专利名称：甘草活性成分及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗前列腺的中药活性组分、药物组合物及其用途。
背景技术：
传统的中药由于其较高的安全性也已用于多种癌症的治疗(HoJW，Leung YK7ChanCP.Herbal medicine in the treatment of cancer (治疗癌症的中草药).Curr Med Chem2002，2，209-214)。已知的此类药物大多是由几种或数十种中药原料配制而成。这类中药复方的成分复杂，作用机理不清楚，质量监控难度较大。目前很少有单味中药用于癌症的治疗。而且，研发中药的有效(活性)成分或部位具有重要的意义。前列腺癌是在亚洲位列第六的导致死亡的癌症。环境与遗传因素在前列腺癌的发病中重要作用。研究发现，前列腺癌过度表达α -甲基酰基辅酶A消旋酶(AMACR)有关。目前还缺乏治疗前列腺癌的传统中草药或从中提取的活性成分。
发明内容
在一实施方案中，提供了甘草(licorice)的活性成分的制备方法，其包括下述步骤，(a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液；(b)将二氯甲烷加入甘草的水提取液中进行提取，收集有机相部分；(c)用水进一步提取步骤(b)得到的有机相部分，收集水相部分；以及(d)将二氯甲烷加入步骤(C)得到的水相部分，进行提取，收集有机相部分。在一实施方案中，提供了一种甘草的活性成分。在一实施方案中，所述甘草的活性成分由包括下述步骤的方法得到:(a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液；(b)将二氯甲烷加入甘草的水提取液中进行提取，收集有机相部分；(C)用水进一步提取步骤(b)得到的有机相部分，收集水相部分；以及(d)将二氯甲烷加入步骤(C)得到的水相部分，进行提取，收集有机相部分。在一实施方案中，所述方法还包括步骤(e)，即将步骤(d)收集的有机相加入水中作进一步提取，收集有机相。在一实施方案中，提供了一种甘草的活性成分，所述甘草的活性成分为图1所示的质谱图所鉴定。在一实施方案中，所述甘草的活性成分为邻苯二甲酸盐衍生物，其质谱数据有90%与DEHP(邻苯二甲酸二乙基己基酯)相同或具有90%的与DEHP相同的基团，例如图2所示的NMR图谱中鉴定的化合物。在一实施方案中，本文所公开的甘草的活性成分用于治疗前列腺癌。在一实施方案中，提供了治疗前列腺癌的中药组合物，该组合物包含本文公开的甘草的活性成分和药学上可接受的载体。
在一实施方案中，提供了前述的甘草活性成分在制备治疗前列腺癌的药物中的用途。此外，提供了一种治疗前列腺癌的方法，该方法通过给予个体治疗有效量的甘草活性的成分或其药物组合物来治疗前列腺癌。
图1显示了甘草活性成分的ES1-MS图。图2显示了甘草活性成分的NMR图谱。图3显示了用本申请公开的甘草活性成分处理前列腺癌PC-3细胞72后PC-3细胞的活存情况。图4显示了用含100 μ M或200 μ M甘草活性成分的培养液处理前列腺癌PC-3细胞24、48和72小时过程中，细胞活存的变化。图5显示了用200 μ M甘草活性成分处理PC_3细胞24小时后，前列腺癌细胞中基因表达变化的散点分布。
具体实施例方式在一实施方案中，提供了本文公开的甘草的活性成分的制备方法，其包括下述步骤(a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液；
·
(b)将二氯甲烷加入甘草的水提取液中进行提取，收集有机相部分；(C)用水进一步提取步骤(b)得到的有机相部分，收集水相部分；以及(d)将二氯甲烷加入步骤(C)得到的水相部分，进行提取，收集有机相部分，即为甘草的活性成分。在一实施方案中，所述甘草活性成分的制备方法还包括步骤(e)，即将步骤(d)收集的有机相加入水中作进一步提取，收集有机相。在一实施方案中，提供了一种甘草(licorice)的活性成分。在一实施方案中，所述甘草的活性成分由本文所公开的甘草活性成分的制备方法而制备:在一实施方案中，提供了一种甘草的活性成分，所述甘草的活性成分为图1所示的质谱图所鉴定。在另一实施方案中，所述甘草的活性成分进一步由图2所示的NMR图谱所鉴定。在一实施方案中，所述甘草的活性成分为邻苯二甲酸盐衍生物，其质谱数据有90%与DEHP (邻苯二甲酸二乙基己基酯)相同或具有90%的与DEHP相同的基团。在一实施方案中，本文所公开的甘草的活性成分用于治疗前列腺癌。在一实施方案中，提供了治疗前列腺癌的中药组合物，该组合物包含本文公开的甘草的活性成分和药学上可接受的载体。在一实施方案中，提供了本文所公开的甘草活性成分在制备治疗前列腺癌的药物中的用途。此外，提供了一种治疗前列腺癌的方法，该方法通过给予个体治疗有效量的甘草活性的成分或其药物组合物来治疗前列腺癌。在一实施方案中,本文所述甘草(英文名称为licorice,拉丁名称为Glycyrrhizaglabra L.,Glycyrrhiza uralensis Fisch 或 Glycyrrhizainflata Bat)又称舌甘草(中国东北、内蒙古地区)、粉草、乌拉尔甘草、甜草根(中国东北地区)、蜜草(名医别录)、国老(名医别录)、甜甘草、甜根子，系豆科植物甘草的干燥根和根茎。甘草为中药处方中常用的一位中药。在一些实施方案中，用于步骤(a)提取甘草的水的重量为甘草重量的1-20倍、1-10倍或1-5倍，例如，水的重量为甘草重量的1、2、3、4、5倍。在一些实施方案中，实施步骤(a)之前，可常规地将甘草在水中浸泡。看根据需要确定浸泡时间，使得干燥的甘草饮片能够入水膨胀，例如浸泡15分钟至6小时、15分钟至2小时，30分钟至I小时。在一些实施方案中，所述步骤(a)是在50°C至120°C温度的水中处理0.5-6小时或1-3小时得到提取物溶液，过滤除去不溶于水的组分或通过离心除去不残渣后即得到甘草的水提取液。在一实施方案中，步骤(a)中水的温度可以为80°C至100°C，处理时间为I小时至3小时、I小时或2小时。在一实施方案中，重复实施步骤(a) 2次，即对甘草进行2次水的提取，然后将两次提取得到的水提取液合并得到所述的水提取液。在一实施方案中，所述离心为4°C，2000Xg或4000rpm，离心10_15min。在一实施方案中，所述步骤(b)中的二氯甲烷与甘草的水提取液的体积比为1:1至5: 1，或者为3: I或5: 2。在另一实施方案中，进行2-3次的所述步骤(b)的提取，合并有机相，从而得到所述有机相部分。在一实施方案中，所述 步骤(C)中水与步骤(b)得到的有机相部分的体积比为
2:1至1: 2或者为1:1。在另一实施方案中，进行1-4次或2-3次的所述步骤(c)的提取，将提取物合并后得到所述水相部分。在一实施方案中，所述步骤(d)中的二氯甲烷与步骤(C)得到的水相部分的体积比为2:1至1: 2或者为1:1。在另一实施方案中，进行2-3次的所述步骤(d)的提取，合并有机相，从而得到所述有机相部分。在一实施方案中，本文公开的甘草活性成分的制备方法还包括用氮气闪蒸所述步骤(d)得到的有机相部分，从而将所述有机相部分的体积进行浓缩。在一实施方案中，所述氮气闪蒸的温度为20-60°C或30-50°C或40°C。在另一实施方案中，所述体积浓缩至原体积的 1/2-1/20，1/3-1/10，或 1/5-1/10。在一实施方案中，本文公开的甘草活性成分的制备方法还包括步骤(e)，即将从步骤(d)的得到的有机相部分进一步与水混合进行提取1-3次或2次，收集并合并有机相部分，即为所述甘草的活性成分。在另一实施方案中，所述步骤(e)是将用氮气浓缩后的步骤
(d)的得到的有机相部分与水混合进行提取1-3次或2次，收集并合并有机相部分，即为所述甘草的活性成分。本文所用术语“药学上可接收的载体”指不干扰活性成分的生物活性有效性的载体。本文所述药学上可接受的载体可以为固体或液体，包括药学上可接受的赋形剂、缓冲齐U、乳化剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂、封装剂、填充剂等。例如，药学上可接受的缓冲剂进一步包括磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐。本文公开的药物组合物可以呈现为单位剂量形式，并且可以通过任一制药领域公知的方法制备。该方法包括将本文的活性成分与一种或几种药学上可接受的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体、固体载体或二者结合来制备组合物，随后根据需要来定型制备的产物。适于口服的本文公开的组合物可以是含有预先确定量的活性成分的诸如胶囊、片齐 、锭剂等剂型。其他剂型包括水性悬浮液或诸如糖浆剂、酏剂或乳剂的非水性悬浮液。适于胃肠外给药的本文公开的组合物可以是包含活性成分的无菌水性或非水性制剂。可以根据已知的方法，使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制备上述制剂。在可接受的载体或溶剂中，可以使用水、林 格氏液以及等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油也可以被方便地用做溶剂或悬浮基质。适于经口、皮下、静脉、肌内等给药方式的载体配方可参见雷明顿药物学(Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.,Easton, PA)。本文所述的“前列腺癌”指发生于前列腺的癌症，包括原发性前列腺癌或转移性前列腺癌。本文公开的甘草活性成分或包含该甘草活性成分与药学上可接受的载体的药物组合物可以通过经口、静脉内、经腹腔、肌注、经直肠或透皮的方式给药。在一些实施方案中，甘草活性成分或包含甘草活性成分与药学上可接受的载体的药物组合物经口给药。在本文所公开的实施方案中，甘草活性组分经口给药的日剂量可以是每千克个体体重 lmg-500mg、5mg-100mg、10mg-50mg 或者是每千克个体体重 5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、40mg 或 50mg。本文中，甘草的活性组分、活性成分、有效成分以及有效部位可以交替使用，除非另有所指。本文所述的“个体”或“患者”可以交替使用，是指包括人的哺乳动物，包括但不限于人、灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。贯穿本说明书的说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。应该理解，在本文公开的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分、成分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾，其根据需要可以任意地替换或组合成为其他的实施方案。上述公开内容总体上描述了实施方案，通过下面的实施例进一步示例所述实施方案。描述这些实施例仅为说明目的，而不是限制所公开的实施方案。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请的范围。实施例实施例1甘草活性成分的提取利用以下方法提取甘草的活性成分:a.将IOOg干燥的甘草(购自香港中草药店)，在5倍量(即500ml)的水中浸泡
0.5小时后，在80-100°C的温度下煮沸I小时。将水提取液在4°C，2000 X g，离心10_15min，得到的上清液。重复上述步骤2次，然后将共计三次的离心上清液合并得到水相部分a。b.将上述甘草水提取得到的水相部分a与二氯甲烷混合，水相部分a与二氯甲烷的体积比为5: 2，提取2次，并将每次的提取的有机相合并得到有机相部分b。c.将上述合并的有机相部分b与等体积的水混合，提取2次，并将每次的提取的水相合并得到水相部分C。 d.将上述合并的水相部分c与等体积的二氯甲烷混合，提取2次，并将每次的提取的有机相合并得到有机相部分d。可以浓缩或干燥该有机相部分，从而去除溶剂，即为本申请公开的甘草的活性成分。可以进一步实施以下步骤e和f，来浓缩并进一步洗提上述有机相部分d，从而得到进一步去除杂质的本申请公开的甘草活性成分。e.用氮气在40°C闪蒸所述步骤(d)得到的有机相部分d，从而将所述有机相部分的体积进行浓缩至50ml浓缩的有机相部分e。f.将有机相部分e与等体积的水混合提取2次，收集并合并有机相部分得到有机相部分f，去除其中的溶剂后即为所述甘草的活性成分。在以下的实施例中，可以使用有机溶剂，例如乙醇，来复溶本申请甘草活性成分。实施例2甘草活性成分鉴定1.ES1-MS/MS 鉴定将干燥的甘草·活性成分复溶在甲醇中，质谱条件为去簇电压为80，溶剂延迟3min，扫描范围50_1100amu，扫描间隔0.2s。2.NMR 鉴定将甘草活性成分干燥在加压条件下去除残留的甲醇后，检测样品获得IH NMR数据。实施例3甘草提取组分的抗肿瘤实验_4] 材料与方法1.细胞模型将已经建系的前列腺癌PC-3细胞系置于含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Ham’ Sf_12K培养基中，在37°C、含5% CO2的饱和湿度的空气中培养。将5X103的PC-3细胞接种于96孔培养板中，其最终体积为每孔100 μ 1，培养24小时。之后，用新鲜的分别含有0、10、50、100、200、300、400或50(^1的本申请公开的甘
草活性成分(处理组)、或4.25%乙醇(载体对照)的培养基替换培养24小时后的培养基，并继续培养24、48或72小时。每组实验重复3次。其中，处理组中的甘草活性成分用乙醇溶解，例如95%乙醇，然后加入培养液中。因此，各个处理组中的乙醇含量与对照一致地为4.25%。2.MTT 分析I).在将细胞培养上述时间后，向每一孔中加入20 μ I的MTT试剂，并将细胞在在37°C、含5% CO2的饱和湿度的空气中孵育2小时。
2).用150μ I DMSO替换培养液中的MTT试剂，来溶解由代谢活性细胞形成的结晶紫(violet crystal)。3).在540nm处用分光光度计定量检测所产生的紫色。4).为了节哀能够不同实验间的变异降低至最低，将结果表示为相对于阴性对照的细胞增殖百分比。用抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)来表示甘草活性成分的细胞毒作用。每个实验重复3次。3.PCR芯片分析I)将 0.39 X IO6的PC-3细胞接种于每孔的最终体积为4ml培养基的T-25培养皿中，培养24小时。2，用新鲜的分别含有200 μ M的本申请公开的甘草活性成分的4.25%乙醇的培养基、或含4.25 %乙醇的培养基(载体对照)替换培养24小时后的培养基，并继续培养24小时。每组实验重复3次。3).用Trizol裂解细胞,再用RNA提取试剂盒(RNAeasy Mini Kit, Qiagen)来提取 RNA。4).取2 μ g提取的RNA来检测用甘草活性成分处理的细胞中相对基因表达水平，所用芯片为RT2Profiler PCR Array System(信号转导途径发现者，SA-Bioscience公司)。5).芯片杂交数据由SA-Bioscience公司提供的基于网络PCR ArrayData分析程序来分析处理。结果1.ES1-MS/MS质谱结果如图1所示。该MS图谱根据质谱数据库进行检索，发现与DEHP (邻苯二甲酸二乙基己基酯)的相似程度达到90%，即可能为DEHP的衍生物。2.NMRIH-NMR的结果如图2所示。3.MTT如图3所示，在用本申请公开的甘草活性成分处理前列腺癌PC-3细胞72时，50 μ M的甘草活性成分即能抑制PC-3细胞的活存，并随剂量的增加成剂量依赖趋势，其中细胞的IC50为151 μ M0图4显示的是，用含100 μ M或200 μ M甘草活性成分的培养液处理前列腺癌PC_3细胞24、48和72小时过程中，细胞活存量的变化。结果表明，在第24小时，用100 μ M或200 μ M甘草活性成分处理的PC-3细胞的活存均有明显下降，在第48小时，两组进一步下降，至72小时时，由于含100 μ M甘草活性成分的培养基中甘草活性成分的消耗，使其有效浓度降低，细胞活存的数量不再进一步下降，但是在含200 μ M甘草活性成分培养基的处理组中，由于其中的活性成分并未完全消耗，细胞的活存数量进一步下降。以上结果表明，本申请公开的甘草活性成分能够抑制前列腺癌细胞的活存，从而能够治疗前列腺癌患者。4.甘草活性成分对前列腺癌细胞基因表达的影响如表I所示，用200 μ M甘草活性成分处理PC-3前列腺癌细胞24小时后，一些基因的表达出现的4倍以上的增加或降低的改变。例如，WNT2、EGRU RBPl和TANK表达增加4倍以上，而CCL2基因的表达出现至少4倍的降低。表权利要求
1.甘草活性成分的制备方法，包括 (a)用水提取甘草，得到甘草的水提取液a; (b)将二氯甲烷加入甘草的水提取液a进行提取，收集有机相部分b； (C)用水进一步提取步骤(b)得到的有机相部分b，收集水相部分c ;以及 (d)将二氯甲烷加入步骤(C)得到的水相部分C，进行提取，收集有机相部分d。
2.如权利要求1所述的制备方法，还包括步骤(e)，将步骤(d)收集的有机相部分d加入水中作进一步提取，收集有机相e。
3.如权利要求所述I或2的制备方法，其中步骤(a)是在50°C至120°C温度的水中加热处理0.5-6小时或1-3小时，过滤除去不溶于水的组分或通过离心除去不残渣后得到甘草的水提取液a。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中步骤(b)中的二氯甲烷与甘草的水提取液的体积比为1:1至5: 1，或者为3:1或5: 2。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其中步骤(c)中水与步骤(b)得到的有机相部分b的体积比为2:1至1: 2或者为1:1。
6.如权利要求所述1-5任一项所述的制备方法，其中步骤(d)中的二氯甲烷与步骤(c)得到的水相部分c的体积比为2:1至1: 2或者为1:1。
7.如权利要求1-6任一项所述的制备方法，还包括用氮气闪蒸所述步骤(d)得到的有机相部分，从而将所述有机相部分的体积进行浓缩。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其中所述体积浓缩至原体积的1/2-1/20，1/3-1/10，或 1/5-1/10。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法，其中步骤(e)是将用氮气浓缩后的步骤(d)的得到的有机相部分与水混合进行提取1-3次或2次，收集并合并有机相部分，即为所述甘草的活性成分。
10.甘草活性成分，其由权利要求1-9中任一项所述的方法制备。
11.如权利要求10所述的甘草的活性成分，其由图1所示的质谱图所鉴定。
12.如权利要求10或11所述的甘草的活性成分，其中所述甘草的活性成分进一步由图2所示的NMR图谱所鉴定。
13.甘草的活性成分，其由图1所示的质谱图所鉴定。
14.如权利要求13所述的甘草的活性成分，其中所述甘草的活性成分进一步由图2所示的NMR图谱所鉴定。
15.甘草的活性成分，其为邻苯二甲酸盐衍生物，质谱数据有90%与DEHP相同或具有90%的与DEHP相同的基团和/或由图2所示的NMR图谱所鉴定。
16.治疗前列腺癌的中药组合物，该组合物包含权利要求10-15任一项所述的甘草活性成分和药学上可接受的载体。
17.权利要求10-15任一项所述的甘草活性成分在制备治疗前列腺癌的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及甘草活性成分，以及包含甘草的活性成分和药学上可接受的载体的治疗前列腺癌的药物组合物。本发明还涉及所述甘草的活性成分的制备方法以及所述活性成分在制备用于治疗前列腺癌的药物中的用途。
文档编号A61P35/00GK103239500SQ20121002537
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者梁悦健, 何永成 申请人:香港中文大学