专利名称：金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及金腰带的用途，特别涉及一种金腰带在制药领域中的用途。
背景技术：
金腰带为瑞香科植物芫花的根皮加工制成品，即芫花根制成品，民间俗称为“贼药”。芫花根，英文名称Root of Lilac Daphne，别名黄大戟、金腰带、蜀桑、铁牛皮、 浮胀草；拉丁植物动物矿物名Daphne genkwa Sieb. et Zucc0芫花根味辛；苦；性温；有毒；归肺；脾；肝；肾经；功能逐水；解毒；散结。主水肿；瘰疬；乳痈；痔瘘；疥疮；风湿痹痛； 用法用量内服煎汤，1. 5-4. 5g ；捣汁或入丸、散。外用适量，捣敷；或研末调敷；或熬膏涂。《吴普本草》久服令人泄；《本草经集注》决明为之使。反甘草。芫花根全年均可采，挖根或剥取根皮，洗净，鲜用或切片晒干。芫花为直立落叶灌木，高达lm。根长者可达10cm，主根直径0. 6-1. 5cm，有分歧，外表黄棕色至黄褐色；根皮富韧性。茎直径至lcm，暗棕色；枝细长，褐紫色，幼时密生绢状短柔毛。叶对生，间或互生；有短柄，长约1mm，被短柔毛；叶片椭圆形至长椭圆形，长2. 5-5cm,宽0. 8-2cm,稍带革质，先端尖，全缘，幼时叶之两面流生绢状短柔毛，以脉上为密，老则渐脱。花淡紫色，腋生，先叶开放，通常3-7朵生叶腋间短梗上，以枝端为多；花两性，无花瓣；花被管细长，长约1cm，密被绢状短柔毛，先端4裂，裂片卵形，长不及Icm ；雄蕊8，2轮，着生于花被管上，不具花丝；雌蕊1，子房上位，1室，花柱极短或缺如，柱头头状。核果革质，白色。种子1颗，黑色。花期 3-4月，果期5月。生于路旁、山坡或栽培于庭园。分布于华东及河北、陕西、河南、湖北、湖南、四川、贵州等地。脊髓损伤，英文名称spinal cord injury，以下简称SCI，脊髓顿挫损伤在临床较为常见。挫损可致脊髓导致局部神经元受损，胶质细胞激活。特别是因外力和炎症导致的脊髓继发损伤可进一步加重对神经元和轴索的损害，进而导致感觉运动和传导功能障碍。脑源性神经营养因子，英文名brain derived neurophic factor,以下简称 BDNF，是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。BDNF于1982年被纯化，是神经生长因子(英文名Nerve Growth Factor,以下简称NGF)家族的第二成员。大量的研究已显示其生理作用不仅涉及神经神经元存活、增殖、 分化和诱导神经突起生长，而且对损伤后的神经再生亦有促进作用。BDNF不仅支持神经脊源性感觉和基板源性运动神经元的存活。而且对培养中的本体感觉神经元亦有作用。此外， 在鹌鹑胚胎DRG和结状节神经元的自然死亡期应用BDNF可阻止其细胞死亡(in vivo)。脑内BDNFmRNA的高峰分别是生后2周。BDNF作用的发挥是通过与高亲和力受体trkB结合而后激活第二信使传导途径来实现的。trkBmRNA在神经元和非神经元广泛表达，包括脊髓和大多数感觉和交感节，遍及神经系统的大多数区域。BDNF和trkB突变小鼠大多在生后几天内死亡。表现为前庭节丧失，感觉神经元中度丧失，但交感节不受影响。近年将胚胎组织脊髓移植入成体脊髓后发现移植物周围BDNF的表达均明显增加。因而一些学者认为，损伤刺激或胚胎移植可能诱发了宿主脊髓在胚胎发生过程中曾经拥有的BDNF的表达模式，以增强这些因子的表达方式来为损伤神经元提供营养支持，以有利于损伤后的突触重建和功能恢复。因此，BDNF在神经元发育和神经损伤修复中具有重要作用，是一个十分重要的分子。 文献报道，BDNF对运动神经元的发育有重要作用。缺乏BDNF可导致胚胎发育中的脊髓运动神经元发生细胞凋亡。在相关研究中，有学者认为，随着反应进程，神经元对神经营养因子(NTF)的依赖作用减弱。如在胚胎发育期，NTF表达水平较高，而随发育进程，NTF表达逐渐减少，成年动物神经组织内往往NTF的含量较低。至今对NTF在成年神经组织中的作用缺乏系统认识。 有学者甚至认为NTF在成年组织中的作用不大。然而，有趣的是，神经损伤后，成年组织内的一些NTF往往明显增加，提示NTF可能重演其在胚胎时的角色，发挥保护神经元，促进神经再生的功能。因此，成年脊髓内的BDNF作为一种备用分子，尽管其含量较低，但对神经元的正常功能维持和对神经元损伤后的营救功能是不能忽视的。在半横断或者全横断损伤脊髓，BDNF表达被明显上调。提示BDNF增加与自主运动功能部分恢复有关。提示BDNF在SCI修复中的重要作用。目前的文献支持BDNF在损伤脊髓中的作用是有益的。BDNF在脊髓损伤后可能参与损伤运动神经元存活的维持和调节突触信息传递，影响其它神经营养因子合成等。BDNF 的生物学作用可总结为①对中脑内多巴胺能(DA)神经元的存活和分化的促进作用。② 对运动神经元的营养作用(容易被运动神经逆行运输，可维持体外培养的大鼠脊髓和脑的运动神经元存活)。③支持感觉神经元存活(节结状神经细胞)，和成年鼠损伤后溃变轴突出芽。④调节神经元的连接(BDNF或NT-3能迅速增加培养的海马神经元内的细胞内Ca2+， 因而能增加神经递质的释放。⑤支持基底前脑胆碱能神经元的存活和生长。关于脊髓内 BDNF的来源可能有两种途径一，从外周逆行转运而来，已报导BDNF可在初级感觉神经元的轴突转运至脊髓。其转运过程是在转运蛋白Hungtinting的帮助下完成的。另一可能是在神经元自身合成，尽管在正常情况下脊髓BDNF的表达水平较低，但损伤后，BDNF基因表达可能明显上调。这可能是损伤神经元启动了自救机制，增加各种因子表达一对损伤刺激， 进而有利于神经元抗损伤反应。N-甲基-D-天门冬氨酸，英文名:N-methyl-D-aspartic acid,以下简称=NMDA ；N- -D-:N-methyl-D-aspartic acid receptor，以下简称NMDA受体，是离子型谷氨酸受体的一个亚型，作为一种兴奋性氨基酸，其在神经损伤修复中能诱导神经元凋亡。各种因素引起神经系统损伤时，神经末稍释放大量谷氨酸等兴奋性氨基酸，激活N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体，从而产生严重的神经毒性，引起神经元的损伤或死亡[1]。Monnerie H，Shashidhara S，Le Roux PD.Effect of excess extracellular glutamate on dendrite growth from cerebral cortical neurons at 3 days in vitro Involvement of NMDA receptors[J]. J Neurosci Res, 2003, 74 (5) :688-700.(《神经元研究月刊》2003年第74 (5)期第688-700页，“在三天时间内超量细胞外谷氨酸对体外大脑皮层神经元树突生长的效果”，作者马尼瑞H，沙斯哈瑞S，列罗克斯PD)有文献报道，谷氨酸通过上调Bax及下调Bcl-2蛋白的表达水平从而诱导小鼠海马神经元HT22细胞系发生凋亡。在原代培养的皮层细胞中，谷氨酸经由线粒体信号转导的caspase活化通路上调caspase-3的表达水平诱导细胞凋亡。因此，研究NMDA受体通路寻找抑制神经元凋亡的途径可成为治疗某些神经系统疾病的关键。内源性兴奋性氨基酸的释放对损伤的中枢神经系统有毒性作用，分布在脊髓的 NMDA受体在中枢神经系统毒性损害中可能起主要作用，其机制主要通过细胞的离子改变造成神经损伤，早期是Na离子和Cl离子在细胞内积聚导致细胞毒性水肿和细胞外Ca向细胞内流，导致迟发性神经细胞死亡。最近的研究表明将NMDA直接应用于脊髓损伤部位激活 NMDA受体可以加重大鼠的瘫痪，而NMDA拮抗剂的应用可以明显促进神经功能的恢复。文献报道，脊髓内的大部分神经递质是谷氨酸能的，包括脑下行纤维，初级传入纤维，和脊髓神经元之间都用谷氨酸作为兴奋性神经递质。NMDA受体主要存在于脊髓背角。特别是脊髓背角浅层(1、II板层)伤害性信息传递通路中的数量最为丰富。不同NMDA受体亚型在脊髓的分布也不同。脊髓后角I，II板层的突触后膜主要表达NRl亚型。NR2各亚型在脊髓上的分布具有明显的区域特征，NR2B表达的密度最高，主要分布在脊髓后角；NR2A和NR2D 中等强度的分布于髓全层，NR2C在脊髓上表达较少。正因为NMDA在这种伤害性传导通路中的特异性分布，目前认为这是其参与伤害性信息传递的物质基础。根据分布，NMDA受体可分为以下几类(1)突触后NMDA受体分布于脊髓背角神经元上的NMDA受体可看做第一级感觉突触的突触后受体。突触后NMDA受体与PsD 95/SAP90的相互作用和脊髓伤害感受信息的传递有关“一，NMDA受体通过NR2亚基的胞浆c 一末端和PSD — 9SAP90的PDZ 区域相互作用锚定于突触后。PsD — 95/SAt 90能集合NMDA受体周围的特殊系列信号蛋白 (nNOS、SynGAP和SPAR)，这些信号蛋白可能位于NMDA受体信号转导的下游” ；“二，使脊髓背角神经细胞内发生蛋白质翻译后加工修饰和核内基因转录水平的变化，形成痛觉过敏和异常痛觉。” (2)突触前NMDA受体分布于传入神经末梢及背根神经节神经元上的NMDA受体可被看做是突触前受体。原位杂交和免疫组化实验提示NMDA受体也存在背根神经节上。 应用全细胞膜片钳技术在成年大鼠新鲜分离的DRG细胞证实了 NMDA受体的存在。再以免疫细胞化学方法显示其胞浆中的Glu样免疫反应性，从而确证了大鼠神经元NMDA自身受体的存在。NMDA受体作为DRG的自身受体，在外周末梢促进伤害信息的传递，在中枢端增加神经递质从传入末梢的释放而易化突触传递.起到突触前调制的作用。大鼠DRG神经元有 NR2B、NR2C亚基，而NR2B亚基主要存在于小直径的初级传入纤维。(3)突触外NMDA受体 分布于第一级感觉突触之外的细胞膜上，称之为突触外NMDA受体。分布于突触外的NMDA 受体主要是NR2B和NR2D亚型。在成年鼠脊髓第U板层用膜片钳记录技术发现”，NR2B亚基主要存在于突触外而不参与突触传递，而在疼痛状态下，突触外谷氨酸的增加能激活突触外的NMDA受体，由此表明突触外NR2B亚基在痛觉传递中的可能作用。NMDA受体可提高脊髓背角神经元的兴奋性，参与脊髓水平伤害性信息传递，在伤害性感受及痛觉过敏形成中起着重要的作用。NMDA受体在中枢敏感化中的重要作用体现在两个方面一是NMDA受体的激活常发生于反复刺激C纤维所致的wind-up现象；二是鞘内应用竞争性或非竞争性NMDA受体拮抗剂可抑制中枢敏感化。累积的生物学、电生理学及行为学资料指出NMDA受体可介导持续数小时到数天的长时程突触可塑性变化一，证明NMDA 受体在中枢敏化及慢性痛的形成中扮演重要角色。当持续性伤害性刺激通过外周神经纤维传递至脊髓后角时，可引起兴奋性氨基酸(主要为谷氨酸和天冬氩酸)释放，激活NMDA受体，引起ca2+内流，进而激活H(C。同时促进NO产生增多，再通过PKC使包括NMDA受体在内的多种受体蛋白和离子通道磷酸化，同时通过NO的复杂作用改变神经元的兴奋性，并以这种正反馈放大效应将伤害性信息进一步向中枢传递，引起痛觉过敏。
发明内容
本发明的目的在于提供金腰带的新用途，即在制药领域中的新应用。本发明涉及金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用。为了更好地理解本发明的实质，下面将用金腰带的动物试验和临床试验结果来说明其在制药领域中的新用途。制备金腰带(1)将芫花根用清水浸泡冲洗7天，剥取根皮，去除木质心及杂质，洗净后晒干，破碎成直径约1平方厘米的小块状；(2)取1000克上述芫花根，加入浓度为60%的乙醇5000毫升，用回流提取法提取 1小时，制得乙醇提取液；(3)取以下重量份配比的原料溶水性糊精1重量份，淀粉1重量份；将上述原料均勻混合，制得吸收剂；(4)取以上333. 3克吸收剂加入到乙醇提取液中，使成清膏状物料，将清膏状物料放在干燥箱中低温干燥，收集干燥物研成细粉，即制成金腰带。以下公开用上述制备的金腰带所进行的动物试验和临床试验结果金腰带的小鼠经口给药急性毒性试验(本实验由国家中医药管理局中医药三级实验室云南中医学院中药药理实验室承办)1、实验材料1. 1动物昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体重18_22g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK(川)2008-24，批号DOSSy2011-01.1. 2药物“金腰带”散剂，每克含3克原生药，由玉溪市中医院提供，临床成人日剂量为1. 5g散剂/日(按60kg/人，即0. 075g生药/Kg体重)。1. 3药物配制“金腰带”散剂临用前以蒸馏水稀释成所需浓度，给药前旋涡混勻。2、方法与结果经预试验，“金腰带”药液最大浓度、最大体积灌胃给予小鼠，动物给药后自发活动减少、呼吸急促、口唇紫绀、而后俯卧不动，7小时后开始出现死亡。动物死亡率为90%，因此求其半数致死量(LD50)。调整给药浓度进行预试，得出90%小鼠死亡率的致死量为60g 生药/Kg体重，最小致死量为10. 68g生药/Kg体重，所以在这两个剂量之间，按1 0.75 的比例设置6个剂量组。取清洁级昆明种小鼠70只，雌雄各半，按体重、性别随机分7组，每组10只。试验前禁食不禁水12小时，6个给药组小鼠分别按60g生药/Kg、45g生药/Kg、33. 75g生药/Kg、 25. 31g生药/Kg、18. 98g生药/Kg、14. 24g生药/Kg体重一次灌胃给予“金腰带”药液，给药体积均为0. %il/10g体重，空白对照组给予等体积的蒸馏水。密切观察12小时，以后上、下
6午各观察一次，连续观察14天。每天观察各组小鼠的外观、行为和毒性反应，并记录各组小鼠的死亡数1、2、3。用Bliss法计算小鼠的半数致死量，结果见表1。表1 “金腰带”药液LD50测试小鼠用药、死亡及有关计算
权利要求
1.金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用。
全文摘要
金腰带在制备治疗急性脊髓损伤的药中的应用，特别涉及一种金腰带在制药领域中的新用途。金腰带治疗急性脊髓损伤损伤确切有效，毒副作用小，安全性较高，金腰带在治疗脊髓损伤时，能够上调BDNF表达，同时下调NMDA受体表达，有效改善SCI大鼠运动功能。
文档编号A61K36/83GK102266433SQ20111020628
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者许争光 申请人:玉溪市中医医院