同的膜蛋白或膜蛋白编码基因。所述不同的艾滋病疫苗进行先后序贯及重复免疫以活化针对病毒的细胞免疫反应。本发明组合多载体基因疫苗序贯和重复应用的技术方案是一种抗多种艾滋病毒的组合疫苗组合方法，采用四种或四种以上的艾滋病疫苗进行序贯免疫，以活化针对病毒的细胞免疫反应，将针对共同表位的细胞免疫反应连续依此提高，从而提高整体的特异性免疫反应；所述不同的艾滋病疫苗所包含的Hiv膜蛋白或核心蛋白基因可以相同。每次用一种艾滋病疫苗接种，每种疫苗可连续接种两次。在四种或四种以上不同载体疫苗序贯应用后，可以用上述载体疫苗重复序贯应用。所述艾滋病疫苗可为含有编码HIV膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗、各种重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗等。所述HIV膜蛋白编码基因至少可以为gpl20、gpl40、gpl45、gpl60或含有上述基因片断的编码基因；所述核心蛋白基因为gag全长或部分片段编码基因。所述HIV膜蛋白或核心蛋白基因可来源于HIV-I或HIV-2型，或来源于不同的 HIV-I亚型或毒株，也可以是来源于同一毒株的不同形式，例如(但不局限于)同一亚型来源的gpl40与gpl45被认为是不同的膜蛋白或膜蛋白编码基因。在本发明的具体实施例中，我们使用如下策略利用表达B’亚型gag基因的质粒 DNA、重组腺病毒及重组仙台病毒疫苗和表达B’ /C重组亚型HIV gag-pol和env基因的重组痘病疫苗进行序贯及重复应用。在恒河猴体内用DNA疫苗初免两次，重组腺病毒或重组仙台病毒疫苗作为第二或第三种疫苗加强免疫两次，最后用重组痘病毒疫苗免疫两次。用 ELISP0T方法检测细胞免疫反应，结果发现接种四种疫苗的恒河猴体内可长期维持较高水平的特异性免疫反应。在一轮四种疫苗免疫接种结束后给予第二轮疫苗接种，结果第二轮第一种疫苗重组腺病毒免疫后即可较长时间维持体内特异性免疫反应水平。(参见附图1)本发明的优势在于在我们前期三种疫苗序贯应用的基础上增加了第四种疫苗的序贯使用，而且第四种疫苗表达与前三种疫苗不同亚型的抗原，结果可以很好的诱导高水平亚型交叉性免疫反应，而且持续的时间延长。四种疫苗序贯和重复使用在文献中未见有报道，在我们的研究中能更好的激发机体的特异性免疫反应，并且可长期维持高水平。
图1为四种疫苗序贯及重复免疫恒河猴用ELISP0T方法检测不同时间点的特异性细胞免疫反应情况。
具体实施例方式HIV疫苗序贯及重复免疫恒河猴实验1.疫苗免疫和分组8只成年恒河猴随机分成3组，第1组2只为PBS对照组，在所有与实验组相同的免疫时间点，肌肉注射Iml无菌PBS ；第2组5只为四种疫苗免疫组，先用DNA于0周，2周初免两次(所用DNA疫苗是表达密码子优化型gag基因的真核表达质粒，是本申请人于2006 提交的申请号为200610098946. 1的在先专利申请中所构建的pVR-mod. gag,由本元正阳基因技术有限公司生产)，再于6周和33周免疫相同剂量的腺病毒疫苗rAd5-gag(rAd5-gag 为表达mod. gag基因的El、E3缺失的复制缺陷型重组5型腺病毒，表达的启动子为mCMV， 加尾信号为SV40polyA，是本申请人于2007年提交的申请号为200710000534. 4的在先专利申请中所构建的rAd5-mod. gag,由本元正阳基因技术有限公司生产)(或仙台病毒疫苗 rSeV-gag，rkV-gag为表达wt. gag269基因的重组F基因缺陷的仙台病毒载体疫苗，由日本载体研究所提供)，于45周和87周加强免疫仙台病毒疫苗(腺病毒疫苗)(同前)，于206 周及236周免疫重组痘病毒疫苗rMVA(rMVA为表达B’ /C重组亚型HIV gag-pol和env基因的重组MVA疫苗，由长春百克药业有限责公司提供)，第282周开始第二轮免疫，先免疫腺病毒疫苗。第3组1只为两种疫苗免疫组，于0周、2周、6周、33周、45周和87周肌肉注射Iml无菌PBS，206周及236周免疫重组痘病毒疫苗rMVA(同前)，282周免疫腺病毒疫苗rAd5-gag(rAd5-gag为表达mod. gag基因的El、E3缺失的复制缺陷型重组5型腺病毒，表达的启动子为mCMV，加尾信号为SV40polyA，是本申请人于2007年提交的申请号为 200710000534. 4的在先专利申请中所构建的rAd5-mod. gag,由深圳市源兴生物医药有限公司生产)。所用疫苗剂量分别为DNA 5mg/只，rAd5-gag IO9PFU/只，rkV-gag IO9CIU/ 只，rMVA 9 X IO7PFU/只。具体分组及免疫情况见表1。表1.恒河猴分组及免疫情况
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗艾滋病的组合艾滋病疫苗，其特征在于可以活化广谱的、 抗艾滋病毒的细胞免疫反应，它由四种或四种以上的艾滋病疫苗组成，不同的艾滋病疫苗所包含的HIV蛋白基因可以相同，每次用一种艾滋病疫苗接种，每种疫苗可连续接种两次。 在四种或四种以上不同载体疫苗序贯应用后，可以用上述载体疫苗重复序贯应用。
2.根据权利要求1所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗，其特征在于所述艾滋病疫苗可为含有编码HIV膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗。
3.根据权利要求1所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗，其特征在于所述HIV膜蛋白编码基因至少可以为gpl20、gpl40、gpl45、gpl60或含有上述基因片断的编码基因；所述核心蛋白基因为gag全长或部分片段编码基因。
4.根据权利要求1所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗，其特征在于所述HIV膜蛋白或核心蛋白基因可来源于HIV-I或HIV-2型，或来源于不同的HIV-I亚型或毒株，也可以是来源于同一毒株的不同基因形式，例如(但不局限于)同一亚型来源的gpl40与gpl45被认为是不同的膜蛋白或膜蛋白编码基因。
5.根据权利要求1所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗，其特征在于所述不同的艾滋病疫苗进行顺序组合先后序贯免疫以活化针对病毒保守区的细胞免疫反应。
6.一种抗多种艾滋病毒的组合疫苗应用方法，其特征在于四种或四种以上的艾滋病疫苗进行先后序贯免疫，以活化针对病毒的细胞免疫反应，将针对病毒的细胞免疫反应连续依此提高，从而主导整体的免疫反应；所述不同的艾滋病疫苗所包含的HIV膜蛋白或核心蛋白基因可以相同，每次用一种艾滋病疫苗接种，每种疫苗可连续接种两次。在四种或四种以上不同载体疫苗序贯应用后，可以用上述载体疫苗重复序贯应用。
7.根据权利要求6所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗应用方法，其特征在于所述艾滋病疫苗可为含有编码HIV膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗、多种重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗等。
8.根据权利要求6所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗应用方法，其特征在于所述HIV 膜蛋白编码基因至少可以为gpl20、gpl40、gpl45、gpl60或含有上述基因片断的编码基因； 所述核心蛋白基因为gag全长或部分片段编码基因。
9.根据权利要求6所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗应用方法，其特征在于所述HIV 膜蛋白或核心蛋白基因可来源于HIV-I或HIV-2型，或来源于不同的HIV-I亚型或毒株，也可以是来源于同一毒株的不同形式，
10.根据权利要求6所述的抗多种艾滋病毒的组合疫苗应用方法，其特征在于所述不同的艾滋病疫苗进行先后序贯及重复免疫以活化针对病毒的细胞免疫反应。
全文摘要
本发明涉及一种提供可以长期维持高水平特异性免疫反应的四种及四种以上HIV载体基因疫苗序贯及重复应用的策略。一种用于预防和/或治疗艾滋病的组合艾滋病疫苗，可以活化广谱的、抗艾滋病毒的细胞免疫反应，它由四种或四种以上的艾滋病疫苗组成，不同的艾滋病疫苗所包含的HIV蛋白基因可以相同，每次用一种艾滋病疫苗接种，每种疫苗可连续接种两次。在四种或四种以上不同载体疫苗序贯应用后，可以用上述载体疫苗重复序贯应用。
文档编号A61K48/00GK102258779SQ20111020029
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者于湘晖, 余双庆, 冯霞, 孔维, 曾毅, 李泽林, 杨玲 申请人:冯霞, 曾毅