专利名称：灵芝酸g在肿瘤治疗中作为免疫增效剂和超抗原依赖的治疗药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及灵芝酸的新用途，尤其涉及灵芝酸G(Gan0deriC acid G)的新用途。
背景技术：
灵芝是中医药学宝库中的珍品。自古以来流传着许多关于灵芝的传说，在这些神话般并带有迷信色彩的传说中，将灵芝奉为“仙草”、“瑞草”，并视其为“吉祥如意”的象征。 我国古代文献中，公元前一世纪左右的《神农本草经》、东晋葛洪的《抱朴子》、唐朝苏敬的 《新修本草》、梁代陶弘景的《神农本草经集注》和《名医别录》以及明朝李时珍的《本草纲目》 等著作均在《神农本草经》的基础上进一步补充、修正了有关灵芝的论述。综上所述，我国古代学者根据实践经验得出，灵芝具有“扶正固本作用”，可以治疗多种疾病。现代科学技术证明，灵芝的主要有效成份包括灵芝多糖(Polysacchari de)、灵芝酸(Ganoderma Acid)和腺苷(Adenosine)等。近年来，多糖的抗肿瘤及免疫调节活性作用倍受关注，有研究表明，多糖可以使受损的DNA得到恢复。北京医科大学教授林志彬、张群豪等从细胞及分子水平观察了灵芝多糖的抗肿瘤作用机制。2002年以后，对灵芝的有效成分研究又发展到对灵芝三萜(灵芝酸)活性成分的探讨。目前，从灵芝中已分离得到的灵芝酸已达100多种，如灵芝酸々、8、(、03、？、6、1、1^嫩、1^、1 、1 。然而对灵芝酸免疫有关的研究甚少，尤其对具有保肝和毒杀肿瘤细胞等功用的机理不清楚。虽然有学者报道过灵芝可促进DC成熟，但国内文献中还没有见到关于T、B细胞系在免疫方面的角色相关报道。有关灵芝酸抗肿瘤专利有CN1483423，主要与其它药物配伍后用于癌症的治疗； 专利CN1480208的用途是作为放、化疗减毒增效的药物组合物；而专利CN1286119则是含 15%的灵芝酸作为健康品的制备方法。另外，灵芝酸单体的专利有CN1823788A，主要成分是灵芝酸Me及T作为增敏增效剂及抑制剂的应用；专利CN1823787A为灵芝酸Me及T在制备癌转移抑制中的应用。灵芝酸G作为灵芝酸中的单体，其相关肿瘤抑制及在联合用药方面尚未见报道。目前，肿瘤化疗中最大的问题是肿瘤形成的耐药性。现代生物技术制药中可以实现的有耐药逆转剂包括反义核酸与核酶，细胞因子(IL-2或TNF- α )、GSH耗竭剂、抗体及小分子抗体肽等。鉴于理想的增效药物应该对正常组织细胞毒性小、具有抗肿瘤活性、稳定、 半衰期长等。本项发明正与其符合。因此，具有直接的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开灵芝酸在制备多药耐药性癌症化疗增敏增效剂和抑制剂中的应用，以满足临床医学的需要。本发明所说的灵芝酸为灵芝酸G(Gan0deriC acid G，缩写GA_G)。发明人发现，灵芝酸G小剂量使用能增加多药耐药性肿瘤对已产生耐药性的化疗药物敏感，大剂量使用能抑制多种多药耐药性肿瘤细胞生长的作用且具有剂量依赖性，可将它们作为治疗多药耐药性肿瘤的药物和增敏增效剂，应用于肿瘤的化疗治疗中。所说的小剂量指的是1 5mg/(公斤体重·天)的剂量，所说的大剂量指10 50mg/(公斤体重 天)的剂量。本发明还涉及一种组合物，包括治疗有效量的灵芝酸G和医学上可接受的载体。可以将灵芝酸G与医学上可接受的载体以组合物的形式，施加于需要治疗的患者，一般剂量为1 50mg/(公斤体重 天)的剂量，具体剂量可根据患者年龄、病情等的不同进行增减。所说的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，润滑剂如滑石粉等。本发明的灵芝酸G与上述载体构成的组合物，可以通过口服、敷贴或注射等多种给药形式施加于需要这种治疗的患者。用于口服时，可以将其制备成为常规的片剂、胶囊或口服液等；用于注射时，可以将其采用本领域常规的方法，制备成为注射液；本发明的灵芝酸G的各种制剂，包括口服制剂、敷贴剂和注射剂等可以采用药学领域常规的方法进行制备；制剂中，灵芝酸G的重量含量为0. 5 99. 9 %，优选的含量为10 99. 9 %。本发明提供的灵芝酸G的各种制剂，在小剂量的情况下具有增强多药耐药性肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用。所说的小剂量指的是1 5mg/(公斤体重 天)的剂量。本发明提供的灵芝酸G的各种制剂，在大剂量的情况下具有抑制多药耐药性肿瘤细胞增殖的作用，说明可以遏制肿瘤细胞的无限增殖能力，因而有可以进一步发挥更大程度治疗肿瘤的效果。所说的大剂量指的是10 50mg/(公斤体重 天)的剂量。本发明提供的多药耐药性肿瘤化疗中的抗癌剂和增敏增效剂，对多药耐药性癌细胞和非多药耐药性癌细胞有相同的细胞毒性，而且两者差异不显著(P < 0. 05)。所说的灵芝酸G是通过发酵提纯或是经过灵芝实体直接分离提纯的单体。所说的超抗原是可以通过市售获得。所说的多药耐药性肿瘤为医学上所属的各类肿瘤，包括良性肿瘤各恶性肿瘤。而所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官的肿瘤，肝癌，子宫瘤，白血病， 神经系统肿瘤，皮肤癌。动物试验证明，本发明的抗癌剂和增敏增效剂，低毒，适合于人和哺乳类动物经口和非经口给药。本发明提供的多药耐药性肿瘤化疗中的抗癌剂和增敏增效剂，通常能与不影响药理学作用的辅料配合制成经口或非经口给药的制剂。本发明的显著优点和技术上的进步本发明提供的具有同时抗肿瘤和增敏增效作用的灵芝酸G单体，克服了传统的以灵芝混合提取物作为药物的缺陷，用现代生物技术作为发明的手段，明确了有效成分，运用纯化合物作为抗肿瘤药物和增敏增效剂，减少了未知成分引起副作用的可能性，这种化合物具有显著的同时抗肿瘤和增敏增效的作用(体外和体内实验)，同时对人体正常细胞的细胞毒性较小，具有良好的应用前景。
图1不同浓度灵芝酸G对各种癌细胞的抑制作用。黑条，灵芝酸G浓度为Oyg/ml 黑格，灵芝酸G浓度为100 μ g/ml黑点，灵芝酸G浓度为30 μ g/ml 白条，灵芝酸G浓度为300 μ g/ml图2灵芝酸G增加裸鼠对顺钼的敏感性。图3100 μ g/ml灵芝酸G对各种癌细胞及正常⑶4+T细胞的毒性作用。图4超抗原依赖的灵芝酸G对肿瘤细胞的杀伤作用。图如超抗原依赖的灵芝酸G对A20细胞的杀伤作用图4b超抗原依赖的灵芝酸G对HeLa细胞的杀伤作用
具体实施例方式下面通过实施例对本发明内容作进一步说明。所举之例并不限制本发明的保护范围。实施例中的所有肿瘤细胞株均由日本东京女子医科大学微生物免疫研究室提供。 所有实验数据均来自同实验室实验所获得。实施例1利用3H法测定U-937、Ramos、K562、Raji, THP-I肿瘤细胞的抑制作用。对数期细胞按IO4/孔接种于96孔圆底培养板，每孔200 μ 1，平行3孔，对照组添加等量培养液，用浓度分别为0、30、100、300 μ g/ml的灵芝酸G添加后，置37°C 5% CO2培养箱培养72小时，计数前6小时前加入咕，然后计数肿瘤细胞的生长数量并做图。实施例2对数期KB-A-I细胞106/ml浓度，0. 2ml/每只接种裸鼠腋下，裸鼠SPF环境下生长 15天，分离实体瘤，无菌条件下接种实验裸鼠左右腋下，5天后药物腹腔注射治疗，按顺钼 (Cisplatin DDP)组和顺钼加灵芝酸G组进行治疗。5天为一疗程，共治疗2个疗程。停药 6天后处死裸鼠，取实体瘤称重计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(％ )=[(对照组实体瘤平均重量数-给药组实体瘤平均重量数)/ 对照组实体瘤平均重量数]X100实施例3利用3H 法测定 KB-A-l、U-937、Ramos、K562、Raji、THP_l、A20、Hela 及 CD4+ 正常人 T细胞的毒性作用，对数期细胞按IO4/孔接种于96孔圆底培养板，每孔200 μ 1，平行3孔， 对照孔添加等量培养液，用浓度为100μ g/ml的灵芝酸G刺激，置37°C 5% CO2培养箱培养 72小时，计数前6小时前加入3H,然后计算药物对细胞的抑制率，并以细胞的半数抑制浓度作图。实施例4用红色荧光染色肿瘤细胞A20、Hela 30秒1640培养液洗涤3次，超抗原和超抗原加灵芝酸G分别刺激肿瘤细胞与T细胞1 1于96孔培养板中混合培养2小时，收集细胞并洗涤固定，用绿色荧光标记的Caspase-3染色肿瘤细胞，用流式细胞仪计数死亡的肿瘤细胞数目作图。
权利要求
1.灵芝酸G在制备肿瘤化疗时的增效剂，或是联合超抗原时作为治疗剂使用，所说的灵芝酸G 为灵芝中的单体(化学名 Lanost-8-en-26-oic acid，3，7，12-trihydroxy-ll, 15， 23-trioxo-, (3 β，7 β，12 β )-，分子式 C30H4408)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所说的肿瘤是指医学上所属的各类肿瘤， 包括良性及恶性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官的肿瘤，肝癌，子宫瘤，白血病，神经系统肿瘤，皮肤癌。
4.一种组合物，包括治疗有效量的灵芝酸G和医学上可接受的载体。
5.超抗原依赖是指各种方式包括医学上可接受的联合用药。
6.根据5中所提的超抗原包括所有能诱导人类T细胞克隆活化的超抗原包括细菌性、 病毒及植物性超抗原。
全文摘要
本发明涉及灵芝酸的一种新用途，尤其涉及灵芝酸G(Ganoderic acid G)在各种肿瘤治疗中的应用。本发明的灵芝酸G的各种制剂，包括片剂、胶囊剂等固型制剂、软膏、贴敷剂、注射剂等可以采用药学领域常规的方法进行制备。本发明提供的肿瘤治疗药物灵芝酸G，小剂量下具有直接抑制肿瘤细胞增殖的作用，而此时对于正常组织细胞的毒性作用不强，对于进一步治疗肿瘤的效果，则在添加超抗原后得到实现。本发明的显著的优点和技术上的进步本发明的灵芝酸G与超抗原联合时，在体外和体内实验中都能有效发挥其杀伤多种肿瘤细胞。
文档编号A61K31/575GK102440994SQ20111029161
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者李仲娟, 杨朝令 申请人:李仲娟, 杨朝令