专利名称：抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于预防HCV感染的技术领域，涉及抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用。
背景技术：
HCV(丙型肝炎病毒)为黄病毒属，单股正链RNA病毒，由结构蛋白(Core、El、E2) 和非结构蛋白(NS2 NS5B)组成。HCV是丙型肝炎的病原体，急性感染后约75%发展为慢性肝炎，其中约20%结局为肝硬化或肝功能衰竭，并有可能进一步发展为肝癌。目前全世界有1. 7亿感染者，我国约有4000万，HCV感染已经成为全球性的社会公共卫生问题之一。HCV因病毒自身的高变异性，给疫苗研究造成极大困难。现今对HCV感染的治疗仅限于单独使用干扰素(interferon，IFN)，或者与广谱抗病毒药物利巴韦林(rikwirin)联合用药，但治疗效果不佳，有一定的副作用，且不同型别对IFN反应性差别较大。多年来研究者一直在寻找防治感染的有效靶点，但还未得到特异有效的抑制剂，使用效果仍在实验或临床研究初步评估阶段。根据病毒与细胞相互作用的理论，病毒与宿主细胞膜表面受体的特异性结合是病毒感染的始动环节，型别不同的同种病毒在与细胞结合过程中作用分子一般是固定的，阻断二者之间的结合，即可有效地抑制病毒性感染的发生。2003年美国FDA批准抗人免疫缺陷病毒(HIV)的新药T-20(又名Enfuvirtide或Fuzeon )上市，T-20是穿入抑制剂中第一个上市的药物，含有36Aa，能够与HIV包膜糖蛋白gp41结合，阻止病毒与靶细胞的融合，临床试验证明效果较好，受试者副反应较小(Cervia JS, et al. Enfuvirtide (T-20) a novel human immunodeficiency virus type lfusion inhibitor. Clin Infect Dis. 2003 ；37 (8) :1102-6)。目前已经确证HCV包膜糖蛋白E1-E2是与宿主细胞受体结合的唯一关键性分子， 其中E2被认为是最重要的分子。1998年Pileri等的研究表明人⑶81 (h⑶81)可能是HCV 的受体(Pileri，P. et al. Binding of hepatitis C virusto CD81. Science. 1998 ；282 938-941)。随后低密度脂蛋白受体(LDLR) (Agnello V, et al. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells vialow density lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 ；96 :12766-71)、清道夫受体 B 族 I 型(SR-BI) (Scarselli Ε, et al.The human scavenger receptorclass B type I is a novel candidate receptor for the hepatitis C virus. EMBO J. 2002 ；21 (19) :5017-25)、钙离子依赖型(C 型)凝集素 DC/L_SIGN(PohlmannS, et al. Hepatitis C virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR. JVirol. 2003 ；77 (7) :4070-80)、Occludin (Ploss A, et al. Human is a hepatitis Cvirus entry factor required for infection of mouse cells. Nature. 2009 ；457 :882-6)和细胞连接骨架蛋白 Clauding-I (Evans MJ, et al. Claudin-Iis a hepatitis Cvirus coreceptor required for a late step in entry. Nature. 2007 ； 446 :801-5)等都被证实是HCV的可能受体，目前比较一致的看法是HCV通过包膜糖蛋白E2与CD81特异性结合，使病毒吸附于宿主细胞表面，但由于CD81介导的内吞作用弱，病毒最终进入细胞可能还需其他分子，如LDLR、SR-BI等来辅助，Clauding-I则在病毒穿入过程的后期起到关键作用(Helle F, et al. Hepatitis C virus entry into host cells. Cell Mol. 2008 ；65 :100-12)。不同研究小组利用噬菌体肽库法筛选HCV的穿入抑制剂，结果显示具有SPQYWTGPA基序的多肽可以竞争抑制HCV E2与MD81的结合(Cao J，et al, Phage displayselection on whole cells yields a small peptide specific for HCV receptor humanCD81. Cell Res. 2003 ； 13 (6) :473-9)、具有 TSQNIRS 基序的多肽可以抑制 HCV侵染细胞(Hong HW, et al. Selection of P印tides Binding to HCV E2andlnhibiting Viral Infectivity. J Microbiol Biotechnol. 2010 ;20 :1769-71)，这些都显示了以阻断 HCV与受体结合为基础设计抗病毒药物的可行性(MeanwellNA. H印atitis C virus entry an intriguing challenge for drug discovery. Curr OpinInvestigate Drugs. 2006 ； 7(8) :727-32.禾口 Pawlotsky JM, et al. The hepatitis Cvirus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 2007 ； 132 (5) :1979-98)。
发明内容
本发明解决的问题在于提供抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用，筛选能与HCV包膜糖蛋白E2结合的多肽序列，获得以HCV E2为靶位的多肽，以阻断病毒与细胞的结合，抑制病毒侵染细胞。本发明是通过以下技术方案来实现抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示。所述的抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽应用于丙型肝炎病毒侵染细胞的吸附抑制剂或阻断剂。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明以HCV E2蛋白做配基淘筛噬菌体随机7肽库，淘筛能够与HCVE2蛋白特异性结合的噬菌体，在确定其结合特异性之后，获得阳性克隆的序列，以阳性克隆所推导出的序列人工合成多肽，命名为TDl和TD2。本发明提供的多肽TDl和TD2，能够与HCV表达的E2蛋白进行结合吸附，从而阻断 HCV对细胞的进入或转染。通过HCV假病毒(HCVpp)及HCV RNA转染的细胞培养(HCVcc) 系统检测多肽TDl和TD2对HCV入胞的抑制作用，结果显示TDl和TD2对HCVpp及HCVcc 感染细胞具有一定的抑制效果，可以作为HCV的吸附抑制剂或阻断剂。
图Ι-a 图Ι-b为Wfestern blot分析E2661蛋白的表达情况，其中图l_a为以 anti-His标签的单抗作为一抗的检测结果，图Ι-b为以HCV阳性血清作为一抗的的检测结果；图2为第三轮噬菌体与HCV E2结合的ELISA检测结果；图3为随机挑选的噬菌体克隆与HCV E2结合力的ELISA检测结果；图4为阳性克隆测序后推导的氨基酸序列，其中下划线表示克隆间的相似序列；
图5为荧光素酶活性检测合成多肽对HCVpp侵染细胞的抑制效果；图6为Wfestern blot法检测HCVcc与多肽孵育后细胞内HCV蛋白的表达；图7为RT-PCR法检测HCVcc与多肽孵育后细胞内HCV RNA的表达。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 1、HCV E2蛋白的构建与表达1. 1利用分子克隆的方法构建E2重组质粒采用PCR扩增HCV的包膜糖蛋白E2的基因(属于Ia基因型)，并分别在上、下游引物的5’端设计EcoRI、3’端设计HindIII酶切位点，将扩增的克隆产物通过构建的酶切位点克隆于pET28a载体(购自Novagen公司，货号69864- 当中，获得重组载体命名为 pET28a-E^61，具体构建方法如下首先通过PCR方法扩增HCV 基因编码区片段，两端引物两端分别设计EcoRI 和HindIII酶切位点，PCR产物克隆于pMD18-T中，获得pMD18_E^61 ；分别用EcoRI和HindIII双酶切pMD18_E^61和pET28a，胶回收载体和目的片段， T4连接酶14°C连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含卡那抗性的LB固体培养基，37°C孵箱培养12 14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为 pET28a-E2661 ；用EcoRI和HindIII双酶切鉴定含目的片段E2661的重组质粒，结果显示E2-661 基因克隆到预定的酶切位点上。1. 2HCV E2在原核细胞中的表达与纯化将重组质粒pET28a_E^61转化大肠埃希菌(E. coli)BL21 (DE3)，并以pET28a空载体为对照同时进行转化。从转化有pET28a-E^61及pET28a空载体的BL21 (DE3)平板上挑取单菌落于5ml LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，次日以1 100接种新鲜的LB培养基，37°C培养约2. 5 3h，至A600值约为0. 5，以终浓度分别为0. 6、0. 8和lmmol/L的IPTG 诱导，在诱导后3、4、证时分别取样。离心收集菌体，超声波裂解菌体后，经SDS-PAGE电泳分析E2-661蛋白的表达情况，结果显示目的蛋白大量表达，分子量约32kD，主要以包涵体形式存在，Western blot显示表达蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清具有良好的反应原性。由于之后噬菌体随机肽库的筛选需要，还需对所表达蛋白进行了纯化，将原核表达产物过镍离子(Ni-NTA)亲和层析柱，重组蛋白E2-661在洗脱液(elution buffer)中含量最多，从而获得了纯化的目的蛋白；对纯化的重组蛋白E2-661进行^festern blot检测(分别以anti-His标签的单抗作为一抗、以HCV阳性血清作为一抗进行表达检测和抗原性检测)和SDS-PAGE分析，如图1所示的Western blot检测结果图Ι-a为anti-His标签检测，其中泳道1 空载体转化菌IPTG诱导；泳道2 pET28a-E2661转化菌经IPTG诱导；泳道3 :pET28a-E2661转化菌IPTG诱导后超声裂解沉淀；泳道4 :PET28a-E2661转化菌未经IPTG诱导，只有泳道2、3具有相应的条带显示，超声处理的结果显示经IPTG诱导之后，目的蛋白主要存在于裂解沉淀中，说明该蛋白以包涵体形式存在。图Ι-b为目的蛋白抗原性检测，其中泳道1 :pET28a-E^61转化菌经IPTG诱导；泳道2 :pET28a-E2661转化菌IPTG诱导后超声裂解沉淀；泳道3 :pET28a-E2661转化菌未经 IPTG诱导，泳道1、2中显示了相应的预期条带，这表明所纯化的重组蛋白能够与阳性血清反应，具有相应的抗原性。以上分析结果显示所纯化的重组蛋白HCV E2-661纯度较好，能够用于后续噬菌体随机肽库的筛选。2、利用噬菌体肽库筛选与HCV E2-661蛋白特异结合的多肽具体采用Ph. D. -7噬菌体随机展示7肽库，购自New England Biolabs公司(货号E8100S)，肽库库容量为2. 8 X IO9,氨基酸分布无明显偏移，以207 (1.观X IO9)计算，几乎涵盖了绝大多数7肽的氨基酸组合。利用噬菌体肽库的筛选具体包括以下步骤1)淘筛噬菌体7肽库以纯化的HCV E2-661包被35mm塑料培养皿，孵育后加入噬菌体，筛选方法按试剂盒提供的操作手册进行下一轮筛选，共进行3轮。HCV E2的浓度及与噬菌体的结合时间依次递减，蛋白浓度由第一轮的100 μ g降至第2、3轮的50 μ g及20 μ g，与噬菌体的结合时间依次为60min、30min和20min。经3轮筛选后，能够与HCV E2-661结合的噬菌体得到了有效的富集。每轮筛选时噬菌体的投入与产出量及富集效果如表1所示表1每轮筛选时噬菌体的投入与产出量及富集效果
权利要求
1.抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽，该多肽的序列如SEQID NO :1或SEQ ID NO 2 所示。
2.权利要求1所述的抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽应用于丙型肝炎病毒侵染细胞的吸附抑制剂或阻断剂。
全文摘要
本发明公开了抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽及其应用，该多肽的序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示。本发明提供的多肽能够与HCV表达的E2蛋白进行结合吸附，从而阻断HCV对细胞的进入或转染。通过HCV假病毒(HCVpp)及HCV RNA转染的细胞培养(HCVcc)系统检测多肽TD1和TD2对HCV入胞的抑制作用，结果显示TD1和TD2对HCVpp及HCVcc感染细胞具有一定的抑制效果，可以作为HCV的吸附抑制剂或阻断剂。
文档编号A61K38/08GK102382171SQ20111029373
公开日2012年3月21日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者兰海云, 吕欣, 姚敏, 尹文, 张建敏, 张芳琳, 李玉成, 杨敬, 贾战生, 雷迎峰, 黄小军 申请人:中国人民解放军第四军医大学