专利名称：一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及菊苣中一种在多个作用靶点上起效的菊苣降糖有效部位的制备及其用途，具体的说是从毛菊苣中提取的活性成分，作为治疗糖尿病药物及功能性食品的用途。
背景技术：
菊苣属于菊科，菊苣属。此属植物有10-12种，我国有3种，新疆有毛菊苣 {Cichorium glanduIosum Bioss. et Huet.)禾口菊苣(CYcAori應 intybus L )两禾中。菊苣是一种用途广泛的植物，意大利居民用菊苣叶做蔬菜沙拉，味美可口，除此之外，菊苣更多是具有很多药用价值。在我国民族药中，菊苣和毛菊苣功效相近，同作菊苣用药，已被药典收录，其药用部分主要为地上部分、根和种子。根据《新疆中草药记载》菊苣作为维吾尔族习用药材有清热、利尿、利胆、消炎的功能。主治黄疸性肝炎、急性肾炎、气管炎。《中国民族药志》也描述菊苣有清热解毒、利水消肿、健胃之功效，用于治疗肝火食少、肾炎水肿、胃脘湿热胀痛和食欲不振。
已有研究表明蛋白酪氨酸磷酸酶IB (PTP1B, protein tyrosine phosphatase IB) 是胰岛素信号转导过程中关键的负调控子，是治疗II型糖尿病、肥胖等疾病的重要靶点。 在新生肝细胞中，PTPlB的减少增加了 IRA/GLUT2复合物，从而增加葡萄糖的吸收。在肝脏中特异性删除PTPlB基因，可以改善代谢综合症的状况和削弱饮食引起的内质网压力， Ali MI等人的研究也指出删除PTPlB基因后会明显改善肥胖且瘦素抵抗的小鼠的外周胰岛素抵抗和动脉血管功能。另外，PTPlB在脂代谢紊乱的调节方面也显示出重要的作用当 PTPlB的大量表达时，出现胰岛素、瘦素抵抗及促使载脂蛋BlOO (apoBlOO)分泌增加，血浆极低密度脂蛋白(VLDL)生成增多，而在抑制了 PTPlB的表达后，高碳水化合物诱导的胰岛素抵抗及与之相关的脂代谢紊乱也受到抑制，细胞内PTPlB蛋白含量减少的同时apoBlOO 的分泌也有所降低。因此PTPlB不仅重要的糖尿病治疗成分的靶点，同时也是脂代谢紊乱的治疗靶点之一。醛糖还原酶(AR，Aldose reductase)存在于许多组织中，为多醇途径之限速酶。 大量研究表明醛糖还原酶过度活跃是糖尿病患者产生多种并发症的原因。醛糖还原酶AR 在高血糖时被激活，催化葡萄糖大量转化为不宜透过细胞膜的山梨醇，致使山梨醇在一些组织中大量蓄积，影响细胞渗透压调节，引起细胞水肿、破裂以及功能障碍，干扰细胞正常代谢，从而产生病变。一方面渗透压上升，引起血管、神经、肾、视网膜、晶状体等组织水肿， 进而发展至基质变化。另一方面，可能引发白内障、视网膜病变、肾功能不全及肾小球基底膜增厚等糖尿病慢性并发症。因此它也是糖尿病及其并发症研究中的一个重要靶点。在国内外研究的已相当多的研究证实菊苣具有降血糖功能。北京中医药大学中药学院研制了菊苣胶囊，张冰等发现菊苣胶囊可以显著降低临床病人的血糖，胆固醇，甘油三酯。郑红梅等从组织形态学上阐述了菊苣双降胶囊药理作用机理，她认为菊苣双降胶囊能降糖作用与修复胰岛β细胞和胰外途径特别是促进肝糖原合成，抑制糖异性有关，另外还推测，菊苣双降胶囊可能直接影响糖代谢，且其降糖作用与抑制肠道对葡萄糖的吸收有关。并且将菊苣降血糖和降血脂的有效部位进一步缩小，通过对大鼠药理实验，发现菊苣正己烷提取物能降低四氧嘧啶大鼠血糖，对其胰岛素水平无显著影响，能降低高血脂大鼠血清总胆固醇、总甘油三脂、低密度脂蛋白含量，并能显著降低其全血粘度、血浆粘度、血浆纤维蛋白原含量。Meehye Kim等人用SD鼠模型实验证明菊苣提取物能降低血清中的HDL/LDL，升高载脂蛋白B/载脂蛋白A-L·因此菊苣提取物能改善脂类代谢，从而改善胆固醇的吸收和合成。Muthusamy等人证明，在3T3-L1脂肪细胞中，菊苣提取物显著改善了葡萄糖吸收，并且有剂量依赖性。同时菊苣提取物具有在不诱导脂肪合成的情况下降血糖的特性。Tousch D等的体外实验证明菊苣酸影响葡萄糖吸收和胰岛素分泌，既改善了胰岛素受体的敏感性， 又促进了胰岛素分泌。Pushparaj PN提出菊苣全草80%乙醇提取物对链脲霉素诱导的糖尿病鼠有治疗效果，并推测其是通过抑制肝脏G-6-Pase来降低血糖。
高云艳等采用四氧嘧啶高血糖模型大鼠、观察菊苣不同提取物对模型动物血糖、血总胆固醇(TC)及总甘油三酯(TG)的影响。结果得出菊苣醇提物对模型降低血糖、血TC及TG 方面疗效优于水煮醇沉提取物。发明专利申请号201010592705. 9菊苣降糖有效部位的制备方法及应用，描述了一种菊苣有效部位的制备方法。其方法是首先用20-95%浓度的甲醇或乙醇水溶液或无水甲醇或无水乙醇，在温度20°C -溶剂沸点的条件下提取菊苣地上部分，其次将提取物浓缩，用水或浓度1 一 20%甲醇或乙醇溶解分散，分别加入预先处理好的HPD600、HPD450、 NKA-9、D201、D301、HPD300、AB-8型大孔树脂柱，以水，10%，3096，95%的甲醇或乙醇溶液梯度洗脱，收集30-95%流出液浓缩后即可得到具有降血糖活性的有效部位。其有效部位的具有蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制作用。而本发明是以极性溶剂20-50%浓度的甲醇或乙醇水溶液，在温度60°C -溶剂沸点的条件下提取菊苣地上部分。因此本发明与以前的不同在于，首先提取方面主要集中在强极性的物质，缩小了有效部位的范围，并且主要集中在耐高温的有效物质的提取。其次，本发明中纯化所用的大孔树脂型号为HPD100、HPD750、X-5、 ADS-17、D4020、D140，因此纯化后得到的有效部位与发明专利申请号201010592705. 9有所不同。并且在洗脱时，主要用60%以下的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱范围较发明专利申请号 201010592705. 9有所缩小，洗脱下来的物质以大极性和中极性居多。再次，纯化得到的部分不但对蛋白质酪氨酸磷酸酶IB具有抑制作用，并有较强的醛糖还原酶抑制率和抗氧化活性，是一个对多靶点起效的菊苣降糖有效部位。
发明内容
本发明目的在于，提供一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途， 该方法从菊苣中采用有机溶剂提取，大孔树脂分离纯化获得降糖有效部位，并阐明其医学用途，经初步的活性筛选试验证明通过本发明所述的方法获得的有效部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPlB)和醛糖还原酶(AR)抑制剂作用，并具有较好的抗氧化活性，可用于治疗糖尿病的药物或保健品的应用，以及该有效部位作为药物组合物的应用。本发明所述的多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法，按下列步骤进行
a、先用极性溶剂20-50%浓度的甲醇或乙醇水溶液，在温度60°C -溶剂沸点的条件下提
4取菊苣地上部分3次，每次提取时间l_4h ；
b、将步骤a提取物浓缩，用水或浓度1 一 10%甲醇或乙醇溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂柱，用水洗去杂质，再用甲醇或乙醇水溶液梯度洗脱，收集1%_60%醇洗脱液，浓缩后即可得到多靶点起效的菊苣降糖有效部位。步骤a提取时固液比为1:15-25。步骤b 所用的大孔树脂型号为 HPD100、HPD750、X-5、ADS-17、D4020、D140。通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位对蛋白质酪氨酸磷酸酶IB和醛糖还原酶具有抑制作用，并具有抗氧化活性。通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位在制备治疗降糖的药物的用途。通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位在制备治疗降糖的功能性食品的用途。
具体实施例方式实施例1
取毛菊苣地上部分300g，粉碎，置于IOL提取罐，用浓度40%乙醇水溶液在温度80°C下提取3次，每次时间为3小时，固液比为1:25，合并提取液；
将提取液浓缩，得到27. 6g具有降糖活性的有效部位，再将浓缩的提取物加入浓度为 10%的乙醇水溶液溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂HPD100柱中吸附，用水清洗除杂后，再用乙醇水溶液梯度洗脱，收集10-60%乙醇洗脱液，浓缩后即可得到3. 3g多靶点起效的菊苣降糖有效部位。实施例2
取毛菊苣地上部分500g，粉碎，置于IOL提取罐，用浓度50%甲醇水溶液在温度60°C下提取3次，每次时间为1小时，固液比为1:20，合并提取液；
将提取液浓缩，得到41g具有降糖活性的有效部位，再将浓缩后的提取液加入浓度为 1%的甲醇水溶液溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂ADS-17柱中吸附，用水除杂后，再用甲醇水溶液梯度洗脱，60%甲醇洗脱，收集流出液，浓缩后即可得到5. 27g多靶点起效的菊苣降糖有效部位。实施例3
取毛菊苣地上部分500g，粉碎，置于IOL提取罐，用浓度70%乙醇水溶液提取，加热至温度70°C提取3次，每次2h，固液比为1 15，合并提取液；
将提取液浓缩，得到32g具有降血糖活性的有效部位，再将浓缩后的提取液加入浓度 5%的乙醇水溶液溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂D4020柱中吸附，用水除杂后，再用乙醇水溶液梯度洗脱，收集10-60%乙醇流出液，浓缩后即可得到4. 49g多靶点起效的菊苣降糖有效部位。实施例4
取毛菊苣地上部分1. mcg，粉碎，置于50L提取罐，用浓度为40%乙醇水溶液提取，加热至溶剂沸点提取3次，每次3h，固液比为1 25，合并提取液；
将提取液放置旋转蒸发仪内减压浓缩，得到191. 52g具有降糖活性的有效部位，再将浓缩后的提取液加入浓度10%的乙醇水溶液溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂柱 HPD100中吸附，用水除杂后，再用10-60%乙醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩后即可得到 25. 54g多靶点起效的菊苣降糖有效部位。实施例5
取毛菊苣地上部分300g，粉碎，置于IOL提取罐，用浓度50%的甲醇的水溶液，在温度 80°C提取3次，每次3h，固液比为1:20，合并提取液；
将提取液放置旋转蒸发仪内减压浓缩，得到31. 38g具有降糖活性的有效部位，加入浓度8%的乙醇水溶液溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂HPD750柱中吸附，用水洗去杂质，再用乙醇水溶液梯度洗脱，收集10-60%乙醇洗脱液，浓缩后即可得到3. 62g多靶点起效的菊苣降糖有效部位。实施例6
取毛菊苣地上部分1. 5Kg,粉碎，置于50L提取罐，用浓度40%的乙醇水溶液，在温度 80°C提取3次，每次4h，固液比为1:25，合并提取液；
将浓缩后的提取液放置旋转蒸发仪内减压浓缩，得到156. 9g具有降糖活性的有效部位，加入浓度10%的乙醇水溶液溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂柱X-5中吸附，再用乙醇溶液梯度洗脱，收集10-60%乙醇洗脱液，浓缩后即可得到约20. 4g多靶点起效的菊苣降糖有效部位。实施例7:筛选实验
蛋白质酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)筛选方法用对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)作为底物，以在阳性药物钒酸钠为对照，利用酶标仪进行蛋白质酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)抑制剂的高通量筛选，根据蛋白质酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)水解pNPP的磷酸基团而产生颜色反应来测定蛋白质酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)的活性；酶反应体系组成如下缓冲液(50 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸，pH 7.3，100 mM氯化钠，0.1 %牛血清白蛋白，和1 mM 二硫代苏糖醇)，蛋白质酪氨酸磷酸酶IB融合蛋白，pNPP，蛋白质酪氨酸磷酸酶IB特异抑制剂钒酸钠(100 yg / mL)；反应体系混勻后在温度37°C放置30分钟，置比色仪上测定405波长条件下的吸收值(A)，测定结果减去本底值后计算酶活性。实施例8
醛糖还原酶(AR)筛选方法缓冲液为0. IM磷酸钠缓冲液，pH 7. 0，用0. 15mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和5mM DL-甘油醛作为底物，以在阳性药物依帕司他为对照， 根据醛糖还原酶(AR)水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的磷酸基团而产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)改变吸光度来测定其活性，反应体系混勻后在温度37°C放置10分钟，置酶标仪上测定340nm波长条件下的吸收值，测定结果减去本底值后计算酶活性，每个样品测定若干个浓度的抑制率，计算出半数抑制率(IC5tl)。实施例9
2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)抗氧化活性测定将 5 mL的2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS (19. 2mg)与88uL的 7 mmoL/L的过硫酸钾(3. 3mg)混合，在室温，避光的条件下静置过夜，形成2，2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基储备液，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30°C，734 nm波长下的吸光度为0. 7 + 0. 02 ；取不同浓度的样品液16 μ L，加入184 μ L的ABTS溶液，准确振30秒，在温度20°C下测定反应液在734 nm处6 min内的吸光值，实验以vc为阳性对照，设试剂空白，样品空白和样品实验组；
抑制率=Ao — At + B/ Ao X 100%
其中，Ao为未加样品的ABTS的吸光值；At为样品与ABTS反应后的吸光值；B为样品空白的吸光值。 实验各组分活性筛选结果
本发明所述的一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途，通过该方法获得的有效部位经筛选对蛋白质酪氨酸磷酸酶IB和醛糖还原酶具有抑制作用，并具有抗氧化活性，其结果见表
权利要求
1.一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法，其特征在于按下列步骤进行a、先用极性溶剂20-50%浓度的甲醇或乙醇水溶液，在温度60°C-溶剂沸点的条件下提取菊苣地上部分3次，每次提取时间l_4h ；b、将步骤a提取物浓缩，用水或浓度1一 10%甲醇或乙醇溶解分散，加入预先处理好的大孔树脂柱，用水洗去杂质，再用甲醇或乙醇水溶液梯度洗脱，收集1%_60%醇洗脱液，浓缩后即可得到多靶点起效的菊苣降糖有效部位。
2.在根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a提取时固液比为1:15-25。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b所用的大孔树脂型号为HPD100、 HPD750、X-5、ADS-17、D4020、D140。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位对蛋白质酪氨酸磷酸酶IB和醛糖还原酶具有抑制作用，并具有抗氧化活性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位在制备治疗降糖的药物的用途。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过该方法获得的多靶点起效的菊苣降糖有效部位在制备治疗降糖的功能性食品的用途。
全文摘要
本发明涉及一种多靶点起效的菊苣降糖有效部位的制备方法及用途，该方法从毛菊苣中采用有机溶剂提取，大孔树脂分离纯化获得降糖有效部位，并阐明其医学用途，经初步的活性筛选试验证明通过本发明所述的方法获得的有效部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)及醛糖还原酶(AR)抑制剂作用，并有较好的抗氧化性作用，可用于治疗糖尿病的药物或保健品的应用，以及作为治疗糖尿病的药物组合物的应用。
文档编号A61K36/28GK102406683SQ20111040026
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者信学雷, 张尧, 阿吉艾克拜尔·艾萨 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所