专利名称：通过抑制鳞状上皮细胞癌抗原的表达而治疗牛皮癣、鳞状上皮细胞癌和/或角化不全的方 ...的制作方法
技术领域：
本发明提供了通过抑制细胞的鳞状上皮细胞癌抗原(Squamous Cell CarcinomaAntigen,下文中称为“SCCA” )的表达而治疗和/或预防选自牛皮癣和鳞状上皮细胞癌的疾病的方法、药物组合物。本发明还提供了以抑制鳞状上皮细胞癌抗原-I(SCCA-I)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候选物质的活性为指标，筛选抑制表皮角化不全的物质的方法；提供了通过所述方法筛选到的抑制表皮角化不全的物质；进一步地提供了通过抑制表皮细胞中SCCA-I的胱天蛋白酶(caspase) 14抑制活性而谋求表皮细胞角化的正常化、抑制表皮角化不全的方法。
背景技术：
SCCA为自鳞状上皮癌细胞提取的抗原，其在子宫颈部、肺、食道、皮肤的鳞状上皮细胞癌中显示出高的血液浓度，常用于鳞状上皮细胞癌的诊断(H. Kato等人，Cancer 40:1621-1628(1977) ；N. Mino 等人，Cancer 62:730-734(1988))。特别是，由于 SCCA 的血液中水平与鳞状上皮细胞癌的进展阶段、恶性程度、肿瘤的大小等呈良好的相关性，其除了用于癌症的早期发现之外，在癌症治疗效果的评价以及诊断所担心的复发等中也是特别有效的癌标志物。还知道SCCA在牛皮癣表皮的上层中表达增强(Takeda A.等人，J. Invest.Dermatol. (2002) 118(1),147-154).牛皮癣是皮肤病中的一种，是以表皮细胞的增殖/分化异常和炎症细胞浸润为特征的慢性、再发性的炎症性角化不全症的牛皮癣。认为牛皮癣除遗传因素之外还因多种环境因子而发病(Hopso-Havu等人，British Journal ofDermatology(1983) 109，77-85)。SCCA是由染色体18q21.3上串联排列的两个基因SCCA-I和SCCA-2编码的。认为由这两个基因编码的蛋白质SCCA-I和SCCA-2均为分子量约45，000的蛋白质，同源性非常高，但是二者反应部位的氨基酸序列不同，具有不同的功能(khick等人，J. Biol. Chem.(1997)27213,1849-55)。虽然已知在鳞状包皮细胞癌和牛皮癣等疾病中存在SCCA-I和SCCA-2高表达，但是，对它们在疾病细胞中发挥什么样的功能尚不清楚。一方面，已知角质形成细胞通过终末分化，具有形成抵御有害环境的被称作“角质层”的保护屏障的功能。终末分化过程在分化程序中受到正确调控，从增殖型基底细胞开始经有棘细胞、颗粒细胞，最后到角质细胞。从颗粒细胞向角化细胞的过渡期中，角质形成细胞的内侧和外侧发生剧烈变化。角质形成细胞的核与细胞器消失，另一方面，生成周围脂质层、被称作角化外皮的强化了的细胞膜以及角蛋白构型(keratin pattern) 0角蛋白构型内部结构柔软，且维持紧张状态。以往的报告称，分化中的角质形成细胞存在DNA片段化和TUNEL阳性细胞等，显示出程序性细胞死亡(apoptosis)特征(Haake A. R.，J. Invest.Dermatol. 101，107-12 (199 )。人角化细胞提取物中检测到了胱天蛋白酶样活性，然后发现在人角质形成细胞中存在若干种胱天蛋白酶。但是，另有报告称，典型的促进程序性细胞死亡的胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶-3、-6和-7，终末分化时不被活化。分化异常往往导致被称作“角化不全”的角化层中的核持久存在。角化不全严重破坏皮肤的屏障功能。但是，何种因子参与脱核过程，另外在角质形成细胞分化中如何调控该过程，直至今日尚不十分明确。胱天蛋白酶是已熟知的程序性细胞死亡的细胞死实行因子，它们是进化过程中保守的半胱氨酸蛋白酶，在天冬氨酸残基的后方切割底物。根据其结构和功能将哺乳动物的胱天蛋白酶分为三个亚群，即开始胱天蛋白酶、实行胱天蛋白酶和炎症性胱天蛋白酶。实行胱天蛋白酶的重要作用是分解CAD (胱天蛋白酶活化型DNA酶)抑制物ICAD，结果是使CAD作为活性核酸酶游离出来(Enari M.等人，Nature 391，43-50 (1998))。胱天蛋白酶活性受多种分子调节。特别是三组与若干种胱天蛋白酶直接复合的抑制性蛋白质。杆状病毒抗程序性细胞死亡蛋白质P35除作用于丝氨酸和其它半胱氨酸蛋白酶12之外，还抑制胱天蛋白酶 1，-3，-6，-7，-8 和-10 (Zhou Q.等人，Biochemistry 37,10757-65 (1998)) 杆状病毒还合成其它抗程序性细胞死亡蛋白质、程序性细胞死亡蛋白质抑制物(IAP)。发现IAP同源体也存在于哺乳动物中(Verhagen A.M.等人，Genome Biol. 2，REVIEWS 3009 (2001)) 哺乳动物IAP通过抑制胱天蛋白酶14、或者通过拮抗促进程序性细胞死亡的促进因子例如DIABLO/Smac而阻断程序性细胞死亡(Wu G. Nature 408，1008-12 (2000))。细胞因子应答修饰因子A(Crm Α)为牛痘病毒基因产物，能够抑制程序性细胞死亡胱天蛋白酶和炎症性胱天蛋白酶(Garcia-Calvo M 等人，J. Biol. Chem. 273，3洸08_13 (1998))。令人感兴趣的是，已教导了 Crm A属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族，作为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的一部分，例如PI-9和PAI-I通过分别与胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶3的相互作用能够抑制程序性细胞死亡(Annand R. R.等人，Biochem. J. 342Pt3，655-65 (1999))。角质形成细胞的终末分化是否是程序性细胞死亡现象的一部分，另外，在此过程中是否有任意的调节蛋白质参与等令人感兴趣。胱天蛋白酶14是胱天蛋白酶家族的最新成员，发现存在于专门分化的角质形成细胞中。胱天蛋白酶14在胱天蛋白酶家族成员间作为同源的EST而鉴定。最新的研究显示，角化细胞中的胱天蛋白酶14经加工形成异二聚体，进而对胱天蛋白酶1对应的合成底物 Trp-Glu-His-Asp-AFC 显示酶活性(Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43，10560-9(2004))。此水解活性对于蛋白质分解切割和cosmotropic盐的存在是必要的。教导了虽然胱天蛋白酶14的一级结构与炎症性胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶1、-4和-5极为相似，但是限定于分化的角质形成细胞中的胱天蛋白酶14的表达以其它方式参与角质形成细胞终末分化(Lippens S.等人，Cell Death Differ. 7，1218-24(2000))。但是，尚不清楚胱天蛋白酶14的活化机制、天然底物和调节因子。发明的公开本发明人以阐明SCCA所参与的表皮生理学机制为目的进行研究之际有令人惊奇的发现，SCCA为具有抑制细胞程序性死亡作用的抗程序性细胞死亡因子。
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简而言之，本发明人进行了皮肤UV防御机制的研究，明确了由于对人皮肤的UV照射，棘层和颗粒层中SCCA的表达有力地增强。然后，在没有发现SCCA表达的3T3细胞中导入人SCCA-I和SCCA-2基因，建立稳定的表达体系。在调查SCCA稳定表达系细胞由于UV照射所致程序性细胞死亡时，发现在任一 SCCA稳定表达体系中，均显著减少由UV照射引起的程序性细胞死亡。进而，通过以pSilencer载体使siRNA在高表达SCCA的HaCat细胞中稳定表达的RNA干扰法，建立了 SCCA-I和SCCA-2的敲低(siSCCA)细胞株，细胞株经UV照射后，与对照株相比，SCCA敲低(knock down)细胞株的程序性细胞死亡率显著增高。根据以上结果，本发明人可以得出如下结论，SCCA是具有抑制程序性细胞死亡的蛋白质。对于癌症和牛皮癣等伴随细胞增殖和分化异常的疾病，认为是由于抑制了癌细胞等的程序性细胞死亡，避免了细胞死亡，而继续异常增殖。因此，在显示SCCA表达增强的细胞中，具有抗程序性细胞死亡作用的SCCA抑制该细胞死亡，作为结果就是该细胞的异常增殖。因此，明确了如果具有程序性细胞死亡抑制作用的SCCA的表达受到抑制，就能够治疗和预防鳞状上皮细胞癌和牛皮癣等伴随细胞增殖异常等的疾病。本发明借鉴上述观点，以提供治疗和预防伴随SCCA高表达细胞的增殖异常的疾病，例如癌症、特别是鳞状上皮细胞癌、进一步地是牛皮癣等的方法、药物组合物作为课题。进一步地，本发明阐明了表皮角化不全的机制，以开发与现有技术不同的全新方法来抑制和治疗表皮角化不全的手段作为课题。考虑到对于伴随角化不全的特应性皮炎、牛皮癣等皮肤病尚无特效药物，本发明对于皮肤科学、化妆品学领域的影响巨大。在第一观点中，本发明提供了通过抑制细胞的鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)的表达而治疗和/或预防选自牛皮癣和鳞状上皮细胞癌的疾病的方法。优选地，通过对编码SCCA的基因实施RNA干扰而抑制细胞的SCCA表达。在更合适的方案中，RNA干扰利用了这样的双链RNA，所述双链RNA由含有序列号1的寡核苷酸或其变体的有义寡核苷酸链和含有序列号2的寡核苷酸或其变体的反义寡核苷酸链组成。本文中，上述序列号1的寡核苷酸的变体具有在高严格条件下与编码SCCA的基因的第46 66位核苷酸杂交的序列，而上述序列号2的寡核苷酸的变体具有在高严格条件下与编码SCCA的基因的第46 66位核苷酸之互补链杂交的序列。在上述观点的其他方案中，本发明提供了通过抑制细胞的SCCA的表达而治疗和/或预防选自牛皮癣和鳞状上皮细胞癌的疾病的药物组合物。优选地，药物组合物含有这样的双链RNA，所述双链RNA提供对编码SCCA的基因进行RNA干扰的短链RNA。在更为合适的方案中，上述药物组合物含有这样的双链RNA，所述双链RNA由含有序列号1的寡核苷酸或其变体的有义寡核苷酸链和含有序列号2的寡核苷酸或其变体的反义寡核苷酸链组成。本文中，上述序列号1的寡核苷酸的变体具有在高严格条件下与编码SCCA的基因中第46 66位核苷酸杂交的序列，而上述序列号2的寡核苷酸的变体具有在高严格条件下与编码SCCA的基因中第46 66位核苷酸之互补链杂交的序列。在合适的方案中，上述双链RNA为在载体中例如在pSilencer载体中含有的形态。本发明进一步地提供了 SCCA表达受到抑制的细胞的制备方法。优选地，通过对编码SCCA的基因进行RNA干扰而抑制SCCA的表达。在更合适的方案中，RNA干扰利用了这样的双链RNA，所述双链RNA由含有序列号1的寡核苷酸或其变体的有义寡核苷酸链和含有序列号2的寡核苷酸或其变体的反义寡核苷酸链组成。本文中，上述序列号1的寡核苷酸的变体具有在高严格条件下与编码SCCA的基因的第46 66位核苷酸杂交的序列，而上述序列号2的寡核苷酸的变体具有在高严格条件下与编码SCCA的基因第46 66位核苷酸之互补链杂交的序列。本发明进一步地提供了通过上述方法使SCCA的表达受到抑制的细胞和含有该细胞的哺乳动物。因此，本发明提供了用于治疗和预防选自鳞状上皮细胞癌和牛皮癣的疾病的方法、药物组合物。进一步地，在其他观点中，本申请还包含以下的发明方案。[1]抑制表皮角化不全的物质的筛选方法，所述方法的特征在于以抑制鳞状上皮细胞癌抗原-I(SCCA-I)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候选物质的活性作为指标。[2] [1]的方法，其包括以下测试体系⑴、(2)、(3)(1)测定半胱氨酸蛋白酶的活性，得到其测定值[χ]；(2) i)将候选物质与酶活性同等量的前述(1)所述半胱氨酸蛋白酶混合，孵育；然后ii)在与前述(1)相同的条件下测定该的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活性，得出其测定值[y]；以及(3) i)将SCCA-I与等量的( i)中所使用的前述候选物质混合，孵育；ii)将该C3)i)孵育混合物与酶活性同等量的前述(1)所述的半胱氨酸蛋白酶混合，在与前述相同的条件下孵育；然后iii)在与前述(1)相同的条件下测定该(3)ii)的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活性，得出其测定值[ζ]；其中，如果满足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} >0，则确定前述候选物质具有抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性，从而选定为抑制表皮角化不全的物质。[3] [2]的方法，以满足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 3 为条件。[4] [3]的方法，以满足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 16 为条件。[5] [1]至W]中任意一项所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是胱天蛋白酶14。[6] [1]至W]中任意一项所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶。[7]抑制表皮角化不全的皮肤外用组合物，特别是美容学的皮肤外用组合物，其特征在于含有选自水烛提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黄瓜提取物、猕猴桃提取物和大枣提取物中的1种或几种生药作为活性成分。[8] [7]的皮肤外用组合物，其特征在于含有水烛提取物。[9] [7]或[8]的组合物，其中前述表皮角化不全是由牛皮癣引起的。[10] [7]或[8]的组合物，其中前述表皮角化不全是由特应性皮炎引起的。[11]通过抑制表皮细胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性而谋求表皮细胞角化的正常化、抑制表皮角化不全的方法。[12] [11]的方法，其通过向表皮涂抹含有选自水烛提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黄瓜提取物、猕猴桃提取物和大枣提取物中的1种或几种生药作为活性成分的皮肤外用组合物，抑制表皮细胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性。[13] [12]的方法，其特征在于前述皮肤外用组合物含有水烛提取物。因此，通过本发明，提供与现有技术不同的全新方法作为抑制和治疗表皮角化不全的手段成为可能。[14]以选自水烛提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黄瓜提取物、猕猴桃提取物和大枣提取物中的一种或几种生药作为活性成分的用途，用于制备抑制表皮角化不全的皮肤外用组合物，特别是美容学或化妆学的皮肤外用组合物。[15] [7]的用途，其中前述生药是水烛提取物。[16] [14]或[15]的用途，其中前述表皮角化不全是由牛皮癣引起的。[17] [14]或[15]的用途，其中前述表皮角化不全是由特应性皮炎引起的。附图简述
图1显示了在露光和非露光部位的表皮中SCCA的表达。图2显示了由UV照射引起的表皮中SCCA表达的变化。图3显示了培养的人角化细胞中UV照射对SCCA表达的影响。图4显示了对SCCA高表达细胞与不表达SCCA的细胞，比较由UV照射诱导的程序性细胞死亡率。图5显示了 SCCA敲低细胞株的建立。图6显示了比较SCCA敲低细胞和对照细胞由UV照射诱导的程序性细胞死亡率。图7显示了皮肤提取物的蛋白质印迹分析。通过使用H-99抗体和hl4D146抗体，利用免疫印迹法对酶原和活性胱天蛋白酶-14的存在进行分析。应用于10 μ g(泳道1，2和4)和1 μ g(泳道；3)的全皮肤提取物、皮肤等价提取物和角化细胞提取物。图8显示了纯化胱天蛋白酶-14的分析。(A)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将自Superdex 75层析得到的级分第25号转移至PVDF膜，然后考马斯亮兰染色。显示17Kda和IlKda两条蛋白质条带。(B)使用H-99、hl4D146和C20抗体进行的蛋白质印迹分析。17KDa条带对H99抗体和hl4D146抗体二者显阳性，而IlKDa条带显示可被C20抗体识别。图9显示了若干种合成抑制物对纯化胱天蛋白酶-14的的效果。胱天蛋白酶的肽抑制物(YVAD，VDVAD, DEVD, VEID，IETD，LEHD, DNLD)、以及半胱氨酸蛋白酶(IAA)和丝氨酸蛋白酶(AEBSF)的类特异性抑制物与胱天蛋白酶-14进行孵育。在1.3M柠檬酸钠和5mMDTT的存在下，使用WEHD-MCA作为底物，测定残留的酶活性。进行试验的酶浓度分别为5、2. 5和1. 25 μ Μ。数值以重复测试的平均值表示。图10 (A)显示了纯化胱天蛋白酶-14对ICAD的切割活性。(B)显示了使用FL331抗体的蛋白质印迹分析。显示3!3Kda和27Kda的切割产物。通过使用10 μ M SCCA-I进行前孵育，ICAD的切割被完全抑制。只有在cosmotrophic盐存在的情况下，可观察到ICAD被分解。使用针对氨基末端的特异性抗体进行蛋白质印迹分析显示，与胱天蛋白酶14进行延长的孵育，完整的ICAD分子消失。向混合物中加入SCCA-I，也已经检测不到ICAD分解，经16小时孵育后，仍丝毫未受影响(B)。(C)显示了在cosmotropic盐存在的情况下，对合成的胱天蛋白酶底物的水解活性的调查结果。图11显示了活性胱天蛋白酶-14和TUNEL阳性细胞的定位。用H_99抗体㈧、
7hl4D146抗体(B)和TUNEL(C)对正常人皮肤的薄切片进行染色。使用Texas-Red用于检测荧光(B)。FITC用于TUNEL，Texas Red用于免疫染色，对TUNEL和胱天蛋白酶实施双重染色。图12显示了 ICAD和角化不全核的共定位(co-localization)。用抗ICAD抗体FL331对正常人皮肤的薄切片进行染色。下表皮的几乎所有核对该抗体显阳性。来自AD患者皮肤的角化细胞表在层上的ICAD用抗体进行染色时，显示出不同大小的阳性部位(B)。通过显示核簇的碘化丙啶(PI)常常观察到核染色(C)。相同部位的明视野显示出表面上的重叠范围(D)。重叠图像明确了 ICAD仅存在于角化不全部位(E)。在明视野中也显示了核染色的重叠图像(F)。图13显示了 SCCA-I和角化不全核的共定位。正常的皮肤切片内几乎不可能检出SCCA-1。在AD患者皮肤的表在层，显示了 SCCA-I阳性部位(H)。仅在这些部位上可观察到核簇(I)。明视野如(J)所示。显示了重叠图像是SCCA-I阳性部位与优选地未消化核存在部位的重叠(K)。还显示了与SCCA-I染色和明视野相应的其他重叠图像(L)。 用于实施发明的最佳方式^^^mm / mmt hm^mmmw^本发明人阐明了 SCCA是具有抑制程序性细胞死亡作用的蛋白质。因此，明确了通过抑制SCCA的表达，能够治疗和预防癌和牛皮癣等伴随鳞状上皮细胞癌抗原表达的细胞的增殖和分化异常的疾病。鳞状上皮细胞癌是位于例如子宫颈、肺、食道、上颚、皮肤等器官的鳞状上皮细胞癌。SCCA是在上述鳞状上皮癌细胞和牛皮癣表皮中存在的分子量约45，000的蛋白质。SCCA-I和SCCA-2的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列如Takeda A等人J. Invest.Dermatol. 118，147-154(2002)(见上文)所述。通过多种遗传学技术，例如RNA干扰法、反义RNA *DNA法、肽及RNA *DNA适配子、位点特异性删除、同源重组、显性失活等位基因、胞内抗体等多种技术，可达到抑制细胞SCCA的表达，特别优选地是通过RNA干扰法。RNA干扰法是通过向细胞导入这样的双链RNA从而抑制目的基因表达的方法，所述双链RNA由包含与编码部分目的基因的部分mRNA互补的约21至23个碱基对的有义寡核苷酸链和包含与上述部分mRNA同源的约21至23个碱基对的反义寡核苷酸链构成。由于该方法是基于源自基因编码区的双链RNA的干扰特性，已在线虫的遗传学研究中证明了具有极好的有用性(Fire等，Nature (1998) 391 :806-811)，也能够用于在果蝇和哺乳动物中产生功能缺损表现型。在本方法中体外合成这样的双链RNA(dsRNA)，所述双链RNA由与SCCA基因适当的目的区域优选地长度约18至23个核苷酸的区域互补的序列(有义寡核苷酸)和与该有义序列互补的长度约18至23个核苷酸的序列(反义寡核苷酸)组成。优选地，双链RNA由含有与SCCA基因的第46 66位核苷酸序列之互补序列(ACATGAACTTGGTGTTGGCT T 序列号1)的有义寡核苷酸和含有与上述第46 66位核苷酸序列同源的序列(AAGCCAACACCAAGTTCATG T ；序列号幻的反义寡核苷酸组成。对于所有有义及反义寡核苷酸的长度无特别限定，例如25个核苷酸或以上至100个核苷酸以下，优选地40个核苷酸或以上至80个核苷酸以下，更加优选地50个核苷酸或以上至70个核苷酸以下。
有义寡核苷酸也可以是含有序列号1的寡核苷酸的变体的寡核苷酸。该变体优选地具有在高严格条件下与编码SCCA的基因的第46 66位核苷酸杂交的序列。另外，反义寡核苷酸也可以是含有序列号2的寡核苷酸的变体的寡核苷酸。该变体优选地具有在高严格条件下与编码SCCA的基因第46 66位核苷酸之互补链杂交的序列。文中所述的高严格杂交条件包括，例如钠浓度约10至40mM、优选地约20mM、温度约50至70°C、优选地约60至65 °C的条件。获得的双链RNA可以直接导入目标细胞，或者也可以预先将dsRNA与携带启动子、终止子等转录元件的载体连接后导入细胞。作为载体，可以使用本领域技术人员公知的各种载体，优选PSilencer载体(Ambion)。通过向细胞导入含有上述双链RNA的载体，通过细胞内转录，产生了序列号1(或其变体)的有义链和序列号2 (或其变体)的反义链以及其有义链和反义链连结的短发夹RNA(shRNA)。shRNA随后被细胞内的核酸酶-切丁酶切割成约21至23个碱基对的短链RNA(short interfering RNA)，复合体RISC形成后，引起切割SCCAmRNA的RNA干扰，结果是通过导入细胞抑制了 SCCA的表达。合适地，本发明中使用SCCA表达抑制基因例如上述双链RNA和其他抑制SCCA表达的基因如反义DNA或RNA、适配子RNA或DNA等(以下简称为“SCCA表达抑制基因”)作为用于抑制SCCA表达，结果预防和治疗牛皮癣和鳞状上皮细胞癌的药物组合物的活性成分。上述SCCA表达抑制基因通过注射直接施与，也可以通过施与整合有所述基因的载体或质粒的方法而施与患部。作为上述载体可例举有腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等，通过使用这些病毒载体，能够更有效地施与SCCA表达抑制基因。另外，可以采用向脂质体等磷脂小泡内导入SCCA表达抑制基因，施与该脂质体的方法。由于脂质体是含有生物分解性材料的闭锁小泡，通过脂质体和基因的混合，使基因保留在脂质体内部的水层和脂质双分子层中(脂质体-基因复合体)。然后，该复合体与细胞共同培养，复合体中的基因摄入至细胞内(脂质转染法)。然后，将得到的细胞按照以下的施与方法进行施与。作为上述药物组合物的施与方式，除常规的静脉内、动脉内等全身施与之外，还可以对存在肿瘤和牛皮癣的各组织进行局部施与。进一步地，还可采用导管技术、外科手术等组合的施与方式。本发明的药物组合物的施与量根据年龄、性别、症状、施与途径、施与次数、剂型不同，由医师等决定合适方式。将质粒DNA直接向静脉内施与，由于DNA被血液中的DNase等立即分解，使基因表达是困难的。因此，使用质粒DNA的情况下，优选地采用质粒的直接注射法。该方法与使用病毒性载体的方法相比较，由于载体纯化简单，能够在短时间内大量制备、对于导入基因的大小和注入时的浓度无限制，具备很多优势(Verma I M等人，Nature 389 =239-242,1997) 0DNA直接注射法是将经纯化的质粒DNA在生理盐水等中溶解，仅将其直接进行肌肉内注射即可。其结果是质粒DNA被摄入至注射部位周边的细胞中，整合至质粒上的真核生物表达单元的基因产生表达，产生该基因产物。关于DNA直接注射法，现今肌肉内注射正成为主流，也可以向肿瘤内(Yang J P等人，Gene.Ther.3 :542-548，1996)、皮内(HenggeU R 等人，J. Clin. Invest. 97 :2911-2916,1996 ；Choate K A 等人，Hum. Gene. Ther. 8 1659-1665,1997)等直接注射质粒DNA。
肌肉内注射质粒DNA为例如将1 μ g至lmg，优选地25 μ g至100 μ g的DNA溶解于50 μ 1的生理盐水，进行注射。由此4至7日后得到表达的最高值。确认SCCA的表达抑制可通过例如直接测定细胞中的SCCA的量进行。优选地，通过从细胞中提取RNA，测定编码SCCA的mRNA的量而确定。本领域公知mRNA提取、其量的测定，例如通过定量聚合酶链反应(PCR)进行RNA的定量。另外，可利用SCCA特异性抗体进行SCCA的测定，可通过本领域公知的例如利用荧光物质、色素、酶等的免疫染色法，蛋白质印迹法，免疫测定法，例如ELISA法、RIA等多种方法进行SCCA的测定。除上述之外，还可以通过测定SCCA已知的生物活性，测定SCCA的表达量。除此之外，SCCA的表达可以通过原位杂交法和测定其生物活性来确定。通过本发明抑制SCCA表达的细胞优选地为表皮细胞，例如颗粒细胞、有棘细胞等也行。另外，作为具有该细胞的哺乳动物，除了人之外还有小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、猿猴等非人哺乳动物。本发明的动物和细胞还可以作为如下用途的模型动物和细胞，用于例如阐明表皮的UV防御机能、预防或抑制UV对皮肤伤害的药物的研究/开发以及筛选。抑制角化不全的物质的筛诜方法、通过该方法筛诜到的物质和角化不全的抑制方法牛皮癣是皮肤病中的一种，是以表皮细胞的增殖/分化异常和炎症细胞浸润为特征的慢性、再发性的炎症性角化不全症。认为牛皮癣除遗传因素之外还因多种环境因子而发病(Hopso-Havu 等人，British Journal of Dermatology (1983) 109，77-85)。SCCA 是由染色体18q21. 3上串联排列的两个基因SCCA-I基因和SCCA-2基因编码。由它们编码的蛋白质SCCA-I和SCCA-2均为分子量约45，000的蛋白质，同源性非常高，但是二者反应部位的氨基酸序列不同，具有不同的功能Gchick等人，J.Biol. Chem. (1997) 27213，1849-55)。本发明的抑制表皮角化不全的物质的筛选方法是以候选物质的如下活性为指标，即抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。作为半胱氨酸蛋白酶，理想地是，使用胱天蛋白酶14是最优选的，也可以用其它胱天蛋白酶家族，或者从方便获取的角度考虑可以用公知的所有其它半胱氨酸蛋白酶例如木瓜蛋白酶，组织蛋白酶例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶L，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶等替代。在合适的方案中，上述筛选方法由如下测试体系(1)、(2), (3)组成，其中测试体系(1)为测试半胱氨酸蛋白酶的活性的体系；测试体系(2)为仅有候选物质存在下，测试半胱氨酸蛋白酶的活性的体系；测试体系( 为将候选物质和SCCA-I预先孵育，在该孵育混合物存在下测试半胱氨酸蛋白酶的活性的体系。由于包括测试体系O)，能知道候选物质自身对半胱氨酸蛋白酶的影响。再者，对测试体系(1)、(2)、(3)的实施顺序无特别限制，只要测试条件相同，也可以在相同日期或不同日期测试。测定半胱氨酸蛋白酶的酶活性可以通过本领域技术人员公知的方法进行，使用作为半胱氨酸蛋白酶的底物习惯使用的例如N α -苯甲酰基-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(L-BAPNA)。在特别合适的方案中，该筛选方法可以按照以下的方式进行。(1)测试半胱氨酸蛋白酶的活性的体系在适当的测试用缓冲液，例如HEPES缓冲液中将半胱氨酸蛋白酶按照所设定的时间进行孵育。然后，添加半胱氨酸蛋白酶的底物例如L-BAPNA，在所设定的温度下按照所设定的时间进行孵育后，使显色，测定半胱氨酸蛋白酶的酶活性[X]。(2)仅有候选物质存在下，测试半胱氨酸蛋白酶的活性的体系将上述测试用缓冲液和候选物质按照所设定的时间进行孵育后，添加半胱氨酸蛋白酶，在与(1)相同的条件下测定半胱氨酸蛋白酶的活性[y]。求出该半胱氨酸蛋白酶酶活性[y]相对于上述[χ]的％ {[y]/[χ] χ 100}ο{[y]/[χ] X 100}的值成为衡量上述试验物质具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的指标，即该值越接近100，则表示试验物质具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低。另外，求出100与上述{[y]/[χ] X 100}值之间的差值{100-[y]/[x]X100}。这种情况下，该值越接近0，则表示试验物质具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低。(3)测定含有SCCA-1、候选物质和半胱氨酸蛋白酶的体系的酶活性将上述测试用缓冲液与SCCA-I混合，然后加入候选物质，按照所设定的时间进行孵育。在与(1)或( 相同的条件下测定半胱氨酸蛋白酶的活性[Z]。求出该半胱氨酸蛋白酶酶活性[ζ]相对于上述[χ]的％ {[ζ]/[χ] X 100}ο{[ζ]/[χ] X 100}值成为衡量SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性和试验物质自身具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性总计的指标，即该值越接近100，其总抑制活性越低。最后，求出{[ζ]/[χ] X 100}与{100-[y]/[x]X100}的差值。该差值越大，则在含有SCCA-1、候选物质和半胱氨酸蛋白酶的体系中，SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低，即提示候选物质显著抑制SCCA-I的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。推定通过上述方法筛选的物质具有抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性效果，进而具有角化不全抑制功能，很有可能作为有效的角化不全抑制剂。这样的物质角化不全抑制功能的确认，可应于发生角化不全的皮肤例如模型动物的皮肤，能够简便地观察治疗效果。因此，本发明的筛选方法作为从众多候选物质例如生药中一次筛选出表皮角化不全抑制物的方法是极为有用的。被认为是角化不全的症状包括例如牛皮癣、特应性皮炎、汗腔角化症、日光角化症、脂漏性角化症、扁平鳞癣等皮肤疾病，因此，通过本发明所述的筛选方法被选出的物质对治疗/预防上述皮肤病是有用的。本发明人通过上述筛选方法探讨了各种生药抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的效果，发现水烛提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黄瓜提取物、猕猴桃提取物和大枣提取物具有如上抑制效果。因此，在其它观点中，本发明提供了抑制表皮角化不全的皮肤外用组合物，其特征在于含有选自水烛提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黄瓜提取物、猕猴桃提取物和大枣提取物中的一种或几种生药作为活性成分。这些来自植物的提取物通过如下方式得到，即根据需要对植物原材料进行干燥，进而根据需要进行切细或粉碎后，通过水性提取剂或有机溶剂进行提取。作为水性提取剂可使用例如冷水、温水、沸水或较之低温的热水，另外，作为有机溶剂可使用例如甲醇、乙醇、1，3- 丁二醇、醚等，可常温下或加热后使用。本发明所述的外用组合物可以任意选择使用1种或2种以上的上述提取物。上述提取物的含量优选地为前述外用组合物总量的0. 001 20. 0质量％，更为优选地为0.01 10.0质量％。特别优选地为0. 1 5.0质量％。含量不满0.001质量％时，会出现本发明效果无法充分发挥的情形；另一方面，含量超过20.0质量％时，会出现制剂化困难而不优选。本发明的外用组合物通过常规方法制备即可，另外，也可制备单独的上述提取物，但是除了上述提取物之外，通常用于化妆品和医药品等皮肤外用剂的成分例如油分、表面活性剂、粉末、色材、水、保湿剂、增粘剂、醇类、各种皮肤营养剂、抗氧化剂、紫外线吸收齐U、香料、防腐剂等可以根据需要适当地配合。此外，也可以适当地配合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属螯合剂，咖啡因、鞣酸、异搏定及其衍生物，甘草提取物、光甘草定、火棘果实的热水提取物、各种生药、醋酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等的药剂，维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等的美白剂，葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖类，视黄醇、视黄酸、视黄醇醋酸酯、视黄醇棕榈酸酯等的维生素A类等。本发明的外用组合物可以作为化妆用品、准药品等，特别适合作为化妆用品用于外表皮肤，其剂型可采用如下多种剂型，水溶液体系、可溶化体系、乳化体系、粉末体系、油液体系、凝胶体系、软膏体系、气溶胶体系、水-油2层体系、水-油-粉末3层体系等。即如果是基础化妆品，可以洗面产品，化妆水，乳液，面霜，凝胶，香精(美容液)，面膜，敷面膏等形式广泛采用上述多种剂型。另外，如果是化妆用化妆品，可以以粉底等形式，作为洗护用品，可以以沐浴液、肥皂等形式而广泛应用。进一步地，如果是准药品，可以以各种软膏剂等形式广泛应用。因此，本发明的外用组合物采取的形式并不限定于上述剂型和形式。本发明进一步地提供了通过抑制表皮细胞中SCCA-I所具有的胱天蛋白酶14抑制活性而谋求表皮细胞角化的正常化，抑制表皮角化不全的方法。被认为是角化不全的症状如上所述，可例举如牛皮癣、特应性皮炎、汗腔角化症、日光角化症、脂漏性角化症、扁平鳞癣等皮肤疾病。优选地，将本发明的皮肤外用组合物应用于皮肤，对其用法、用量无特别限定，可根据皮肤外用组合物的剂型和所处置皮肤的角化不全状态作出适宜的决定。下面，通过列举具体实施例，更具体地说明本发明。并且，本发明并不受这些实施例的限制。
实施例(ι) m^rr^mm /(1-i)免疫组织化学检查表皮活组织检查按照AmeX步骤进行(Sato Y等人，Am. J. Pathol.，125，431-435(1986))，用冷丙酮固定后包埋于石蜡中。用二甲苯对切片进行脱石蜡处理，用丙酮，然后用PBS洗涤。然后，用10%正常兔血清(Histofine，Tokyo, Japan)封闭该切片的非特异性结合部位。将表皮切片分别与抗SCCA-I 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(稀释为 1 500)、抗 SCCA-2 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)(稀释为 1 500)或抗 SCCA 多克隆抗体(如 Takeda A.等人，J，Invest. Dermatol. 118,147-154(2002)中记载的方式纯化)孵育。用PBS洗涤后，将切片用苏木精复染，用DAKOEnvision System(DAK0 Corp.，CA，USA)进行观察。
图1是收集自非露光部位的上臂部位(人M岁)，臀部(人46岁)，大腿部位(人75岁)获得的表皮，以及自露光部位的颊部(人20岁，76岁)，眼睑(人82岁)获得的表皮作为表皮样本，使用与SCCA-I和SCCA-2 二者结合的抗SCCA多克隆抗体作为抗体，进行显微镜观察的结果。根据图1，表明了与非露光部位相比，露光部位的表皮上层中SCCA显著增强。但是，即使在露光部位，也没有发现基底层中SCCA表达的增强。图2是作为表皮样本，对实施了 UV照射(透射仪TOREX FL205-E-30/DMR(ToshibaMedical Supply)的人表皮和没有实施照射的对照表皮中分别的SCCA-I和SCCA-2的表达的显微镜观察结果。分别使用抗SCCA-I单克隆抗体和抗SCCA-2单克隆抗体作为抗体。根据图2，清楚了通过对人表皮照射UV，使SCCA-I和SCCA-2的表达均被增强。此外，在皮肤有棘层和颗粒层中表达增强显著。根据上述内容，清楚了如果表皮受到UV照射，在表皮中，尤其是在其有棘层和颗粒层中SCCA-I和SCCA-2的表达被增强。α-ii)定量 PCR 实验接着，进行基因水平确认表皮中SCCA-I和SCCA-2的表达由于UV照射而被增强的实验。在角质形成细胞-SFM培养基(GIBCO，Invitrogen)中，在L-谷氨酰胺和上皮细胞生长因子存在下，在高湿度，5% CO2环境下，于37°C培养人角化细胞，对集密度为60-70% 的细胞照射 UVB 0-48 小时。使用透射仪 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba MedicalSupply)，以50mJ/cm2的强度进行UVB照射。对照细胞不进行UVB照射。使用Isogen(Nippon Gene)，按照所附的说明书，从上述培养细胞中分离纯化总RNA。通过定量实时聚合酶链反应法(PCR)确定SCCA-I和SCCA-2各自的表达水平。简而言之，用 Superscript II Qnvitrogen, Carlsbad，CA)使总 RNA 转变为 cDNA。用 ABI PRISM7900HT 测序检测系统(Applied Biosystems, Foster City，CA)，进行 40 个 2-步骤 PCR 循环，使所述样本扩增。使用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内部标准。使用的引物如下所示。SCCA-I 正向引物5' -GTGCTATCTGGAGTCCT-3‘(序列号 3)反向引物5' -CTGTTGTTGCCAGCAA-3‘(序列号 4)Taq Man 探针5' -CATCACCTACTTCAACT-3‘(序列号 5)SCCA-2 正向引物5' -CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3‘(序列号 6)反向引物5 ‘ -TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3 ‘(序列号 7)Taq Man 探针5' -AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3‘(序列号 8)
GAPDH 正向引物5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3‘(序列号 9)反向引物5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3‘(序列号 10)Taq Man 探针5 ‘ -AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ‘(序列号 11)使报告色素(6-羧基-荧光素)与Taq Man探针序列的5’末端结合，然后使淬火色素(6-羧基-四甲基-罗丹明)整合入其3’末端。图3中显示了 UVB照射对培养的人角化细胞中SCCA表达的影响的结果。表明SCCA-I, SCCA-2均由于UVB照射而增强表达。因此，清楚了表皮细胞由于UV照射，在基因水平上SCCA-I，SCCA-2的表达增强。研究UV照射中SCCA的作用根据上述内容，清楚了在表皮细胞中由于受到UV照射，SCCA-I和SCCA-2的表达增强。然后，研究了 SCCA-I和SCCA-2在受UV照射的表皮细胞中起什么作用。(1-iii) SCCA-I和2高表达细胞的建立3T3细胞(由ATCC获得)是不表达SCCA-I和2的小鼠胎儿来源的细胞。以如下所述方式将编码SCCA-I或2的基因导入到这种细胞中。用Bam HI 和 Kpn I 双重消化 SCCA-1 和 SCCA-2 的 cDNA (Takeda A 等人，J. Invest.Dermatol. 118,147-154(2002)) 将其亚克隆到 pTarget 载体中，然后用 LipofectaminePlus (GIBCO, Invitrogen Corp.)导入到3T3细胞中。简而言之，将675 μ 1无血清DMEM培养基Qnvitrogen Corp.)中的20 μ g cDNA与75 μ 1的Plus试剂混合，于25°C放置15分钟。向650 μ 1无血清DMEM培养基中添加Lipofectamine (100 μ 1)，然后将其加入到上述cDNA-Plus混合物中，然后于25°C放置15分钟。将该cDNA混合物添加到IOml无血清DMEM培养基中，然后于37°C，5%C02环境下在其中培养3T3细胞4小时。将该培养基换成含有10% FCSdnvitrogen Corp.)的DMEM培养基，然后培养过夜。第二天，以500 μ g/ml的终浓度添加G418 (Calbiochem)。培养期间G418保持在该浓度。每2_3天更换培养基。培养4周后，可以分离出若干G418抗性克隆，建立SCCA-I和SCCA-2表达细胞系。确认导入了编码SCCA-I的cDNA的细胞(SCCA-1导入细胞)特异且稳定地表达SCCA-I,并确认导入了编码SCCA-2的cDNA的细胞(SCCA-2导入细胞)特异且稳定地表达SCCA-2。此外，通过同样的操作导入了非特异性序列的3T3细胞(对照细胞)既不表达SCCA-I，也不表达 SCCA-2。采用上述SCCA-I导入细胞、SCCA-2导入细胞和对照细胞，对表皮细胞施与UV照射时的SCCA-I、SCCA-2所产生的作用进行研究。具体而言，研究了 SCCA-I、SCCA-2对于表皮细胞中UV诱导的程序性细胞死亡的作用。在含有10% FCS的DMEM培养基中，在高湿度、5% CO2环境下，于37°C培养上述各种细胞。对集密度为60-70%的细胞照射UVB 0-48小时。使用透射仪TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)，以 50mJ/cm2 的强度进行 UVB 照射。对于这些细胞的程序性细胞死亡评价，使用FACS COULTER(EPIX XL-MCL，BeckmanCoulter)，通过以膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双重染色法(Armexin V-FITC试剂盒，Immunotech)作为指标的FACS(荧光活性细胞分选仪)分析来进行。结果如图4所示。如图4清楚所示，SCCA-I和SCCA-2导入细胞均发现因UV照射引起的程序性细胞死亡显著减少。因此，推定SCCA-I和SCCA-2均能够抑制由UV诱导的程序性细胞死亡。为了确认这一点，本发明人接下来通过RNA干扰法建立了 SCCA-I和SCCA-2敲低的细胞株，进而对于表皮细胞内的SCCA-I和SCCA-2在UV照射中的作用进行研究。(1-iv)建立SCCA敲低的细胞HaCat 细胞(H. Hans.等人，Experimental Cell Research 239,399-410(1998))是高表达SCCA的人角化细胞。通过按照RNA干扰法，以pSilencer载体(Ambion)使siRNA(小干扰性RNA)在这种细胞中稳定表达，建立SCCA-I和2敲低的细胞株。采用pSilencer载体，按照所附说明书构建siRNA。详细的是，将这样的双链寡核苷酸克隆入pSilencer载体的HindIII部位和BamH I位点，所述双链寡核苷酸由含有与编码SCCA的基因中第46-66位核苷酸互补的21mer寡核苷酸(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T 序列号1)的65mer有义寡核苷酸(序列号1 和含有与第46-66位核苷酸同源的21mer寡核苷酸(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T 序列号2)的65mer反义寡核苷酸(序列号13)组成。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，按照所附说明书进行对HaCat细胞的转染。使用这样的双链寡核苷酸制备对照细胞，所述双链寡核苷酸由与哺乳动物的基因序列不具有显著同源性、互补性的两条寡核苷酸组成。在潮霉素B选择培养基中对转染细胞培养4-6周，通过进行选择从而获得稳定的细胞系。为了确认SCCA的表达是否受到抑制，以上述方式，通过实时PCR测定SCCA-I和SCCA-2的表达。有义寡核苷酸(序列号12)GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGAACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA(下划线部分是同源区域)反义寡核苷酸(序列号13)AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGTTCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG(下划线部分是互补性区域)结果如图5所示。确认导入了上述siRNA的细胞中，与对照细胞相比，SCCA-I和2的表达均被抑制(敲低)90%以上。使用上述敲低细胞和对照细胞，研究了 SCCA-I和2对表皮细胞中UV诱导的程序性细胞死亡的作用。在角质形成细胞-SFM培养基中(GIBCO，Invitrogen)，在L-谷氨酰胺和上皮细胞生长因子存在下，在高湿度，5% CO2环境下，于37°C培养上述各种细胞。对集密度为60-70% 的细胞照射 UVB。使用透射仪 TOREX FL205-E-30/DMR (Toshiba Medical Supply),以50mJ/cm2的强度进行UVB照射。使用FACS COULTER,通过以膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)双重染色法作为指标的FACS (荧光活性细胞分选仪)分析来进行对于这些细胞的程序性细胞死亡评价。14/23 页结果如图6所示。对敲低细胞进行UV照射，结果表明与对照细胞中38%的细胞发生程序性细胞死亡相反，敲低细胞中约80%的细胞发生程序性细胞死亡。因此，认为SCCA显著抑制由UV照射诱导的表皮细胞的程序性细胞死亡。因此，清楚了 SCCA承担着表皮细胞的UV防御机制，另外，SCCA是具有程序性细胞死亡抑制作用的蛋白质。(2)抑制角化不全的物质的筛诜方法、通过该方法筛诜出的物质和角化不全抑制方法(2-i)材料和方法材料Ac-WEHD-MCA, Ac-YVAD-MCA, Ac-VDVAD-MCA, Ac-DEVD-MCA, Ac-VEID-MCA,Ac-IETD-MCA、Ac-LEHD-MCA 购自 P印tide Institute, Inc.(日本、大阪府)。苄氧羰基(X)-YVAD-FMK, Z-VDVSD-FMK、Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK 及 Z-VAD-FMK 购自 BioVision (Mountain View, CA)。重组胱天蛋白酶 10购自 BIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA)。H-99抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc)用于胱天蛋白酶14的酶原形和大亚单位的检测。H-99抗体是人胱天蛋白酶14中M-122位氨基酸所对应肽产生的抗体，因此，可与胱天蛋白酶14酶原和其经加工的形态即其大亚单位反应。C-20抗体(Santa Cruz)用于胱天蛋白酶14小亚单位的检测。开裂部位特异性抗体(hl4D146)为使用对应于人胱天蛋白酶14的推测加工部位的合成五肽TVGGD，通过对兔实施免疫而获得的。(2-ii) WEHD-MCA水解活性的测定将Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43,10560-9(2004)所述的方法进行或多或少的变更，以Ac-WEHD-MCA作为底物，测定胱天蛋白酶14的活性。简而言之，以45 μ L的0. IM HEPES 缓冲液(ρΗ 7. 5)、0· 06Μ NaCl、0. 01 % CHAPS、5mM DTT、1. 3M 柠檬酸钠禾口 10 μ MTOHD-MCA制作测试混合物(全部以最终浓度表示)。向该混合物中加入酶样品(5μ 1)，孵育10至30分钟。加入150 μ 1的0. IM —氯代乙酸使反应中止，然后，使用Fluoroskan AscentFL (Thermo Electron Co.，WoIsam, MA)于:355nm激发波长和460nm发射波长处进行测定。对抑制物进行测试时，将胱天蛋白酶14和肽抑制物室温下于测试缓冲液中孵育15分钟，然后加入5 μ 1的100 μ M WEHD-MCA开始测试。(2-iii)胱天蛋白酶14的纯化从正常人的脚后跟部擦取的人角化细胞(约14g)于玻璃勻浆器中用含有0. 14MNaCl的0. IM Tris-HCKpH 8.0)进行提取。15，OOOg离心60分钟后，得上清液。用Amicon Ultra (Millipore, ΜΑ)进行浓缩，经快速脱盐柱 HR10/10 (Amersham Biosciences)脱盐后，将粗产物涂于Hift^p 16/10QXL柱。用20mM Tris-HCl (ρΗ 8.0)清洗柱子，经0至IM线性NaCl梯度洗脱。通过使用抗胱天蛋白酶14抗体(H-99) (Santa CruzBiotechnology, CA)和hl4D146抗体的蛋白质印迹分析对级分进行追踪。另外，测定各级分对 Ac-Tyr-Glu-His-Asp-甲基-香豆酰胺(WEHD-MCA) (P印tide Institute, Inc.日本国大阪)的水解活性。将显阳性的级分上样于经同样缓冲液平衡过的Mono Q柱，用最大IM的NaCl梯度进行洗脱。胱天蛋白酶14级分进一步地通过Mono S阳离子交换层析分离。用20mM醋酸缓冲液(pH4. 5)对柱进行平衡，然后用0至IM的NaCl梯度进行洗脱。将显阳
16性的级分进行浓缩，然后将其上样于经25mM乙醇氨(pH 8. 3)平衡的层析聚焦Mono P柱。使用46ml Polybuffer (pH 5. 0)，一边形成pH 8至5的pH梯度，一边进行洗脱。胱天蛋白酶14使用Superdex 75凝胶层析进行最终的纯化。蛋白质浓度由BioRad Protein AssayKit(BioRad Lab, Hercules, CA)确定。(2-iv)重组胱天蛋白酶14和SCCA-I的制备使用正向引物AAGGATCCAATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG(序列号14)和反向引物TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (序列号 1 通过 PCR 将编码胱天蛋白酶14的cDNA从角质形成细胞cDNA中分离并扩增。将PCR产物克隆入pQE_100DoubleTag载体Oliagen，Valencia, CA)中，随后在大肠杆菌JM109中表达。从牛皮癣cDNA文库(Takeda A等人，J. Invest. Dermatol. , 118,147-54(2002))中分离 SSCAl cDNA，然后克隆入 pQE30 载体(Quiagen)。通过 Ni-NTA Agarose (Quiagen)和Mono Q层析纯化重组蛋白质。(2-v)免疫组织化学经患者同意后，通过外科整形手术取得人头皮试验片。将组织在磷酸缓冲液(PH7.4)中的4%低聚甲醛(PFA)固定，石蜡包埋。制备薄切片，于4°C放置一晚后与适宜的抗体一起孵育。使用连接有过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Nichirei公司生产)作为二次抗体，与作为显色试剂的DAB反应。进行TUNEL阳性细胞和活性胱天蛋白酶的双重免疫检测时，使用连接有TexasRed(注册商标)色素的抗兔IgG(驴)作为二次抗体。使用荧光素原位细胞死亡检测试剂盒(Roche Diagnostics)，按照制备商提供的说明书实施TUNEL反应。进行ICAD的蛋白质印迹和免疫组织化学分析时，使用抗ICAD IgG(FL331，SantaCruz Biotechnology)禾口 DFF45/ICAD Ab_2(NeoMarkers, Fremont, CA)。有报道称在活性特应性皮炎(AD)患者的皮肤内常常观察到簇化的角化不全(Sakurai K.等人，J. Dermatol, ki. 30，37-42 (2002) ；Piloto Valdes, L.等人，Allergol.Immunopathol. (Madr) 18，321-4 (1990))。本实验中使用非侵入方法研究角化不全皮肤中ICAD和SCCA-I的定位。从AD或正常志愿者的皮肤收集表在性角化层，然后使用医用粘着剂Aron Alpha A(Sankyo Co. ,Tokyo)使其附着于载玻片上。用3%低聚甲醛固定后，将样品用0. 1% Triton X-100浸透，之后该样品用抗ICAD或抗SCCA-I抗体于4°C免疫染色过夜。分别将Alexa Fluor 400接合型抗兔(ICAD)或抗小鼠IgG(SCCA-I)作为二次抗体，室温孵育1小时。为了便于对核进行视觉化观察，将样品在0. 碘化苯基偶氮二氨基吡啶溶液中浸润5分钟，之后用PBS清洗3次。使用Leica DMLA显微镜进行荧光观察。(2-vi)蛋白质印迹分析利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法，通过5至20%梯度的凝胶分离蛋白质。电泳后，将蛋白质转移至聚乙烯赖氨酸二氟化物膜(Immobilon-P、Millipore，Bedford, ΜΑ)上，之后与含有H-99，hl4D146或C20的抗胱天蛋白酶14抗体一起孵育。使用过氧化物酶标记的抗兔IgG(Sigma)或抗山羊IgG作为二次抗体，之后使用ECL_pIus (Amersham)通过化学发光法使免疫反应性蛋白可见。(2-vii)结果角化细胞中的胱天蛋白酶14为在Aspim处被加工
通过蛋白质印迹分析，H-99抗体只能检测出角化细胞提取物中的17KDa条带(图8)。该结果与含有未经加工的30Kda结构的来自全皮肤或皮肤等价模型的提取物的结果不一致。用hl4D146抗体也可识别该17KDa条带(图8B)，推测是活性胱天蛋白酶14(pl7)的大亚单位。这提示在终末分化的最终阶段中通过Asp146的开裂完成胱天蛋白酶14的成熟。进一步地，在皮肤等价模型中，也可通过H-99和hl4D146抗体识别30KDa条带，这提示在Asp146进行了切割。(2-viii)自角化细胞提取物制备胱天蛋白酶14角化细胞中的胱天蛋白酶14的大部分是经加工过的结构，因此，推测以活性型存在(Eckhart L.等 A, ]. Invest. Dermatol. 115,1148-51 (2000) ；Lippens S.等人，Cell Death Differ. 7,1218-24(2000) ；Mikolajczyk, J.等人，Biochemistry 43，10560-W2004))，从而认为人角化细胞是极好的胱天蛋白酶14纯化源。但是，还知道人角化细胞含有胱天蛋白酶 1 样酶(Takahashi T.，J. Invest. Dermatol. Ill, 367-72 (1998)) 胱天蛋白酶1的底物，例如WEHD-底物能够被胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶14 二者水解。本发明人首先在有无1. 3M柠檬酸钠和5mM 二硫苏糖醇存在下，试验由胱天蛋白酶1引起的水解TOHD-MCA。明确了在标准胱天蛋白酶测试缓冲液中，尽管TOHD-MCA是胱天蛋白酶1的极好底物，但存在cosmotropic离子时，胱天蛋白酶1不能水解该底物(数据未显示)。因此，通过如下3种方法对各个级分进行评价，即对TOHD-MCA的水解活性、对H-99的反应性和hl4D146抗体。表1表示连续层析的结果。使用Hift~ep Q柱进行最初的阴离子交换层析后，收率增加170%，比活性增加约10倍。认为以上增加大概是由于将胱天蛋白酶14自内源性抑制物隔离而造成的。蛋白质印迹分析显示级分No. 16至20是含有分子量为17Kda的H-99且14D146均阳性的条带。认为这些级分也具有TOHD-MCA水解活性。后续的Mono Q阴离子交换层析中，如根据17Kda大小且H-99和hl4D146均阳性的条带进行判断，级分No. 25至No.四含有经加工形式的胱天蛋白酶14。只有这些级分显示有WEHD-MCA水解活性。Mono S阳离子层析和Mono P层析聚焦对于去除杂质蛋白质是有效的，从而使比活性分别增加3. 5倍和7倍。另外，只有H-99且hl4D146均阳性的级分显示TOHD-MCA水解活性。Superdex 75层析最后阶段分离出分子量30Kda的峰，该峰与TOHD-MCA水解活性峰一致。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法显示该制备物含有17Kda和IlKDa片段。前者对H-99抗体和hl4D146抗体均显阳性，后者被C20抗体识别。以上提示人胱天蛋白酶14作为由大亚单位(17KDa)和小亚单位(IlKDa)组成的异二聚体被纯化。另外，Superdex 75凝胶层析显示人角化细胞中的胱天蛋白酶14与其他胱天蛋白酶不同，是像粒酶B活化型那样作为单体存在的。表1汇总了胱天蛋白酶14的纯化率。以约IOOmg可溶性蛋白质提取物为起始物，可得到11. 8μ g纯化蛋白质。比活性增加764倍，收率为9. 1%。
权利要求
1.水烛提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黄瓜提取物、猕猴桃提取物和大枣提取物中的1种或几种生药的用途，用于作为活性成分制备抑制表皮角化不全的皮肤外用组合物。
2.权利要求1所述的用途，其特征在于所述皮肤外用组合物含有水烛提取物。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述表皮角化不全是由牛皮癣引起的。
4.权利要求1或2所述的用途，其中所述表皮角化不全是由特应性皮炎引起的。
全文摘要
在第一观点中，本发明提供了通过抑制细胞的鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)的表达，治疗和/或预防选自牛皮癣和鳞状上皮细胞癌的疾病的方法。在其它观点中，本发明提供了抑制表皮角化不全的物质的筛选方法，所述方法的特征在于以候选物质抑制鳞状上皮细胞癌抗原-1(SCCA-1)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性为指标。
文档编号A61K36/185GK102552564SQ20121003173
公开日2012年7月11日 申请日期2005年9月22日 优先权日2005年3月18日
发明者仲西城太郎, 日比野利彦, 片桐千华 申请人:株式会社资生堂