专利名称：一种具有抗血栓作用的地龙提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗血栓作用的地龙提取物，属于制药领域。
背景技术：
地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)、通俗环毛虫引 Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛虫引Pheretima. guillelmi (Michaelsen)或木节肓毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称 “沪地龙”。地龙，即蚯蚓，性寒，味微咸，是传统的中药材。根据记载，二千多年前，我们的祖先就是应用地龙治疗气虚血滞，脉络瘀阻所致中风中经络，半身不遂等疾病，在《本草纲目》 中开列了 40种地龙药方。在这些药方中，地龙多以水煎提取或者打粉直接口服入药，且疗效显著。随着科学发展，人类逐渐发现地龙含有多种有效成分，如黄嘌呤、维生素B族、生物碱类等。1991年Mihara发现地龙勻浆提取液具有溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原双重作用，随后研究证明发挥这些抗血栓药效物质是地龙体内的一组蛋白质，称之为蚓激酶。这些蚓激酶对于降低血液粘稠度，改善血小板聚集功能，对于预防和治疗心脑血管疾病效果显
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者O目前地龙临床用药主要有三种方式第一种是传统的水煎液提取物，第二种是打粉直接口服入药，第三种是地龙勻浆液的粗提物，是一类蛋白质成分。这三种提取物在临床上对于预防和治疗血栓性疾病都有显著性效果，然而在化学成分上却有较大的区别。这三种提取方法各有优缺点。水煎提取物能有效地提取氨基酸、核酸类物质，然而不利于提高蛋白质、多肽类成分的活性；实验发现，水煎煮提取物药理学上仅具有抗凝血作用，不具有溶解血栓的作用。地龙饮片直接打粉口服入药，因未经提取和纯化过程，有效成份未经浓缩， 口服剂量大。勻浆提取物虽然能有效提取蛋白质，并较好地保存多肽类成分的活性，但提取过程未经过加热，提取条件缓和，使氨基酸、核酸类物质无法得到有效提取；实验证明，普通勻浆法得到的蛋白质物质具有溶栓活性，但不具有抗凝活性。
发明内容
针对以上不足，本发明目的是提供一种具有抗血栓作用的地龙提取物，该地龙提取物最大限度地保护蛋白质及多肽类成分，同时具有抗凝血与溶解血栓的双重作用。本发明具有抗血栓作用的地龙提取物，以广地龙饮片为原料，通过下方法提取而得原料广地龙饮片进行粗粉碎，加5 15倍重量水浸泡4 5h，连同浸泡液入粉碎机进行湿法粉碎至颗粒平均细度D50 ^ IOOym的浆料，离心取上清液，过平均孔径为 0. 45 μ m的陶瓷膜，滤过液在彡-20°c下冷冻2小时，然后在温度为_4°C _6°C，绝对压强为0. Imbr 0. 05mbr条件下冷冻干燥，即得粉状地龙提取物。所述原料广地龙饮片的粗粉碎物料过M目筛。
所述陶瓷膜的材质为&02、Al2O3或TiO2。所述抗血栓作用的地龙提取物在制备治疗心脑血管疾病的抗血栓药物中的应用。本发明采用湿式粉碎方法达到细胞级的粉碎水平，且整个提取过程控制在低温条件下进行，所得地龙提取物既能提取氨基酸、核酸类物质，又可最大限度地保存蛋白质及多肽类组分的活性，充分保证了地龙有效化学组分的提取，蛋白质及多肽类成分的提取率均明显高于普通勻浆或者水煎煮提取方法。因此本地龙提取物同时具有抗凝血与溶解血栓的双重作用，动物实验也表明其具有很好的抗血栓效果而且提取方法简单而高效。
图1是地龙化学成分高效液相(HPLC)指纹图谱分析图。图2是体外抗凝血实验结果的分析图表。图3纤溶蛋白平板实验结果照片。图4是体内动静脉旁路血栓实验结果分析图。图5是地龙普通勻浆与湿法粉碎的浆料粒度随粉碎时间的变化曲线图。图6是普通勻浆粉碎与湿法粉碎的地龙浆液中，蛋白质得率随粉碎时间的变化曲线。图7普通勻浆与湿法粉碎提取地龙的化学成分指纹图谱。
具体实施例方式实施例1 地龙湿法粉碎提取液与地龙水煎煮提取液主要化学成分分析。1.地龙湿法粉碎提取液制备称取广地龙饮片适量，粗粉碎后，过二号筛。准确称取过筛的地龙粗粉碎物100g，抢水洗去表面泥沙后，加入IOOOmL水，浸泡4h后，将料液与地龙一同放入振动式超微粉碎机(济南贝力粉有限公司出品，BL-6型)，粉碎lOmin，得平均细度D50 ^ IOOym的浆料，经4000r ^irT1离心，取上清液，将所得的上清液通过膜孔径 0. 45 μ m ZrO2陶瓷膜，即得含生药量0. Ig · mL—1的地龙湿法粉碎提取液。2.地龙水煎煮提取液的制备称取广地龙饮片适量，粗粉碎后，过二号筛。准确称取过筛的地龙粗粒100g，抢水洗去表面泥沙，加入IOOOmL水，浸泡4h后，加热回流提取，煮沸Ih后，停止。将药液离心GOOOr ^irT1)，取上清液，将所得的上清液通过膜孔径0. 45 μ m ZrO2陶瓷膜，取透过液即得相当于含生药量0. Ig · mL—1的地龙水煎煮提取液。3.活性成分含量分析(1)蛋白质含量分析采用考马斯亮蓝法研究蛋白质含量，结果研究表明地龙湿法粉碎提取液蛋白质浓度为3. 09mg · ml—1，地龙水煎煮提取液只有0. 69mg · ml—1。与水煎煮提取比较，湿法粉碎提取液中的地龙蛋白质含量提高了数倍。(2)氨基酸含量分析采用日本日立835型氨基酸自动分析仪进行游离氨基酸组成分析。采用分析柱为 2. 6mmX 150mm不锈钢柱，色谱柱2622sc#,柱温57°C。缓冲液泵流速0. 225mL · mirT1，茚三酮泵流速为0. 30mL · mirT1，每次进样量为20 μ L。结果见表1，每毫升地龙湿法粉碎提取液的总游离氨基酸含量为20. 75mg，每毫升地龙水煎液的总游离氨基酸含量为30. 94mg,即水煎煮提取液的总氨基酸含量略高于湿法
粉碎提取液，但二者所含的氨基酸种类无差异。 表1地龙湿法粉碎液与水煎煮提取液氨基酸组成分析
氨基酸种类-样品(lmL)-
湿法粉碎提取液水煎煮提取液
Aspartic acid (Asp)3.22.2
Threonine (Thr)1.581.21
Serine (Ser)1.831.22
Glutamic acid (Glu)5.794.13
Proline (Pro)1.330.8
Glycine (Gly)2.721.17
Alanine (Ala)2.931.99
Cysteine (Cys)0.000.00 Valine (Val)1.661.27
Methionine (Met)0.50.47
Isoleucine (lie)1.191.1
Leucine (Leu)2.552.02
Tyrosine (Tyr)0.680.65
Phenylalanine (Phe)0.950.86
Lysine (Lys)1.980.9
Histidine (His)0.460.45
Arginine (Arg)1.590.31
NH30.830.69
Total amino acid content30.9420.75(3)化学成分指纹图谱分析对照品制备称取次黄嘌呤4. 50mg、黄嘌呤2. 09mg、尿嘧啶2. 94mg,置50ml容量瓶中，加0. 05mol -L-I (NH4) 2HP04溶液使溶解，并稀释至刻度，摇勻，过0. 45 μ m微滤膜，取续滤液上样。供试品制备地龙湿法粉碎提取液与地龙水煎煮提取液分别通过0. 45 μ m滤膜， 取液。分别进行色谱分析，进样量均为10yL。色谱条件流动相A 0. 05mol · L-1 (NH4)2HPO4溶液；流动相B 甲醇。检测波长为 254nm;柱温为 30°C ；流速为 0. 8ml .mirT1。Hedera 0DS-2C18 色谱(4. 6mmX 250mm，5 μ m)。 洗脱梯度:0-7min,0-2% B ；7-15min, 2-5 % B ； 15-50min, 5-50 % B ；流速为 0. 8ml · mirT1。 记录60min色谱，见图1。图1中，A为对照品图谱、B为超微粉碎提取液图谱，C为水煎煮提取液图谱，1为尿嘧啶峰；2为黄嘌呤峰；3为次黄嘌呤峰。图1可见，相对保留时间(tK)在0 15min里，主要是一些极性相对较大的核酸类物质，B和C的图谱峰较一致。tK在15min之后，是一些极性相对较弱的物质，地龙湿法超微提取液只出现3个明显的特征图谱峰(图谱B)，水煎煮提取液出现大量复杂图谱峰(图谱C)。说明对于地龙化学组分的提取，湿法粉碎提取与水煎煮存在一定的差异。可见，湿法粉碎对于热敏性物质(例如，蛋白质)等有较好的提取，然而对于其他化学成分，提取率略低于水煎煮提取。
实施例2 地龙湿法粉碎提取液与地龙水煎液抗血栓药效比较。将实施例1所得地龙湿法粉碎提取液标号为样品1 ；所得地龙水煎煮提取液标号为样品2 ；地龙湿法粉碎提取液过截留分子量10000的聚醚砜膜的透过液，标号为样品3 ； 地龙水煎煮提取液过截留分子量10000的聚醚砜膜，取透过液，标号为样品4。(1)体外抗凝血实验方法在已灭过菌的陶瓷孔板上，每孔内分别加入健康SD大鼠的静脉血200 μ L， 各孔分别加入200 μ L的样品1、样品2、样品3、样品4、生理盐水(均预温与鼠体温一致的温度)，然后最后每孔加入4μ L凝血酶(1IU)，混合，放入37°C恒温恒湿培养箱，Ih内记录各时间段的凝血状况，实验结果见图2。由图2可见，0-5min时间段内，生理盐水组已部分形成血凝块，给药组出现少许血凝块，组间并无明显差异。5-30min时间段内，生理盐水组已全部形成血凝块，而给药组只是部分形成血凝块，组间的凝血状态仍无明显差异。60min后，给药组已全部形成血凝块。以上体外抗凝血试验结果表明，地龙水煎煮提取液与地龙湿法粉碎提取液都能显著延长凝血时间，体外抗凝血并无明显差别。(2)体外溶栓实验方法向直径为IOcm的培养皿中分别加入!Bmg -πιΓ1的牛血纤维蛋白原溶液15mL， 质量分数1 %的琼脂溶液10mL，50IU -πιΓ1的牛凝血酶溶液0. 4mL,摇勻，静置30min使其凝固后，用打孔器在上面打出直径为5mm的孔，4°C冰箱保存备用。如图3，测活时，取样品1、 2、3、4及阳性对照(尿激酶，IOOU · πιΓ1) 20 μ L,点入小孔中，37°C恒温培养17h后，若出现透明圈，说明药物具有溶解纤维蛋白质活性，透明圈大小代表纤溶活性大小。图3中，样品 1 地龙湿法粉碎提取液；样品2 地龙水煎煮提取液；样品3 去除蛋白质的地龙湿法粉碎提取液；样品4 去除蛋白的地龙水煎煮提取液；阳性对照组尿激酶。由图3可知，只有地龙湿法粉碎提取液(样品1)和对照组尿激酶出现纤溶蛋白活性透明圈，说明地龙湿法粉碎提取液中的蛋白质具有较强的纤溶蛋白活性。而水煎煮提取液(样品2)，去除蛋白质后的湿法粉碎提取液(样品幻，去除蛋白质后的水煎煮提取液(样品4)无纤溶蛋白活性均未出现透明圈，说明地龙水煎煮提取液中的蛋白质无纤溶活性。因此证明本发明湿法粉碎提取物(液)具有体外溶解血栓药效。(3)体内抗血栓实验方法将80只大鼠按体质量随机分为8组，每组10只空白对照组(生理盐水)、 阿司匹林组(100mg/kg)、湿法粉碎提取液(0. 8,0. 4,0. 2g生药/kg)、水煎煮提取液(0. 8， 0.4，0.2g生药/kg)。口服灌胃1周，末次给药Ih后，大鼠以3.5%水合氯醛腹腔注射 (lmL/100g)麻醉，正中切开颈部皮肤，钝性剥离右颈总动脉及左颈外静脉，将事先充满肝素生理盐水(50U/mL)的聚乙烯管(分3段连结，在中段放入长5cm的4号手术线)的一端插入左颈外静脉后，从聚乙烯管注入肝素50U/kg，夹住管壁，将右颈总动脉近心端用止血夹夹住以阻断血流，眼科剪一小口，将聚乙烯管另一端插入右颈总动脉，结扎。打开止血夹开放血流，15min后中断血流，迅速取下聚乙烯管，取出手术线，用湿的滤纸去除浮血，放在已称质量的盖波片上，用分析天平称质量，以总质量减去线质量和盖波片质量即得血栓湿重。试验结果见图4，与正常组相比，高剂量给药组与阿斯匹林组相比，可明显减少血栓重量(P < 0. 01)，并且抗血栓形成呈剂量依赖性。然而，地龙湿法粉碎提取液与地龙水煎煮提取液的抗血栓作用无显著性差异(P > 0. 05)。图中4，*P < 0. 05、#P < 0. 01与正常组比较;#P < 0. 05、##P < 0. 01与阿斯匹林组比较。综上可知，地龙湿法粉碎提取物具有溶解血栓与抗凝血双重作用。体内抗血栓可等同于水煎煮提取液。地龙湿法粉碎可充分保证地龙抗血栓活性物质的提取。实施例3 普通勻浆与湿法粉碎的比较试验。操作适量地龙药材，经粉碎过二号筛，取等重量的两份过筛后地龙，分别抢水洗去地龙表面泥沙，加入10倍重量的水，分别采用弗鲁克组织勻浆机(IOOOOr · HIirT1)和振动式超微粉碎机进行粉碎，勻浆粉碎所得物料和湿法粉碎所得物料均分别按1、3、5、10、15、 30min不同时间点取样，立即离心，上清液备用，离心后的药渣供粒径测量。(1)粉碎粒度试验分别将粉碎时间为1、3、5、10、15、30min各时间点所得样品的离心后的药渣用水重新分散后，采用MICRO RACS 3500型粒度分析仪激光散射测定药渣粒径分布，每份平行测定3次。以中位径D50值为指标，比较两种不同粉碎方法的粒径随粉碎时间的变化曲线如图5。粒度分析结果见图5可知，地龙普通勻浆和地龙湿法粉碎均达Imin左右，二者粒径均急剧减小，然而随着粉碎时间的推移，粒径变化都呈缓慢趋势，粉碎效率下降。粉碎时间达30min时，地龙普通勻浆微粒D50值达到175. 85 μ m左右，而地龙湿法粉碎在Imin时， D50就已达到158. 11 μ m，粉碎时间达IOmin时，湿法粉碎的地龙微粒D50值达到17. 53，至少是同时间普通勻浆微粒的1/15。结果提示，湿法粉碎的粉碎细度和粉碎效率明显高于普通勻浆。(2)蛋白质得率分析按1、3、5、10、15、30min的不同粉碎时间点所得的浆液，用Bradford法检测普通勻浆与湿法粉碎不同粉碎时间蛋白质得率，。蛋白质得率=提取的总蛋白质量/投入的生药量*100%。图6结果可以看出，普通勻浆30min蛋白质得率，湿法粉碎Imin之内即可完成，说明湿法粉碎可以在较短时间内完成地龙蛋白质的提取，并且蛋白得率明显高于普通勻浆。(3)指纹图谱分析分别吸取上述两种不同粉碎方法的30min离心液，经70%乙醇沉淀去除大分子蛋白质，离心，取上清液，过0. 45 μ m微滤膜，取滤液上样，进行检测，记录50min色谱。色谱条件如下色谱柱为Hedera 0DS-2C18色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)，流动相A 0. 05mol · L-1 (MM)2HPO4溶液。流动相B 甲醇。检测波长为254nm ；柱温为30°C ；流速为 0. 8mL · mirT1。洗脱梯度:0-7min,0-2% B ；7-15min, 2-5 % B ； 15-50min, 5-50 % B ；流速为 0. 8ml · mirT1。分别记录50min色谱，色谱见图7。由图7可见，地龙湿法粉碎与普通勻浆所得的样品提取液的峰形基本一致。表明两种粉碎方法提取所得的物质是一致的，然而在相同的生药投入量中，湿法粉碎所得的色谱峰面积明显大于普通勻浆，说明湿法粉碎法对于地龙其他化学有效成分的提取效率明显高于普通勻浆法。
权利要求
1.一种具有抗血栓作用的地龙提取物，其特征是以广地龙饮片为原料，通过下方法提取而得原料广地龙饮片进行粗粉碎，加5 15倍重量水浸泡4 5h，连同浸泡液入粉碎机进行湿法粉碎至颗粒平均细度D50 ^ IOOym的浆料，离心取上清液，过平均孔径为 0. 45 μ m的陶瓷膜，滤过液在彡-20°c下冷冻2小时，然后在温度为_4°C _6°C，绝对压强为0. Imbr 0. 05mbr条件下冷冻干燥，即得粉状地龙提取物。
2.根据权利要求1所述的具有抗血栓作用的地龙提取物，其特征是所述原料广地龙饮片的粗粉碎物料过M目筛。
3.根据权利要求1或2所述的具有抗血栓作用的地龙提取物，其特征是所述陶瓷膜的材质为 ZrO2、Al2O3 或 TiO2。
4.权利要求1所述抗血栓作用的地龙提取物在制备治疗心脑血管疾病的抗血栓药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗血栓作用的地龙提取物，以广地龙饮片为原料，由原料广地龙饮片进行粗粉碎，加5～15倍重量水浸泡4～5h，连同浸泡液入粉碎机进行湿法粉碎至颗粒平均细度D50≤100μm的浆料，离心取上清液，过平均孔径为0.45μm的陶瓷膜，滤过液在≤-20℃下冷冻2小时，然后在温度为-4℃～-6℃，绝对压强为0.1mbr～0.05mbr条件下冷冻干燥而得。本地龙提取物既能提取氨基酸、核酸类物质，又最大限度地保存了蛋白质、多肽类组分等有效化学组分的活性，本地龙提取物同时具有抗凝血与溶解血栓的双重作用，动物实验表明其具有很好的抗血栓效果而且提取方法简单而高效。
文档编号A61P7/02GK102389442SQ20111037520
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者付廷明, 杨丰云, 郭立玮 申请人:南京中医药大学