专利名称：纳米粒子药物组合物的制备方法和纳米粒子药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米粒子药物领域，具体地，涉及一种纳米粒子药物组合物的制备方法和由该方法制备的纳米粒子药物组合物。
背景技术：
纳米载药体系是指药物与纳米载体形成的粒径介于1-1OOOnm的药物输送系统，包括纳米球、纳米囊、纳米粒子和纳米脂质体等。纳米载药体系与其它药物载体相比，具有显著优势:(1)超微小体积，可通过人体最小的毛细血管，不易被吞噬细胞迅速清除，延长了在循环系统中的存留时间；⑵到达网状内皮系统分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位；(3)能穿透组织间隙并被细胞吸收，有利于透皮吸收和细胞内药效发挥；(4)药物可包埋或键合在纳米粒子内部，也可吸附或偶合在其表面；(5)利用纳米材料本身的生物可降解性，PH或温度敏感性等，达到药物控制释放的效果；(6)提高药物的生物利用度和降低毒副作用等。纳米粒子是纳米载药体系中常用的一种选择，通常用作为药物载体的聚合物负载药物，来得到纳米粒子药物组合物。但是，目前公开的纳米粒子药物组合物的制备方法得到的纳米粒子药物组合物多为只负载一种药物化合物的纳米粒子药物组合物。如对于亲水性小分子药物化合物，通过亲水性乳化的方式将药物化合物负载在聚合物上，具体方法为:将两亲性聚合物溶解于有机溶剂中，并与亲水性小分子药物化合物的水溶液混合后在超声波条件下进行第一次乳化，第一次乳化后的物料加入表面活性剂进行第二次乳化，将第二次得到的乳液分散于表面活性剂水溶液中并旋转蒸发除去有机溶剂，离心分离后得到负载亲水性小分子药物化合物的纳米粒子组合物。如对于疏水性药物化合物,通过疏水性乳化的方式将药物化合物负载在两亲性聚合物上，具体方法为:将溶解有药物和两亲性聚合物的有机溶液缓慢滴入含有表面活性剂水溶液中，搅拌一定时间后超声波乳化得到乳液，将得到的乳液旋转蒸发除去有机溶剂，离心分离后得到负载疏水性药物化合物的纳米粒子组合物。当负载多种药物化合物时，如果分别通过亲水性乳化的方式或疏水性乳化的方式将多种药物化合物负载在聚 合物上，得到的纳米粒子药物组合物中，各药物化合物之间的含量比例难以控制，限制了纳米粒子药物组合物的使用效果的提高。因此，现有的纳米粒子药物组合物存在各药物化合物之间的含量比例难以控制的缺陷。
发明内容
为了克服现有的纳米粒子药物组合物存在各药物化合物之间的含量比例难以控制的缺陷，本发明提供了一种制备能够按需求控制各药物化合物之间的含量比例的纳米粒子药物组合物的制备方法以及该方法制备的纳米粒子药物组合物。本发明的发明人发现，不同的药物化合物由于亲水性和/或疏水性不同，在分别通过亲水性乳化的方式或疏水性乳化的方式将多种药物化合物负载在两亲性聚合物上时，得到的纳米粒子药物组合物中，各药物化合物之间的含量比例只能为较窄范围，而无法根据用药需求进行调整；但是，如果通过具有两次乳化步骤的复乳法将亲水性和/或疏水性不同的药物化合物负载到所述两亲性聚合物上，就能够很容易地根据用药需求进行调整得到的纳米粒子药物组合物中各药物化合物之间的含量比例，并且由于阳离子聚合物的掺入，能够实现核酸药物的负载，由此得到本发明。本发 明提供了一种纳米粒子药物组合物的制备方法，所述纳米粒子药物组合物含有两亲性聚合物、阳离子聚合物、疏水性药物、亲水性小分子药物和核酸药物，该方法包括以下步骤:(1)在超声波辐射条件下，使第一溶液与亲水性小分子药物的水溶液混合并乳化，得到第一乳液；所述第一溶液含有所述两亲性聚合物和第一有机溶剂；所述第一有机溶剂为能够溶解所述两亲性聚合物，但不溶于水，且在乳化条件下不与所述两亲性聚合物、所述疏水性药物、所述亲水性小分子药物和所述核酸药物发生化学反应的有机溶剂；(2)将所述第一乳液与第一表面活性剂水溶液混合，并将所得混合后的物料与第二溶液和阳离子聚合物的水溶液混合并乳化，得到第二乳液；所述第二溶液含有所述疏水性药物和第二有机溶剂；所述第二有机溶剂为能够溶解所述疏水性药物，但不溶于水，且在乳化条件下不与所述两亲性聚合物、所述疏水性药物、所述亲水性小分子药物和所述核酸药物发生化学反应的有机溶剂；(3)将所述第二乳液与第二表面活性剂水溶液混合，并除去所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂，而后离心并分离得到沉淀物。(4)将所述沉淀物用水溶液溶解后与核酸药物混合，分离得到纳米粒子药物组合物。本发明提供的方法，可以能够很容易地根据用药需求进行调整使得本发明提供的纳米粒子组合物中，亲水性和/或疏水性不同的药物化合物之间以及与核酸药物的含量比例。通过上述调整，可以高效地利用纳米载药体系在给药方式上的特有优势，达到最佳的药物配伍使用效果，尤其是能够使得在受药靶位点的局部区域中，例如肿瘤发生位点中，亲水性小分子药物、疏水性药物和核酸药物化合物达到最佳的药物配伍使用效果。本发明还提供了一种纳米粒子药物组合物，该纳米粒子药物组合物由上述方法制备得到，其中，所述疏水性药物为紫杉醇，所述亲水性小分子药物为阿霉素，所述核酸药物为SiRNA，所述两亲性聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物，所述阳离子聚合物为ε -多聚赖氨酸，所述纳米粒子药物组合物中，所述疏水性药物和所述亲水性小分子药物的重量比为1: 10000-10000: I。实验证明，本发明提供的上述纳米粒子药物组合物，与将只负载紫杉醇的纳米粒子药物组合物和只负载阿霉素的纳米粒子药物组合物按紫杉醇与阿霉素的重量比为I: 0.9-1.1混合后得到的药物组合物相比，对于黑色素瘤、肺癌和肝癌等肿瘤具有更好的治疗效果。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
图1为在透射电镜下观察实施例1得到的纳米粒子药物组合物的图像。图2为激光粒度仪测得实施例1得到的纳米粒子药物组合物的粒径图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了一种纳米粒子药物组合物的制备方法，所述纳米粒子药物组合物含有两亲性聚合物、阳离子聚合物、疏水性药物、亲水性小分子药物和核酸药物，该方法包括以下步骤:(I)在超声波辐射条件下，使第一溶液与亲水性小分子药物的水溶液混合并乳化，得到第一乳液；所述第一溶液含有所述两亲性聚合物和第一有机溶剂；所述第一有机溶剂为能够溶解所述两亲性聚合物，但不溶于水，且在乳化条件下不与所述两亲性聚合物、所述疏水性药物、所述亲水性小分子药物和所述核酸药物发生化学反应的有机溶剂；(2)将所述第一乳液与第一表面活性剂水溶液混合，并将所得混合后的物料与第二溶液和阳离子聚合物的水溶液混合并乳化，得到第二乳液；所述第二溶液含有所述疏水性药物和第二有机溶剂；所述第二有机溶剂为能够溶解所述疏水性药物，但不溶于水，且在乳化条件下不与所述两亲性聚合物、所述疏水性药物、所述亲水性小分子药物和所述核酸药物发生化学反应的有机溶剂；(3)将所述第二乳液与第二表面活性剂水溶液混合，并除去所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂，而后离心并分离得到沉淀物。 (4)将所述沉淀物用水溶液溶解后与核酸药物混合，分离得到纳米粒子药物组合物。其中，步骤(I)中，所述第一溶液与所述亲水性小分子药物的水溶液的体积比没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，所述第一溶液与所述亲水性小分子药物的水溶液的体积比为1: 1-1: 10;进一步优选为1:2-1: 6，最优选为1: 4。根据本发明，所述第一溶液中，相对于每毫升的第一有机溶剂，所述两亲性聚合物的含量没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，所述第一溶液中，相对于每毫升的第一有机溶剂，所述两亲性聚合物的含量为5-100毫克；进一步优选为20-40毫克。根据本发明，所述亲水性小分子药物的水溶液中，相对于每毫升的水，所述亲水性小分子药物的含量没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，所述亲水性小分子药物的水溶液中，相对于每毫升的水，所述亲水性小分子药物的含量为1-100毫克；进一步优选为10-50毫克。根据本发明，步骤(I)中，所述两亲性聚合物的选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，例如，所述两亲性聚合物为同时含有亲水性基团和疏水性基团的聚合物；所述亲水性基团可以为聚乙二醇基团、聚氧乙烯基团和聚异丁烯酸基团等中的一种或多种，所述疏水性基团可以为聚氧乙烯基团、聚乳酸-乙醇酸基团、聚苯乙烯基团和聚己内酯基团中等的一种或多种。需要说明的是，所述两亲性聚合物的重复单元的排列方式没有特别地要求，只要是能用于形成纳米粒子药物组合物即可，例如可以为交替、嵌段、无规或接枝中的一种或多种，也可以由含有亲水性基团和疏水性基团的单体均聚得到；所述两亲性聚合物的分子量没有特别的要求，只要是能用于形成纳米粒子药物组合物即可，例如所述两亲性聚合物按照SHT 1759-2007规定的方法测得的重均分子量可以为 104-105。根据本发明，为了使所述纳米粒子药物组合物还能具有更加特异的靶向性能和/或成像性能，优选情况下，步骤(1)中，所述两亲性聚合物还含有靶向基团和/或成像基团。其中，所述靶向基团和/或成像基团的选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，进一步优选情况下，所述靶向基团为叶酸基团、精-甘-天冬氨酸基序环肽(RGD)基团和转铁蛋白基团等中的一种或多种；所述成像基团为量子点基团和/或荧光染料基团。例如，所述量子点基团可以为金量子点基团、镉量子点基团和钯量子点基团等纳米材料中的一种或多种；所述荧光染料基团可以为异硫氰酸荧光素基团、四溴荧光素二钠基团和酸性红87基团中的一种或多种。其中，所述靶向基团和/或成像基团的含量没有特别地要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，例如，相对于每摩尔的亲水性基团，所述靶向基团和/或成像基团的含量可以为0.2-1摩尔。根据本发明的一种优选实施方式，步骤(I)中，所述两亲性聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷、聚乙二醇和聚L-乳酸中的一种或多种。其中，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸的亲水基团为聚乙二醇单甲醚基团，疏水基团为聚乳酸-乙醇酸基团，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物的重复单元的排列方式为嵌段，其中，乙二醇单元和乳酸-乙醇酸单元之间的摩尔比可以为1:1-1: 8，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物按照SHT 1759-2007规定的方法测得的重均分子量可以为104-105。符合上述要求的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物可以通过商购获得。根据本发明，所述亲水性小分子药物的选择没有特殊的要求，可以根据所期望的药效和药物在水中的溶解度进行选择，所述亲水性小分子药物的分子量可以为IOOODa以下，例如，可以选择在水中的溶解度大于lg/100g的药物作为亲水性小分子药物，优选情况下，所述亲水性小分子药物为阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素和表柔比星中的一种或多种。根据本发明，所述第一有机溶剂的选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果并降低成本，优选情况下，所述第一有机溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃、丙酮、甲基丁酮、二氯苯和甲基异丙酮中的一种或多种。根据本发明，步骤(1)中，所述乳化的条件没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(1)中，所述乳化的条件包括:超声波辐射的频率为20-25kHz，进一步优选为22-23kHz ;相对于每毫升接受超声波辐射的物料，功率为19-190W，进一步优选为28.5-57W ;乳化的温度为1_99°C，进一步优选为20_30°C ;乳化的时间为1_30分钟，进一步优选为3-10分钟。其中，步骤⑴中，所述混合的方式没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(I)中，所述混合的方式包括:将所述亲水性小分子药物的水溶液加入到第一溶液中混合。根据本发明，步骤(2)中，所述第一表面活性剂水溶液的用量、所述第二溶液和阳离子聚合物的水溶液的用量没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤⑵中，相对于I体积的第一乳液，所述第一表面活性剂水溶液的用量为0.5-2体积，进一步优选为0.8-1体积；所述第二溶液的用量为0.1-1体积，进一步优选为0.4-0.6体积；所述阳离子聚合物的水溶液的用量为0.1-1体积，进一步优选为0.4—0.6 体积。其中，步骤(2)中，所述第一表面活性剂水溶液中，相对于每毫升的水，所述第一表面活性剂的含量没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，所述第一表面活性剂水溶液中，所述第一表面活性剂的含量为0.6-6重量％，进一步优选为2-4重量％。其中，步骤(2)中，所述第二溶液中，相对于每毫升的第二有机溶剂，所述疏水性药物的含量没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，所述第二溶液中，相对于每毫升的第二有机溶剂，所述疏水性药物的含量可为0.1毫克至所述疏水性药物在所述第二有机溶剂中达到饱和浓度的含量，进一步优选为1-10毫克。
其中，步骤(2)中，所述阳离子聚合物的水溶液中，所述阳离子聚合物的含量没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，所述第四溶液中，所述阳离子聚合物的含量可为I毫克至所述阳离子聚合物在所水溶液中达到饱和浓度的含量，进一步优选为20-40毫克。根据本发明，步骤(2)中，所述第一表面活性剂的作用是提高第二乳液的稳定性，从而可以提高纳米粒子药物组合物的稳定性，其选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，所述第一表面活性剂为聚乙烯醇、土温80、司盘和十二烷基磺酸钠中的一种或多种。其中，所述聚乙烯醇的选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，例如，所述聚乙烯醇可以为医药级聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的皂化度可以为70-95mol% ;所述聚乙烯醇在25°C下的粘度可以为500_900mPa.S。符合上述要求的聚乙烯醇可以通过商购获得，例如可以购买自国药集团化学试剂有限公司的牌号为PVA-124的
女口
广叩ο其中，所述疏水性药物的选择没有特殊的要求，可以根据所期望的药效和药物在水中的溶解度进行选择，例如，可以选择在水中的溶解度小于Ig/IOOg的药物作为疏水性药物，优选情况下，所述疏水性药物为紫杉醇、喜树碱、三尖杉酯碱和长春瑞宾中的一种或多种。
其中，所述阳离子聚合物的选择没有特殊的要求，可以根据所期望的纳米粒子表面电势进行选择，例如，可以选择在水中的为正电势的阳离子聚合物，优选情况下，所述阳离子聚合物为多聚赖氨酸、壳聚糖和聚醚酰亚胺-胺型树枝状高分子中的一种或多种。所述多聚赖氨酸优选为ε-多聚赖氨酸。其中，步骤(2)中，所述乳化的条件没有特殊的要求，可以根据所期望的药效和药物在水中的溶解度进行选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，所述乳化的条件包括:超声波辐射的频率为20-25kHz，进一步优选为22-23kHz ;相对于每毫升接受超声波辐射的物料，功率为19-190W，进一步优选为28.5-57W ;乳化的温度为1_99°C，进一步优选为20_30°C ;乳化的时间为1_30分钟，进一步优选为3-10分钟。其中，步骤(2)中，将所述第一乳液与所述第一表面活·性剂水溶液混合的过程中，所述混合的方式没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，将所述第一乳液与所述第一表面活性剂水溶液混合的过程中，所述混合的方式包括:在100-1200转/min的搅拌条件下，将所述第一乳液加入到所述第一表面活性剂水溶液中混合，且所述第一乳液加入的速度为0.l-3ml/min。其中，步骤(2)中，将如上混合所得混合后的物料与所述第二溶液和所述阳离子聚合物的水溶液混合并乳化的过程中，所述混合的方式没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(2)中，将所得混合后的物料与所述第二溶液和所述阳离子聚合物的水溶液混合并乳化的过程中，所述混合的方式包括:在1000-1200转/min的搅拌条件下，将所述第二溶液和所述阳离子聚合物的水溶液加入到如上混合所得混合后的物料中，且所述第二溶液加入的速度为0.1-lml/min。根据本发明，步骤(3)中，相对于I体积的所述第二乳液，所述第二表面活性剂水溶液的用量没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(3)中，相对于I体积的所述第二乳液，所述第二表面活性剂水溶液的用量为2-20体积，进一步优选为10-15体积。其中，步骤(3)中，所述第二表面活性剂水溶液中，相对于每毫升的水，所述第二表面活性剂的含量没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(3)中，所述第二表面活性剂水溶液中，所述第二表面活性剂的含量为0.3-3重量％，进一步优选为0.6-1重量％。其中，步骤(3)·中，所述第二表面活性剂的作用是提高所述沉淀物的稳定性，从而可以提高纳米粒子药物组合物的稳定性，其选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，步骤(3)中，所述第二表面活性剂为聚乙烯醇、土温80、司盘和十二烷基磺酸钠中的一种或多种。其中，所述聚乙烯醇的选择没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，例如，所述聚乙烯醇可以为医药级聚乙烯醇；所述聚乙烯醇的皂化度可以为70-95mol% ;所述聚乙烯醇在25°C下的粘度可以为500_900mPa.S。符合上述要求的聚乙烯醇可以通过商购获得，例如可以购买自国药集团化学试剂有限公司的牌号为PVA-124的产品。其中，在步骤(3)中，将所述第二乳液与第二表面活性剂水溶液混合的过程中，所述混合的方式没有特别的要求，可以为纳米粒子药物组合物制备领域常规的选择，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，在步骤(3)中，将所述第二乳液与第二表面活性剂水溶液混合的过程中，所述混合的方式包括:在100-1200转/min的搅拌条件下，将所述第二乳液加入到所述第二表面活性剂水溶液中，且所述第二乳液加入的速度为0.l-3ml/min ;加入所述第二乳液后,可在100-1200转/min的搅拌条件下维持5-100mino其中，在步骤(3)中，除去所述第一有机溶剂和第二有机溶剂的过程中，所述除去所述第一有机溶剂和第二有机溶剂的方法没有特别的要求，例如，可以通过旋转蒸发的方式除去所述第一有机溶剂和第二有机溶剂。其中，在步骤(3)中，离心并分离得到沉淀物的过程中离心的速度可以为5000_15000g。根据本发明，其中，步骤(4)中，相对于I重量份的所述沉淀物，水的用量可以为1-1000重量份，优选为10-100重量份。其中，步骤(4)中，相对于I重量份的所述沉淀物，所述核酸药物的用量可以为
0.001-1重量份，优选为0.1-0.2重量份。其中，所述核酸药物包括各种以核酸为有效成分的药物，例如DNA药物和RNA药物，优选为siRNA药物。其中，在步骤(4)中，将所述沉淀物用水溶液溶解的过程和随后与核酸药物混合的过程中，溶解的方式和混合的方式没有特别的要求，为了进一步提高所述纳米粒子药物组合物的使用效果，优选情况下，在步骤(4)中，将将所述沉淀物用水溶液溶解后与核酸药物混合的方式包括:在100-1200转/min的搅拌条件下，将所述沉淀物和所述核酸药物加入到水中，然后，可在100-1200转/min的搅拌条件下维持5_100min。其中，步骤(4)中，分离得到所述纳米粒子药物组合物的过程中，所述分离的方法没有特别的要求，例如，可以通过离心并收集沉淀的方法(所得到的沉淀为所述纳米粒子药物组合物)进行分离，离心的速度可以为5000-15000g。本发明还提供了一种纳米粒子药物组合物，该纳米粒子药物组合物由上述方法制备得到，其中，所述疏水性药物为紫杉醇，所述亲水性小分子药物为阿霉素，所述核酸药物为siRNA，所述两亲性聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物，所述阳离子聚合物为ε -多聚赖氨酸，所述纳米粒子药物组合物中，所述疏水性药物和所述亲水性小分子药物的重量比为1: 10000-10000: I。其中，优选情况下，所述疏水性药物和所述亲水性小分子药物的重量比为I: 1000-1000: I。其中，所述核酸药物可以按所需比例与纳米粒子混合相对于I重量份的所述沉淀物，所述核酸药物的用量可以为0.001-1重量份,优选为0.01-0.2重量份。实验证明，所述纳米粒子药物组合物用于小鼠时，以阿霉素的量计算，经静脉给药的有效量为0.l-10mg/kg体重。本发明中，气体和液体的体积均为20°C下，一个标准大气压下的数值。以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明的范围并不限于以下实施例中。实施例1本实施例按照以下步骤制备纳米粒子药物组合物。(I)将20mg的两亲性聚合物(聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸，PLGA-PEG，购自济南岱罡生物科技有限公司，该聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物的亲水基团为聚乙二醇单甲醚基团，疏水基团为聚乳酸-乙醇酸基团，所述聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物的重复单元的排列方式为嵌段，其中，乙二醇单元和乳酸-乙醇酸单元之间的摩尔比为1: 1-1: 8，按照SHT 1759-2007规定的方法测得的重均分子量为IO4-L 5X IO5)`溶于Iml第一有机溶剂(二氯甲烷)中，得到第一溶液。将0.6mg的亲水性小分子药物(阿霉素，购自北京华丰科技有限公司，牌号为HF090516)溶于Iml水中，得到亲水性小分子药物的水溶液。将250 μ I的亲水性小分子药物的水溶液加入Iml的第一溶液中，得到混合后的物料。在25°C下，将Iml的上述得到的混合后的物料用功率为28.5W且频率为23kHz的超声波辐射3分钟后，得到第一乳液。(2)将第一表面活性剂(聚乙烯醇，购自国药集团化学试剂有限公司，牌号为PVA-124，皂化度为85mol% ;在25°C下的粘度为700mPa.s)配制为浓度2重量％的水溶液，得到第一表面活性剂水溶液。在1000转/min的搅拌条件下，将Iml步骤⑴得到的第一乳液以lml/min的速度加入到Iml第一表面活性剂水溶液中，得到混合后的物料。将
0.125mg疏水性药物(紫杉醇，购自北京诺瑞医药技术有限公司，牌号为090328)溶于Iml第二有机溶剂(二氯甲烷)中，得到第二溶液。将20mg的阳离子聚合物多聚赖氨酸，购自浙江银象生物工程有限公司)溶解在0.1ml水溶液中，得到阳离子聚合物的水溶液。在1000转/min的搅拌条件下，将0.25ml的上述得到的第二溶液和0.1ml的上述得到的阳离子聚合物的水溶液分别以lml/min的速度加入上述得到的混合后的物料中，得到用于超声的物料。在25°C下，将Iml上述得到的用于超声的物料用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐射5分钟后，得到第二乳液。(3)将第二表面活性剂(聚乙烯醇，购自国药集团化学试剂有限公司，牌号为PVA-124，皂化度为85mol% ;在25°C下的粘度为700mPa.s)配制为浓度0.6%的水溶液，得到第二表面活性剂水溶液。在800转/min的搅拌条件下，将Iml步骤⑵得到的第二乳液以2ml/min的速度加入到IOml的上述第二表面活性剂水溶液中，然后在600-800转/min的搅拌条件下维持lOmin。在室温。C下，旋转蒸发除去第一有机溶剂(二氯甲烷)和第二有机溶剂(二氯甲烷)，得到旋蒸后的产物。将旋蒸后的产物在13000g的离心速度下离心10分钟后，收集得到沉淀物。(4)将得到的沉淀物(IOmg左右)用2ml的水溶解后，加入0.05mg的核酸药物(siRNA，正义链序列为 5’ -GAAUUAACCCUUGGUGAAUTT-3’ (SEQ ID NO:1)，反义链序列为5’-AUUCACCAAGGGUUAAUUCTT-3’ (SEQ ID NO: 2)，购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，该siRNA能够沉默抗凋亡蛋白survivin基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长)，振荡混匀后室温放置30分钟，13000g的离心速度下离心10分钟后，收集沉淀，得到纳米粒子药物组合物。按照文献(AshlynnL.Z.Lee，等.生物材料(Biomaterials) 2009，30，919-927)中所述的方法，在透射电镜下观察本实施例得到的纳米粒子药物组合物，结果如图1所示，说明得到的纳米粒子药物组合物的粒径大小约为200nm。按照文献(AshlynnL.Z.Lee,等.生物材料(Biomaterials) 2009, 30,919-927)中所述的方法，利用激光粒度仪测得本实施例得到的纳米粒子药物组合物的平均粒径为200.63±12.36nm(图2)，分散度为0.131，zeta电位为29.6±0.14，表明该纳米粒子药物组合物的稳定性较好。按照文献(AshlynnL.Z.Lee,等.生物材料(Biomaterials) 2009, 30,919-927)中所述的方法，将本实施例得到的纳米粒子药物组合物冷冻干燥后用乙腈溶解，利用高效液相色谱检测(标准品购自Agilent Technologies,牌号Agilent 1200 series),可以看出本实施例得到的纳米粒子药物组合物同时具有阿霉素和紫杉醇的特征峰。并通过紫外分光光度计方法测得本实施例得到的纳米粒子药物组合物中含有siRNA，说明阿霉素和紫杉醇在本实施例得到的纳米粒子药物组合物中同时存在，且每克的本实施例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为0.15mg，紫杉醇的含量为0.075mg, siRNA的含量为0.045mg。对比例I本对比例按照实施例1的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是:将20mg的两亲性聚合物(聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物，PLGA-PEG，购自济南岱罡生物科技有限公司)溶于Iml水中，得到的溶液作为第一溶液，即用水替换第一有机溶剂(二氯甲烧)。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本对比例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为3 00nm ;测得每克的本对比例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为0.05g，紫杉醇的含量为0g，siRNA的含量为0g。对比例2按照以下步骤制备纳米粒子药物组合物。(I)将20mg的两亲性聚合物聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物，PLGA-PEG，购自济南岱罡生物科技有限公司)溶于Iml第一有机溶剂(二氯甲烷)中，得到第一溶液。将0.6mg的亲水性小分子药物(阿霉素，购自北京华丰科技有限公司，牌号为HF090516)溶于Iml水中，得到的溶液作为亲水性小分子药物的水溶液。将第一表面活性剂(聚乙烯醇，购自国药集团化学试剂有限公司，牌号为PVA-124)配制为浓度2重量％的水溶液，得到第一表面活性剂水溶液。将0.125mg疏水性药物(紫杉醇，购自北京诺瑞医药技术有限公司，牌号为090328)溶于Iml第二有机溶剂(二氯甲烷)中，得到第二溶液。在1000转/min的搅拌条件下，将上述得到的第一溶液、上述得到的第二溶液、上述得到的亲水性小分子药物的水溶液、上述得到的第一表面活性剂水溶液混合，得到用于超声的物料。在25°C下，将Iml上述得到的用于超声的物料先用28.5W的频率为23kHz的超声波辐射3分钟后，再用57W的频率为23kHz的超声波辐射3分钟，得到第二乳液。(2)将第二表面活性剂(聚乙烯醇，购自国药集团化学试剂有限公司，牌号为PVA-124)配制为浓度0.6重量％的水溶液，得到第二表面活性剂水溶液。在1000转/min的搅拌条件下，将Iml步骤(I)得到的第二乳液以lml/min的速度加入到IOml的上述第二表面活性剂水溶液中,然后在600-800转/min的搅拌条件下维持lOmin。在室温下,旋转蒸发lOmin，除去第一有机溶剂(二氯甲烷)和第二有机溶剂(二氯甲烷)，得到旋蒸后的产物。将旋蒸后的产物在13000g的离心速度下离心10分钟后，收集得到沉淀物。(4)将得到的沉淀物(IOmg左右)用2ml的水溶解后，加入0.05mg的核酸药物(siRNA,与实施例1中相同)，振荡混匀后室温放置30分钟，13000g的离心速度下离心10分钟后，收集沉淀，得到纳米粒子药物组合物。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本对比例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为300nm ;测得每克的本对比例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为Og，紫杉醇的含量为0.02g，siRNA的含量为Og。实施例2本实施例按照实施例1的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是，所述亲水性小分子药物的水溶液中阿霉素的浓度为0.4mg/ml，所述第二溶液中紫杉醇的浓度为10mg/ml,所述核酸药物的用量为0.05mg。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本实施例得到的纳米粒子药物组合物的粒径约为200nm ;测得每克的本实施例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为0.0005g，紫杉醇的含量为0.5g，siRNA的含量为0.000045g。对比例3本对比例按照对比例2的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是，所述亲水性小分子药物的水溶液中阿霉素的浓度为0.4mg/ml，所述第二溶液中紫杉醇的浓度为10mg/ml,所 述核酸药物的用量为0.05mg。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本对比例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为300nm ;测得每克的本对比例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为Og，紫杉醇的含量为0.lg, siRNA的含量为Og。实施例3本实施例按照实施例1的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是，所述亲水性小分子药物的水溶液中阿霉素的浓度为IO m g /m I，所述第二溶液中紫杉醇的浓度为
0.4mg/ml,所述核酸药物的用量为0.05mg。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本实施例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为260nm ;测得每克的本实施例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为0.47g，紫杉醇的含量为0.00047g, siRNA的含量为0.000045g。对比例4本对比例按照对比例2的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是，所述亲水性小分子药物的水溶液中阿霉素的浓度为IO m g /m I，所述第二溶液中紫杉醇的浓度为
0.4mg/ml,所述核酸药物的用量为0.05mg。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本对比例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为300nm ;测得每克的本对比例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为Og，紫杉醇的含量为0.lg, siRNA的含量为Og。对比例5本对比例按照与对比例2相同的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是，不使用第二溶液，并且亲水性小分子药物的水溶液中阿霉素的使用量为3.5mg，核酸药物(siRNA，与实施例1中相同)的使用量为0.1mg0按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本对比例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为300nm ;测得每克的本对比例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为0.3g，紫杉醇的含量为0g，siRNA的含量为0.09mg。对比例6本对比例按照与对比例2相同的方法制备纳米粒子药物组合物，所不同的是，不使用亲水性小分子药物的水溶液，并且第二溶液中紫杉醇的使用量为2mg。按照与实施例1相同的测量方法，利用激光粒度仪测得本对比例得到的纳米粒子药物组合物的粒径为300nm ;测得每克的本对比例得到的纳米粒子药物组合物中阿霉素的含量为0g，紫杉醇的含量为0.15g。测试实施例1本测试实施例中，将实施例1制得载有多种药物的纳米粒子组合物作为实验药物；将对比例5得到的纳米粒子药物组合物和对比例6得到的纳米粒子药物等量混合，得到阿霉素的含量为15重量％，紫杉醇的含量为7.5重量％的纳米粒子药物组合物混合物。将该纳米粒子药物组合物混合物作为对照药物。将黑色素瘤细胞(B16细胞系，购自ATCC，编号B16-F10)以每35mm内径的培养皿IO3个的密度分别接种于含有2ml的DMEM培养基(购自Gibco，牌号sh30022.01B,且含10体积％的胎牛血清)的两个培养皿中，在37°C和5体积％的CO2浓度下培养24小时后，吸出培养基，将2ml溶有实验药物的培 养基(以阿霉素计，药物浓度为0.17ymol/ml)加入其中一只培养皿中，将2ml溶有对照药物的培养基(以阿霉素计，药物浓度为0.17ymol/ml)加入另一只培养皿中，将上述2只培养皿在37°C和5%的CO2浓度下孵育24小时后，按照文献(Qinghua Miao,等，生物材料(Biomaterials), 2010, 31 (28):7364-75)中所述的CCK-8法检测不同时间段细胞凋亡水平。可以发现，使用实验药物的培养皿中，细胞活性为 90.2±1.2(4h)，31.88±2% (8h)，16.3±3.2% (12h)，6.1±0.05% (24h);使用对照药物的培养皿中，细胞活性为 96.2 ±2.1 % (4h)，53.63±1.3% (8h)，42.5±3.4% (12h)，34.43±1.5(24h)。上述结果说明实验药物对黑色素瘤细胞具有更强的促凋亡效果。使用黑色素瘤细胞(B16细胞系，购自ATCC，编号B16-F10)和C57小鼠(C57系，购自北京维通利华公司)，按照文献(Fariyal Ahmed,等.分子药物学(MolecularPharmaceutics), 3, 340-350)中的方法制备荷瘤裸鼠，待肿瘤长至0.5cm2大小时，将荷瘤裸鼠随机分为实验组荷瘤裸鼠和对照组荷瘤裸鼠，按照文献(同上)中的方法，经尾静脉，将溶有实验药物的磷酸盐缓冲液(以阿霉素计，给药量为3mg/kg体重)给药至实验组荷瘤裸鼠；将溶有对照药物的磷酸盐缓冲液(以阿霉素计，给药量为3mg/kg体重)给药至对照组荷瘤裸鼠。一周后，按照文献(Fariyal Ahmed,等.分子药物学(MolecularPharmaceutics)，3，340-350)中的方法测定肿瘤的大小，其中，实验组荷瘤裸鼠的肿瘤大小平均为452mm3，对照组荷瘤裸鼠的肿瘤大小平均为8462mm3。上述结果说明说明实验药物对黑色素瘤具有更强的抑制效果。以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。·
权利要求
1.一种纳米粒子药物组合物的制备方法，所述纳米粒子药物组合物含有两亲性聚合物、阳离子聚合物、疏水性药物、亲水性小分子药物和核酸药物，该方法包括以下步骤: (1)在超声波辐射条件下，使第一溶液与亲水性小分子药物的水溶液混合并乳化，得到第一乳液； 所述第一溶液含有所述两亲性聚合物和第一有机溶剂；所述第一有机溶剂为能够溶解所述两亲性聚合物，但不溶于水的有机溶剂； (2)将所述第一乳液与第一表面活性剂水溶液混合，并将所得混合后的物料与第二溶液和阳离子聚合物的水溶液混合并乳化，得到第二乳液； 所述第二溶液含有所述疏水性药物和第二有机溶剂；所述第二有机溶剂为能够溶解所述疏水性药物，但不溶于水的有机溶剂； (3)将所述第二乳液与第二表面活性剂水溶液混合，并除去所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂，而后离心并分离得到沉淀物； (4)将所述沉淀物用水溶液溶解后与核酸药物混合，离心分离得到纳米粒子药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(I)中，所述第一溶液与所述亲水性小分子药物的水溶液的体积比为1: 1-1: 10 ;所述第一溶液中，相对于每毫升的第一有机溶剂，所述两亲性聚合物的含量为5-100毫克；所述亲水性小分子药物的水溶液中，相对于每毫升的水，所述未水性小分子药物的含量为1-100晕克。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(I)中，所述两亲性聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸、聚 环氧乙烷-聚环氧丙烷和聚乙二醇与聚L-乳酸中的一种或多种；所述亲水性小分子药物为阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素和表柔比星中的一种或多种；所述第一有机溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃、丙酮、甲基丁酮、二氯苯和甲基异丙酮中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(I)中，所述乳化的条件包括:超声波辐射的频率为20-25kHz，相对于每毫升接受超声波辐射的物料，功率为10-190W ;乳化的温度为1-99°C，乳化的时间为1-30分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，相对于I体积的第一乳液，所述第一表面活性剂水溶液的用量为0.5-2体积，所述第二溶液的用量为0.1-1体积，所述阳离子聚合物的水溶液的用量为0.1-1体积；所述第一表面活性剂水溶液中，所述第一表面活性剂的含量为0.6-6重量％ ;所述第二溶液中，相对于每毫升的第二有机溶剂，所述疏水性药物的含量为0.1毫克至所述疏水性药物在所述第二有机溶剂中达到饱和浓度的含量；所述阳离子聚合物的水溶液中，相对于每毫升的水，所述阳离子聚合物的含量为I毫克至所述阳离子聚合物在所水溶液中达到饱和浓度的含量。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，步骤(2)中，所述第一表面活性剂为聚乙烯醇、土温80、司盘和十二烷基磺酸钠中的一种或多种；所述疏水性药物为紫杉醇、喜树碱、三尖杉酯碱和长春瑞宾中的一种或多种；所述阳离子聚合物为多聚赖氨酸、壳聚糖、聚醚酰亚胺和聚酰胺-胺型树枝状高分子中一种或多种。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其中，步骤(2)中，所述乳化的条件包括:超声波辐射的频率为20-25kHz，相对于每毫升接受超声波辐射的物料，功率为10-190W ;乳化的温度为1_99°C，乳化的时间为1-30分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，相对于I体积的所述第二乳液，所述第二表面活性剂水溶液的用量为2-20体积；所述第二表面活性剂水溶液中，所述第二表面活性剂的含量为0.3-3重量％ ； 所述第二表面活性剂为聚乙烯醇、土温80、司盘和十二烷基磺酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，相对于I重量份的所述沉淀物，水的用量为1-1000重量份，所述核酸药物的用量为0.001-1重量份。
10.一种纳米粒子药物组合物，该纳米粒子药物组合物由权利要求1-9中任意一项所述的方法制备得到，其中，所述疏水性药物为紫杉醇，所述亲水性小分子药物为阿霉素，所述核酸药物为SiRNA,所述两亲性聚合物为聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物，所述阳离子聚合物为ε -多聚赖氨酸，所述纳米粒子药物组合物中，所述疏水性药物和所述亲水性小分子药物的重量比为1 : 10000-10000: I。
全文摘要
本发明提供了一种纳米粒子药物组合物的制备方法，该方法包括(1)使第一溶液与亲水性小分子药物的水溶液混合乳化得到第一乳液；所述第一溶液含有所述两亲性聚合物和第一有机溶剂；(2)将所述第一乳液与第一表面活性剂水溶液混合，并将所得混合后的物料与第二溶液和阳离子聚合物的水溶液混合并乳化，得到第二乳液；所述第二溶液含有所述疏水性药物和第二有机溶剂；(3)将所述第二乳液与第二表面活性剂水溶液混合，离心分离得到沉淀物；(4)将所述沉淀物用水溶解后与核酸药物混合，分离得到纳米粒子组合物。本发明还提供了由上述方法制备得到的纳米粒子药物组合物。
文档编号A61K31/337GK103142482SQ201110402420
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者聂广军, 王海, 吴雁 申请人:国家纳米科学中心