碳酸酐酶的新型抗体的制作方法

专利名称：碳酸酐酶的新型抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与碳酸酐酶结合的抗体，其中，所述抗体包含(a)决定Vh区域的CDR 的氨基酸序列 SEQ ID NO. I (CDR I)、SEQ ID NO. 2 (CDR 2)和 SEQ ID NO. 3 (CDR 3)，和/ 或决定 Vl 区域的 CDR 的氨基酸序列 SEQ ID NO. 4 (CDR I)，SEQ ID NO. 5 (CDR 2)和 SEQ IDNO. 6 (CDR 3);或者，(b)其中在所述氨基酸序列SEQ ID NO. I至SEQ ID NO. 6的任一序列中至少一个氨基酸被保守地取代的(a)的氨基酸序列。
背景技术：
在本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请和厂商的操作手册。这些文献的公开内容，尽管我们认为它们与本发明的专利性无关，但仍通过引用方式将它们完整地并入本文。更具体地，通过引用方式并入所有引用的文献从而达到与明确且单独地指明各独立文献以通过引用方式并入的相同程度。碳酸酐酶是催化碳酸到碳酸氢根和质子的可逆水合并因此参与维持体内pH动态平衡的酶家族(Badger and Price (1994), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Bio. ,45:369-392)。如果缺乏酶，则该反应会进行得很慢。由于大多数碳酸酐酶在其活性部位含有锌离子，因此将其归类为金属酶。碳酸酐酶家族有几个成员。其中，至少有5个不同的CA亚族(α、β、、、δ和 ε )。这些亚族没有明显的氨基酸序列相似性并且在大多数情况下被认为是趋同进化的例子。α-碳酸酐酶(CA)在哺乳动物中被发现。该亚族的成员可以从其动力学、组织表达和亚细胞定位来区分(Kivela et al 2005)。α-CA酶被分成4个主要亚群，S卩，分成细胞溶质CA (CA-I, CA-I I, CA-111, CA-VII和 CA-XIII)，线粒体 CA(CA-VA 和 CA-VB)，分泌性 CA(CA-VI)和膜相关 CA(CA_IV、CA-IX、CA-XII、CA-XIV 和 CA-XV) (Breton et al. (2001), JOP 2 (4Suppl) : 159 - 64)。此外，有三种“催化性”CA同工型(isoform) (CA_VIII、CA_X和CA-XI)，其功能仍不清楚。此外，所有这些CA均存在几种同工型。CA-II,CA-IX和CA-XII与肿瘤形成过程相关，它们是多种肿瘤的潜在的组织学和预后的生物标记(Nordfors et al. (2010), BMC cancer; 10:148)。CA-II 是 α-CA 基因家族中被最广泛表达的成员，实际上其出现于每种人体组织和器官中。就催化活性而言，其为已知的最有效的酶。其以某种程度出现在恶性细胞中，并且，有趣的是，最近发现其在肿瘤新生血管的内皮细胞内有异位表达。跨膜酶CA-IX是作为在几种类型的人类癌症以及在正常胃肠组织中表达的新型肿瘤相关抗原而被首次认识的。已经发现CA-IX的功能与细胞粘附、分化、增殖和致瘤过程相关，其酶活性与CA II相当。另一种跨膜CA同工酶CA-XII是首次在正常肾组织和肾细胞癌中被发现的。进一步的研究显示，其在几种其他肿瘤中有表达(Ulmasov et al. (2000))，而且在一些如结肠和子宫的正常器官中也有表达。人CA-XII的X线晶体结构显示其为双拓扑二聚蛋白，它的短细胞内C-末端位于活性部位域的对侧上以使后面朝向细胞外间隙。
CA-II、CA-IX和CA-XII在肿瘤中的高表达(特别是在缺氧条件下)进一步提示，这些酶可能功能性地参与由细胞外间隙的酸化促进的侵袭过程。支持这种假设的是，CA抑制物已经在体外显示能够降低癌细胞的侵袭能力和增殖(Manokaran et al. (2008), JBiomed Nanotechnol.，4(4) :491-498)。尤其是，CA IX和XII似乎被类似的机制调节，这是因为这些同工酶的转录是通过缺氧诱导因子-Ia (HIF-Ia)介导的途径在缺氧条件下在肿瘤中被诱导的(Chiche et al. (2009))。此外，已经显示，在乳腺肿瘤中，CA-XII的表达与雌激素受体 a (ERa )高度相关(Barnett et al. (2008), Cancer Res 68:3505-3515)。为了更详细地解释CA在癌症发展中的重要性，快速增殖的肿瘤细胞迅速蔓生使得从最近的血管(100-150 μ m)扩散的氧气减少。因此，肿瘤细胞接收低水平的氧气，这引起局部缺氧中心和组织坏死。缺氧在细胞中造成选择压力使细胞采取应激状态，结果是表达了大约50种另外的蛋白，包括与pH动态平衡有关的酶(Potter et al. (2004), CellCycle, 3:164-167) 0如上文所解释的，通过所选的碳酸酐酶(CA)同工酶(特别是CA-II、CA-IX和CA-XII)之间的错综复杂的协同作用实现了(至少部分实现了)应激状态。Proescholdt 等人((2005) Neuro Onco 7:465-475)证明了 CA XII 和癌症之间的直接关联。其证明了，与正常脑组织相比，CA XII在原发和转移脑肿瘤中的表达上调。此外，Ilie et al. (2011)，In J Cancer, 128 (7) : 1614-23和Hynninen et al. (2006), Histopathology, 49:594-602表明CA XII分别在来自可切除的非小细胞肺癌和卵巢癌的组织中过表达。Hsiehet al. (2010), Eur J Cell Biol, 89:598-606显示，在体内和体外，CAXII与肿瘤细胞系的侵袭和转移相关。此外，CA抑制剂，特别是，CA-II和CA-XII的抑制剂被用于降低眼内压并由此治疗眼高压(Al-Barrag et al. (2009), Clinical 0phthalomology3:357-362)。同样地，已显示CA抑制剂在青光眼的治疗中是有用的(Haapasalo et al. (2008), Neuro Oncology3:357-362，and Vullo et al. 2005)。因此，已知的是，CA，特别是CA-XII，在缺氧、癌症和眼部疾病中起作用并因此成为治疗性处理或诊断的重要标祀(Thiry et al 2008, Vulo et al2005, and Haapasalo etal. (2008), Neuro Oncology 3:357-362)。尽管系统的碳酸酐酶抑制剂是本领域内已知的，但它们伴有不良副作用，例如酸-碱失衡、超敏反应和致命的缺血性贫血(aplasmaticanemia) (Gross et al. (1988), Am J Opthamol. , Naeser et al. (1986), Acta Opthalmol. , 64:330-337, Mastropasqua et al. (1998)，212:318-321;and Passp et al, Br JOpthalmol. 1985;69:572-575)。因此，需要在用于上述疾病的其他治疗和诊断手段的开发中可采用的其他手段和方法。

发明内容
为了满足这种需要，提供了具有权利要求书中所述特征的实施方式。因此，在第一个实施方式中，本发明涉及一种与碳酸酐酶结合的抗体，其中，所述抗体包含(a)决定Vh区域的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO. I (CDR I), SEQ ID NO. 2 (CDR 2)和SEQ ID NO. 3 (CDR 3)，和/或决定'区域的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO. 4 (CDR I) ,SEQID NO. 5 (CDR 2)和 SEQ ID NO. 6 (CDR 3);或者，(b)其中在所述氨基酸序列 SEQ ID NO. I至SEQ ID NO. 6的任一序列中的至少一个氨基酸被保守地取代的(a)的氨基酸序列。
根据本发明，术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体以及其仍保留结合特异性的衍生物或片段。制备抗体的技术是本领域公知的并且记载在例如Harlow和Lane的"Antibodies, A Laboratory Manual〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 以及 Harlow 和 Lane 的“ Using Antibodies: A Laboratory Manual，，Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999中。根据本发明，术语“抗体”还包括如下实施例,例如嵌合抗体、单链抗体和人化抗体，以及抗体片段，例如，特别是Fab片段，由Eph受体、ephrin或磷酸酯酶胞外域和Fe.抗体片段组成的融合蛋白，或者衍生物进一步包含F(ab' )2、Fv片段或scFvs ;参见,例如，Harlow and Lane (1988) and (1999), loc. Cit0 各种方式是在本领域是已知的并且可用于制备这些抗体和/或片段。因此，可以通过模拟肽(peptidomimetics)来制备所述(抗体)衍生物。此外，可以采用文献中记载的用于制备单链抗体的技术(参见，例如，美国专利4，946，778)来制备对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的单 链抗体。同样地，可以使用转基因动物来表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人化抗体。最优选地，本发明的抗体为单克隆抗体。对于单克隆抗体的制备，任何提供通过连续细胞系培养制备的抗体的技术都可以使用。这种技术的实例包括原始的杂交瘤技术(Kohier and Milstein (1975)Nature 256, 495)以及随着现有技术进一步发展三体杂交瘤(trioma)技术、人 B 细胞杂交瘤技术(Kozbor (1983) Immunology Today 4, 72)和用于制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole et al. (1985)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.，77)。可以使用在BIAcore系统中采用的表面等离子共振来提高噬菌体抗体的效力，噬菌体抗体与本发明的多肽的表位结合(Schier (1996) HumanAntibodies Hybridomas 7, 97;Malmborg(1995) J. Tmmunol. Methods 183,7)。从本发明的上下文中还可以想到，术语“抗体”包括可以在细胞内表达的抗体结构，例如，可以经由病毒或质粒载体中的任一种转染和/或转导的抗体结构。在本发明的上下文中记载的抗体能够与所述多肽的表位特异性地结合/相互作用，所述多肽优选为CA-XII，在此CA-XII被进一步限定。根据本发明使用的术语“特异性地结合/相互作用”是指抗体不会或基本不会与类似结构的表位发生交叉反应。可以在研究条件下测试抗体系列(a panel of antibodies)的交叉反应性，例如，通过评价所述抗体系列在常规条件下与目标表位以及与或多或少的数个(结构上和/或功能上)紧密相关的表位的结合。只有那些与目标表位的相关前后序列(例如，在CA(特别是CA-XII)结构中的特异性基序)结合但不会或基本不会与任何其他表位结合的抗体才被认为是对目标表位具有特异性的并因此属于根据本发明的抗体。相关的方法记载在例如Harlow and Lane, 1988 and 1999, loc cit中。所述抗体特异性地与构象表位或连续表位结合/相互作用，所述表位对于所述多肽(优选CA-XII)是独一无二的。对于多肽抗原而言，构象表位或非连续表位的特征在于存在两个以上的在一级序列中是分开的而当多肽折叠成天然蛋白/抗原时又在分子表面上集合到一起的离散的氨基酸残基(Sela(1969) Science 166, 1365; Laver (1990) Cell 61,553)。对表位起作用的两个以上的离散的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的单独部分。当多肽链折叠成三维结构时，这些残基在分子表面上集合到一起以构成表位。相反，连续或线性表位由两个以上的存在于多肽链的单个线性片段中的离散的氨基酸残基构成。例如，可以按W0/2000/029019和US 6，294，171中的记载来施用抗体。就此而言，提及了在图6中显示了催化活性被抗体EXO6A10抑制的CA-XII的催化域。
术语“⑶R”是本领域公知的并且特指互补性决定域(参见，例如，Harlow andLane, "Antibodies, a laboratory manual", CSH Press, Cold Spring Harbour, 1988)。CDR为在抗体的可变(V)域发现的相对短的氨基酸序列。抗体的每个可变域(重链Vh和轻链Vl)包含有时被称为高变区的三个互补性决定区，可变域与四个相对保守的框架区或“FR”侧接。抗体的六个CDR主要决定了抗体的特异性并与使其与特异性配体接触。本领域技术人员会容易地理解，具有上述CDR (SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 6)的抗体的可变域可被用于构建进一步改善特异性和生物学功能的抗体。在这种情况下，本发明涵盖了包括上述可变域的抗体，该抗体有利地具有实质上与所附实施例中所描述的抗体相同、相似或改善的结合特性。根据本发明，本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链可以因此通过在氨基酸序列SEQ ID NO. I至SEQ ID NO. 6的任一序列中的至少一个保守氨基酸取代而被进一步修饰。就此而言，按优选程度增加的顺序，优选的是在SEQID NO. I至SEQ ID NO. 6的任一序列中少于10个氨基酸、少于9个氨基酸、少于8个氨基酸、少于7个氨基酸、少于6个氨基酸、少于5个氨基酸、少于4个氨基酸、少于3个氨基酸、少于2个氨基酸、或I个氨基酸被保守地 取代。术语“保守取代”在本领域内被广泛使用并特指用具有相似特性的氨基酸替换多肽中的氨基酸。相似特性为，例如，大小、疏水性或电荷。公知的是，氨基酸被分成带正电荷的、带负电荷的、具有不带电荷的侧链的或具有疏水性侧链的。保守取代的实例为Leu取代lie、Arg取代Lys、Phe取代Trp、Asp取代Glu、Ser取代Thr,或者反之亦然。通常氨基酸序列(特别是CDR的氨基酸序列)的总的功能基本上不会受到保守取代的影响，甚至可能会被改善。引入上述修饰，特别是在编码CDR氨基酸序列的DNA序列中引入氨基酸取代的方法对于本领域技术人员而言是公知的；参见，例如，Sambrook, Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)N. Y0本发明的抗体显示出与其抑制和生物活性相关的有利属性。如可以从所附实施例看出的是，与氨磺酰乙酰唑胺(即，已知的CA抑制剂，例如，由Kaur et al. (2002), Int JPharm 248 (1-2) : 1-14所公开)相比，包含具有SEQ ID NO I至SEQ ID NO 6的CDR的抗体EXO 6A10抑制CA-XII的酶活性要高出40倍。此外，目前的实施例显示抗体EXO 6A10在缺氧培养条件下抑制肿瘤细胞系A549 (来源于腺癌)的生长。据本发明人所知，EXO 6A10因此被确认为抑制活细胞上的CA-XII的活性的第一抗体。这是这样一个概念的证据，即，本发明提供的抗体适合用于与碳酸酐酶活性相关(特别是与CA-XII活性相关)的疾病的治疗和诊断手段。本发明的抗体被期望与CA的不同成员结合，优选其胞外活性部位空穴具有同源性的其他膜相关的 α-碳酸酐酶(CA) (Alterio et al. (2009) PNAS106:16233-16238)。更优选的是，本发明的抗体与膜相关的CA (CA-IX或CA-XII)结合，并且进一步优选与CA-XII
彡口口 因此，在优选的实施方式中，本发明的抗体与碳酸酐酶XII结合。就此而言，优选的是CA-XII为人CA-XII。进一步优选的是所述抗体与胞外域CA-XII的至少一个表位(SEQ ID NO. 17的25-301位氨基酸)结合，并且更进一步优选的是在CA-XII的非连续的催化域(SEQ ID NO: 17的94-199位氨基酸)的区域结合(Whittington et al. (2001)。根据本发明的术语“胞外域”是本领域公知的术语，并且结合本发明涉及的是CA-XII延伸进入胞外环境的部分。根据本发明的术语“催化域”也是本领域公知的术语，并且结合本发明涉及的是CA-XII中将碳酸催化成为碳酸氢根和质子发生处的部分。如上文更详细地解释，已知CA-XII在缺氧、癌症和眼部疾病中的作用，CA-XII因此成为用于诊断和医学目的的重要标靶。以下将更详细地讨论本申请的诊断和医学目的。在优选的实施方式中，本发明涉及包含由SEQ ID NO. 7的氨基酸序列决定的Vh区域和由SEQ ID NO. 8的氨基酸序列决定的\区域的抗体。如上所述，抗体具有两个可变域，即，重链域轻链域Vl。SEQ ID NO. 7和SEQID NO. 8显示了本发明的抗体EXO 6A10的Vh和\域的序列。在进一步优选的实施方式中，本发明的抗体为单克隆抗体。 单克隆抗体可以通过以下方法制备例如，已经建立的技术，所述技术如最初记载在Kohler and Milstein, Nature 256 (1975)，495和Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981)，3 中的技术，其中，在此情况下，所述技术包括小鼠骨髓瘤细胞与经免疫的哺乳动物的脾细胞的融合，所述技术随着现有技术的发展而改进。就此而言，需要注意的是，本发明的抗体为单克隆抗体，该单克隆抗体已在大鼠中针对如图11所示且由如图12所示的核酸编码的CA-XII的人序列而产生。因此，特别优选的是本发明的单克隆抗体为大鼠单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，本发明的抗体与(a)标记基团、(b)毒素或(C)抗肿瘤药物连接。就此而言，所述标记基团可为半抗原或荧光染料，例如选自FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、楼桃色(cherry)、Cy3、Cy5、Cy5. 5、Cy7、DNP> AMCA、生物素、异轻基洋地黄毒苷、Tamra、德克萨斯红、若丹明、Alexa荧光素、FITC、TRITC。或者，所述标记基团可为放射性同位素，例如，3H、14C、15N、35S、9°Y、99Tc、nlIn、125I或131L适合的标记基团的其他实例为酶基团(例如，辣根过氧化物酶、辣根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或预定的由第二指示物识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合域、表位标志)。本文所用的术语“毒素”涉及任何由活细胞或器官产生并对细胞或器官有毒的化合物。毒素，因此可为，例如，小分子、肽或蛋白。具体的实例为神经毒素、坏死毒素、血毒素和细胞毒素。根据本发明，术语“抗肿瘤药物”是指能够阻止或减缓组织异常生长的药物。因此，抗肿瘤药物在治疗癌症中特别有用。抗肿瘤药物可为血管生成抑制剂、DNA嵌入剂(DNAintercalator)或DNA交联剂、DNA合成抑制剂、DNA-RNA转录调节剂、酶抑制剂、基因调节剂、微管抑制剂或其他抗肿瘤剂。对本领域技术人员显而易见的是，本发明的抗体可以通过本领域已知的方法与如上所述的标记基团、毒素或抗肿瘤药物连接。这样的连接可以在抗体或抗原表后以化学方法将其连接到附着位点，或者可以在DNA水平上将连接产物设计入本发明的抗体或抗原。DNA随后在如下所述的合适的宿主系统内表达，而且，如果需要，就收集所表达的蛋白并使其复性。连接可以通过本领域已知的连接体来实现。具体地，用这种技术可以采用在酸性或还原条件下或者在暴露于特定的蛋白酶时释放所述毒素或抗肿瘤药物的不同连接体。在一些实施方式中，通过不同长度的间隔臂来附着标记基团、毒素或抗肿瘤药物以减少可能的空间位阻会是理想的。在其他实施方式中，本发明涉及编码根据本发明所述的抗体的核酸分子。编码本发明抗体的本发明所述的核酸分子可为，例如DNA、cDNA、RNA或者合成制备的DNA或RNA，或者包含一种或多种上述核酸分子的重组制备的嵌合核酸分子。所述核酸分子还可以是相当于全部基因或其大部分或者相当于其片段和衍生物的基因组DNA。所述核苷酸序列可以相当于天然产生的核苷酸序列或者可以含有单个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，只要本发明的核酸包含编码SEQ ID NO I至SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8的核酸，或者该序列中至少一个氨基酸被保守地取代，或者包含由SEQ ID NO 9 至 SEQ ID NO 15 或 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 限定的核酸。在本发明特别优选的实施方式中，核酸分子为cDNA分子。本发明的实施方式还涉及包含可表达形式的核酸分子的载体。本发明的载体可为，例如，噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可为有复制能力的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒繁殖通常只会在补足的宿主/细胞中发生。核酸分子可被插入几种市售可得的载体。非限制性实例包括原核质粒载体，例如 pUC-系列、pBluescript (Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或PCRTOPO(Invitrogen)，以及能够适应在哺乳动物细胞中表达的载体，例如PREP (Invitrogen)、pcDNA3 (Invitrogen)、pCEP4 (Invitrogen)、pMClneo (Stratagene)、pXTl (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EB0_pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2_dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR (Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10 (Edge Biosystems)、pTriEx-Hygro (Novagen)和 pCINeo (Promega)。植物表达载体包括 pGEM-T (Promega)、p CAMBIA 1391 (Cambia)、GATEWAY (Invitrogen)、pGreen 和pGreenll (PGREEN)。适用于甲醇酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的实例包括,例如质粒 pA0815、pPIC9K 和 pPIC3. 5K(均由 Intvitrogen 出产)。上述核酸分子还可以被插入载体从而产生与另一多核苷酸的翻译融合。对于载体修饰技术，参见Sambrook and Russel (2001)，loc. Cit。通常，载体可含有一个或多个用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统、一个或多个用于宿主中的筛选标记(例如，抗生素抗性)以及一个或多个表达组件。合适的复制起点(ori)包括，例如，Col E1、SV40病毒和M 13复制起点。插入载体的编码序列例如可以通过标准方法合成或从天然来源分离。可以采用已经建立的方法将编码序列与转录调节元件和/或其他氨基酸编码序列连接。确保在原核或真核细胞内表达的转录调节元件(部分表达组件)对本领域技术人员而言是公知的。这些元件包括确保转录起始的调节序列(例如，转录起始密码子、启动子(如天然相伴的或异源的启动子)和/或隔离子(insulator),内部核糖体进入位点(IRES) (Owens, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 98 (2001)，1471-1476)以及非必需的确保转录终止和转录物稳定的多聚腺苷酸(poly-Α)信号。其他的调节元件可包括转录以及翻译增强子。优选地，本发明的多核苷酸可操作地与能使其在原核或真核细胞中表达的表达控制序列连接。所述载体可进一步包括作为其他调节元件的编码分泌信号的核苷酸序列。这种序列对本领域技术人员是公知的。此外，根据所用的表达系统，能够将表达的多肽导向细胞腔隙的前导序列可被加入到本发明多核苷酸的编码序列中。这种前导序列是本领域公知的。此外，优选的是，所述载体包括可选标记。可选标记的实例包括新霉素、氨苄青霉素、潮霉素和卡那霉素抗性等。根据本发明的表达载体能够引导本发明的多核苷酸和编码抗体的复制和表达。包含所述调节元件的适合表达载体是本领域公知的。就此而言，需要注意的是本发明抗体的Vh和\区域可由不同的表达载体编码。如上所述的核酸分子可被设计成用于直接导入或者通过脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)导入宿主。另外，杆状病毒系统或者基于牛痘病毒或塞 姆利基森林病毒的系统可被用作用于本发明核酸分子的真核表达系统。经典的哺乳动物表达载体包含介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白编码序列以及转录终止和转录物多腺苷酸化所需的信号。此外，还可以包括如复制起点、耐药基因、调节子(作为诱导型启动子的部分)的元件。Iac启动子是可用于原核细胞的经典的诱导型启动子，其可用乳糖类似物异丙基- β -硫代半乳糖批喃糖苷(isopropyl-β -thiogalactopyranosid) ("IPTG")来诱导。对于重组表达和分泌，目标多核苷酸可以连接在例如PelB前导信号(其引导重组蛋白进入外周胞质)和在称为PHEN4的噬菌粒内的基因111(记载在 Ghahroudi et al, 1997, FEBS Letters 414:521-526 中)之间。其他元件可以包括增强子、Kozak序列以及用于RNA剪接的与供体和受体侧接的间插序列。高效转录可由来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)(例如，RSV、HTLVI, HIVI)和细胞巨化病毒(CMV)的早期启动子。但是，也可以使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。或者，重组多肽可以在含有整合入染色体的基因结构的稳定细胞系中表达。用可选标记(例如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素)的共转染使得能够识别和分离转染的细胞。转染的核酸也可以被扩增以表达大量的编码多肽。如上所述，表达载体将优选地包括至少一种可选标记。这种标记包括二氢叶酸还原酶、G418或者用于真核细胞培养的新霉素抗性基因或用于在大肠杆菌(E. coli)和其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适合宿主的代表性实例包括，但不限于，细菌细胞，例如大肠杆菌细胞、链霉菌属(Streptomyces)细胞和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞,例如酵母细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2细胞和草地贪夜蛾(Spodoptera)SfO细胞；动物细胞，例如CHO细胞、COS细胞、HEK 293细胞和Bowes黑色素瘤细胞；以及植物细胞。对上述宿主细胞而言适合的培养基和培养条件是本领域公知的。本发明的另一个实施方式涉及包含本发明载体的非人宿主。该宿主可为原核或真核细胞。存在于宿主细胞内的本发明的多核苷酸或载体可以被整合到宿主细胞的基因组中或者其可被保留在染色体外。就此而言，也可以理解的是本发明的核酸分子可被用于“基因打靶”和/或“基因替代”，用于恢复突变基因或者用于通过同源重组来产生突变基因;参见，例如 Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990)，4712-4716;Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach,Oxford University Press。适合的原核宿主细胞包括，例如埃希氏菌属(Escherichia)细菌、杆菌属(Bacillus)细菌、链霉菌属细菌和鼠伤寒沙门氏菌。适合的真核宿主细胞为例如真菌细胞，特别是如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或甲醇酵母(Pichia pastoris)的酵母菌；或者昆虫细胞，例如果蝇S2和草地贪夜蛾Sf9细胞；以及植物细胞和哺乳动物细胞。对于上述宿主细胞适合的培养基和培养条件是本领域公知的。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela、HEK293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos I、Cos 7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞，小鼠C2C12细胞，BHK (幼仓鼠肾细胞)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。同样在本发明范围内的是如原代哺乳动物细胞(如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))的宿主。或者，可在稳定细胞系中表达重组抗体，所述稳定细胞系包含整合到染色体中的基因结构。在更优选的实施方式中，所述细胞为原代细胞或原代细胞系。原代细胞为直接从有机体获得的细胞。本发明还涉及包含可被用于产生本发明抗体的一种或多种核酸分子的转基因非人动物。抗体可以产生在组织或体液中或者从组织或体液回收，所述体液例如为山羊、母牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔子、仓鼠或其他哺乳动物的乳汁、血液或尿液。参见，例如第 5，827，690,5, 756，687,5, 750，172 和 5，741，957 号美国专利。在其他实施方式中，本发明涉及制备本发明抗体的方法，所述方法包括(a)在允许所述抗体合成的条件下培养本发明的宿主；以及(b)从培养物中回收所述抗体。根据本领域已知的技术，转化的宿主可以在发酵器中生长和培养以实现最佳的细胞生长。一旦表达，本发明的全部抗体可根据本领域的标准操作来纯化，所述操作包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等；参见Scopes, "ProteinPurification", Springer-Verlag, N. Y. (1982)。然后,可以从生长培养基、细胞溶解产物或细胞膜碎片中分离本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链。可以通过任何常规的方法来分离和纯化本发明的例如微生物表达抗体或免疫球蛋白链，所述常规的方法例如为制备色谱法分离和免疫分离，所述免疫分离例如为那些包括使用定向的单克隆或多克隆抗体(如抗本发明抗体的恒定区的)的免疫分离。在另一个实施方式中，本发明涉及包含本发明的抗体、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主的诊断组合物。在此采用的术语“组合物”是指包含至少一种本发明的抗体、核酸分子、载体和/或宿主的组合物，所述组合物在下文中有时被称作复合物(compound)。本发明的诊断组合物可用于检测CA(特别是CA-IX或CA-XII)在不同细胞、组织或另一合适样品中的不期望的表达或过表达，所述检测包括使样品与本发明的抗体接触并且检测CA(特别是CA-IX或CA-XII)在样品中的存在。因此，本发明的诊断组合物可用于评价如下文所限定的发作或疾病状况。特别地，表达CA(尤其是CA-IX或CA-XII)的恶性细胞(如癌细胞)能够被本发明的抗体、抗体片段或其衍生物当做靶子。已经与本发明的抗体结合的细胞可能因此受到如补体系统的免疫系统功能或者细胞介导的细胞毒性的进攻，因此会减少显示CA(特别是CA-IX或CA-XII)的不期望的表达或过表达细胞的数量或清除这些细胞。如上所述，在本发明的一个方面，本发明的抗体、抗体片段或其衍生物与标记基团连接。这种抗体特别适合诊断用途。本发明的诊断组合物可作为单独的活性剂施用或者可以与其他制剂组合施用。
在其他实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗体、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主。所述药物组合物优选施用于如家畜和宠物动物的哺乳动物。最优选的是施用于人。可以以合适的剂量向对象施用本文所述的药物组合物。用于根据本发明所述用途的药物组合物可使用一种或多种生理性载体或赋形剂根据本领域发现的常规方法来配制，参见，例如Ansel et al.，“Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”, 7thedition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999。因此，所述药物组合物可以以任选地包含常规可药用赋形剂的剂量单位制剂经口或经胃肠外(例如，皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、经眼、经粘膜、硬膜下、通过离子透入的局限或局部、舌下、通过吸入喷雾、气溶胶或直肠)等施用。
对于经口施用，本发明的药物组合物可以采用例如通过常规方法与可药用赋形剂制备的片剂或胶囊剂的形式，所述可药用赋形剂例如为粘合剂(如，预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)、填料(如，乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)、润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石、硅石)、崩解剂(如，马铃薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠)或润湿剂(如，十二烷基硫酸钠)。如上所述，所述药物组合物可以与生理学可接受的载体一起施用给患者。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、助剂、赋形剂或媒介物。这种药用载体可为无菌液体，例如水或油，包括石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当由静脉内施用所述药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和右旋糖水溶液和甘油水溶液也可被用作液体载体，尤其是用作可注射的溶液。适合的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、白明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、钠离子、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可以含有少量的乳化剂或PH缓冲剂。这些组合物可以是溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放制剂等的形式。所述组合物可与传统的粘合剂和如甘油三酸酯的载体一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准的载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药用载体的例子记载在E. ff. Martin的〃雷明顿氏药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences) 〃中。这种组合物会含有治疗有效量的(优选纯化形式的)上述复合物以及适量的载体，从而向患者提供适合的施用方式。所述制剂应当适合施用方式。经口施用的液体制剂例如可以采用溶液、糖浆剂或混悬液的形式，或者可以采用干燥产品的形式存在并在使用前与水和其他合适的载体构成。这种液体制剂可以使用下列药学上可接受的添加剂通过常规手段而制备如悬浮剂(例如，山梨醇、糖浆、纤维素衍生物、氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂、阿拉伯胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油性酯类、乙醇、精馏植物油)；防腐剂(例如，甲基或或丙基对羟基碳酸酯、山梨酸)。视需要而定，所述制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂还可被适当地配制成容许控制释放本发明的药物组合物的形式。对于通过吸入的施用，本发明的药物组合物可以使用适合的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体)以来自增压包装或喷雾器中的喷雾的存在形式方便地递送。在增压喷雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供用于递送计量用量的阀而确定。例如，在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒可被配制成包含本发明的药物组合物的粉末混合物和适合的粉末基质(如乳糖或淀粉)。
本发明的药物组合物可以被配制成通过注射的肠胃外给药形成，例如，通过弹丸注射或连续输注。注射部位包括静脉内的、腹膜内的或皮下的。注射制剂可以以单位剂型呈现(例如，在药瓶中，在多剂量容器、密封安瓿或小瓶中，作为含水溶液或用于重配的冻干制品)，并且可以添加防腐剂。本发明的药物组合物可以采用如下形式混悬液、在含油或水性载体(vehicle)中的溶液或乳液,并且可以包含配方剂(如混悬剂、稳定剂或分散剂)。或者，所述试剂可以采用粉末形式在使用前与适合的载体(例如，无菌无热原水)配药。必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。通常，所述成分以单独地或者以单位剂型混合在一起而被提供，例如，在密封容器(如指示活性剂数量的安瓿或药囊(sachette))中的冻干粉末或无水浓缩剂。当将要通过输注施用所述组合物时，可以用含有无菌药用级别水或盐水的输注瓶调配所述组合物。在通过注射施用所述组合物时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使所述成分可以在施用前被混合。本发明的药物组合物可以被配制成经皮给药的形式。经皮组合物通常被配制成局·部用的含有活性成分的膏剂或霜剂，活性成分的用量通常为约O. 01至约20wt%，优选为约O. I至约20wt%,优选为约O. I至约10wt%,且更优选为约O. 5至约15wt%。当配制成膏剂时，通常将活性成分与石蜡族或水溶性膏剂基质组合。或者，可以将所述活性成分用例如水包油霜剂基质配制成霜剂。这种经皮制剂是本领域中众所周知的，并且通常包含附加成分以提高活性成分或制剂的透皮稳定性。所有这些已知的经皮制剂和成分都属于本发明的范围内。还可以通过经皮装置施用本发明的组合物。因此，可以使用贮器或多孔膜型或者固体基质变型的任一贴片进行经皮给药。本发明的药物组合物可以被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子(例如，从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的阴离子)形成的盐，以及与阳离子(例如，从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的阳离子)形成的盐。如需要，本发明的药物组合物还可以存在于可以包含一种或多种含有所述试剂的单位剂型的包装或分配器装置中。例如，所述包装可以包括金属箔或塑料薄片，例如，泡状包装。所述包装或分配器装置可以带有给药说明书。本发明的药物组合物可以以单一活性剂施用，或者可以联合其他试剂(优选为本领域中已知的适合用于治疗正在谈论的疾病的试剂)施用。所述药物组合物通常是通过将所需纯度的药物组合物以单位剂量的可注射形式(溶液、混悬液或乳液)与药学上可接受的载体(即，在所使用的剂量和浓度下对受者无毒并且与制剂中的其他成分相容的载体)混合来配制。通常，所述制剂是通过使所述药物组合物的组分与液体载体或细粒固体载体或二者均匀密切地接触而制备的。然后，如需要，将所述产品形成所需制剂。这些载体赋形剂的实例包括水、盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。在此也可以使用如不挥发性油和油酸乙酯的非水性载体以及脂质体。所述载体适当地包含少量添加剂(如提高等渗性和化学稳定性的物质)。这些材料在所使用的剂量和浓度下对受者无毒，并且包括缓冲系，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸以及其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天门冬胺酸或精氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA ;糖醇，如甘露醇或山梨醇；抗衡离子，如钠；和/或，非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或PEG。将要用于治疗给药的药物组合物的组分必须是无菌的。通过经由无菌滤膜(例如，O. 2微米膜)过滤容易实现无菌。药物组合物的治疗组分通常被放到具有无菌入口的容器(例如，具有通过皮下注射针可刺入的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。根据本发明的实施方式，本发明的抗体、本发明的核酸分子、本发明的载体或者本发明的宿主用于治疗或抑制缺氧、实体肿瘤或眼部疾病。此外，本发明描述了一种通过向需要治疗的对象施用有效量的本发明的核酸分子、本发明的载体或者本发明的宿主而治疗或抑制缺氧、实体肿瘤或眼部疾病的方法。在这点上，术语“缺氧”指的是机体作为整体(全身缺氧)或身体局部(组织缺氧)丧失足够的供氧的病理状态。例如，在细胞水平上供氧和其需求间不匹配会导致缺氧状态。 完全丧失供氧的缺氧被称作缺氧症并因此被含盖在保护性术语缺氧内。根据本发明的术语“实体肿瘤”定义为通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织团。实体肿瘤可以是良性的(非癌症)，或者恶性的(本领域中常常称作癌症)。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型来命名。在下文中提供实体肿瘤的实例。本文所用术语“眼部疾病”指的是眼睛(包括其附属物)的病理状态或损伤。例如，眼部疾病可以包括眼睛的天然晶状体的模糊化或浑浊化，例如由流体漏出和集聚造成的黄斑水肿或者中央视网膜的水肿，视网膜下的透明小体(hyaline body)的小型积聚，视神经损伤，黄斑细胞变性，视力损失或眼睛的结膜和角膜的炎症，以及瘢痕组织形成。在下文中提供眼部疾病的实例。本领域技术人员将理解而且特别是从引言部分中提供的信息(通过引用的方式并入本申请)中显而易见的是，本发明的抗体、核酸分子、载体或宿主特别用于治疗或抑制本文提到的特定疾病。在本发明的优选实施方式中，所述缺氧选自肿瘤缺氧、神经元缺氧、大脑缺氧、狭窄和缺血中。在本发明的另一个优选实施方式中，所述实体肿瘤选自肉瘤、神经胶质瘤、癌症、间皮瘤、淋巴瘤、肾脏肿瘤、肺肿瘤、乳房肿瘤、宫颈肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肝肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和头颈部肿瘤中。在本发明的又一个优选实施方式中，所述眼部疾病选自眼高压、青光眼、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎、伴X染色体的视网膜分层剥离和高血压性视网膜病变。


附图显示图I :碳酸酐酶的功能(得自Innocenti et al.，2007)。细胞溶质的(CA-II)和跨膜(CA-IX和XII)与其他蛋白质的相互作用涉及PH内稳态和阴离子运输，如(I)单羧酸根运载体；(2) Na+-H+-反向转运体；(3)依赖ATP的NA+-K+-反向转运体；(4) H+-ATP酶；(5)水通道蛋白(acquaporins) ； (6)膜结合CA(CA-IX、XII或XIV) ； (7)碳酸氢根/氯离子阴离子交换体(AE)。图2 =CA-XII在不同类型的人类癌症中的表达水平。图3 :使用EXO 6A10抗体和荧光染料标记的第二抗体对A549细胞进行的免疫荧光染色显示CA-XII的膜相关定位。图4 :A :如通过流式细胞计量术所显示的CA-XII在人类癌症细胞系和外周血单核细胞(PBMC)的细胞表面上表达(灰色是=同种型对照；黑线=EXO 6A10)。B :如免疫印迹所示，CA-XII在从患有卵巢癌的患者的恶性腹水中分离的外来体上。GMl=神经节苷脂Ml ( 一种外来体的标记物)；iso=同种型对照。
图5 :上图=CA-XII (IC50=6. 14x I(T9M)和氨磺酰乙酰唑胺(IC50=2. 38x I(T7M)的EXO 6A10抑制作用。下图CA II的EXO 6A10抑制作用。图6 :用于EXO 6A10干扰CA-XII活性的CA-XII的不连续催化区的相关氨基酸残基(得自 Whittington et al. , 2001)。图7 :三维肿瘤球形体中的代谢活性的EXO 6A10抑制(Unbehandelt=未处理的)。上图在EXO 6A10(终浓度10μ g/ml)存在下培养球形体，使用乙酰唑胺(AAZ，终浓度100 μ M)培养球形体，以及在没有进行任何附加处理的情况下培养对照球形体(Unbeh.)。两天后，通过MTT测定法以及在595nm读取吸光度(extinction) (Cory et al. 1991)来测量球形体的代谢活性。全部数据均表示为均值土标准误差。使用t检验进行未处理的球形体和经处理的球形体之间的比较。下图对A549球形体(已用左侧未处理的EXO 6A10培养两天)进行照相，随后用3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑氮溴化物((3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenhyltetrazoliumbromide)处理。图8 :产生抗体EXO 6A10的杂交瘤(=6A10杂交瘤)的免疫球蛋白轻链的可变区的核苷酸和氨基酸序列。构成免疫球蛋白与抗原的相互作用的互补决定区(CDR) 1-3用黄色标出。根据在Chothia et al.，1989中描述的标准识别⑶R。图9 :产生抗体EXO 6A10的杂交瘤(=6A10杂交瘤)的免疫球蛋白重链的可变区的核苷酸和氨基酸序列。构成免疫球蛋白与抗原的相互作用的互补决定区(CDR) 1-3用粗体加下划线标出。根据在Chothia et al.，1989中描述的标准识别⑶R。图10 :通过流式细胞计量术显示的用编码人CA-XII的表达质粒转染的鼠科L929细胞中的EXO 6A10的结合(黑线，L929+CA-XII)以及作为对照的EXO 6A10与未转染的L929细胞的结合(灰色区域，L929)。图11 =CA-XII (同种型I)的公开序列的氨基酸序列和通过RT-PCR克隆的cDNA的电脑模拟(in silico)翻译的氨基酸序列的比对。显然，两种序列是相同的。图12 =CA-XII (同种型I)的公开的核苷酸序列和通过RT-PCR克隆的cDNA的核苷酸序列的比对。显然，两种序列是相同的。图13 :缺氧诱导CA XII在成胶质细胞瘤细胞系上的表达。在21%02 (常氧)条件下或者在1%02 (缺氧)条件下培养细胞。使用EXO 6A10抗体通过流式细胞计量术测量CAXII表面表达。黑线=EXO 6A10，灰色图形=同种型对照。
具体实施方式
实施例举例说明本发明。实施例I -不同类型的人类癌症中的CA-XII表达水平CA-XII在不同类型的人类癌症中高度表达。如Bernett et al. (2008)记载的数据(得自http://ist. genesapiens.org)所证明的，CA XII的过表达在乳腺癌中最明显。实施例2-A549细胞的免疫荧光染色在室温下，将A549细胞用4%(v/v)多聚甲醛(于PBS中)固定10分钟，用PBS和O. 5% (v/v) Triton-X-IOO (于PBS中)清洗，以及用EXO 6A10抗体孵育60分钟。在用PBS和PBS/0. 5% (v/v) Triton-X-IOO清洗之后，将细胞用荧光染料标记的第二抗体(小鼠抗大鼠IgG/Cy3)孵育,而后,通过Leica激光扫描显微镜显现所结合的抗体。用DAPI对细胞核进行复染色。因此，CA-XII的染色与A549细胞的细胞膜清楚地关联(图3，箭头)。实施例3 -所调查的人类癌细胞系表达CA-XII 参照图4A，如流式细胞计量术所显示的，所调查的大多数的恒定的人类癌细胞系在细胞表面上表达CA-XII。将恒定的人类癌细胞系在冰上用EX06A10(在2%(v/v)FCS(例如，胎牛血清)(于PBS中)中1:5稀释的杂交瘤上清液)孵育15分钟，在PBS/2% (v/v) FCS中清洗三次，而后在冰上用特异性第二抗体(山羊抗大鼠IgG/Cy5)染色另外15分钟。然后，采用Becton Dickinson FACS Calibur装置和FlowJo软件(Treestar公司)通过流式细胞计量术测量6A10的结合。使用具有无关的特异性的同一同种型(谷胱甘肽-S-转移酶)的抗体作为对照(灰色是=同种型对照；黑线=EXO 6A10)。没有与外周血单核细胞(PBMC)结合以及没有与两种黑色素瘤细胞系结合(未显示)是可检测的。图4B显示，CA-XII还存在于从患有卵巢癌的患者的恶性腹水中分离的外来体上，正如该免疫印迹所示。外来体是通过差速离心(500xg; 10. OOOxg; 70. OOOxg)从恶性腹水中分离的，并且在PBS中再悬浮。使用标准布雷德福特(Bradford)测定法测量蛋白质浓度。将2 μ g蛋白质用吸量管转移到硝酸纤维素膜上。将膜用不同的第一抗体孵育。清洗后，将这些膜用特异性第二抗体(抗大鼠IgG/过氧化物酶)孵育。用霍乱毒素亚单位B/过氧化物酶检测神经节苷脂GMl。用ECL系统使这些膜显影。实施例4 -由EXO 6A10和乙酰唑胺引起的CA-XII抑制作用参照图5 (上图)，与氨磺酰乙酰唑胺(IC50=2. 38xlO_7M)相比，EX06A10更加有效地抑制CA-XII (IC50=6. Hxl(T9M)。相反，参照图5(下图)，EXO 6A10并没有显著地抑制CA-II。实施例5-EX0 6A10 与 CA-XII 结合CA XII的催化区的三维结构。显示了有关的氨基酸残基(得自Whittington etal.，2001)。实施例6 - EXO 6A10对三维肿瘤球形体中的代谢活性的抑制作用将A549肺癌细胞平铺到96孔细胞培养板上的由1%(ν/ν)琼脂糖(于PBS中)组成的垫子上。在这些条件下，在标准细胞培养基中生长成单层的大多数细胞系不会粘附到琼脂糖上。相反，细胞自然地形成称作肿瘤球形体的三维结构。图7 (上图)在EXO 6A10 (终浓度10 μ g/ml)存在的情况下培养一些球形体，而用乙酰唑胺(AAZ，终浓度ΙΟΟμΜ)培养另一些球形体。在没有任何其他处理的情况下培养对照球形体(Unbeh.)。两天后，通过上述MTT测定法以及在595nm读取吸光度(Cory etal. 1991)来测量球形体的代谢活性。对于每组，包括10个球形体，计算平均值，标准差。全部数据均表示为均值土标准误差。使用t检验进行未处理的球形体和经处理的球形体之间的比较，使用 Prism4 计算(GraphPad Software, La Jolla)。图7(下图)将A549球形体用EXO 6A10或左侧未处理的情况下培养两天。然后，加入3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四唑氮溴化物，并且照相。显然，与未处理的球形体相比，经EXO 6A10处理的球形体小得多并且密集得多。实施例7 -用编码人CA-XII的表达质粒转染鼠科L929细胞用编码人CA-XII的表达质粒转染鼠科L929细胞。然后，通过流式细胞计量术显示EXO 6A10的结合(图10，黑线，L929+CA-XII)。作为对照，测试EXO 6A10与未转染的L929细胞的结合(图10，灰色区域，L929)。EX06A10与转染的细胞结合，而不与未转染的细胞结合。因此，表明膜的结合局限在过表达的人CA-XII。实施例8 -在常氧或缺氧的条件下培养成胶质细胞瘤细胞系U373和U251 在人类癌症中CA XII与缺氧有关。在常氧(约21%的O2)或者在缺氧的条件下(1%的O2)培养成胶质细胞瘤细胞系U373和U251。在常氧的条件下(左图)，没有检测到CA XII表达，然而，在将细胞保持在缺氧条件下(图13)时，该酶明显地被诱导。这些结果说明，缺氧的癌细胞，CA XII是重要的酶。参考文献Alterioj V.，Hilvoj M.，Di Fiore, A.，Supuranj C. T.，Pan，P.，Parkkila，S.，Sealoni，A.，Pastorekj J.，Pastorekovaj S.，Pedonej C.，Scozzafavaj A.，Monti, S. M.，and DeSimone, G. (2009).Crystal structure of the catalytic domain of the tumor-associated humancarbonic anhydrase IX. Proc Natl Acad Sci USA 106，16233-16238.Barnett, D. H.，Shengj S.，Charnj T. H.，Waheedj A.，Sly, W. S.，Linj C. Y.，Liuj E.T. , and Katzenellenbogenj B. S. (2008). Estrogen receptor regulation of carbonicanhydrase XII through a distal enhancer in breast cancer.Cancer Res68，3505-3515.Chichej J.，Ilcj K.，Laferrierej J.，Trottie r，E.，Dayan, F.，Mazurej N.M.，Brahimi-HornjM. C.，and PouyssegurjJ. (2009). Hypoxia-inducibIe carbonicanhydrase IX and XII promote tumor cell growth by counteracting acidosisthrough the regulation of the intracellular pH. Cancer Res 69，358—368.Chothiaj C.，Leskj A. M.，Tramontane ，A.，Levitt, M.，Smith-Gill，S.J.，Air, G.，Sheriff，S.，Padlanj E. A.，Davies, D.，Tulip, W. R.，and et, a. (1989).Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342，877—883.Cory, A. H.，Owen, T. C.，Barltropj J. A.，and Cory, J. G. (1991) · Use of anaqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture.Cancer Commun 3，207-212. Innocentij A.，Vulloj D.，Pastorekj J.，Scozzafavaj A.，Pastorekova, S. , Nishimorij I. , and Supuranj C. T. (2007). Carbonic anhydrase inhibitors.Inhibition of transmembrane isozymes XII (cancer-associated)and XIV withanions. Bioorg Med Chem Lett 17，1532-1537.
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权利要求
1.一种与碳酸酐酶结合的抗体，其中，所述抗体包含 (a)决定Vh 区域的 CDR 的氨基酸序列 SEQ ID NO. I (CDR I)、SEQ ID NO. 2 (CDR 2)和SEQ ID NO. 3 (CDR 3)，和决定'区域的 CDR 的氨基酸序列 SEQ ID NO. 4 (CDR I)、SEQ IDNO. 5 (CDR 2)和 SEQ ID NO. 6 (CDR 3);或者 (b)其中在所述氨基酸序列SEQID NO. I至SEQ ID NO. 6的任一序列中至少一个氨基酸被保守地取代的(a)的氨基酸序列。
2.权利要求I所述的抗体，其与碳酸酐酶XII结合。
3.权利要求I或2所述的抗体，其中，所述抗体包含由SEQID NO. 7的氨基酸序列决定的VH区域和由SEQ ID NO. 8的氨基酸序列决定的VL区域。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的抗体，其中，所述抗体为单克隆抗体。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的抗体，其中，所述抗体与下列连接 (a)标记基团， (b)毒素，或 (C)抗肿瘤药物。
6.一种编码根据权利要求I至5中任一项所述的抗体的核酸分子。
7.一种包含可表达形式的权利要求6所述的核酸分子的载体。
8.—种包含权利要求7所述的载体的非人宿主。
9.一种制备权利要求I至5中任一项所述的抗体的方法，其包括 (a)在允许所述抗体合成的条件下培养权利要求8所述的宿主；以及 (b)从培养物中回收所述抗体。
10.一种诊断组合物，其包含权利要求I至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主。
11.一种药物组合物，其包含权利要求I至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主。
12.权利要求I至5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主用于治疗或抑制缺氧、实体肿瘤或眼部疾病的用途。
13.权利要求12所述的抗体、核酸分子、载体或宿主，其中，所述缺氧选自肿瘤性缺氧、神经元性缺氧、脑缺氧、器官狭窄和局部缺血。
14.权利要求12所述的抗体、核酸分子、载体或宿主，其中，所述实体肿瘤选自肉瘤、神经胶质瘤、癌、间皮瘤、淋巴瘤、肾脏肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肝肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤以及头颈肿瘤。
15.权利要求12所述的抗体、核酸分子、载体或宿主，其中，所述眼部疾病选自眼高压、青光眼、黄斑变性、年龄相关的黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎、伴X染色体的视网膜分层剥离和高血压性视网膜病。
全文摘要
本发明涉及一种与碳酸酐酶结合的抗体，其中，所述抗体包含(a)决定VH区域的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO.1(CDR 1)、SEQ ID NO.2(CDR 2)和SEQ ID NO.3(CDR 3)，以及决定VL区域的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO.4(CDR 1)、SEQ ID NO.5(CDR 2)和SEQ ID NO.6(CDR 3)；或者(b)其中在氨基酸序列SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6中的任一序列中至少一个氨基酸被保守地取代的(a)的氨基酸序列。
文档编号A61K39/395GK102883747SQ201180022602
公开日2013年1月16日 申请日期2011年5月2日 优先权日2010年5月3日
发明者赖因哈德·蔡德勒, 克里斯蒂娜·巴特克, 伊莉莎白·克雷默, 安德鲁·弗拉特利, 克劳迪乌·苏普兰 申请人:慕尼黑赫尔穆侯尔茨中心-德意志健康与环境研究中心(责任有限公司), 赖因哈德·蔡德勒