专利名称：一种双水相体系富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法
技术领域：
本发明属双水相体系富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法。
背景技术：
红三叶也称红车轴草(Trifolium. Pratense. L)，为豆科(Leguminosae)车轴草 (Trifolium. L)属多年生草本植物。原产于小亚西亚及欧洲西南部，是欧洲、美国东部、新西兰等海洋性气候地区的最重要的牧草和饲料之一，我国南北各地均有栽培。岷县于1944 年由美国引进红三叶，已有60余年的种植历史，经多年的驯化、选育，现已成为当地的优势草种。由于岷山红三叶蛋白质含量高、营养丰富，1987年经全国饲料牧草品种审定委员会审定登记并命名为岷山红三叶，并被誉为中国第一草。研究表明，岷山红三叶是重要的药材，含丰富的异黄酮类物质，因其独特的药用价值，已由牧草型向药用型发展，该草的主要异黄酮成分为鹰嘴豆芽素A(bionchanin Α)和 B (formonetin)、芒柄花素(Formononetin)、朿Ij芒柄花苷(Ononin)、染料木素(genistein)、 大豆素(daidzein)、大豆甙元、大豆甙、染料木甙等，其中以鹰嘴豆芽素A和芒柄花素含量最尚。异黄酮的主要作用是调节人体的内分泌，防止妇女更年期综合症，降低血脂，减少冠心病的发生、防止骨质疏松症、抗癌、止痛消肿、保护神经系统、抗感染、延缓衰老等。异黄酮类物质在医学上具有多种用途，是一种很有价值的药物原料，但是其提取工艺报导得还很少，尤其是完整的提取工艺还未见到。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产品的安全性高、生产成本低、适合产业化开发的富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法。本发明以如下技术方案解决上述技术问题将红车轴草干燥、粉碎、乙醇回流提取、过滤除杂浓缩得红车轴草粗提液的浓缩液，用双水相体系富集分离此浓缩液中的异黄酮类物质，上相液处理后真空干燥得到红车轴草异黄酮类物质；其特征是取上述红车轴草粗提液的浓缩液，按以下比例加入硫酸铵和乙醇浓缩液体积占浓缩液和乙醇体积之和的70 90%;液体体积(mL)硫酸铵质量(g) 为100 15 31 ；加热至40°C 45°C，混勻，静置1 3h，分为上、下两相，将上相、下相分开，下相降温、结晶，过滤得硫酸铵晶体供循环使用；上相液加无水乙醇沉淀除残存杂质后回收乙醇，上清液浓缩真空干燥即得红车轴草异黄酮类物质。应用乙醇-硫酸铵双水相富集分离红车轴草异黄酮类化合物，具有明显的优点(1)分相迅速在实验中观察到，采用乙醇-硫酸铵双水相富集分离法，红车轴草粗提液的浓缩液、硫酸铵和乙醇按合适比例加入加热，混勻后，约10分钟左右即可分相(不需要离心分离)，且没有乳化层，缩短了实验周期。
⑵过程集成乙醇-硫酸铵双水相富集分离既达到了初步纯化的目的，又浓缩了料液。表现为杂质(如亲水性物质糖、蛋白质等)进入下相，异黄酮类物质富集在上相，上相较原始处理液减少，异黄酮浓度和纯度都提高。(3)降低物耗本发明方法用乙醇作为双水相的有机溶剂，毒性小，乙醇和硫酸铵容易回收利用， 大大降低了原材料的消耗。(4)用本发明的方法红车轴草异黄酮类物质的回收率高，生产方法简单，易于掌握，不受环境影响；成本低廉，适合产业化生产。
具体实施例方式实施例1(1)红车轴草异黄酮类物质的提取红车轴草烘干、粉碎，以料液比1 9 (g/mL)加入Φ (C2H50H) = 70%乙醇溶液，回流提取4次，每次1.证，过滤除杂后得到红车轴草粗提液，真空浓缩至原体积的约1/6得浓缩液。(2)红车轴草异黄酮类物质的双水相富集分离取红车轴草浓缩液9mL，加入硫酸铵3. Ig和乙醇ImL混勻，45 V水浴2h，期间不断振摇，分相后趁热分开上下相，冷却至室温量取上下相体积，分别为3. 36mL和8. OOmL, 相比(上下相体积比，下同)0. 420。分别测定(分光光度法，下同)上相液的异黄酮浓度为7380. 110mg/L，下相液的异黄酮浓度为259. 43%ig/L，异黄酮在上下相的分配系数为 28. 447，总异黄酮的收率达92.。将下相降温、结晶，过滤，过滤所得硫酸铵晶体供循环使用。(3)上相液用无水乙醇纯化、浓缩、干燥得成品将上相液加5倍体积无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后，上层清液旋转真空蒸发回收乙醇循环使用，所得浓缩液70°C下真空干燥即得到红车轴草异黄酮类物质成品 (0. 151 )。实施例2(1)红车轴草异黄酮类物质的提取红车轴草烘干或阴干、粉碎，以料液比1 9 (g/mL)加入Φ (C2H50H) = 70%乙醇溶液，回流提取4次，每次1. 5h，过滤除杂后得到红车轴草粗提液，真空浓缩至原体积的约 1/6得浓缩液，测定浓缩液异黄酮浓度为3238. Ollmg/L。(2)红车轴草异黄酮类物质的双水相富集分离取红车轴草浓缩液16mL，加入硫酸铵5. 2g和乙醇4mL混勻，40°C水浴3h，期间不断振摇，分相后趁热分开上下相，冷却至室温量取上下相体积，分别为10. OOmL和 12. 20mL，相比0. 820。测定上、下相液的异黄酮浓度分别为4520. 44mg/L和156. 053mg/L, 异黄酮在上下相的分配系数为28. 967，总异黄酮的收率达95. 96%。将下相降温、结晶，过滤，所得硫酸铵晶体供循环使用。(3)上相液加无水乙醇纯化、浓缩、干燥得成品
将上相液加4倍体积无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后，上层清液旋转真空蒸发回收乙醇循环使用，所得浓缩液60°C下真空干燥即得到红车轴草异黄酮类物质成品 (0. 2958g)。
权利要求
1. 一种富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法，将红车轴草干燥、粉碎、乙醇回流提取、过滤除杂浓缩得红车轴草粗提液的浓缩液，用双水相体系富集分离此浓缩液中的红车轴草异黄酮类物质，上相液处理后真空干燥得到红车轴草异黄酮类物质；其特征是取上述红车轴草粗提液的浓缩液，按以下比例加入硫酸铵和乙醇浓缩液体积占浓缩液和乙醇体积之和的70 90% ；液体体积mL 硫酸铵质量g为100 15 31，加热至40°C 45°C， 混勻，静置1 3h，分为上、下两相，将上相、下相分开，下相降温、结晶，过滤得硫酸铵晶体供循环使用；上相液加无水乙醇沉淀除残存杂质后回收乙醇，上清液浓缩真空干燥即得红车轴草异黄酮类物质。
全文摘要
一种双水相体系富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法，先将红车轴草干燥、粉碎，回流提取、除杂后得到红车轴草粗提液，浓缩后按比例加入硫酸铵和乙醇，加热，混匀，分为上、下两相，异黄酮类物质主要分配在含乙醇的上相，并得到浓缩和纯化。将上、下两相分开后，下相降温、结晶、过滤，回收硫酸铵晶体；上相液加无水乙醇沉淀除去硫酸铵等残存杂质后回收乙醇，浓缩液真空干燥得产品。本方法的优点是分相迅速，过程集成，提高了红车轴草异黄酮类物质在上相的浓度和纯度；物耗降低，毒性小，乙醇和硫酸铵易回收利用；且红车轴草异黄酮类物质的回收率高，生产方法简单，易于掌握，不受环境影响；成本低廉，适合产业化生产。
文档编号A61P25/00GK102406693SQ20111037174
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者毕云英 申请人:威海天泓农业科技有限公司