专利名称：蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种变应原疫苗，尤其涉及一种蒿属花粉变应原疫苗，以及它的制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
人们对于变应原疾病的认识始于“花粉热”，1911年科学家Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变应原疾病治疗的历史从此开始。我国变应原的发展是1956 年协和医院耳鼻喉科主任张庆松教授从美国引进，并取得了突破性进展，发现了中国最重要的秋季型致敏花粉是蒿属(Artemisia)植物花粉。上世纪八十年代由叶世泰、乔秉善牵头全国数十家医院完成的中国气传致敏花粉调查显示，很多地区夏秋季空气中花粉含量最多的为蒿属花粉。此后，大批学着对我国蒿属花粉过敏开展大量的临床流行病学调查，发现蒿属花粉过敏广泛分布于我国各个地区，在北方地区它是过敏性鼻炎和哮喘主要致病因
ο蒿属(Artemisia)植物为1、2或多年生草本植物，稀灌木，常具浓烈香气，多有根状颈和营养枝。蒿属的花粉特征具有高度一致性，主要体现在花粉呈球形或近球形，极面观呈三裂圆形具三孔沟，赤道面观为圆形或椭圆形。多数种的染色体数目为2η= 18，少数种的染色体数目为2η = 36。我国蒿属花粉分布较广，并且在临床上已证实导致人过敏的花粉有三种艾蒿花粉(Artemisia argyi Levi, et Vant)、大轩蒿花粉(Artemisia sieversiana Wild)、黄花蒿花粉(Artemisia annua L)。可见《中国气传花粉和植物彩色图谱》的记载。2011年北京新华联协和药业在蒿属花粉传播季节(7月-10月)开展了一项流行病学调查，对疑是蒿属花粉过敏的病人同时点刺艾蒿花粉变应原点刺液、大籽蒿花粉变应原点刺液、黄花蒿花粉变应原点刺液。此次临床流行病学调查结果显示在我国，三种蒿属花粉存在交叉过敏，虽然不同病人对三种蒿属花粉变应原反应程度存在差异性。在我国还存在不同种类的蒿属花粉，现尚没有报道证明其它蒿属花粉是否致人过敏。其它蒿属花粉相比上述三种蒿属花粉，分布范围和生长能力相对比较小。再者，蒿属花粉过敏存在交叉免疫原性，黄花蒿花粉、大籽蒿花粉、艾蒿花粉分布广泛，花粉原料更易于收集，所以这三种蒿属花粉是制备蒿属花粉变应原疫苗的合适的原料选择。北京协和医院变应原制剂室生产的大籽蒿花粉变应原注射液和黄花蒿花粉变应原注射液已证明安全有效，同时，欧洲和北美洲的艾蒿花粉变应原注射液也已被明安全有效。结合我国蒿属花粉过敏的流行病学，如果能研制出黄花蒿花粉、大籽蒿花粉和艾蒿花粉的变应原联合疫苗，肯定会比单一蒿属花粉变应原疫苗更有效，也更合适我国蒿属花粉过敏患患者的需求。即相比单一的蒿属花粉变应原疫苗，在能保证安全性的同时也会提高治疗的有效性。现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100年的历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。本世纪初，舌下滴剂变应原疫苗广泛用于欧洲、南美洲、澳州、东南亚和中东地区。专利申请CN200910147470. X(专利名称一种稳定的含有蒿属花粉变应原的药物组合物，
公开日期2010年12月8日)公开了一种药物组合物，可以包含北艾花粉变应原、 黄花蒿花粉变应原和大籽蒿花粉变应原。北艾花粉主要分布于欧洲，和上述我国主要致敏的蒿属花粉变应原大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、艾蒿花粉变应原不同。并且，该专利申请只是提到可以将蒿属花粉变应原制备成组合物，仅有这样的思路，并没有具体公开该组合物是如何制备的，变应原的比例，制得的组合物疗效怎样...等都是未知的，即实质上并没有解决蒿属花粉是否可以用来制备得到联合疫苗这一技术问题。
发明内容
本发明的目的之一在于针对上述问题，提供了一种蒿属花粉变应原疫苗。它是一种黄花蒿花粉、大籽蒿花粉和艾蒿花粉的变应原联合治疗性疫苗。本发明的另一目的，在于提供一种所述蒿属花粉变应原疫苗的制备方法。本发明的又一目的，在于提供所述蒿属花粉变应原疫苗在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。本发明提供的一种蒿属花粉变应原疫苗，包括大籽蒿花粉(Artemisia sieversiana ffilld)变应原、黄花蒿花粉(Artemisia annua L.)变应原、艾蒿花粉 (Artemisia argyi Levi, et Vant)变应原。其中，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原三者的活性比为(0. 5 2) (0. 5 2) (0. 5 2)，优选为(0. 5 1) (0. 5 1) (0. 5 1)， 更优选1 1 1。本发明所述的蒿属花粉变应原疫苗，还包括药学上可接受的载体。其中，所述药学上可接受的载体为氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐、甘油和苯酚。其中，所述氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、甘油和苯酚的加入浓度为 氯化钠0. 5 % 1 %，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液IOmM 500mM，苯酚0. 2 % 0. 5 %， 甘油50%。氯化钠优选0. 5% ；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液优选50mM 500mM ；苯酚优选0.2% 0.4%。上述浓度百分数都是W/V比(重量体积比)。其中，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的PH值为7. 5 8. 5，优选8. 0。本发明所述的蒿属花粉变应原疫苗制成的剂型可以是注射剂、胶囊、舌下滴剂、 口服液、鼻腔剂或贴剂。所述疫苗制成的剂型优选舌下滴剂。舌下给药变应原疫苗相比皮下注射给药变应原疫苗，更安全，患者可以自己回家用药。鼻炎和哮喘病人中，儿童患者占很大比例，对于儿童群体患者，舌下给药变应原疫苗，患者依从性更好，更容易接受这种治疗方式。其中，所述蒿属花粉变应原疫苗舌下滴剂的有效剂量为80AU/ml 50000AU/ml。本发明提供的一种所述蒿属花粉变应原疫苗的制备方法，包括提取所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原的变应原，将三种变应原原液以及药学上可接受的载体混合。其中，所述籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液的具体提取方法都是一样的，包括分别以大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、过滤、浓缩，制得所述籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液。所述籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液的提取方法，进一步地，包括以下步骤1)收集大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉；收集花粉后，筛除杂质，然后对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定；2)脱脂将步骤1)得到的花粉分别用丙酮浸泡搅拌脱脂，将脱脂后的固体物自然干燥；其中，花粉和丙酮的体积比为1 2 1 10，优选1 5;3)浸提将步骤2)脱脂后的大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉，分别以料液比 1 10 1 50 (W V)加入IOmM 500mM，pH值为7. 5 8. 5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，2 8°C搅拌2 24h进行提取，得到粗提液；将粗提液，6000rpm, 4°C，离心15min ； 取上清8000rpm，4°C，离心30min后取上清；其中，料液比优选1 25，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度优选50mM 500mM，pH值优选8. 0 ；提取温度优选4°C，时间优选12 Mh， 更优选Mh ；4)过滤将步骤3)得到的粗提液分别依次用2 10 μ m、0. 45 1 μ m和0. 22 0. 45 μ m滤膜过滤；依次使用的滤膜优选8 μ m、0. 45 μ m和0. 22 μ m ；5)浓缩将步骤4)过滤后的提取液，分别用3KD IOKD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致；提取液超滤浓缩至原体积的1/10 1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml ；超滤膜优选5KD， 提取液超滤浓缩至原体积优选1/5。本发明提供的所述蒿属花粉变应原疫苗在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。尤其是在制备通过特异性免疫方式治疗蒿属花粉过敏介导的过敏性疾病药物中的应用。所述过敏性疾病包括过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘。本发明提供的蒿属花粉变应原疫苗选用了三种蒿属花粉变应原大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原，它们是我国主要致敏的三种蒿属花粉变应原。联合疫苗的整体有效性高于单一的蒿属花粉变应原疫苗，囊括了我国致敏蒿属花粉的主要变应原。可以治疗由多种蒿属花粉过敏介导的过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘疾病，疗效好，联合用药有效性提高，并且安全性和稳定性都比现有技术好。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1大籽蒿花粉变应原原液的制备1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集大籽蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉以体积比1 5加入丙酮，在室温间断搅拌下脱脂，每次池， 脱脂后丙酮无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味。3)将脱脂后的大籽蒿花粉IOOOg以投料比1 25 (W V)加入25000ml、200mM、
PH8. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4°C搅拌Mh。将提取后的提取液，6000rpm, 4°C，离心15min ；取上清8000rpm，4°C，离心30min后取上清。4)将提取结束后的提取液用8 μ m滤膜澄清过滤，再将粗提液经0. 45 μ m、0. 22 μ m 滤膜依次过滤。5)将4)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原体积1/10，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml。实施例2黄花蒿花粉变应原原液的制备1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集黄花蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉以体积比1 2加入丙酮，在室温间断搅拌下脱脂，每次池， 脱脂后丙酮无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味。3)将脱脂后的黄花蒿花粉IOOOg以投料比1 10(W V)加入25000ml、50mM、 PH8. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，3°C搅拌12h。将提取后的提取液，6000rpm, 4°C，离心15min ；取上清8000rpm，4°C，离心30min后取上清。4)将提取结束后的提取液用8 μ m滤膜澄清过滤，再将粗提液经0. 45 μ m、0. 22 μ m 滤膜依次过滤。5)将4)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原来体积的1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml。实施例3艾蒿花粉变应原原液的制备1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集艾蒿蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉以体积比1 10加入丙酮，在室温间断搅拌脱脂，每次池， 直至脱脂后上清丙酮为无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。3)将脱脂后的艾蒿花粉IOOOg以投料比1 50 (W V)加入25000ml、500mM、 pH8. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，2°C搅拌Mh。将提取后的提取液，6000rpm，4°C，离心15min ；取上清8000rpm，4°C，离心30min后取上清。4)将提取结束后的提取液用8 μ m滤膜澄清过滤，再降粗提液经0. 45 μ m、0. 22 μ m 滤膜依次过滤。5)将4)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原来体积的1/10，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于100000AU/ml。大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液也可采用完全相同的方法进行制备。实施例4蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8. 0,50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比 1:1: 1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的
半成品。三种蒿属花粉变应原按活性比1 1 1混合，保证了三种蒿属花粉变应原的质和量的均一性。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例5蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用 PH8. 0,300mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比 1:1: 1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.4% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例6蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用PH8. 0，50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比 1:1: 1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.3% (w/v)的苯酚和终浓度为(w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例7蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用 PH8. 0,500mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000. AU/ml后混合，按体积比 1:1: 1配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。
2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例8蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8. 0,50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比 0.5 2 0.5配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好 20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例9蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8. 0,50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比 0.5 0.5 2配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好 20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例10蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8. 0,50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比 2 0.5 0.5配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好 20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例11蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用pH8. 0,50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制为100000AU/ml后混合，以体积比2 2 0.5配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好 20000AU/ml、4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例12蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制按本发明专利的工艺制备大籽蒿花粉变应原提取液、黄花蒿花粉变应原提取液、 艾蒿花粉变应原提取液，在5KD超滤过程中，用50mMPH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超
滤ο将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用 pH6.0，50mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1 :1:1 配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、 4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例13蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制按本发明专利的工艺制备大籽蒿花粉变应原提取液、黄花蒿花粉变应原提取液、 艾蒿花粉变应原提取液，在5KD超滤过程中，用50mMPH5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超
滤ο将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用 pH5.0，50mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1 :1:1 配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、 4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。实施例14蒿属花粉变应原舌下滴剂疫苗的制备1)半成品的配制按本发明专利的工艺制备大籽蒿花粉变应原提取液、黄花蒿花粉变应原提取液、 艾蒿花粉变应原提取液，在5KD超滤过程中，用50mMPH7. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超滤ο将大籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液、艾蒿花粉变应原原液分别用 pH7.0，50mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制为100000AU/ml后混合，按体积比1 :1:1 配制为100000AU/ml蒿属花粉变应原原液，再按上述相同的方式配制好20000AU/ml、 4000AU/ml、800AU/ml、160AU/ml蒿属花粉原液，将上面五个浓度的蒿属花粉变应原原液添加终浓度为50% (w/v)的甘油，终浓度为0.2% (w/v)的苯酚和终浓度为0.5% (w/v)的氯化钠，最终配制成 50000AU/ml、10000AU/ml、2000AU/ml、400AU/ml、80AU/ml 五个浓度的半成品。2)半成品分装将检验合格的五个浓度的半成品，在无菌条件下分装到成品包装瓶中。试验例1蒿属花粉变应原交叉免疫性1)体内点刺实验方法本实验使用北京协和医院变应原制剂室制备的艾蒿花粉变应原点刺液、黄花蒿花粉变应原点刺液、大籽蒿花粉变应原点刺液给疑是蒿属花粉患者同时点刺三种点刺液。此次蒿属花粉过敏流行病学调查地点为我国蒿属花粉最严重的东北地区。在此次流行病学调查实验中，共进入实验组的有1059例病人，其中893例病人点刺三种蒿属花粉变应原阳性； 4例病人点刺黄花蒿阳性，艾蒿、大籽蒿点刺阴性；162例病人三种蒿属花粉点刺阴性。此次蒿属花粉过敏临床流行病学调查结果显示在我国，艾蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、 大籽蒿花粉变应原存在交叉过敏。2)体外实验本实验采用RAST竞争免疫抑制实验，采用UniCAP (法玛西亚)，用艾蒿花粉变应原包被的immimoCAP小管，收集30份三种蒿属花粉点刺阳性的蒿属花粉变应原血清分别来验证三种蒿属花粉变应原交叉过敏的强度。实验方法将黄花蒿花粉变应原溶液、艾蒿花粉变应原溶液、大籽蒿花粉变应原溶液配制为蛋白浓度为100yg/ml溶液(Bradford法测定蛋白浓度)。将100μ g/ml三种蒿属花粉变应原溶液用生理盐水稀释为10-1、10-2、10-3三个浓度，分别取100 μ 1样品置于5ml印pendorf小管中，每管加100 μ 1蒿属花粉变应原血清， 37°C孵育60min。以100 μ 1生理盐水加100 μ 1阳性血清为阳性对照，以100 μ 1生理盐水加100μ 1阴性血清为阴性对照，对艾蒿花粉变应原immimoCAP上机检测，计算每个浓度的抑制率。实验结果如下表一蒿属花粉交叉免疫抑制实验抑制率
权利要求
1.一种蒿属花粉变应原疫苗，包括大籽蒿花粉(Artemisia sieversiana Willd)变应原、黄花蒿花粉(Artemisia annua L.)变应原和艾蒿花粉(Artemisia argyi Levi, et Vant)变应原。
2.根据权利要求1所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原、 黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原三者的活性比为(0.5 2) (0.5 2) (0.5 2)。
3.根据权利要求1或2所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原三者的活性比为(0.5 1) (0.5 1) (0. 5 1)，优选为 1:1:1。
4.根据权利要求1 3任意一项所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体为氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐、甘油和苯酚。
5.根据权利要求4所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述氯化钠浓度为 0. 5% 1%，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度为IOmM 500mM，苯酚浓度为0. 2% 0.5%，甘油浓度为50% ；氯化钠优选0.5%，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液优选50mM 500mM,苯酚优选0. 2 % 0. 4 %。
6.根据权利要求4或5所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的PH值为7. 5 8. 5，优选8. 0。
7.根据权利要求1 3任意一项所述的蒿属花粉变应原疫苗，其特征在于，所述疫苗制成的剂型为注射剂、胶囊、舌下滴剂、口服液、鼻腔剂或贴剂；优选舌下滴剂，其有效剂量为 80AU/ml 50000AU/ml。
8.权利要求4 7任意一项所述蒿属花粉变应原疫苗的制备方法，其特征在于，包括 提取所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原的变应原，将三种变应原原液以及药学上可接受的载体混合。
9.根据权利要求8所述的蒿属花粉变应原疫苗的制备方法，其特征在于，分别以大籽蒿花粉、黄花蒿花粉或艾蒿花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、过滤、浓缩，制得籽蒿花粉变应原原液、黄花蒿花粉变应原原液和艾蒿花粉变应原原液。
10.权利要求1 7任意一项所述的蒿属花粉变应原疫苗在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用。所述蒿属花粉变应原疫苗，包括大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原。该联合疫苗相比单一的蒿属花粉变应原疫苗，在能保证安全性的同时也提高了治疗的有效性；可以治疗由多种蒿属花粉过敏介导的过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘疾病。
文档编号A61P37/08GK102552900SQ201110433650
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者乔秉善, 何立峰, 姜敏, 汤承祁, 牛占坡, 白彩明, 裴潇竹 申请人:北京新华联协和药业有限责任公司