专利名称：自体活细胞软组织填充凝胶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及利用生物组织工程技术和细胞再生医学原理制备的人体用软组织填充剂，尤其是涉及一种自体活细胞软组织填充凝胶，本发明还涉及该填充凝胶的制备方法。
背景技术：
近年来随着医疗美容市场的高度繁荣，人们对美的追求也逐渐从最初的阶段转向到对自然健康美的更高一级的阶段，这也相应的对医疗美容机构的美容技术提出了更高的要求。在目前的美容手术中，除了常规的矫形类美容手术外，微整形类的面部软组织填充术占据了 30%以上的份额。以玻尿酸填充为例，年产值就高达70多亿。玻尿酸之所以能取得这么好的市场业绩，一是因为面部软组织填充市场的巨大，二是因为玻尿酸的成分与人体的相似性极高，可以安全无残留的降解。但由于玻尿酸属于异体填充物，临床上会经常出现一些并发症，且玻尿酸降解周期短，作用效果只能持续6-13个月，而高昂的价格及每年的重复注射对消费者又是极大的负担，因而医疗美容工作者一直在寻求一种安全无副作用且效果可以长久保持的软组织填充剂。生物组织工程技术和再生医学的不断进步，为我们开拓了新的研究方向，其中以自体成纤维细胞的体外培养扩增然后回输移植到皮肤内，依靠自体成纤维细胞成活后分泌合成胶原和细胞外基质来达到填充作用的技术最为成熟。在美国获得了专利技术认定的 Isolagen，于2011年6月22日获FDA批准应用于临床，说明该技术的安全性和有效性已受到认可。在我国由秦军侠等发明的《人自体胶原蛋白活细胞注射剂及其制备方法》已获得国家发明专利(专利号ZL 200610017330. 7)，该技术是将体外培养的自体成纤维细胞和在培养时所分泌的胶原蛋白等物质，混合成成纤维细胞和胶原蛋白混合液，依靠胶原蛋白起到暂时的填充作用，以移植成活的成纤维细胞分泌合成胶原达到长久的填充效果。临床使用中发现该技术存在三方面严重缺陷其一，由于原代培养采用的是胎牛血清，传代培养使用的是无血清培养基，细胞回输到体内后，对人体内部的环境适应性差，影响细胞的成活， 对美容效果有一定影响；其二，由于注射剂中的胶原蛋白含量太少，即时性的软组织缺陷填充效果很不理想；其三，回输液中缺少促进细胞成活、提高分裂增殖能力的物质，回输后会出现细胞营养缺乏，从而影响后期填充效果。
发明内容
本发明的目的在于为了解决先前的自体皮肤成纤维细胞移植存在的不完善的问题，提供一种更为可靠和完善的升级产品，即自体活细胞软组织填充凝胶。该凝胶注射到皮肤真皮深层后，即可起到即时的填充作用，又可保证成纤维细胞的高成活率，以及成活后分泌合成胶原和细胞外基质所需营养物质的供给，从而达到长久填充功能，本发明还提供该填充凝胶的制备方法。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案本发明所述的自体活细胞软组织填充凝胶，包括培养扩增至至少8 X IO8个的成纤维细胞，血小板浓度为正常血浓度8倍以上的富血小板血浆和凝血酶-钙剂。凝血酶-钙剂是按1000U凝血酶溶于Iml 10%氯化钙配制而成，属于常规配制方法。本发明自体活细胞软组织填充凝胶的制备方法为
第一步，将自体外周静脉血离心后抽取血清分离胶以上的血浆，将其再次分离后抽取最下层血浆，此血浆中的血小板和生长因子的浓度为正常血浓度的8倍以上；
第二步，将第一步制备好的血浆按5%的比例加入到无血清培养基中，制成全营养培养基备用；
第三步，按常规方法将自体成纤维细胞在第二步制备成的全营养培养基中进行原代培养和传代培养，直至成纤维细胞的数量达到至少8 X IO8个；
第四步，将第三步得到的成纤维细胞按照8X IO8个需要Iml富血小板血浆的比例加入到第一步制得的血浆中，再加入凝血酶-钙剂激活，即可得到纤维蛋白原网状填充凝胶。本发明的优点在于较好的解决了成纤维细胞培养、回输、成活繁殖过程中细胞健康状态的保持、回输后的成活、细胞繁殖营养供给、细胞繁殖空间的释放等问题，保证了细胞的高成活率、高合成机能。
具体实施例方式
本发明所述的本发明所述的自体活细胞软组织填充凝胶，包括培养扩增至至少8 X IO8 个的成纤维细胞，血小板浓度为正常血浓度8倍以上的富血小板血浆和凝血酶-钙剂。凝血酶-钙剂是按1000U凝血酶溶于Iml 10%氯化钙配制而成，属于常规配制方法。本发明填充凝胶的具体制备步骤为
第一步，将自体外周静脉血20ml加入到两个IOml装有血清分离胶和抗凝剂的采血管中，用台式低速自平衡离心机以315 X g离心力离心lOmin，用IOml注射器抽取血清分离胶以上的全部血浆，将其加入到两个普通IOml采血管中，再以260Xg离心力离心5min，用 5ml注射器分别抽取两个采血管最下层的Iml血浆，得到2ml富血小板血浆；所得血浆中的血小板和生长因子的浓度可以达到正常血浓度的8倍以上，同时可以最大限度的保证血小板的完整性和活性；由于富血小板血浆会因设备和提取方法的不同，对提取的血小板浓度造成很大影响，而本发明采用两步法提取的富血小板血浆血小板浓度可以达到正常血浓度的8倍以上，完全满足了细胞生长的需要；
富血小板血浆中含有丰富细胞生长因子和营养物质的高浓营养液，对人体细胞组织的生理机能具有较强的提高作用。富血小板血浆中含有丰富的血小板、纤维蛋白原、多种氨基酸、蛋白多糖、微量元素等，经凝血酶-钙剂激活后，纤维蛋白原凝聚成具有网状结构的纤维蛋白胶，可以诱导血小板持续长时间的释放各类细胞生长因子，如转化生长因子-β (transforming growth factor-β , TGF-β )、血小板衍生生长因子(platelet derivedgrowthfactor, PDGF)、类姨岛素生长因子(insulinlike growth factor, IGF)、 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管内皮生长因子(vascular endohelial growth factor,VEGF)等，这些生长因子和营养物质对组织的修复和再生起着重要的作用。
第二步，将第一步制备好的富血小板血浆以5%的比例加入到无血清培养基(品牌优选GIBC0)中，制成全营养培养基备用；
第三步，按常规方法将自体皮肤组织在培养皿中进行原代培养，所用的培养基为第二步制备的全营养培养基；原代细胞的培养扩增后，仍使用第二步制备的全营养培养基进行传代培养，传代培养的环境控制在37°C、CO2浓度为5%，3-4天换一次培养基，当细胞传代至4-5代时，成纤维细胞的数量即可达到8 X IO8个；在细胞培养的原代和传代时使用第二步制备的全营养培养基可以使细胞适应机体的环境，同时富血小板血浆中各种营养物质之间的比例与人体正常比例一致，可以发挥出最佳的协调作用，促进细胞的分裂增殖，并保持良好的功能状态；
第四步，将第三步得到的成纤维细胞消化、离心、沉淀、收集后装入到按第一步的方法制备的Iml富血小板血浆中，再加入0. Iml的凝血酶-钙剂(凝血酶-钙剂按1000U凝血酶溶于lmll0%氯化钙配制而成)进行激活，激活后血浆中的纤维蛋白原会在5-lOmin内凝成满足要求的自体活细胞软组织填充凝胶，成纤维细胞被固定在纤维蛋白原网状凝胶内，网状凝胶形成了天然的细胞支架。注射进皮肤后，依靠凝胶的支撑作用，起到即时的填充作用，并随着凝胶的降解逐渐为成纤维细胞的繁殖释放出足够的空间，释放出的空间被新繁殖的细胞和细胞所分泌合成的胶原及细胞外基质所填补，从而达到了既促进细胞成活和繁殖，又能即时并长久的保持软组织填充的效果。本发明制备的自体活细胞软组织填充凝胶，所用成纤维细胞和富血小板血浆均取自自体，与先前同类技术相比具有三大优点1、富血小板血浆中丰富的生长因子和营养物质可以极大提高移植成纤维细胞的成活率，并可以持续为细胞的繁殖提供足够的营养支持；2、网状的纤维蛋白凝胶为细胞繁殖提供了天然可降解的生长支架，可以提高移植细胞的成活率，同时网状结构的可降解凝胶可以为细胞的分裂繁殖释放出足够的生长空间，避免了直接的细胞移植注射由于皮肤内没有足够的空间容积影响细胞的成活和繁殖；3、富血小板血浆中的活性成分与人体内成分比例一致，只是浓度有所提高，细胞已适应了富血小板血浆的环境，移植到皮肤内后，细胞不需要重新再适应，可以快速成活并发挥正常生理机能。从临床200多名志愿者的使用效果观察，无一例发生不良反应，效果满意率90%以上。
权利要求
1.一种自体活细胞软组织填充凝胶，其特征在于包括培养扩增至至少8 X IO8个的成纤维细胞，血小板浓度为正常血浓度8倍以上的富血小板血浆和凝血酶-钙剂。
2.根据权利要求1所述的自体活细胞软组织填充凝胶的制备方法为第一步，将自体外周静脉血离心后抽取血清分离胶以上的血浆，将其再次分离后抽取最下层血浆，此血浆中的血小板和生长因子的浓度为正常血浓度的8倍以上；第二步，将第一步制备好的血浆按5%的比例加入到无血清培养基中，制成全营养培养基备用；第三步，按常规方法将自体成纤维细胞在第二步制备成的全营养培养基中进行原代培养和传代培养，直至成纤维细胞的数量达到至少8 X IO8个；第四步，将第三步得到的成纤维细胞按照8X IO8个需要Iml富血小板血浆的比例加入到第一步制得的血浆中，再加入凝血酶-钙剂激活，即可得到纤维蛋白原网状填充凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种自体活细胞软组织填充凝胶，包括培养扩增至8×108个的自体成纤维细胞、血小板浓度为正常血浓度8倍以上的富血小板血浆和凝血酶-钙剂。制备方法为首先将提取的成纤维细胞经体外扩增至8×108个，加入到制备好的富血小板血浆中，经凝血酶-钙剂激活，血浆中的纤维蛋白原凝聚成具有网状结构的纤维蛋白胶，即得到活细胞软组织填充凝胶；成纤维细胞的原代和传代所用培养基均由无血清培养基和5%的富血小板血浆配制而成。本发明的优点在于较好的解决了成纤维细胞体外扩增培养、收集回输、体内成活繁殖过程中细胞健康状态的保持、回输后的成活、细胞繁殖的营养供给、细胞繁殖的空间释放等问题，保证了细胞的高成活率。
文档编号A61L27/54GK102488924SQ201110437800
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者侯强, 吴刚, 潘万立, 秦军侠, 郭栋梁 申请人:侯强, 吴刚, 潘万立, 秦军侠, 郭栋梁